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    网重庆时时彩走势图: 一种重组蛋白VO及其制备方法和应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610068623.1

    申请日:

    2016.02.01

    公开号:

    CN105601751A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C07K 19/00申请日:20160201|||公开
    IPC分类号: C07K19/00; C12N15/63; G01N33/68; G01N33/569; A61K39/108; A61P31/04 主分类号: C07K19/00
    申请人: 中国人民解放军第三军医大学
    发明人: 顾江; 魏超; 顾浩; 赵莉群; 杨峰; 高晨; 敬海明; 邹全明
    地址: 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号
    优先权:
    专利代理机构: 重庆志合专利事务所 50210 代理人: 胡荣珲
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610068623.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种重组蛋白Vo,所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成;所述重组蛋白Vo具有以下通式:loop1-(linker?a)n1-loop2-(linker?b)n2-loop3-(linker?b)n3-loop4-(linker?a)n4-loop1-(linker?a)n5-loop2-(linker?b)n6-loop3-(linker?b)n7-loop4。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明的重组蛋白Vo可用于诊断试剂、预防或治疗性药物的制备,具有良好的抗E.coli?K1感染的免疫?;ばЧ?。

    权利要求书

    1.一种重组蛋白Vo,其特征在于,所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌
    K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成;所述重组蛋白Vo
    具有以下通式:
    loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linker
    a)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4;
    其中,所述连接肽linkera选自GlySerGlyGlySer,GlyGlySerGlyGly,
    TyrAlaProValAspVal中的一个,优选为GlySerGlyGlySer;
    所述连接肽linkerb选自GlySerGlyGlySerGly,GlyGlySerGlyGly,
    TyrAlaProValAspVal中的一个,优选为GlySerGlyGlySerGly;
    n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选自1、2、3或4,优选为1;
    优选地,所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO:3;
    优选地,所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO:4。
    优选地,所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO:5;
    优选地,所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO:6。
    2.如权利要求1所述的重组蛋白Vo,其特征在于,所述重组蛋白Vo
    的氨基酸序列为SEQIDNO:2;优选地,编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序
    列为SEQIDNO:1。
    3.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体由骨架质??尚奘蔚亓?br />编码权利要求1~2中任一项所述的重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。
    4.如权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述骨架质粒选自pGex
    系列载体、pET系列载体或pQE系列载体;优选为pGex-6P-2。
    5.一种如权利要求1或2所述的重组蛋白Vo的制备方法,其特征在于,
    所述方法包括:
    1)构建如权利要求3或4所述的表达载体;
    2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌,得到含有表达载体的宿主
    菌;
    3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo;
    4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。
    6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述宿主菌选自大肠杆菌
    XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种,优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。
    7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述宿主菌为大肠杆菌
    XL1-blue菌株。
    8.如权利要求1或2所述的重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治疗
    脑膜炎大肠杆菌K1的药物中的应用。
    9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物为用于诊断脑膜炎
    大肠杆菌K1的试剂盒。
    10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物为用于预防或治
    疗脑膜炎大肠杆菌K1的亚单位疫苗。

    说明书

    一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用

    技术领域

    本发明属于生物技术制药领域,涉及一种重组脑膜炎大肠杆菌K1疫
    苗蛋白Vo,本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。

    背景技术

    细菌性脑膜炎是新生儿的常见感染性疾病,是新生儿死亡及远期致残
    的主要原因。世界卫生组织数据显示,新生儿细菌性脑膜炎发生率位于新
    生儿感染性疾病的前5位,其死亡率高达40%。由于早产儿的增多及其它
    原因,我国新生儿细菌性脑膜炎发病率逐渐上升,其已成为新生儿住院三
    大病因之一。随着抗生素耐药性的泛滥,新生儿细菌性脑膜炎的疗效和预
    后更加不容乐观。资料显示约有1%-40%的新生儿细菌性脑膜炎患者死
    亡,仅30%的患者能够治愈?;颊咧斡笸ǔ3鱿稚窬低澈笠胖?,如脑
    积水、癫痫、智能低下等,为家庭和社会造成严重的负担。

    大肠杆菌K1(E.coliK1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,
    约超过80%病例的由该菌感染所致。外膜蛋白A(outermembraneA,
    OmpA)是E.coliK1的关键致病因子,在E.coliK1引发的新生儿脑膜炎
    中发挥重要作用(KimK.S.2008.NatRevMicrobiol6:625-634.)。研究发
    现,E.coliK1引起新生儿脑膜炎必须通过以下4个病理过程:①E.coliK1
    感染宿主并定植新生儿肠道或泌尿道;②E.coliK1从感染定植部位入血并
    在血液中繁殖,引起新生儿菌血症;③E.coliK1突破新生儿血脑屏障,进
    入中枢神经系统;④E.coliK1在颅内释放促炎因子和毒素,引起白细胞的
    浸润和血脑屏障通透性增加,最终引发新生儿脑膜炎等感染性疾病。在整
    个新生儿脑膜炎的发病过程中,E.coliK1能抵抗血液免疫系统的杀伤并引
    发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染是决定细菌感染的关键因素,而外
    膜蛋白A(outermembraneproteinA,OmpA)在此细菌致病的关键过程中
    都发挥决定性的作用(KrishnanS.,andN.V.Prasadarao.2012.FEBSJ.),
    所以OmpA可以作为脑膜炎大肠杆菌疫苗的重要候选疫苗分子。

    OmpA为I型跨膜蛋白,其全长346个氨基酸,主要由2个domain
    组成,N端1-198氨基酸为典型的beta-barrel的跨膜结构,C端domain为
    肽聚糖结合结构域。重组表达的全长OmpA蛋白因为含有跨膜结构难溶于
    水,不能作为疫苗分子。OmpA的N端结构域是其主要功能结构域,其暴
    露在胞外的loop1,loop2,loop3,loop4是其介导OmpA相关病理生理过
    程的关键结构域。此外,通过AntiJen,Bepipred和Epitome等表位软件预
    测发现OmpA的loop1,loop2,loop3,loop4具有很多的B细胞表位和T
    细胞表位。目前尚没有基于OmpA蛋白制备抗体的报道。

    发明内容

    针对脑膜炎大肠杆菌的严重危害,本发明提供一种脑膜炎大肠杆菌K1
    的重组蛋白Vo,该重组蛋白由脑膜炎大肠杆菌K1OmpA的有效成分构成,其
    可应用于制备脑膜炎大肠杆菌的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。

    为实现上述目的,本发明提供如下的技术方案:

    一种重组蛋白Vo,所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白
    A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成;所述重组蛋白Vo具有以下通式:

    loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linker
    a)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4;

    其中,所述连接肽linkera选自GlySerGlyGlySer,GlyGlySerGlyGly,
    TyrAlaProValAspVal中的一个,优选为GlySerGlyGlySer;

    所述连接肽linkerb选自GlySerGlyGlySerGly,GlyGlySerGlyGly,
    TyrAlaProValAspVal中的一个,优选为GlySerGlyGlySerGly;

    n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选自1、2、3或4,优选为1;

    优选地,所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO:3;

    优选地,所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO:4。

    优选地,所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO:5;

    优选地,所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO:6。

    在根据本发明的一个实施方案中,所述重组蛋白Vo的氨基酸序列为
    SEQIDNO:2;优选地,编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQIDNO:1。

    本发明还提供了一种表达载体,所述表达载体由骨架质??尚奘蔚亓?br />编码上述重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。

    在根据本发明的一个实施方案中,所述骨架质粒选自pGex系列载体、
    pET系列载体或pQE系列载体;优选为pGex-6P-2。

    进一步地,本发明提供了上述重组蛋白Vo的制备方法,所述方法包括:

    1)构建如上所述的表达载体;

    2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌,得到含有表达载体的宿主
    菌;

    3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo;

    4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。

    在根据本发明的一个实施方案中,所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、
    BL21或HMS174菌株中的一种,优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。

    优选地,所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue菌株。

    进一步地,本发明提供了上述重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治
    疗脑膜炎大肠杆菌K1的药物中的应用。

    在根据本发明的一个实施方案中,所述药物为用于诊断脑膜炎大肠杆菌
    K1的试剂盒。

    在根据本发明的一个实施方案中,所述药物为用于预防或治疗脑膜炎大
    肠杆菌K1的亚单位疫苗。

    由于采用了上述技术方案,本发明具有如下的优点:

    1)用于表达重组蛋白Vo的表达质??稍谠吮泶锵低?大肠杆菌中诱
    导表达。

    2)选择pGEX载体系列时,重组蛋白Vo以融合蛋白形式表达;表达载
    体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST),所表达的融合
    蛋白中就含有一个GST标签,此标签就成为蛋白纯化的标记,使得纯化条
    件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入,从而纯化后的蛋白能最大限度保
    持其空间构象和免疫原性;纯化出来的重组蛋白Vo的纯度大于95%。

    3)Vo重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫?;ばЧ?。

    利用本发明的重组蛋白Vo制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射
    途径进行免疫接种,激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实,所
    述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗E.coliK1感染的免疫?;ばЧ?。为
    进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础,同时为防治疫苗和诊
    断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

    附图说明

    图1:重组蛋白Vo的结构组成示意图。A为OmpA分子的结构示意图。
    B为重组蛋白Vo的结构示意图。

    图2为重组质粒pGex-6P-2-Vo的双酶切鉴定结果。其中,泳道1为核
    酸(DNA)分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:4500、3000、2000、
    1200、800、500、200bp;泳道2&3:重组表达质粒pGEX-6p-2-Vo经酶切后
    的鉴定结果,酶切后分离的片段约4000bp和约500bp。

    图3为蛋白Vo诱导鉴定结果;其中,泳道1:蛋白分子量标准(Marker),
    从上到下大小分别为:170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、
    35Kd、25Kd、15Kd;泳道2:结合诱导表达的超声上清的GST填料;泳
    道3:经PP酶酶切后的上清;泳道4:经PP酶酶切后的GST填料。

    图4为纯化后的蛋白VoSDS-PAGE电泳结果;其中,泳道1:蛋白分子
    量标准(Marker),从上到下大小分别为:170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、
    55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd;泳道2:纯化的Vo蛋白。

    具体实施方式

    为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及
    实施例,对本发明进一步详细说明。应当理解,此处说描述的具体实施例仅
    用以解释本发明,并不用于限定本发明。

    实施例1基因的合成和亚克隆

    1.按照图1的设计思路,设计含有Loop1、Loop2、Loop3、Loop4和蛋白
    连接子的重组蛋白Vo,编码Vo的DNA的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上
    海生工生物工程有限公司合成。

    2.重组质粒的转化

    从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞(上海超研生物科技有
    限公司),第一管加入pGEX-6P-2质粒(GEHealthcareLifeSciences),作阳
    性对照;第二管加入1ulVo合成质粒;第三管不加外源DNA,作阴性对照。
    冰浴50min,42℃金属浴中热击90s,迅速冰浴2min。加入600μlLB空白培养
    基,混匀,置于37℃摇床中220rp振摇1h。

    各管以5000rpm室温离心3min.,弃去300μl上清,再重悬菌体,取200μl
    涂布于,Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

    阴性对照平板没有菌落出现;阳性对照平板长满菌落,说明感受态细胞
    制作正确,结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落,接种于Amp抗性
    LB培养基中,37℃振荡培养过夜。

    2.双酶切鉴定

    取37℃摇床培养过夜的阳性质粒,按照说明书的步骤,通过快速质粒小
    提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara
    公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切,37℃水浴半小时。体系如下:


    灌制1.0%琼脂糖凝胶,其中含EB(上??£缮锟萍加邢薰?
    0.5ug/ml,将上述酶切反应体系中各加入1μl6×Loadingbuffer,通过凝胶80V
    电泳20min后,UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切
    成2个片段,大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-2部分,小片段约500bp,
    为插入的编码Vo的片段(图2)。

    实施例2重组融合蛋白Vo在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及
    表达形式的鉴定

    1.Vo诱导表达

    1)取过夜培养的pGEX-6P-2-Vo/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+
    抗性的LB培养基中,180rpm37℃过夜培养,分别取过夜培养的菌液400μL
    加入20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用),
    37℃培养2~3h,转速200rpm,二次活化至OD600为0.8-1.0时,加入IPTG
    4μL,使其终浓度为200μM,再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。

    2)将诱导表达后的菌液取出,以12000rpm离心5min,弃去上清,加
    入1mLlysisbuffer(20mMPB,pH7.2,250mMNacl)混匀,超声裂解3min
    (超声6次30s/次),再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。

    2.处理上清

    取GlutathioneSepharose4B20μl,用PBS洗涤3次后,将准备好的上清
    加入GlutathioneSepharose4B中,室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心
    3min后,使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次,PBS洗涤一次。向结合后的
    GlutathioneSepharose4B加入20μL2×蛋白质上样buffer,煮沸5min,
    14000rpm离心3min。

    3.处理沉淀

    在沉淀中加入500μLPBS重悬菌体,取80μL重悬菌液加入20μL5×蛋白
    质上样buffer,煮沸5min,14000rpm离心3min。

    4.SDS-PAGE电泳

    将5%浓缩胶灌入制胶版中,在加入蒸馏水将胶压平,室温放置30min
    使其凝固,将上层的蒸馏水倒干,再灌入10%分离胶,立即插上梳子,室
    温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样,进行
    SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min,再调至180v,电泳1~2h后,将胶
    取出,置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色,再置于脱色液中振荡脱色后,在
    呈像系统下观察结果,PGEX-6P-2-Vo/XL-1blue在30℃为可溶性蛋白(图3)。

    实施例3Vo抗原的制备

    1.放大培养获取蛋白

    取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-Vo/XL-1blue菌液400μL加入到
    20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化,200rpm37℃培养5~6h后,
    取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次
    活化,37℃培养3~4h至OD600为1.0时,加入80μLIPTG(终浓度为200μM)
    置于16℃摇床中过夜诱导后,12000rpm离心15min收集菌体,再加20mLlysis
    buffer(同实施例2)重悬菌体后,将菌液进行超声裂解3min(200V),收集
    上清与800μL用于结合GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B(GE公司)
    凝胶珠(beads)结合处理;再进行SDS-PAGE凝胶电泳。

    2.使用酶切方法,将目的蛋白和GST标签分开,获取目的蛋白Vo

    向余下约800μL已结合蛋白的GlutathioneSepharose4B中加入800μL
    PBS和120μLPreScissionprotease(PP酶,GE公司),室温垂直旋转酶切
    5h后,离心吸取上清后,分别用800μLPBS洗涤3次,各后取10μL样品变
    性处理后,上样5μL进行蛋白电泳(方法同上),在呈相系统下观察结果,
    酶切下来的Vo蛋白分子量在15-25kDa之间,与预期蛋白分子量大小相符
    合,见图4。

    实施例4大肠杆菌K1感染小鼠模型的构建

    1.大肠杆菌K1菌液的制备

    取冻存的大肠杆菌K1菌株RS218(ATCC700973),采用LB营养琼脂平
    板复苏,37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mLLB液体培养基,37
    ℃需氧180rpm振荡培养15h后,取0.2mL接种于20mLLB液体培养基中,
    37℃需氧230rpm振荡培养6h。6000g离心收集菌体,生理盐水洗涤两次后
    用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD600值,并按照1
    OD=1.0×109CFU/ml将其换算成细菌浓度。

    2.感染剂量的确定

    采用生理盐水将实施例1获得的E.coliK1菌液调节至五种不同浓度,
    将实验动物6~8周德雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每只小鼠通过腹腔注
    射E.coliK1菌液250μL,采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。
    动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况,
    观察周期为7天,观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。

    表1:E.coliK1菌感染剂量的确定


    腹腔注射
    剂量(CFU)
    数量
    浓度(CFU/ml)
    注射剂量(μl)
    1
    E.coli K1
    1.0×108
    10
    4.0×108
    250
    2
    E.coli K1
    0.5×108
    10
    2.0×108
    250
    3
    E.coli K1
    1.0×107
    10
    4.0×107
    250
    4
    E.coli K1
    1.0×106
    10
    4.0×106
    250
    5
    生理盐水
    -
    10
    -
    250

    采用不同浓度的E.coliK1菌株ATCC700973感染BALB/c小鼠时,经过
    7天的观察,结果发现:感染量为1.0×106CFU时小鼠死亡率为0,;感染量
    为1.0×107CFU时小鼠死亡率为20%,感染量为0.5×108CFU时小鼠死亡
    率为80%,感染量达到1.0×108CFU时小鼠死亡率100%。确定小鼠感染的
    优选剂量为0.5×108CFU。

    实施例5动物的免疫

    1)首次免疫,用PBS稀释Vo抗原,加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3;
    用5号半型针头,双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射,每只BALB/C小
    鼠注射量为100μL,并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组;

    2)第二次免疫,第7天进行第二次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白
    抗原量是首次免疫的1/2,免疫途径同上;

    3)第三次免疫,第14天进行第三次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白
    抗原量与第二次免疫相同,免疫途径同上。

    实施例6:抗体的检测

    第三次免疫后第7和14天,采集BALB/C小鼠的血,用ELISA检测小
    鼠免疫后,IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。

    1.制备液体

    1)包被液的配制:称取Na2CO31.6g,NaHCO32.9g,溶于1LddH2O,
    用PH计将pH调至9.6;

    2)封闭液的配制:1g牛血清V,溶于100mL抗体稀释液(1∶100);

    3)抗体稀释液的配制:将磷酸盐溶于1LddH2O,再加入500μLTween
    20,再用PH计将pH调至7.4;

    4)洗涤液的制备:同抗体稀释液

    5)显色液(TMB),为天根公司产品;

    6)终止液(2MH2SO4)的制备:将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH2O
    中。

    2.ELISA检测Vo重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

    1)用包被液将纯化后的Vo重组蛋白稀释为:1ug/mL、5ug/mL、
    10ug/mL;

    2)包被:将重组蛋白稀释液加入酶标板,100μL/孔,4℃过夜后用洗
    涤液洗涤3遍,空干后用保鲜膜包上,置于4℃冰箱中备用;

    3)封闭:酶标板加封闭液200μL/孔,置于37℃孵育箱中2小时,洗
    涤3遍;

    4)将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比
    稀释;

    5)取封闭好的酶标板,依次加入稀释血清,100μL/孔,置于37℃孵育
    箱1h,洗涤3遍,空干;

    6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液,稀释1∶
    5000,制成抗体工作液;

    7)加入稀释抗体工作液,100μL/孔,置于37℃孵育箱40min,洗涤三
    遍,空干;

    8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔,室温避光反应5min;

    9)加入终止液(2MH2SO4),立即置于酶标仪上以450nm波长处测定
    OD值;

    10)结果判断:A样品/A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清
    1∶1000倍稀释)。

    结果:检测Vo蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶16000;免疫后
    第7天的抗体阳性率达到100%,说明本发明构建的Vo重组蛋白能够使免疫
    小鼠体内产生抗体。

    实施例8:Vo重组蛋白动物免疫的攻毒?;て兰?br />

    Vo末次免疫后10~14天,采用与实施例5相同的方法,用生理盐水将
    准备E.coliK1菌液并调节浓度至2.0×108CFU/mL,用腹腔注射菌液250μL,
    采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小
    鼠死亡情况,观察周期为7天,观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处
    死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

    表2Vo重组蛋白免疫小鼠后的攻毒?;ばЧ?br />


    表2显示:阴性对照组和空白对照组的存活率分别为15%和20%,重组
    融合蛋白Vo加Al(OH)3佐剂组的存活率为80%。因此,本发明的Vo重组蛋
    白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生免疫应答,并且能够对E.coliK1
    的感染起到?;ぷ饔?,可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防E.coliK1
    的感染。

    通过以上实施例,本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易
    见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂,例如包被试剂、检测抗
    体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒,例如检测试剂盒,用于诊断是否感
    染E.coliK1菌、确定预后等。

    本领域技术人员可以将本发明Vo重组蛋白用于其他任何适用的用途。

    尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神
    和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化??梢岳斫?,本发明不限于所
    述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。



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    一种 重组 蛋白 VO 及其 制备 方法 应用
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