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    重庆时时彩投注经验: 一种人源化抗白介素22基因工程抗体及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610095313.9

    申请日:

    2016.02.22

    公开号:

    CN105601739A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/24申请日:20160222|||公开
    IPC分类号: C07K16/24; A61K39/395; A61P19/02; A61P29/00; A61P37/02; A61P1/00; A61P3/10; G01N33/68 主分类号: C07K16/24
    申请人: 王晨辉; 武汉安迪晶赛生物技术有限公司
    发明人: 王晨辉
    地址: 430075 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号武汉国家生物产业基地研发楼B5栋6层
    优先权:
    专利代理机构: 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 代理人: 汪俊锋
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610095313.9

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.01.18|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及生物技术领域,更具体地,本发明公开了一种人源化抗IL-22基因工程抗体、其制备方法及应用。通过运用基因工程技术以及噬菌体表面展示技术,直接从人抗体基因库中筛选能与人IL-22结合的抗体,获得抗体基因并表达。该抗体可用于Th17/IL-17相关自身免疫性疾病的治疗及IL-22的检测。

    权利要求书

    1.一种人源化抗IL-22抗体,包括重链和轻链,其特征在于,
    所述的重链的可变区的3个互补决定区序列分别为:
    CDR1:Gly-Ile-Thr-Gly-Ser–Arg-Tyr-Trp(SeqNO:1);
    CDR2:Ile-Tyr-Thr-Asp-Gly–Ser-Thr-Thr(SeqNO:2);
    CDR3:Ala-Arg–Pro-Thr–Asp-Gly–Val-Asn-Val–Thr-His-Asp-Tyr(SeqNO:3);
    所述的轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为:
    CDR1:Gln-Ser-Val-Gly-Ser–Asn(SeqNO:4);
    CDR2:Gly-Ala–Ser(SeqNO:5);
    CDR3:Gln–Gln-Tyr-Gly-Ser–Ser-Pro-Gln-Thr(SeqNO:6)。
    2.根据权利要求1所述的人源化抗IL-22抗体,其特征在于,对其氨基酸序列进行一定
    的取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
    3.一种编码人源化抗IL-22单链抗体,其特征在于,对权利要求1所述的人源化抗IL-22
    抗体的Fab段的轻链可变区和重链可变区进行重组,所获得分子量更小的单链抗体。
    4.权利要求1-3任意一项所述的人源化抗IL-22抗体在制备预防或治疗Th17/IL-17相
    关自身免疫疾病的药物中的应用。
    5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的Th17/IL-17相关自身免疫性疾病包
    括银屑病,特应性皮炎,类风湿关节炎,红斑狼疮,炎症性肠病,多发性硬化症,I型糖尿病。
    6.权利要求1-3任意一项所述的人源化抗IL-22抗体在制备检测IL-22的试剂中的应
    用。

    说明书

    一种人源化抗白介素22基因工程抗体及其应用

    技术领域

    本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种人源化抗白介素22(interleukin-
    22,IL-22)基因工程抗体的制备方法以及在Th17/IL-17相关自身免疫性疾病中的用途。

    背景技术

    Th17细胞是近年来新发现的T细胞亚群,主要分泌IL-17A,IL-17F,IL-21和IL-
    22。Th17细胞的主要作用是参与宿主防御真菌及细菌,但是许多研究发现Th17/IL-17在许
    多自身免疫性疾病如银屑病,红斑狼疮,多发性硬化症,炎症性肠病等疾病以及肿瘤的发生
    发展中发挥十分重要的作用1。

    Th17/IL-17的主要功能是对抗细菌以及真菌的感染,但是在激活宿主防御的过程
    中,经常伴有炎症细胞浸润为主的局部炎症反应,以及活性氧的产生,因而不可避免的产生
    组织损伤。特别是在各种因素导致的慢性炎症过程中,Th17招募的中性粒以及巨噬细胞等
    骨髓起源的细胞常?;嵩斐裳现氐木植孔橹鹕松踔磷陨砻庖呒膊〉姆⑸?。通过运用各种
    Th17/IL-17相关基因敲除小鼠的研究证实了Th17/IL-17对于众多的自身免疫性疾病银屑
    病,红斑狼疮,多发性硬化症,炎症性肠病等疾病的发生发展中发挥十分重要的作用1。Eli
    Lilly,Novartis等众多制药公司研发了许多针对Th17/IL-17的抗体和药物,针对众多的自
    身免疫性疾病开展了临床试验。其中针对IL-17以及IL-17受体的人源化单克隆抗体在治疗
    银屑病以及银屑病性关节炎方面取得了较好的疗效。现在抗IL-17的抗体治疗银屑病已进
    入III期临床实验。从临床实验的结果来看,尽管针对IL-17的抗体具有非常好的效果,但还
    有20%左右的患者对IL-17中和不产生任何反应,40%左右的患者反应较差2。针对IL-17受体
    的抗体用于治疗银屑病性关节炎也进入临床II期实验,从结果上来看,尽管也有一定的疗
    效,但也有高达50%左右的患者对治疗不起任何反应3。针对IL-17的中和抗体治疗在多发性
    硬化症,关节炎以及炎症性肠病方面的临床实验结果不是很好,提示可能具有更加复杂的
    机制参与这些疾病中。

    白介素22(IL-22)属于IL-10家族细胞因子,其主要由Th17,γδT细胞,NKT细胞
    以及最新鉴定的ILC细胞分泌。IL-22在众多的组织中均有表达,如肠,肺,肝脏,肾脏,胸腺,
    胰岛和皮肤等。IL-22的主要生理学功能是促进细胞增殖,再生以及宿主防御。但是近些年
    的研究发现IL-22在众多自身免疫性疾病中发挥十分重要的作用,如银屑病,特应性皮炎,
    关节炎,红斑狼疮,炎症性肠病等。通过基因敲除IL-22小鼠以及中和IL-22研究发现,IL-22
    可以作为银屑病、特应性皮炎以及炎症性肠病的治疗靶点。

    Act1是IL-17信号通路最重要的接头分子,对于IL-17信号转导具有至关重要的作
    用。近年来,研究发现Act1的单核苷酸多态性与许多自身免疫性疾病密切相关,如银屑病、
    炎症性肠病、红斑狼疮等。我们的一个研究发现Act1的一个单核苷酸多态性导致银屑病的
    分子机制,并且运用小鼠模型证明在Act1缺失/突变造成的皮肤炎症中IL-22扮演十分重要
    的角色。由此,发现抗IL-22抗体能够改善Act1缺失/突变造成的皮肤炎症,提示抗IL-22抗
    体可以作为抗IL-17抗体的补充治疗方法来应用(见说明书附图1和图2)4。我们和临床合作
    的一个课题发现,对抗IL-17抗体治疗不反应的这部分银屑病病人中,Act1的突变率非常
    高。因此,对于抗IL-17抗体不反应的这一部分病人,可以采取抗IL-22抗体治疗,应该会有
    很好的效果,考虑到Th17/IL-17参与众多自身免疫性疾病,抗IL-22抗体可以作为抗IL-17
    抗体治疗的补充治疗方法,具有十分广泛的治疗和应用前景。

    然而,鼠源性抗体应用于人体治疗中存在诸多问题:(1)不能有效地激活人体中补
    体和Fc受体相关的效应系统;(2)被人体免疫系统所识别产生人抗鼠抗体(HAMA);(3)在人
    体循环系统中被很快清除掉。因此,人源化单链抗体的研究是目前抗体研究的热点之一。

    参考文献:

    1.GaffenSL,JainR,GargAV,CuaDJ.TheIL-23-IL-17immuneaxis:from
    mechanismstotherapeutictesting.NatRevImmunol.2014Sep;14(9):585-600.

    2.MeasePJ.etal.Brodalumab,ananti-IL17RAmonoclonalantibody,in
    psoriaticarthritis.NEnglJMed.2014Jun12;370(24):2295-306

    3.LangleyRG,etal.Secukinumabinplaquepsoriasis--resultsoftwophase
    3trials.NEnglJMed.2014Jul24;371(4):326-38.

    4.WangC,etal.Thepsoriasis-associatedD10Nvariantofthe
    adaptorAct1withimpairedregulationbythemolecularchaperonehsp90.Nat
    Immunol.2013Jan;14(1):72-81。

    发明内容

    为了解决现有技术存在的问题,本发明提供一种人源化抗IL-22基因工程抗体。

    本发明是通过以下技术方案来实现:

    本发明通过运用基因工程技术以及噬菌体表面展示技术,直接从人抗体基因库中筛选
    能与人IL-22结合的抗体,获得抗体基因并表达。

    一种人源化抗IL-22抗体,包括重链和轻链,所述的重链的可变区的3个互补决定
    区序列分别为:

    CDR1:Gly-Ile-Thr-Gly-Ser–Arg-Tyr-Trp;

    CDR2:Ile-Tyr-Thr-Asp-Gly–Ser-Thr-Thr;

    CDR3:Ala-Arg–Pro-Thr–Asp-Gly–Val-Asn-Val–Thr-His-Asp-Tyr;

    所述的轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为:

    CDR1:Gln-Ser-Val-Gly-Ser–Asn;

    CDR2:Gly-Ala–Ser;

    CDR3:Gln–Gln-Tyr-Gly-Ser–Ser-Pro-Gln-Thr;

    考虑到密码子的简并性,可在其编码区,在不改变氨基酸序列的条件下,编码上述Fab
    段抗体的基因序列可以进行修改,获得编码相同抗体的基因;也可以根据表达抗体宿主的
    密码子偏爱性,人工合成改造基因,以提高抗体的表达效率。

    进一步地,本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组,获得分子
    量更小的单链抗体(ScFv),该抗体同样能够特异性识别人IL-22。

    此外,可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中,并
    导入宿主细胞中,获得表达抗人IL-22的全抗免疫球蛋白。

    在本发明的实施例中,将上述Fab抗体的轻链和重Fd段基因分别克隆入全抗体表
    达载体pAC-K-Fc并转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现了全抗体的分泌
    型表达,得到抗人IL-22全抗体。

    本发明的另一个目的是提供所述的人源化抗IL-22抗体在制备治疗Th17/IL-17
    相关自身免疫性疾病的药物中的应用。

    所述的Th17/IL-17相关自身免疫性疾病包括银屑病,特应性皮炎,类风湿关节炎,
    红斑狼疮,炎症性肠病,多发性硬化症,I型糖尿病。

    本发明的IL-22人源化抗体将作为抗IL-17抗体治疗的补充治疗方法,尤其是针对
    抗IL-17抗体治疗效果不明显或完全不起反应的病人。

    附图说明

    图1为抗IL-22抗体中和治疗的Act1-/-小鼠皮肤炎症状况示意图。

    三周龄Act1-/-小鼠给予非特异性IgG或者抗IL-22抗体腹腔注射(500μg每只每
    次,一周三次,持续三周)。三周后,处死小鼠,取背部皮肤做H&E染色,CD3染色,CD4染色,
    CD11b染色??梢钥闯隹笽L-22抗体中和治疗明显改善Act1-/-小鼠皮肤炎症状况。

    图2为抗IL-22抗体中和治疗的Act1-/-小鼠皮肤炎症基因表达示意图。

    三周龄Act1-/-小鼠给予非特异性IgG或者抗IL-22抗体腹腔注射(500μg每只每
    次,一周三次,持续三周)。三周后,处死小鼠,取背部皮肤做实时定量PCR分析炎症基因表
    达??梢钥闯隹笽L-22抗体中和治疗明显减轻Act1-/-小鼠皮肤炎症基因表达。

    具体实施方式

    下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而
    不是限定。

    材料:

    细胞、载体、cDNA、重组蛋白:pTXB1载体购自NEB公司;昆虫细胞Sf9来自美国细胞培养
    中心(ATCC);E.coliBL21购自NEB公司;人IL-22cDNA购自GE;人重组IL-22R1蛋白购自R&D
    公司。

    实施例1制备人IL-22

    利用基因工程技术构建人IL-22基因表达载体(人IL-22编码核苷酸序列包括SEQID
    NO.7,氨基酸编码序列包括SEQIDNO.8)。我们将人IL-22cDNA构建入pTXBl表达载体,转
    化感受态E.coliBL21(DE3),在LB(Amp+)琼脂平板上调取单克隆,37℃培养过夜。次日
    按l:100比例转接入1LLB培养集中。37℃摇菌至A600=0.5?0.7,加入IPTG(1mM)进行诱导
    表达。37℃摇菌6-8小时,离心,去上清。将细菌重悬在50mlColumn缓冲液中(Column缓冲
    液配方:20mMTris-HCl,1mMEDTA,1mMDTT,pH7.425°C),超声破碎,取超声破碎菌
    的上清液过柱。用100mlColumn缓冲液清洗柱子,再用30mlDTT缓冲液,30mM(Tris-HCl
    20Mm,NaCl500Mm,EDTApH8.00.1mM)清洗一遍。关闭出样口,4℃切割过夜。用30ml再次
    用缓冲液清洗(20mMTris-HClpH8.4、150mMNaCl、2.5mMCaCl2),并收集目的蛋白。将收
    集的目的蛋白通过色谱进一步分离,得到纯度大于98%的重组蛋白。

    实施例2人源化抗IL-22抗体的筛选

    1、噬菌体抗体库筛选阳性抗体

    噬菌体表面展示技术是近年建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术。它
    以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽
    或蛋白质表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬
    菌体。它实现了基因型和表型的转换,提供了高效率的筛选系统,因而将会在众多基础和应
    用研究领域产生深远的影响。由于该技术具有生产人源化抗体的潜力,因此,吸引了许多学
    者投入这一研究中,使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展,并由此开创了一条简便、快速的
    基因工程抗体生产路线。

    用IL-22抗原溶液100μl(100mg/ul)包被96孔酶标板,4℃孵育过夜。第二天去除包
    被液,加入BSA(0.5%)封闭,室温1-2小时。用洗板机洗板10次。每孔加入2X1011pfu噬菌体
    (100μl),室温孵育1-2小时。用TBST清洗板子10次,加入0.2MGlycine-HCl缓冲液洗脱15-
    20分钟(pH2.0),加入1mMTris-HCl缓冲液20μl(pH9.0)。将以上第1轮筛选物进一步
    扩增纯化,再进行3-5次筛?。ㄊ删辶烤?X1011pfu),抗原量依次为10μg/ml、1μg/ml。

    2、人源抗IL-22Fab抗体的ELISA检测:

    通过抗人Fab抗体(Sigma公司,1﹕2000稀释)检测Fab的表达。具体如下:酶标板包被抗
    人Fab抗体,4℃过夜。加入BSA(0.5%)封闭,室温孵育1-2小时。加入表达的Fab抗体,37℃孵
    育1小时。洗板6次,加入酶标抗人Fab二抗,37℃孵育1小时。显色液显色,H2SO4终止反应,酶
    标仪检测吸光度值。

    3、人源Fab抗体可变区基因测序:

    制备质粒DNA(通过QIAGEN质粒提取试剂盒),进行核酸序列测序。测序结果与Internet
    V-Base基因库中IgG基因序列比较。

    实施例3重组抗体的制备

    1、表达重组抗体质粒构建

    将获得的Fab抗体的轻链克隆入pAC-K-Fc载体(catNo.PROGENPR3003),再克隆重链
    Fd段,构建成重组抗体表达载体。

    2、转染及重组病毒滴度测定:

    转染Sf9细胞(PharmagenBaculoGoldco-transfectionkit),具体转染方法详见转
    染说明书。27℃培养4-5天后,收集上清,并进行病毒滴度测定。

    3、重组抗体IgG的分泌表达与纯化:

    应用病毒感染Sf9细胞,27℃孵育2小时,换成SF-900ⅡSFM无血清培养液,27℃继续
    培养5天,收集上清。亲和层析纯化上清(Amersham,Protein-A亲和层析柱)。

    实施例4人源化抗IL-22抗体的特性鉴定

    1、使用人源化IL-22抗体检测重组的人IL-22:

    双抗体夹心酶的研制:将抗IL-22抗体进行稀释(1mg/ml),包被酶标板,4℃孵育过夜。
    同时标记抗IL-22抗体(辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记)。将纯化的人重组IL-22蛋白倍
    比稀释,加入包被后的酶标板,37℃孵育30分钟,洗板6次。加入标记的抗IL-22抗体,37℃孵
    育30分钟。洗板,加入显色剂显色。

    2、使用人源化IL-22抗体进行阻断IL-22与其受体IL-22R1结合实验

    将5份等量的IL-22与IL-22R1重组蛋白加入免疫沉淀缓冲液中(0.5%TritonX-100,
    20MmHepespH7.4,150mMNaCl,12.5mMβ-glycerophosphate,1.5mMMgCl2,10
    mMNaF,2mMdithiothreitol,1mMsodiumorthovanadate,2mMEGTA,20mM
    aprotinin,1mMphenylmethylsulfonylfluoride),再分别加入依次递增量的抗IL-22
    抗体,通过IL-22抗体进行免疫沉淀,检测免疫复合体中的IL-22R1的量是否随加入抗IL-22
    抗体的量而减少。



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    一种 人源化抗 白介素 22 基因工程 抗体 及其 应用
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