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    帝皇娱乐重庆时时彩: ELL作为E3泛素连接酶的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610003565.4

    申请日:

    2016.01.05

    公开号:

    CN105602910A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/00申请日:20160105|||公开
    IPC分类号: C12N9/00; A61K38/43; A61P35/00; G01N33/574; G01N33/573 主分类号: C12N9/00
    申请人: 中国科学院水生生物研究所
    发明人: 肖武汉; 陈瑜; 姬伟; 周迟
    地址: 430072 湖北省武汉市东湖南路7号
    优先权:
    专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 关畅;白艳
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610003565.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.03.05|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了ELL作为E3泛素连接酶的应用,本发明提供了ELL蛋白或其截短体在如下1)-6)至少一种中的应用:1)制备降解c-Myc蛋白产品;2)作为E3泛素酶连接酶;3)制备抑制肿瘤细胞增殖产品;4)制备抑制肿瘤形成产品;5)制备鉴定或辅助鉴定待测组织是否为肿瘤组织产品;6)制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为肿瘤患者产品。本发明的实验证明了,本发明发现ELL结合c-Myc并诱导其通过蛋白酶体降解,体内和体外的研究均表明ELL具有E3泛素连接酶的特征,ELL可以抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成,并可作为肿瘤临床诊断的分子标记,作为一种新型的c-Myc的E3泛素连接酶,且可以制备抑制肿瘤的药物或试剂盒,以及诊断肿瘤的试剂盒。

    权利要求书

    1.ELL蛋白或其截短体在如下1)-5)至少一种中的应用:
    1)制备降解c-Myc蛋白产品;
    2)作为E3泛素酶连接酶;
    3)制备抑制肿瘤细胞增殖产品;
    4)制备抑制肿瘤形成产品;
    5)作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记;
    所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基酸残
    基的任一区段。
    2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述ELL蛋白的氨基酸序列为序列表中序
    列4;
    所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2;
    所述ELL蛋白截短体为如下1)-6)中任一种:
    1)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位;
    2)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    3)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位;
    4)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位;
    5)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。
    3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:
    所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
    4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述产品为试剂盒或药物。
    5.如下1)-5)任一种产品,其包括ELL蛋白或其截短体;
    1)降解c-Myc蛋白产品;
    2)作为E3泛素酶连接酶;
    3)抑制肿瘤细胞增殖产品;
    4)抑制肿瘤形成产品;
    5)作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记;
    所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基酸残
    基的任一区段。
    6.根据权利要求5所述的产品,其特征在于:
    所述ELL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4;
    所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2;
    所述ELL蛋白截短体为如下1)-6)中任一种:
    1)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位;
    2)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    3)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位;
    4)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位;
    5)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。
    7.根据权利要求5或6所述的产品,其特征在于:
    所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
    8.根据权利要求5-7中任一所述的产品,其特征在于:所述产品为试剂盒或药物。
    9.一种蛋白质,其为如下1)-6)中任一种:
    1)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第46-621位;
    2)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    3)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第509-621位;
    4)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第466-621位;
    5)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位;
    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。

    说明书

    ELL作为E3泛素连接酶的应用

    技术领域

    本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种ELL作为E3泛素连接酶的应用。

    背景技术

    ELL的基因产物首先被鉴定出来的是与MLL基因在急性髓性白血病(AML)(Thirman
    等人1994)的易位融合部分(MLL-ELL)。进一步的生化研究发现:ELL是一转录延伸因子。在
    体外实验中(Invitro),它可以增加RNA聚合酶II的转录延伸活性。后来的在体研究(In
    vivo)揭示出它与基因转录活性位点相关联(Eissenberg等人2002,Shilatifard等人
    1996)。ELL是两个不同的延伸复合体的一部分,即超级延伸复合体(SEC)和小延伸复合体
    (LEC)(Hu等人2013,Luo等人2012,Smith和Shilatifard2013)。作为正转录延伸因子(P-
    TEFb)中最活跃的形式之一,超级延伸复合体(SEC)执行几项重要功能,例如:HSP70诱导热
    休克、发育基因响应环境胁迫(Lin等人2010,Lin等人2011),MLL-AFF1-转化细胞中的HOX基
    因失调(Lin等人2010),以及HIV的转录激活(He等人2010,Sobhian等人2010)。小延伸复合
    体(LEC)在snRNA基因转录的启始和延伸阶段调节小核RNA(smallnuclearRNA)的转录及
    功能(Hu等人2013,Smith等人2011)。

    ELL在哺乳动物的胚胎发育中是必需的,因为ELL靶向敲除的小鼠出现胚胎致死
    (Mitani等人2000)。此外,ELL作为类固醇受体,低氧诱导因子1-α(HIF-1α),E2F1和TFIIH复
    合体的结合蛋白,它能以一种正向或负向的方式来调节它们结合蛋白的活性(Pascual-Le
    Tallec等人2005)(Liu等人2010a)(Mourgues等人2013,Zhang等人2014)。综上所述,ELL有
    着非常多样化的功能;然而,其在生理条件下确切的作用机制仍然未知。

    原癌基因c-Myc,最初是通过识别在宿主细胞基因组中类似v-Myc癌基因而被鉴定
    出来(Vennstrom等人1982)。随后的研究表明,人类c-Myc在多发性骨髓瘤中频繁易位(Shou
    等人2000),并在许多不同的人类癌症中高表达或突变(Beroukhim等人2010),从而证实它
    是一个人类癌基因(Dang2012)。c-Myc基因编码一种在调节基因表达方面有重要作用的多
    功能转录因子,其功能牵涉到诸多生物过程,这些过程有助于肿瘤发生、肿瘤发展以及肿瘤
    转移(Dang2012)。

    c-Myc是一个可以调节多个生理过程的不稳定蛋白。泛素-蛋白酶体途径(UPS)是
    c-Myc在细胞中降解的最突出的机制之一(FarrellandSears2014)。鉴于浩如烟海的底
    物需要相应的特异性靶向E3泛素连接酶,因此人类E3连接酶的估计数目大于600(Berndsen
    和Wolberger2014)。E3连接酶可分为三大家族:最新发现的(RING)-FINGER家族、HECT家族
    和RING-between-RING(RBR)家族(Berndsen和Wolberger2014)。RING-FINGERE3连接酶可
    以直接催化泛素从E2转移到底物。与此相反,HECT和RBRE3连接酶催化的是两步反应,其中
    泛素首先从E2转移到E3的一个活性的半胱氨酸位点,然后再从E3到底物。作为RING-FINGER
    结构泛素连接复合体的组分之一(Farrell和Sears2014),FBW7(通过介导c-Myc降解来抑
    制其活性)是研究得最充分的E3泛素连接酶;它识别第c-Myc第58位苏氨酸(T58)的磷酸化,
    该磷酸化通过通过糖原合酶激酶3(GSK3)介导(Welcker等人2004,Yada等人2004)。另一个
    RING-FINGERE3连接酶Skp2,能够识别在c-Myc氨基末端的一段保守序列元件(MBII)和
    HLH-LZ基序(第367-439氨基酸),促进它的多泛素化和降解,并导致c-Myc转录活性的增强
    (Kim等人2003,vonderLehr等人2003)。第三个RING-FINGERE3连接酶β-TRCP,结合在c-
    Myc的氨基末端,并使用UbcH5泛素结合酶(E2)以形成c-Myc上的异型泛素链;从而增强c-
    Myc的稳定性(Popov等人2010)。唯一被报道过的c-Myc的HECTE3连接酶HectH9,泛素化c-
    Myc形成一个63位赖氨酸的多聚泛素链(Adhikary等人2005),它并不引起的c-Myc降解,但
    却是c-Myc反式激活多个靶基因所必需的(Adhikary等人2005)。因此,c-Myc的稳定性和泛
    素化之间存在着复杂的关联性,正如同c-Myc的转录活性和稳定性之间的关系一样。

    作为经典原癌基因之一,c-Myc在约70%的人类肿瘤中存在过量表达;然而,这些
    肿瘤中只有20%表现出的c-Myc基因扩增或易位,这足以解释c-Myc在蛋白水平的高表达
    (Farrell和Sears2014)。因此,在人类肿瘤中观察到的c-Myc蛋白的过表达可能与相应的
    E3泛素连接酶的下调有关。事实上,肿瘤中已经报道了c-Myc的一些E3连接酶的异常表达
    和/或突变。值得注意的是,在人类癌症中FBW7的点突变可以导致其失活,并且可能不表达
    (Farrell和Ears2014)。最近有研究表明,FBW7通过调节c-Myc的稳定性来影响白血病起始
    细胞活性,FBW7对c-Myc的泛素化的调节会控制慢性髓细胞性白血病发生和发展(King等热
    2013,Reavie等人2013)。与此相反,c-Myc的转录活性的正调控基因Skp2和HectH9显示出致
    癌性,他们的过表达在许多人类肿瘤中所验证(Farrell和Sears2014)。

    发明内容

    本发明的一个目的是提供ELL蛋白或其截短体的用途。

    本发明提供了ELL蛋白或其截短体在如下1)-6)至少一种中的应用:

    1)制备降解c-Myc蛋白产品;

    2)作为E3泛素酶连接酶;

    3)制备抑制肿瘤细胞增殖产品;

    4)制备抑制肿瘤形成产品;

    5)作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记;

    所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基
    酸残基的任一区段。

    所述ELL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4;

    所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2。

    上述应用中,所述ELL蛋白截短体为如下1)-6)中任一种:

    1)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位;

    2)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    3)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位;

    4)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位;

    5)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。

    上述应用中,所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞;所述结肠癌细胞具
    体为HCT116细胞。

    上述应用中,所述产品为试剂盒或药物。

    本发明的另一个目的是提供一种如下1)-5)任一种。

    1)降解c-Myc蛋白产品;

    2)作为E3泛素酶连接酶;

    3)抑制肿瘤细胞增殖产品;

    4)抑制肿瘤形成产品;

    5)作为肿瘤诊断和/或鉴定的分子标记;

    所述ELL蛋白截短体的氨基酸序列为ELL蛋白氨基酸序列中包含第583-614位氨基
    酸残基的任一区段。

    所述c-Myc蛋白的氨基酸序列为序列2。

    所述ELL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4;

    上述产品中,所述ELL蛋白截短体为如下1)-6)中任一种:

    1)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第46-621位;

    2)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    3)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第509-621位;

    4)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第466-621位;

    5)所示的ELL蛋白截短体的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。

    上述产品中,所述肿瘤为结肠癌;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞;所述结肠癌细胞具
    体为HCT116细胞。

    上述产品中,所述产品为试剂盒或药物。

    本发明第三个目的是提供一种蛋白质。

    本发明提供的蛋白质,其为如下1)-6)中任一种:

    1)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第46-621位;

    2)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    3)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第509-621位;

    4)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第466-621位;

    5)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第447-621位;

    6)所示的蛋白的氨基酸序列为序列4第583-614位。

    本发明的实验证明,ELL具有E3泛素连接酶的特征,它结合c-Myc并诱导其通过蛋
    白酶体降解。ELL可以通过降解c-Myc蛋白,从而抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成。因此,本发
    明揭示了ELL的一个先前未知的功能,即作为一种新型的c-Myc的E3泛素连接酶,介导c-Myc
    的有效降解。它可以开发为肿瘤临床诊断的标记分子以及治疗肿瘤的靶标分子。

    附图说明

    图1为过表达ELL和干扰ELL表达对c-Myc降解的影响。

    图2为ELL作为一个E3泛素连接酶的实验证明。

    图3为体外实验证明ELL是E3泛素连接酶。

    图4为ELL降解c-Myc蛋白的活性区域的确定。

    图5为ELL抑制结肠癌细胞增殖。

    图6为ELL抑制结肠移植瘤的肿瘤生长及ELL在作为肿瘤标志物中的应用。

    具体实施方式

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

    下述实施例中细胞及培养:

    HEK293,HEK293T,HCT116和COS7细胞来自ATCC。

    HEK293,HEK293T和COS7细胞使用添加10%胎牛血清(FBS;Hyclone公司)的
    Dulbecco’smodifiedEagle’smedium培养基(DMEM;HyClone公司)培养;HCT116细胞使用
    添加10%胎牛血清(FBS;Hyclone公司)McCoy的5A培养基(HyClone公司)培养。培养条件为
    37℃,5%CO2。VigoFect(VigorousBiotech)用于细胞转染。

    下述实施例中抗体和试剂

    使用的抗体如下:anti-ELLantibody(A0668,ABclonal;51044-1-AP,
    Proteintech;HPA046076,Sigma-Aldrich),anti-c-Mycantibody(9E10,SantaCruz;
    A0309,ABclonal;D84C12,CellSignaling),anti-Flagantibody(F1804,Sigma);anti-
    HAantibody(Covance),anti-Hisantibody(H15,SantaCruz),anti-GAPDHantibody
    (SC-47724,SantaCruz),anti-α-tubulinantibody(EPR1333,Epitomics)。使用的试剂如
    下:chloroquinediphosphate(BioVison),AICAR(Cayman),MG132(Calbiochem),
    cycloheximide(Sigma-Aldrich)。

    下述实施例中免疫共沉淀和Westernblot分析:

    Anti-c-Mycantibody,anti-HAantibody和anti-Flagantibody-conjugated
    agarosebeads购自Sigma-Aldrich。ProteinA/GSepharosebeads购自GECompany。
    GlutathioneS-transferase(GST)-BindResin购自Novagen。

    内源性免疫共沉淀的实验步骤已在(Zhang等人2014)中描述。在GSTpull-down分
    析中,通过E.coli(BL21)细菌表达GST标签的c-Myc和His标签的ELL并进行纯化。使用GST-
    BindResin进行免疫共沉淀后,通过SDS-PAGE将蛋白质分离。将胶用考马斯蓝染色或转移
    到PVDF膜,通过Westernblot分析检测His-ELL。使用FujiFilmLAS4000mini
    luminescentimageanalyzer进行Westernblot结果的拍摄,使用MultiGaugeV3.0根据
    Westernblot获得的条带密度定量分析蛋白水平。

    下述实施例中体内泛素化实验如下:

    在HEK293T细胞中共转染质粒HA-c-Myc、质粒Myc-ELL、质粒Myc-ELL(C595A),质粒
    His-ubiquitin或质粒His-ubiquitin(K48R)。通过Ni2+-NTAresin(Novagen)对His-
    ubiquitin或His-ubiquitin(K48R)进行纯化,最后使用HA抗体检测c-Myc的泛素化。

    下述实施例中体外细胞生长实验:

    通过慢病毒感染获得细胞接种于6孔板中,每孔细胞量为1×105,使用细胞计数仪
    (TC10;Bio-Rad)连续计数4天。

    下述实施例中细胞克隆形成实验:

    将过表达ELL的HCT116稳定细胞系接种于六孔板中,每孔2×104个细胞;敲降ELL
    的HCT116稳定细胞系每孔接种1.5×104个细胞。接种六天后,使用甲醇固定细胞并用结晶
    紫染色。使用显微镜拍摄并对克隆数进行计数。

    统计分析:

    体外生长实验和克隆形成实验的数据来自三次独立重复实验的平均值,表示为平
    均值+SEM;体内实验数据表示为平均值+SEM。使用GraphPadPrism5(GraphPadSoftware
    Inc.)进行数据分析。

    实施例1、ELL促进c-Myc降解

    蛋白c-Myc的氨基酸序列为序列2,其编码基因的核苷酸序列为序列1;

    蛋白ELL的氨基酸序列为序列4,其编码基因的核苷酸序列为序列3。

    人工合成上述序列。

    1、ELL降低外源Myc表达

    表达c-Myc的质粒HA-c-Myc(WT)为将c-Myc编码基因插入pCMV-HA载体(Clontech)
    的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    表达ELL的质粒HA-ELL为将ELL的编码基因插入pCMV-HA载体的SalI和KpnI位点得
    到的质粒;

    质粒HA-empty为pCMV-HA载体。

    将质粒HA-ELL和HA-empty分别与HA-c-Myc(WT)按照质量比为1:1共转染细胞
    HEK293。转染后第2天,收集上清液进行Westernblot检测,采用的抗体如图。

    结果如图1A所示,共转染质粒HA-ELL和HA-c-Myc(WT)会降低HA-c-Myc的蛋白水
    平,而HA-empty空载体和HA-c-Myc(WT)共转染不能降低HA-c-Myc的蛋白水平,证明ELL可以
    降解c-Myc蛋白。

    2、ELL降低内源Myc表达

    表达ELL的质粒pcDNA-ELL为将ELL的编码基因插入pcDNA3.0(+)(Invitrogen)载
    体的KpnI和XhoI位点得到的质粒;

    质粒pcDNA-empty为pcDNA3.0(+)载体。

    将质粒pcDNA-ELL和pcDNA-empty分别按照不同的浓度(-为不转染质粒,+为转染
    0.5微克质粒,++为转染1微克质粒转染细胞HCT116(含有内源c-Myc)。转染后第2天,收集上
    清液进行Westernblot检测,采用的抗体如图。

    结果如图1B所示,ELL在HCT116细胞中,梯度过表达ELL会导致内源c-Myc的梯度降
    解。

    3、干扰ELL表达增加内源c-Myc的稳定性

    根据ELL设计干扰其表达的ELL-shRNA-1和ELL-shRNA-2:

    ELL-shRNA-1的编码基因:5’-CAACACCAACTACAGCCAGGA-3’;

    ELL-shRNA-2的编码基因:5’-GCGAGTACCTGCACAGCAA-3’。

    pSuper-ELL-shRNA-1为将ELL-shRNA-1的编码基因插入pSuper载体(Brummelkamp
    TR1,BernardsR,AgamiR.Asystemforstableexpressionofshortinterfering
    RNAsinmammaliancells.Science.2002Apr19;296(5567):550-3.)得到的质粒;

    pSuper-ELL-shRNA-2为将ELL-shRNA-2的编码基因插入pSuper载体得到的质粒;

    将pSuper-ELL-shRNA-1和pSuper-ELL-shRNA-2分别按照不同的浓度(-为不转染
    质粒,+为转染1微克质粒,++为转染2微克质粒)转染细胞HCT116,转染后第2天收集上清液
    进行Westernblot检测,采用的抗体如图。

    以pSuper-GFP(ControlshRNA)(记载在如下文献中:ChenZ,LiuX,MeiZ,Wang
    Z*,XiaoW*.EAF2suppressesHIF-1alphatranscriptionalactivitybydisrupting
    itsinteractionwiththeco-activatorCBP/p300.MolecularandCellular
    Biology.2014,34(6):1085-1099.)为对照。

    结果如图1C所示,可以看出,在HCT116细胞中敲降ELL则会增加c-Myc的稳定性。

    综上所述,ELL可以降解c-Myc。

    实施例2、ELL作为一个E3泛素连接酶降解c-Myc蛋白

    1、ELL能够增强c-Myc的泛素化

    为了验证ELL引起的蛋白降解的类型,运用了抑制剂,包括氯喹(溶酶体蛋白水解
    抑制剂,Chlq)(Sigma,87111906),氯化铵(溶酶体蛋白水解抑制剂,NH4CL)(国药试剂,
    12125-02-9),AICAR(自噬抑制剂)(Cayman,2627-69-2)和MG132(蛋白酶体抑制剂)(Sigma,
    M8699),以确定它们是否可以阻断ELL介导的c-Myc的降解。

    将质粒HA-ELL、质粒HA-ELL和质粒HA-c-Myc分别转染细胞HEK293,转染后第2天,
    向细胞培养液中分别加入Chlq和AICAR,且Chlq和AICAR的终浓度均达到20mM,继续培养6小
    时,收集上清液进行Westernblot检测,采用的抗体如图。以不加入抑制剂为对照(con.)。

    结果如图2A-2C,可以看出,只有蛋白酶体抑制剂MG132能阻断ELL介导的c-Myc降
    解,这表明ELL经由蛋白酶体途径促进c-Myc的降解。

    为了验证ELL确实参与c-Myc的蛋白酶体降解,接下来,在HEK293T共转染His-
    ubiquitin或His-ubiquitin(K48R),HA-c-Myc以及Myc的空载体或Myc-ELL进行体内泛素化
    实验,具体如下:

    过表达ELL的质粒Myc-ELL为将ELL的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的
    SalI和KpnI位点得到的质粒;

    His-Ub质粒为将序列5(MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQ
    LEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG)所示的ubiquitin编码基因插入pCI载体(Promega)的SalI
    和NotI位点得到的质粒;

    His-Ub(K48R)质粒为将ubiquitin的第48位的K突变为R得到蛋白的编码基因插入
    PIC载体的SalI和NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-empty为CMV-Myc空载体。

    将His-Ub(K48R)或His-ub、HA-c-Myc、Myc-ELL或Myc-empty按照图2D和2E的组合
    转染HEK293T细胞,转染第2天收集细胞裂解液。将各组合的细胞裂解液进行免疫共沉淀,通
    过Westernblot分析,采用的抗体如图。

    结果如下,图2D显示过表达ELL能够增强c-Myc的泛素化。

    考虑到48位赖氨酸(K)在多泛素化中的作用(Berndsen和Wolberger2014),使用
    Ub(K48R)突变体进行泛素化实验,结果表明,该突变体不能形成K48连接的泛素链。如图2E
    所示,在野生型泛素存在的条件下,ELL可以诱导c-Myc的泛素化;当泛素K48R突变体存在时
    则不能诱导c-Myc的泛素化。

    这表明,ELL促进48位赖氨酸连接的多聚泛素链在c-Myc上的形成,从而进一步验
    证了ELL在c-Myc的蛋白酶体降解的作用。

    这些数据使假设ELL可能具有E3泛素连接酶的活性,究竟ELL哪段(图4A)促进c-
    Myc的降解,需要下面进一步研究。

    2、ELL促进c-Myc降解的核心片段

    质粒HA-ELL(1-45)为将ELL氨基酸序列第1-45位氨基酸残基所示ELL(1-45)截短
    体的编码基因插入CMV-HA载体(Clontech)的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(1-379)为将ELL氨基酸序列第1-379位氨基酸残基所示ELL(1-379)截
    短体的编码基因插入CMV-HA载体的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(1-508)为将ELL氨基酸序列第1-508位氨基酸残基所示ELL(1-508)截
    短体的编码基因插入CMV-HA载体的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(46-621)为将ELL氨基酸序列第46-621位氨基酸残基所示ELL(46-
    621)截短体的编码基因插入CMV-HA载体的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(447-621)为将ELL氨基酸序列第447-621位氨基酸残基所示ELL(447-
    621)截短体的编码基因插入CMV-HA载体的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(509-621)为将ELL氨基酸序列第509-621位氨基酸残基所示ELL(509-
    621)截短体的编码基因插入CMV-HA载体的XbaI和BamHI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(466-621)为将ELL氨基酸序列第466-621位氨基酸残基所示ELL(466-
    621)截短体的编码基因插入CMV-HA载体的EcoRI和KpnI位点得到的质粒;

    质粒HA-ELL(447-621)为将ELL氨基酸序列第447-621位氨基酸残基所示ELL(447-
    621)截短体的编码基因插入CMV-HA载体的EcoRI和KpnI位点得到的质粒;

    将上述质粒分别转染细胞HEK293。转染后第2天,收集上清液进行Westernblot检
    测,采用的抗体如图。

    结果如图4B和4C所示,可以看出,含有583-614区域的ELL(46-621)截短体、ELL
    (447-621)截短体、ELL(509-621)截短体、ELL(466-621)截短体和ELL(447-621)截短体可以
    降解c-Myc蛋白,证明583-614区域对于降解c-Myc蛋白是必需的。

    因此583-614区域为ELL降解c-Myc蛋白的活性区域。

    3、ELL(C595A)

    在ELL(583-614)区域只在第595位存在半胱氨酸,并且这一位点从斑马鱼到人类
    都是保守的(图2F)。因为HECT和RBR-domainE3连接酶都需要通过半胱氨酸活性位点发挥其
    催化活性(Berndsen和Wolberger2014),所以研究了ELL的C595突变为丙氨酸得到的突变
    体ELL(C595A)后是否还具有E3连接酶的作用。

    ELL(C595A)的氨基酸序列为将ELL氨基酸序列4第595位的半胱氨酸突变为丙氨酸
    得到的蛋白,其编码基因的核苷酸序列为将ELL编码基因序列3第位TGC突变为GCC。

    表达ELL(C595A)的质粒HA-ELL(C595A)为将ELL(C595A)的编码基因插入CMV-HA载
    体的SalI和NotI位点得到的质粒;

    将质粒HA-ELL(C595A)和质粒HA-c-Myc共转染细胞HEK293。转染后第2天,收集上
    清液进行Westernblot检测,采用的抗体如图。以质粒HA-ELL为对照。

    结果如图2G所示,ELL(C595A)突变体不能促进c-Myc的降解。

    将质粒HA-ELL(C595A)和质粒HA-c-Myc按照不同的质量比(1:1)共转染细胞
    HEK293。转染后第2天,收集上清液进行Westernblot检测,采用的抗体如图。以质粒HA-ELL
    为对照。

    结果如图2H所示,与野生型HA-ELL相比,蛋白HA-ELL(C595A)对内源c-Myc的稳定
    性没有明显影响。

    表达ELL(C595A)的质粒Myc-ELL(C595A)为将ELL(C595A)的编码基因插入CMV-Myc
    载体的SalI和NotI位点得到的质粒;

    将质粒His-Ub、质粒HA-c-Myc和质粒Myc-ELL(C595A)转染HEK293T细胞,转染2天
    收集细胞裂解液。将各组合的细胞裂解液进行免疫共沉淀,通过Westernblot分析,采用的
    抗体如图。以质粒Myc-ELL为对照。

    结果如图2I所示,可以看出,与野生型ELL相比,过表达ELL(C595A)突变体会减弱
    c-Myc的泛素化。这些结果表明,ELL可能具有E3泛素连接酶活性并且595位半胱氨酸是其活
    性位点。

    4、ELL的E3泛素连接酶活性检测

    为进一步证明E3是一个E3泛素连接酶,利用一个商业化的试剂盒(UW9920,
    BIOMOL),在体外对ELL的E3泛素连接酶活性进行了验证。

    克隆了11个E2质粒,具体如下:

    质粒Myc-UbcH1为将UbcH1的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的EcoRI和
    XhoI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH2为将UbcH2的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    XhoI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH3为将UbcH3的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH5a为将UbcH5a的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH5b为将UbcH5b的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH5c为将UbcH5c的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH6为将UbcH6的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH7为将UbcH7的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的EcoRI和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH8为将UbcH8的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的EcoRI和
    XhoI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH10为将UbcH10的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒;

    质粒Myc-UbcH13为将UbcH13的编码基因插入CMV-Myc载体(Clontech)的BglII和
    NotI位点得到的质粒。

    质粒His6-ELL为将ELL的编码基因插入pET-32a(+)载体(Novagen)得到的质粒;

    质粒His6-ELL(C595A)为将ELL(C595A)突变体的编码核苷酸序列插入pET-32a(+)
    载体得到的质粒;

    质粒His6-c-Myc为将c-Myc的编码基因插入pET-32a(+)载体(Novagen)得到的质
    粒。

    将上述11个E2质粒、质粒His6-ELL、质粒His6-ELL(C595A)和质粒His6-c-Myc按照
    图3所示组合进行免疫共沉淀实验。

    结果如下,图3A-B所示,UbcH8与ELL有最强的结合。

    进一步的体外泛素化分析显示:UbcH8能介导ELL的E3泛素连接酶(图3C),证明
    UbcH8是ELL的E2。此外,ELL(C595A)突变体不能引起c-Myc的泛素化(图3D)。

    上述结果表明,ELL为一个E3泛素连接酶,靶向作用于c-Myc,导致c-Myc蛋白通过
    蛋白酶体降解,氨基酸片段583-614为ELL蛋白的活性区域,595位点的半胱氨酸是ELL作为
    E3泛素连接酶的活性位点。

    ELL(C595A)突变体丧失了E3泛素连接酶活性。

    实施例2、ELL抑制结肠癌细胞增殖

    为了证明ELL介导的c-Myc降解和抑制其转录活性的生物学功能,使用慢病毒包装
    的三个HCT116细胞系:对照,ELL和ELL(C595A)进行细胞增殖实验。

    pHAGE-control为pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体;

    pHAGE-ELL为将ELL编码基因序列3插入pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体(Addgene)
    的XbaI和BamHI位点得到的载体;

    pHAGE-ELL(C595A)为将ELL(C595A)编码基因插入pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体
    的XbaI和BamHI位点得到的载体;

    ELL-shRNA为将ELLshorthairpinRNA的编码序列CAACACCAACTACAGCCAGGA插入
    pLKO.1载体(Sigma-Aldrich)上得到的载体;

    将上述各载体分别和包装载体psPAX2(Addgene),pMD2.G(Addgene)转染HEK293T
    细胞,转染后8小时,将培养基更换为含有10%FBS的新鲜DMEM培养基。40小时后,从培养基
    中收集病毒,得到表达对照慢病毒、表达ELL的慢病毒、表达ELL(C595A)的慢病毒、表达
    scrambled的慢病毒和表达ELL–shRNA的慢病毒。过滤,并转染HCT116细胞。上述含有病毒的
    培养基中加入Polybrene(8μg/mL)以提高感染效率。

    结果如下:

    与转染pHAGE-control的对照组细胞相比,转染pHAGE-ELL的HCT116细胞增殖速度
    从第二天起明显下降(图5A)。用Westernbolt(图5C)证实ELL在HCT116细胞中的表达。与此
    相反,转染pHAGE-ELL(C595A)的HCT116细胞系的增殖速度与对照组细胞相似(图5D)??寺?br />形成实验也验证了上述结果(图5E)。转染pHAGE-ELL(C595A)的HCT116细胞系的表达通过
    Westernblot分析(图5F)证实。相反,稳定敲降ELL的细胞系(转染ELL–shRNA的细胞)与对
    照组细胞(转染scrambled的细胞)相比增殖速度加快(图5G、5H)。对ELL-shRNA的介导的敲
    降效率通过Westernblot分析(图5I)证实。

    此外,利用Rat1细胞(含野生型c-Myc)和HO15.19(从Rat1细胞而来,但缺失c-Myc)
    验证了ELL对细胞增殖的影响是否依赖于c-Myc。转染pHAGE-ELL的Rat1细胞增殖速度明显
    低于pHAGEControl转染的Rat1细胞(图5J)。然而,转染pHAGE-ELL的HO15.19细胞增殖速度
    与转染了pHAGEControl的HO15.19细胞无显著差别(图5K)。

    因此,ELL可以抑制细胞的增殖,这种抑制作用可能是由它介导c-Myc的降解来实
    现的。ELL(C595A)不能抑制细胞的增殖。

    上述Rat1细胞和HO15.19细胞记载在如下文献中:

    MateyakMK,ObayaAJ,AdachiS,SedivyJM.Phenotypesofc-Myc-deficient
    ratfibroblastsisolatedbytargetedhomologousrecombination.Cellgrowth&
    differentiation:themolecularbiologyjournaloftheAmericanAssociationfor
    CancerResearch8,1039-1048(1997);或YuanJ,Minter-DykhouseK,LouZ.Ac-Myc-
    SIRT1feedbackloopregulatescellgrowthandtransformation.TheJournalof
    cellbiology185,203-211(2009)。

    实施例3、ELL抑制结肠移植瘤的肿瘤生长

    将实施例2中转染pHAGE-control的HT116细胞、转染pHAGE-ELL的HT116细胞和转
    染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞进行移植瘤生长实验:将15只雄性裸鼠随机分成3组,每
    组5只,三组裸鼠分别皮下注射上述三种不同的细胞系,每只裸鼠注射的细胞量为2×106
    个。从第三周起,每周测量肿瘤的长宽高并使用V=π.abc/6(Flatz等人2010)计算肿瘤体
    积。6周后,处死裸鼠,测量肿瘤的重量并对相应的基因表达进行分析。肺部组织经过HE染色
    后进行组织学分析。

    肿瘤体积结果如图6A和6B,过表达ELL(C595A)的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL
    (C595A)的HT116细胞)肿瘤生长速度与对照组(转染pHAGE-control的HT116细胞)几乎相
    同,而过表达ELL的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL的HT116细胞)只形成一个很小的肿瘤。

    肿瘤重量分析也表明,对照组(转染pHAGE-control的HT116细胞)和过表达ELL
    (C595A)突变体的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞)的肿瘤之间无明显差
    异(图6C)。过表达ELL的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL的HT116细胞)和过表达ELL(C595A)突
    变体的HCT116细胞(转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞)的肿瘤表达通过Westernblot分
    析(图6D)证实。

    这些数据表明,ELL可以抑制结肠肿瘤移植瘤的生长。

    实施例4、ELL在作为肿瘤标志物中的应用

    利用上海佐诚生物科技有限公司提供的90个结肠癌组织芯片(产品号:HCo1-
    Ade180Sur-04),86个正常组织为对照。利用ELL抗体和c-Myc抗体进行免疫组织化学染色
    后,在显微镜下拍照,根据染色的深浅进行定量分析;检测ELL蛋白和c-Myc蛋白在结肠癌组
    织和正常组织中的表达。

    结果如图6所示,ELL在正常组织中高表达,而在癌组织中的表达显著降低(图6E,
    6G)。与之相反,c-Myc的表达,在癌组织中高表达,而在正常组织中,表达量很低(图6E,6F)。

    这些数据表明,ELL的表达可能可以作为结肠癌临床诊断的分子标记。












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