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    重庆时时彩几号开买: 一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610045691.6

    申请日:

    2016.01.22

    公开号:

    CN105601750A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 著录事项变更IPC(主分类):C07K 19/00变更事项:申请人变更前:宁波美康生物科技股份有限公司变更后:美康生物科技股份有限公司变更事项:地址变更前:315104 浙江省宁波市鄞州中心区启明南路299号变更后:315104 浙江省宁波市鄞州中心区启明南路299号|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 19/00申请日:20160122|||公开
    IPC分类号: C07K19/00; C12N15/62; C12N15/81; C12N1/19; C07K16/26; C07K16/06; G01N33/68; C12R1/84(2006.01)N 主分类号: C07K19/00
    申请人: 宁波美康生物科技股份有限公司
    发明人: 邹炳德; 邹继华; 李富勇; ??觳?
    地址: 315104 浙江省宁波市鄞州中心区启明南路299号
    优先权:
    专利代理机构: 宁波市鄞州甬致专利代理事务所(普通合伙) 33228 代理人: 沈春红
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610045691.6

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.04.12|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用:该融合蛋白是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒S片段从167至224氨基酸片段的58个氨基酸即LCMVs(167-224)与人C肽的全序列31个氨基酸串联形成的融合蛋白;LCMVs(167-224)在融合蛋白的N端,人C肽的全序列在融合蛋白的C端;LCMVs(167-224)氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列,人C肽的氨基酸序列为SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。该融合蛋白比偶联BSA或KLH刺激小鼠的免疫反应能力更强,免疫小鼠获得的抗血清对于C肽效价更高,更容易制备出高亲和力的C肽抗体用于免疫学检测,在抗体制备和免疫学检测等领域将有良好的应用前景。

    权利要求书

    1.一种基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:该融合蛋白是淋巴细胞性脉络丛脑
    膜炎病毒S片段从167至224氨基酸片段的58个氨基酸即LCMVs(167-224)与人C肽的
    全序列31个氨基酸串联形成的融合蛋白——LCMVs(167-224)-C肽;LCMVs(167-224)
    在融合蛋白的N端,人C肽的全序列在融合蛋白的C端;LCMVs(167-224)氨基酸序列
    为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列,人C肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的氨
    基酸序列。
    2.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:所述基因重组人
    C肽融合蛋白中的LCMVs(167-224)和人C肽两个片段之间由2-10氨基酸连接。
    3.根据权利要求2所述的基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:所述的氨基酸从
    N端至C端依次为天冬氨酸、甘氨酸和精氨酸。
    4.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:所述的基因重组
    人C肽融合蛋白的两端加入标签。
    5.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:所述的基因重组
    人C肽融合蛋白的N端加入6个组氨酸。
    6.根据权利要求1所述的基因重组人C肽融合蛋白,其特征在于:该融合蛋白的蛋
    白序列为SEQIDNO:3所示;编码该融合蛋白的基因序列为SEQIDNO:4所示。
    7.一种LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K表达载体。
    8.一种宿主细胞,它包含具体的表达载体为:LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K/GS115。
    9.一种基因重组人C肽融合蛋白的制备方法,其特征在于:步骤包括:
    (1)利用毕赤酵母密码子偏好表或专业的密码子优化网站分别对LCMVs(167-224)
    和人C肽蛋白基因优化为毕赤酵母偏好序列;
    (2)交由商业公司合成上述优化后的基因;
    (3)利用软件设计扩增LCMVs(167-224)和人C肽基因的上下游引物,并在
    LCMVs(167-224)基因上游引物和人C肽基因下游引物中加入合适的酶切位点及?;ぜ?br />基,LCMVs(167-224)基因下游引物和人C肽基因上游引物中加入连接氨基酸的基因密
    码和互补序列;
    (4)通过PCR的方法,由一系列的温度控制,使得LCMVs(167-224)和人C肽基
    因得以扩增,之后利用两扩增基因中含有的互补序列,再次PCR得到融合基因
    LCMVs(167-224)-C肽;
    (5)使用常规的酶切、连接方式克隆LCMVs(167-224)-C肽至一个毕赤酵母表达载
    体;
    (6)含有LCMVs(167-224)-C肽的毕赤酵母表达载体经过酶切线性化、乙醇沉淀后,
    转化入毕赤酵母工程菌;
    (7)使用常规的毕赤酵母培养基培养工程菌,低浓度的乙醇诱导目的蛋白表达,
    后分离出上清,用C肽免疫比浊试剂盒检测筛选得到表达较高的菌落;
    (8)使用合适的条件保存该菌种,取该菌种放大培养,诱导表达LCMVs(167-224)-C
    肽融合蛋白;
    (9)通过层析的方法从该酵母的发酵液中纯化获得LCMVs(167-224)-C肽融合蛋
    白。
    10.一种基因重组人C肽融合蛋白在C肽的抗原或抗体的检测或用于免疫动物来获
    得C肽抗体中的应用。

    说明书

    一种基因重组人C肽融合蛋白及其制备方法与应用

    技术领域

    本发明涉及一种基因重组人C肽融合蛋白(C肽融合蛋白),具体为一种基因重组人C肽融合蛋白即LCMVs(167-224)-C肽及其制备方法与应用,属于基因工程技术、抗体制备、免疫检测等领域。

    背景技术

    C肽(人C肽)是指胰岛素原(由86个氨基酸组成,分子量9000道尔顿,它的结构是由胰岛素及连接肽两部分组成,连接肽有35个氨基酸组成)随细胞浆中的微泡进入高尔基体,它在胰岛素原转化酶作用于分解时,与胰岛素的AB两链相接的CA1赖氨酸、CA2精氨酸、Bc1精氨酸及Bc2精氨酸等四个氨基酸分离形成的31个氨基酸的多肽。

    正常人24h尿中排出C肽为36±4μg。幼年型糖尿病者为1.1±0.5μg;成年型糖尿病者为24±7μg。C肽清除率与肌酐清除率无明显关系。C肽的清除滤较胰岛素微高。C肽为5.1±0.6mL/min,后者为1.1±0.2mL/min。每日C肽排出量相当于胰岛分泌量的5%,占胰岛素总量的0.1%,因此C肽的测定可应用于临床。C肽具有如下特点:(1)在胰岛的β细胞的分泌中,胰岛素与C肽总分子量相等。(2)胰岛素半衰期为4.8min,而C肽为11min,胰岛素原为17.5min。(3)胰岛素在肝肾内分解而C肽不被分解是完整链从肾脏排出。(4)C肽无生物学活性,但具有很强的种属特异性,与抗胰岛素无交叉免疫反应。由于胰岛素原的浓度还不到C肽的十分之一,故一般检测C肽(总C肽)可代表血中的游离C肽。

    C肽测定具有重要的临床意义:(1)可反映机体胰岛β细胞的分泌功能;(2)C肽测定对糖尿病患者的分型和低血糖症的鉴别有指导意义;(3)测定C肽浓度可作为鉴定胰脏手术后的疗效和残存β细胞分泌功能的一项定量指标,以确定是否给与胰岛素。在随访中多次测定C肽浓度,也有利于判定肿瘤有无复发或转移。

    直接免疫C肽无法获得抗C肽特异性抗体,加入一般的载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)同样很难免疫得到高亲和力的特异性抗体。对于一些特殊的半抗原,选择合适的载体蛋白成为了制备其优良抗体的关键。

    LCMV(淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)能感染人和许多种动物,使其患淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LymphocyticChoriomeningitis,LCM)。LCM为人畜共患病,小鼠、豚鼠、仓鼠、犬、猴、鸡、兔和棉鼠均易感。LCMV病毒是非溶细胞性病毒,在动物体内增殖并不对机体产生损害,而是动物本身对病毒的免疫反应,导致对机体的损害而表现出临床症状。急性感染的小鼠由于不同的组织和病毒数量而产生不同程度的免疫反应,反应强烈的可引起动物死亡。该病毒能在体内引起强烈反应的主要片段是LCMVs。

    通过选择优势抗原片段中的抗原表位区域所编码的基因序列,截取LCMVs中优势抗原区域作为C肽的载体,通过基因工程和层析技术,获得优良的完全抗原。C肽作为半抗原,只有抗原性,没有免疫原性,很难引起动物的免疫反应,与LCMVs优势抗原区域偶联后,获得的完全抗原能够免疫动物产生高效价的抗体,是制备C肽抗体的必要条件。

    发明内容

    本发明针对现有技术的上述不足,提供一种基因重组人C肽融合蛋白,即LCMVs(167-224)-C肽,其是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒S片段从167至224氨基酸片段的58个氨基酸(LCMVs(167-224))与人C肽的全序列31个氨基酸串联形成的融合蛋白;LCMVs(167-224)在融合蛋白的N端,人C肽的全序列在融合蛋白的C端,LCMVs(167-224)氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列:TIQYNLTFSDRQSAQSQCRTFRGRVLDMFRTAFGGKYMRSGWGWTGSDGKTTWCSQTS;人C肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列:EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ。

    本发明所述基因重组人C肽融合蛋白即LCMVs(167-224)-C肽,其中LCMVs(167-224)和C肽两个片段之间可由2-10氨基酸连接,所述的氨基酸优选为天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和精氨酸(Arg);进一步优选,从N端至C端依次为天冬氨酸、甘氨酸和精氨酸。

    本发明所述的融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽的两端可加入一些标签,优选为N端加入6个组氨酸(His)。

    本发明上述的基因重组人C肽融合蛋白优选的蛋白序列(氨基酸序列)如

    SEQIDNO:3所示:

    HHHHHHTIQYNLTFSDRQSAQSQCRTFRGRVLDMFRTAFGGKYMRSGWGWTGSDGKTTWCSQTSDGREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ

    本发明上述的基因重组人C肽融合蛋白编码该融合蛋白的基因序列(核苷酸序

    列)为SEQIDNO:4所示:

    CACCATCACCACCATACTATCCAATACAACTTGACTTTCTCTGACAGACAATCTGCTCAATCTCAATGTAGAACTTTCAGAGGTAGAGTTTTGGACATGTTCCGTACTGCGTTCGGTGGTAAGTACATGAGATCTGGTTGGGGTTGGACTGGTTCTGACGGTAAGACTACTTGGTGTTCTCAAACTTCTGACGGCCGTGAAGCTGAAGACTTGCAAGTTGGTCAAGTTGAATTGGGTGGTGGTCCAGGCGCGGGTAGCTTGCAACCATTGGCGTTGGAAGGTTCTTTGCAA。

    本发明所述的融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽可由重组表达、化学合成、蛋白偶联等方法制备。

    本发明还提供至少一种上述的融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽的制备,例如,具体的LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白制备步骤概括描述如下:通过计算机分析LCMV全部蛋白序列,筛选出LCMVs蛋白内的强抗原表位,即从第167位氨基酸至224位氨基酸,LCMVs(167-224)氨基酸序列如下:

    TIQYNLTFSDRQSAQSQCRTFRGRVLDMFRTAFGGKYMRSGWGWTGSDGKTTWCSQTS;设计连接融合蛋白片段和加入的标签以及其表达的方法;利用基因工程的技术表达以及层析技术纯化该融合蛋白,简要步骤包括:

    (1)利用毕赤酵母密码子偏好表或专业的密码子优化网站(如//www.cbs.dtu.dk/services/)分别对LCMVs(167-224)和人C肽蛋白基因优化为毕赤酵母偏好序列;

    (2)交由商业公司合成上述优化后的基因,一般交付形式为连接在一个克隆载体中如PUC57;

    (3)利用软件如primerpremier5.0设计扩增LCMVs(167-224)和人C肽基因的上下游引物,并在LCMVs(167-224)基因上游引物和人C肽基因下游引物中加入合适的酶切位点及?;ぜ罨?,LCMVs(167-224)基因下游引物和人C肽基因上游引物中加入连接氨基酸的基因密码和互补序列。

    (4)通过PCR(聚合酶链式反应)的方法,由一系列的温度控制,使得LCMVs(167-224)和人C肽基因得以扩增,之后利用两扩增基因中含有的互补序列,再次PCR得到融合基因LCMVs(167-224)-C肽;

    (5)使用常规的酶切、连接方式克隆LCMVs(167-224)-C肽至一个毕赤酵母表达载体;

    (6)含有LCMVs(167-224)-C肽的毕赤酵母表达载体经过酶切线性化、乙醇沉淀后,转化入毕赤酵母工程菌;

    (7)使用常规的毕赤酵母培养基培养工程菌,低浓度的乙醇诱导目的蛋白表达,后分离出上清,用C肽免疫比浊试剂盒检测筛选得到表达较高的菌落;

    (8)使用合适的条件保存该菌种,取该菌种放大培养,诱导表达LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白;

    (9)通过层析的方法从该酵母的发酵液中纯化获得LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白。

    上述步骤(1)至(9)仅描述了一种具体的该融合蛋白的制备方法,不能理解为限制本发明的范围。有一点对于本领域技术人员来说是明显的,即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。

    本发明通过层析的方法纯化获得LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白,可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察纯化的效果。

    本发明所述的融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽的优良特性及其应用主要表现在可以用于免疫动物来获得C肽抗体;也可以用于C肽的抗原或抗体的检测。

    其中,简述免疫小鼠制备C肽抗体。第一次采用皮下免疫,后面的加强免疫采用腹腔免疫、腘内免疫、皮下免疫或者脾内直接免疫。首次免疫和加强免疫结束后,在融合前三天一般还要进行一次冲击免疫,以增加脾脏内浆细胞的数量。常见的免疫途径和周期:


    途径 佐剂 剂量 免疫间隔时间
    首次免疫 皮下 弗氏完全佐剂 20-80μg 0 第一次加强免疫 皮下或腹腔 弗氏不完全佐剂 30-50μg 3-4周 第一次加强免疫 皮下或腹腔 弗氏不完全佐剂 30-50μg 2-3周 第一次加强免疫 皮下或腹腔 弗氏不完全佐剂 30-50μg 2-3周 第一次加强免疫 皮下或腹腔 弗氏不完全佐剂 30-50μg 2-3周 冲击免疫 皮下或腘内 30-50μg 2-3周

    本发明所述的较强的免疫反应,是通过检测抗血清效价来评定的,血清效价高就是本发明所述融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽具有更好的刺激免疫反应和容易制备抗体的最好验证。关于抗血清效价的检测,通常采用酶联免疫吸附实验(ELISA),测效价一般采用间接ELISA,简要步骤为:

    (1)在96孔酶标板中包被待测抗血清的对应抗原;

    (2)洗涤酶标板,加入封闭液,封闭酶标板中未结合抗原的位置;

    (3)洗涤酶标板,加入梯度稀释的抗血清,与包被抗原相互作用的抗体结合上去;

    (4)洗涤酶标板,铺上抗血清动物相应的酶标二抗;

    (5)洗涤酶标板,加入显色液,后加入终止液,然后酶标仪读数;

    (6)制作效价曲线,比对效价。

    利用上述步骤(1)至(6)得到的融合蛋白,可以用于免疫动物来获得C肽抗体;也可以用于C肽的抗原或抗体的检测。

    本发明还提供了一种载体,它含有上面所述核苷酸序列,一个具体的表达载体为:LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K表达载体。

    本发明还提供了一种宿主细胞,它包含上述载体具体的表达载体为:LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K/GS115。

    在本发明中的术语及相关方法:术语“蛋白”、“融合蛋白”、“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链,无论是否经过翻译后修饰(例如,糖基化或磷酸化)。术语“LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白”,是相对于单纯的LCMVs(167-224)和单纯的C肽而言,此处指两种不同的蛋白序列按一定方式拼接形成一个具有特殊功能的蛋白。

    本发明另一方面提供了核酸序列,它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。

    本发明的最终的核酸序列通??梢杂肞CR扩增法、基因重组或人工合成中的一种或几种方法获得。之后再将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

    本发明的融合蛋白用基因重组方法来制备,具体地说,将编码LCMVs(167-224)与C肽基因分别通过PCR的方式扩增出来,并且在LCMVs(167-224)基因的3′端引入连接氨基酸基因和C肽基因的5′端序列,在C肽基因的5′端引入连接氨基酸基因和LCMVs(167-224)基因的3′端序列,分别扩增得到的两段基因之间就有一段互补区,最后将两段基因一起PCR,获得最后的LCMVs(167-224)-C肽重组融合基因;然后,上述重组基因克隆到表达载体质粒中,选用的表达载体包括各种含有启动子,调控基因,筛选基因和克隆位点等元件的质粒,例如选用pPIC9K(Invitrogen)质粒,该质??梢栽谑谐∩匣竦?;然后,将上述表达质粒转化到重组工程细胞宿主内,从而获得表达本发明融合蛋白的重组工程细胞。这些重组工程细胞可以是来源于动物细胞,植物细胞,昆虫细胞,真菌,酵母和细菌等。质粒pPIC9K适合转化入酵母工程菌中表达融合蛋白,因此优选的重组工程细胞宿主为酵母工程菌,例如采用毕赤酵母工程菌GS115。

    本文所用的术语“转化”是指用基因工程领域技术人员熟知的方法:将含有目的基因的表达载体导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异,通常包括:电转化;采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染;微粒轰击;脂质体转染;感染等。本发明中较佳的方法是电转化方法;随后,在适宜培养条件下繁殖宿主细胞。

    本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基配方、培养温度、诱导物、诱导剂量和时间等条件。采用本领域常规检测手段,如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),酶联免疫吸附实验(ELISA)等,可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后,可用常规的蛋白分离纯化技术,进行融合蛋白的纯化,其包括离心,过滤,层析等手段。具体地,层析方法又包括亲和层析,凝胶过滤,离子交换色谱以及疏水层析等。本发明提供的该融合蛋白的分离纯化方法包括上述方法中的一种或几种。

    本发明也提供了一种鉴定LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白免疫效果的方法。具体而言,是间接ELISA,即在酶标板中包被OVA-C肽(鸡卵清白蛋白与基因重组人C肽融合蛋白),之后用脱脂奶粉封闭,然后吸附用LCMVs(167-224)-C肽融合蛋白免疫得到的动物血清,吸附相应的动物的酶标二抗,再加入显色液显色,终止显色后可以用酶标仪读取血清的效价数据。

    本发明的有益效果:本发明提供了一种融合蛋白及其制备方法,该工艺包括提供一种工程菌,该工程菌包含一种表达载体,在适合蛋白表达的条件下由工程菌产生并经分离获得融合蛋白,该融合蛋白能增强C肽在动物体内的免疫效果,而且该融合蛋白免疫获得的小鼠抗血清,比BSA-C肽,KLH-C肽免疫获得的小鼠抗血清与交叉抗原反应的能力更强,说明融合蛋白免疫小鼠获得的抗血清对于C肽效价更高,刺激小鼠的免疫反应能力更强,更容易制备出高亲和力的C肽抗体用于免疫学检测,在抗体制备和免疫学检测等领域将有良好的应用前景。

    附图说明

    图1LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒构建。

    图2SDS-PAGE电泳结果图。

    图3免疫小鼠血清效价检测图。

    具体实施方式

    下面通过实施例进一步详细描述本发明,但本发明不仅仅局限于以下实施例。

    实施例

    将设计好的两段基因序列,优化酵母密码子偏好,优化结果为:

    LCMVs(167-224)基因(SEQIDNO:5):

    ACTATCCAATACAACTTGACTTTCTCTGACAGACAATCTGCTCAATCTCAATGTAGAACTTTCAGAGGTAGAGTTTTGGACATGTTCCGTACTGCGTTCGGTGGTAAGTACATGAGATCTGGTTGGGGTTGGACTGGTTCTGACGGTAAGACTACTTGGTGTTCTCAAACTTCT

    C肽基因SEQIDNO:6:

    GAAGCTGAAGACTTGCAAGTTGGTCAAGTTGAATTGGGTGGTGGTCCAGGCGCGGGTAGCTTGCAACCATTGGCGTTGGAAGGTTCTTTGCAA

    交由苏州金唯智生物科技有限公司用常规人工方法合成上述两段基因。合成的基因由质粒的形式交付,分别为:LCMVs(167-224)-PUC57和C肽-PUC57。

    设计引物L1和L2,由商业公司合成,其序列如下SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。

    L1SEQIDNO:7:5′TACGTACACCATCACCACCATCATACTATCCAATAC3′

    L2SEQIDNO:8:5′AGAAGTTTGAG3′

    L1中(TACGTA)为SnaBⅠ酶切位点;(CACCATCACCACCAT)为6个组氨酸标签。L2中为使能和C肽基因搭桥拼接的C肽基因的5′端序列;为连接氨基酸天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸编码基因。

    设计引物C1和C2,由商业公司合成,其序列如下SEQIDNO:9和SEQIDNO:10示。

    C1SEQIDNO:9:5′GACGGCCGTGAAGCTGAAGACTTGC3′

    C2SEQIDNO:10:5′CCTAGGTTGCAAAGAACCTTC3′

    C1中(GACGGCCGT)为接氨基酸天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸编码基因;C2中(CCTAGG)为AvrⅡ酶切位点。

    分别扩增LCMVs(167-224)和C肽基因:

    以LCMVs(167-224)-PUC57为模板,分别用相应引物L1和L2以扩增条件为:95℃

    3min预变性,之后95℃30s、61℃40s、72℃30s,35个循环扩增,最后72℃8min完全延伸,即扩增出LCMVs(167-224)基因。以C肽-PUC57为模板,分别用相应引物C1和C2,以扩增条件为:95℃3min预变性,之后95℃30s、62℃40s、72℃30s,35个循环扩增,最后72℃8min完全延伸,即扩增出C肽基因。

    扩增LCMVs(167-224)基因配制体系为:

    扩增C肽基因配制体系为:

    分别回收扩增LCMVs(167-224)和C肽基因:

    扩增LCMVs(167-224)基因和扩增C肽基因结束后,各加入11μL10×LoadingBuffer混合后分别经1%琼脂糖凝电泳切胶回收,使用胶回收试剂盒纯化扩增的基因片段。

    扩增LCMVs(167-224)-C肽融合基因:

    以纯化后的LCMVs(167-224)基因和C肽基因为模板,分别用相应引物L1和C2以扩增条件为:95℃5min预变性,之后95℃30s、60℃40s、72℃1min,35个循环扩增,最后72℃8min完全延伸,即扩增出LCMVs(167-224)-C肽融合基因。

    扩增LCMVs(167-224)-C肽融合基因配制体系为:

    回收LCMVs(167-224)-C肽融合基因:

    扩增LCMVs(167-224)-C肽融合基因结束后,加入22μL10×LoadingBuffer后别经0.8%琼脂糖凝电泳切胶回收,使用胶回收试剂盒纯化扩增的基因片段。

    酶切LCMVs(167-224)-C肽融合基因

    将纯化回收得到的LCMVs(167-224)-C肽融合基因用SnaBⅠ和AvrⅡ酶切,37℃水浴条件下酶切3h,使LCMVs(167-224)-C肽融合基因两端有特异性的连接位点。

    SnaBⅠ和AvrⅡ酶切LCMVs(167-224)-C肽融合基因的体系为:

    提取pPIC9K质粒:

    取pPIC9K质粒10ng,加入外购100μL装的TOP10感受态中,冰浴30min,42℃水浴90s后加入新鲜的LB培养基(每升纯水中称取酵母粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g,高压灭菌30min)700μL,放入37℃恒温摇床,220转/min,复苏30min。取复苏后的培养基50μL,均匀涂布于氨苄抗体的LA固体培养板(每升纯水中称取酵母粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂粉15g,高压灭菌后倒入平板中凝固)中,在37℃恒温箱中孵育12h。挑取培养板中的单克隆菌落,接种于氨苄抗性的LB培养基中,在37℃恒温摇床,220转/min,培养12h。取培养后的pPIC9K/TOP10菌液,用质粒小提试剂盒,提取pPIC9K质粒。

    将提取的pPIC9K质粒用SnaBⅠ和AvrⅡ酶切,37℃水浴条件下酶切3h,使pPIC9K质粒多克隆位点中有特异性的连接末端。

    SnaBⅠ和AvrⅡ酶切pPIC9K质粒的体系为:

    将SnaBⅠ和AvrⅡ酶切LCMVs(167-224)-C肽融合基因和pPIC9K质粒,均加入11μL10×LoadingBuffer后别经0.8%琼脂糖凝电泳切胶回收,使用胶回收试剂盒纯化扩增的基因片段。

    回收后获得的带有特异的连接末端的LCMVs(167-224)-C肽融合基因和pPIC9K质粒,在连接酶的作用下,16℃气浴连接16h,即将LCMVs(167-224)-C肽融合基因和pPIC9K质粒组合成LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒。

    连接LCMVs(167-224)-C肽融合基因和pPIC9K质粒的体系为:

    取连接后的整个10μL体系,加入外购100μL装的TOP10感受态中,冰浴30min,42℃水浴90s后加入新鲜的LB培养基700μL,放入37℃恒温摇床,220转/min,复苏60min。取复苏后的菌液,常温500×g离心5min,弃去上清,加入200μLLB培养基重悬,将其均匀涂布于氨苄抗体的LA固体培养板中,在37℃恒温箱中孵育12h。挑取培养板中的单克隆菌落,接种于氨苄抗性的LB培养基中,在37℃恒温摇床,220转/min,培养12h。取培养后的LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K/TOP10菌液,用质粒小提试剂盒,提取LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒,构建的设计见图1。

    LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒的线性化:

    将提取的LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒用SacⅠ酶切,37℃水浴条件下酶切3h,使该质粒成线性。

    SacⅠ酶切LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒的体系为:

    SacⅠ酶切后的LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒使用PCR清洁回收试剂盒回收该线性载体。

    乙醇沉淀线性LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒:在线性LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒中加入1/10体积pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液,后加入2.5倍体积的100%冷乙醇,-20℃冷冻至少4h。取出立即在4℃,20000×g条件下离心15min,小心弃去上清,添加200μL70%冷乙醇,在4℃,20000×g条件下离心10min,小心弃去上清,室温放置10min后,加入20μL双蒸水溶解。

    转化载体进入毕赤酵母GS115:将电转仪开启,调节至酵母转化的模式,预热待用。在100μLGS115感受态中加入1μg乙醇沉淀后的线性LCMVs(167-224)-C肽-pPIC9K质粒,混匀后冰浴5min。取出冰浴的1mm电转杯,小心加入感受态,不要产生气泡,电转杯放入电转仪中电击,之后迅速取出,加入900μl1mol/L的山梨醇,混匀后即可涂布在氨苄抗性的MD平板(每升纯水中加入13.4g酵母基本氮源,0.4mg生物素,20g葡萄糖,15g琼脂粉,高压灭菌后倒入平板中凝固)中,将平板置于28℃恒温箱中孵育3天。

    筛选高表达的酵母克?。喝〕銎桨?,挑取40个饱满圆润的单菌落,分别接种于5mLBMGY培养基(每升纯水中加入13.4g酵母基本氮源,10g酵母粉,20g蛋白胨,甘油10mL,0.1mol/LpH7.2磷酸缓冲液)中,于28℃恒温摇床中,220转/min培养1天,之后往各个菌液中加入25μL的甲醇诱导,每隔24h加一次,待诱导了72h后,分别取出各管菌液,500×g离心5min,上清用C肽免疫比浊试剂盒检测培养上清液中融合蛋白的浓度,选择表达最高的克隆(10.2mg/L)保种,并用此菌种放大培养。

    融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽的纯化:取放大培养的菌液2L,500×g离心30min。上清上样至20mmol/L磷酸盐+0.15mol/L氯化钠+25mmol/L咪唑(pH7.4)平衡的Ni-NTA柱子中,后20mmol/L磷酸盐+0.15mol/L氯化钠+25mmol/L咪唑(pH7.4)平衡柱子,待紫外检测平稳后,用20mmol/L磷酸盐+0.15mol/L氯化钠+500mmol/L咪唑(pH7.4)洗脱目的蛋白,收集洗脱峰,全程线性流速控制在75cm/h以下。

    洗脱得到的样品透析至20mmol/L磷酸盐+0.15mol/L氯化钠(pH7.4)中,离心后获得上清7.2mL,用0.22μm滤膜过滤除菌。取出5μL,加入1.5μL5×蛋白电泳上样缓冲液,行SDS-PAGE,电泳结果见图2;取出适量用C肽免疫比浊试剂盒检测其浓度为1.87mg/mL。

    融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽免疫小鼠:用20mmol/L磷酸盐+0.15mol/L氯化钠(pH7.4)将融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽稀释至1mg/mL,与等体积的弗氏完全佐剂混合后充分乳化,腹部,背部多点皮内免疫5只小鼠,每只200μL;3周之后取1mg/mL融合蛋白LCMVs(167-224)-C肽与等体积的弗氏不完全佐剂混合充分乳化,同样方式免疫小鼠,之后每两周用弗氏不完全佐剂混合融合蛋白同样方案免疫小鼠,五次免疫后取小鼠血清测效价,此实验用BSA-C肽和KLH-C肽同样各免疫3只做对比,一只不免疫的小鼠做对照。

    小鼠血清效价检测:配制包被缓冲液(称取Na2CO31.59g,NaHCO32.93g用纯水定容至1L)、清洗缓冲液(称取NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KH2PO40.2g,Tween-200.5mL用纯水定容至1L)、封闭液(称取NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KH2PO40.2g,脱脂奶粉50g用纯水定容至1L)。

    用包被缓冲液稀释OVA-C肽至1mg/L,每孔100μL铺入96孔酶标板中,37℃恒温孵育1h;弃去样品,用清洗缓冲液每孔200μL清洗3遍,拍干孔内液体,每孔加入200μL封闭液,37℃恒温孵育1h;弃去封闭液,用清洗缓冲液每孔200μL清洗3遍,加入100μL用封闭液梯度稀释的各只小鼠的血清,血清稀释倍数依次为:A行-1000,B行-2000,C行-4000,D行-8000,E行-16000,F行-32000,G行-64000,H行-128000倍,各只小鼠血清上样顺序为:第1-5列加入LCMVs(167-224)-C肽免疫的5只小鼠血清,第6-8列加入BSA-C肽免疫的3只小鼠血清,第9-11列加入KLH-C肽免疫的3只小鼠血清,第12列做空白对照,加好血清后在37℃恒温孵育1h;弃去孔内液体,用清洗缓冲液每孔200μL清洗3遍,拍干孔内液体,每孔加入100μL用封闭液2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗,37℃恒温孵育1h;弃去孔内液体,用清洗缓冲液每孔200μL清洗3遍,拍干孔内液体,每孔加入100μLTMB显色液,室温避光孵育5min;每孔加入100μL2mol/L的H2SO4终止显色;在酶标仪450nm波长读取每孔的吸光度,结果示表1;以稀释梯度为横轴,A450nm为纵轴绘制图3。

    图3是根据ELISA方法检测的抗血清效价曲线图。ELISA方法测效价是基于抗原抗体的相互作用原理,抗原抗体的相互作用越强,最后读数得到的数值越高,某孔读数达到某目标值(样品吸光值/阴性吸光值>2.1,此时该样品孔对应的稀释梯度被称为效价)梯度稀释越大。该图表反应出一个效价比较的整体趋势,更加直观。读数原始数据:

    表1

    阴性吸光值均值为0.0767,其2.1倍是0.16107,上表中黑色加粗标记即为该列大于0.16107最大稀释梯度孔读值,所以从上表可以判断,该融合蛋白免疫获得的抗血清效价约为1:32000,BSA-C肽免疫获得的抗血清效价约为1:8000,KLH-C肽免疫获得的抗血清效价约为1:16000。




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