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    重庆时时彩和值跨度怎么算: 抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制备方法和应用.pdf

    关 键 词:
    抗甲型 流感病毒 核蛋白 重组 抗体 及其 制备 方法 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510975577.9

    申请日:

    2015.12.22

    公开号:

    CN105601744A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 专利申请权的转移IPC(主分类):C07K 16/46登记生效日:20170109变更事项:申请人变更前权利人:菲鹏生物股份有限公司变更后权利人:菲鹏生物股份有限公司变更事项:地址变更前权利人:518000 广东省深圳市南山区西丽留仙洞中山园路1001号TCL科学园区研发楼D2栋6层变更后权利人:518000 广东省深圳市南山区西丽留仙洞中山园路1001号TCL科学园区研发楼D2栋6层ABCD单元601、602、603、604号房变更事项:申请人变更后权利人:广东菲鹏生物有限公司|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/46申请日:20151222|||公开
    IPC分类号: C07K16/46; C07K16/10; C12N15/85; G01N33/68; G01N33/569 主分类号: C07K16/46
    申请人: 菲鹏生物股份有限公司
    发明人: 杨耿周; 刘莉莉; 魏钟杰; 龚春喜
    地址: 518000 广东省深圳市南山区西丽留仙洞中山园路1001号TCL科学园区研发楼D2栋6层
    优先权:
    专利代理机构: 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 代理人: 生启
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510975577.9

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.02.01|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    专利申请权、专利权的转移|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体,包括重组轻链和重组重链;所述重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区,所述重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性抗体相比,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造,保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此,从临床诊断应用方面来看,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用价值。本发明还公开了上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法和应用。

    权利要求书

    1.一种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体,其特征在于,包括重组轻链和
    重组重链;
    所述重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人
    IgG2的轻链恒定区,所述重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重
    链可变区与人IgG2的重链恒定区。
    2.如权利要求1所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体,其特征在于,
    所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的序列如SEQIDNO.1所
    示,所述人IgG2的轻链恒定区的序列如SEQIDNO.2所示。
    3.如权利要求1所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体,其特征在于,
    所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的序列如SEQIDNO.3所
    示,所述人IgG2的重链恒定区的序列如SEQIDNO.4所示。
    4.一种如权利要求1~3中任一项所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体
    的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
    将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段插入到含有
    人IgG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第一表达载体;
    将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段插入到含有
    人IgG2的重链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第二表达载体;
    将所述第一表达载体和所述第二表达载体转染到同一宿主细胞中;以及
    诱导所述宿主细胞表达并回收得到所述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体。
    5.如权利要求4所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,其
    特征在于,所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段的
    序列如SEQIDNO.5所示,所述人IgG2的轻链恒定区的表达基因的序列如SEQ
    IDNO.6所示。
    6.如权利要求4所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,其
    特征在于,所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段的
    序列如SEQIDNO.7所示,所述人IgG2的重链恒定区的表达基因的序列如SEQ
    IDNO.8所示。
    7.如权利要求4所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,其
    特征在于,所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段通
    过如下步骤制得:
    从保藏号为CCTCCC2015227的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒
    进行RT-PCR,得到的RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上游引物
    mKF和下游引物mKR为扩增引物进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq
    DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细
    胞中表达;以及
    回收所述DH5α感受态细胞表达的产物,以上游引物Ab3-VHF和下游引物
    Ab3-VHR为扩增引物进行PCR,得到所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的
    轻链可变区的表达片段。
    8.如权利要求4所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,其
    特征在于,所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段通
    过如下步骤制得:
    从保藏号为CCTCCC2015227的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒
    进行RT-PCR,得到的RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上游引物
    mHF和下游引物mHR为扩增引物进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq
    DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细
    胞中表达;以及
    回收所述DH5α感受态细胞表达的产物,以上游引物Ab3-VKF和下游引物
    Ab3-VKR为扩增引物进行PCR,得到所述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的
    轻链可变区的表达片段。
    9.如权利要求1所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体在制备甲型流感
    病毒检测试剂或甲型流感病毒检测仪器中的应用。
    10.一种甲型流感病毒的检测试剂盒,其特征在于,包括检测试纸,所述
    检测试纸包括如权利要求1~3中任一项所述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗
    体。

    说明书

    抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制备方法和应用

    技术领域

    本发明涉及免疫检测领域,尤其是涉及一种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制备方法和应用。

    背景技术

    流感病毒属正粘病毒科,系RNA病毒。病毒内部的核心由单链核糖核酸及核蛋白(NP)组成,根据核蛋白的抗原性不同可分为A(甲)、B(乙)、C(丙)三型,每型又可区分为不同亚型。甲型变异较快,每2年~3年可发生一次,乙型变异较慢。当抗原发生较大的变异时,与前次流行株完全不同,是抗原的质变,称为抗原株变,此时产生了新的亚型。由于人群对新的亚型缺乏抗体,因此??梢鸫蟮牧餍?。

    病毒的核蛋白(NP)是保守的结构蛋白,在病毒进化过程中变异率很低。同样,对流感病毒NP的研究也已经证明了其结构的保守性。目前多种RNA病毒(如新城疫病毒,狂犬病毒,水疱性口炎病毒,麻疹病毒等)的核蛋白都已作为抗原用于ELISA诊断试剂盒中??辜仔土鞲胁《竞说鞍椎闹刈榭固蹇捎糜诜治隹乖南肝⒔峁辜凹煅榭乖固逦粗慕峁构叵瞪稣攵愿丛由锘旌衔镏械奶囟ǚ肿拥目固?,可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断和治疗。

    长期以来,鼠源性的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗,但是在检测过程中使用鼠源性的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体也存在一些弊端,特别是在双抗体夹心法的检测试剂中同时使用两个鼠源性单抗的时候,很容易出现假阳,导致这些假阳的原因很多,也很难分析,例如血液样本中有可能存在HAMA效应,而在一些咽拭子或鼻拭子样本中也有可能存在一些能跟鼠抗结合的成分,所以如何能避开两个抗体都是鼠源性的情况,这类问题就能很好的解决,而目前重组抗体工程里面对抗体的人源化改造已经相当成熟,同时人源化改造的抗体还具有可以用于预防和治疗的潜能,因此,对鼠源性抗体进行人源化改造是非常必要的。

    发明内容

    基于此,有必要提供一种人源化改造的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及其制备方法和应用。

    一种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体,包括重组轻链和重组重链;

    所述重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区,所述重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。

    一种上述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,包括如下步骤:

    将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段插入到含有人IgG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第一表达载体;

    将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段插入到含有人IgG2的重链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第二表达载体;

    将所述第一表达载体和所述第二表达载体转染到同一宿主细胞中;以及

    诱导所述宿主细胞表达并回收得到所述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体。

    上述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体在制备甲型流感病毒检测试剂或甲型流感病毒检测仪器中的应用。

    一种甲型流感病毒的检测试剂盒,包括检测试纸,所述检测试纸包括上述的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体。

    这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体包括重组轻链和重组重链,重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区,重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性抗体相比,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造,保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此,从临床诊断应用方面来看,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用价值。

    附图说明

    图1为实施例1中抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法的流程图;

    图2为一实施方式的甲型流感病毒的检测试剂盒的示意图;

    图3为如图2所示的甲型流感病毒的检测试剂盒的检测试纸的正面示意图;

    图4为如图2所示的甲型流感病毒的检测试剂盒的检测试纸的纵截面示意图;

    图5为以杂交瘤细胞FLUA-1A5提取的RNA反转录后得到的cDNA为模板进行PCR得到的产物的琼脂糖凝胶电泳,M为DL2000DNAMarker;

    图6为pFP-IgCK质粒的图谱;

    图7为pFP-IgCH质粒的图谱;

    图8为用VL和VH特异的引物扩增的VL(390bp)和VH(402bp)基因片段,M为DL2000DNAMarker;

    图9为重组抗体用proteinG亲和层析柱纯化时的穿透峰和吸收峰;

    图10为重组抗体纯化后SDS-PAGE分析,a为鼠源抗体,b为重组抗体,M为ProteinMarker。

    具体实施方式

    下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的杂交瘤细胞、抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体及应用作进一步详细的说明。

    一实施方式的抗甲型流感病毒核蛋白(NP蛋白)的重组抗体,包括重组轻链和重组重链。

    重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体(mAb)的轻链可变区(L链V区,VL)与人IgG2的轻链恒定区(L链C区,CL;k链C区,Ck;等)。

    重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区(H链V区,VH)与人IgG2的重链恒定区(H链C区,CH)。

    其中,上述抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体由保藏号为CCTCCC2015227的杂交瘤细胞产生,该杂交瘤细胞于2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国.武汉.武汉大学,分类命名:杂交瘤细胞株FLUA-1A5。

    具体的,抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的序列如SEQIDNO.1所示,人IgG2的轻链恒定区的序列如SEQIDNO.2所示。

    具体的,抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的序列如SEQIDNO.3所示,人IgG2的重链恒定区的序列如SEQIDNO.4所示。

    这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体包括重组轻链和重组重链,重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区,重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性抗体相比,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造,保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此,从临床诊断应用方面来看,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用价值。

    本发明还提供了如图1所示的上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法,包括如下步骤:

    S10、将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段插入到含有人IgG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第一表达载体。

    抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的信号肽(SignalPeptide,SP)序列、框架区(frameworkRegion,FR)序列以及互补决定区(complementarydeterminingregion,CDR)序列(即,高变区序列),并且抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段预留有XbaI和PmlI双酶切位点。

    具体的,抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段的序列如SEQIDNO.5所示,用于表达如SEQIDNO.1所示的抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区。

    抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段可以通过如下步骤制得:从保藏号为CCTCCC2015227的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR(RT-PCR使用的引物序列如SEQIDNo.17所示),得到的RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上游引物mKF和下游引物mKR为扩增引物进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaqDNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;以及回收DH5α感受态细胞表达的产物,以上游引物Ab3-VHF和下游引物Ab3-VHR为扩增引物进行PCR,得到抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段。

    得到抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段经过测序验证后,即可用于后续步骤。

    上游引物mKF的序列如SEQIDNO.9所示,下游引物mKR的序列如SEQIDNO.10所示。

    上游引物Ab3-VHF的序列如SEQIDNO.11所示,下游引物Ab3-VHR的序列如SEQIDNO.12所示。

    含有人IgG2的轻链恒定区的表达基因的表达载体可以为pFP-IgCH、pFP-IgCK或基因工程常用的其他真核表达载体。

    具体的,人IgG2的轻链恒定区的表达基因的序列如SEQIDNO.6所示,用于表达如SEQIDNO.2所示的人IgG2的轻链恒定区。

    S20、将抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段插入到含有人IgG2的重链恒定区的表达基因的表达载体中,得到第二表达载体。

    抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的信号肽(SignalPeptide,SP)序列、框架区(frameworkRegion,FR)序列以及互补决定区(complementarydeterminingregion,CDR)序列(即,高变区序列),并且抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段预留有NheI和HindIII双酶切位点。

    具体的,抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段的序列如SEQIDNO.7所示,用于表达如SEQIDNO.3所示的抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区。

    抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区的表达片段通过如下步骤制得:从保藏号为CCTCCC2015227的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR(RT-PCR使用的引物序列如SEQIDNo.17所示),得到的RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上游引物mHF和下游引物mHR为扩增引物进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaqDNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;回收DH5α感受态细胞表达的产物,以上游引物Ab3-VKF和下游引物Ab3-VKR为扩增引物进行PCR,得到抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段。

    得到的抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区的表达片段经过测序验证后,即可用于后续步骤。

    上游引物mHF的序列如SEQIDNO.13所示,下游引物mHR的序列如SEQIDNO.14所示。

    上游引物Ab3-VKF的序列如SEQIDNO.15所示,下游引物Ab3-VKR的序列如SEQIDNO.16所示。

    含有人IgG2的重链恒定区的表达基因的表达载体可以为pFP-IgCH、pFP-IgCK或基因工程常用的其他真核表达载体。

    具体的,人IgG2的重链恒定区的表达基因的序列如SEQIDNO.8所示,用于表达如SEQIDNO.4所示的人IgG2的重链恒定区。

    S30、将S10得到的第一表达载体和S20得到的第二表达载体转染到同一宿主细胞中。

    宿主细胞可以为FreestyleCHO-S细胞或基因工程常用的其他表达细胞。

    S40、诱导S30得到的宿主细胞表达并回收得到抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体。

    这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法制得的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体包括重组轻链和重组重链,重组轻链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG2的轻链恒定区,重组重链包括抗甲型流感病毒核蛋白的鼠源抗体的重链可变区与人IgG2的重链恒定区。与传统的鼠源性抗体相比,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体通过人源化改造,保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了鼠源性抗体有可能存在的假阳反应性。因此,从临床诊断应用方面来看,这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体的制备方法制得的抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体比传统鼠源性抗体更具有应用价值。

    这种抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体可广泛应用在制备甲型流感病毒检测试剂或甲型流感病毒检测仪器的领域中。

    如图2所示的一实施方式的甲型流感病毒的检测试剂盒,其包括壳体200和检测试纸100??翘?00上开设有加样孔210及观察窗220。

    结合图3和图4,检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠,金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠,硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜上,且检测线160设在靠近金标垫130的一端,质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。硝酸纤维素膜140上附着有抗甲型流感病毒核蛋白的鼠单抗??辜仔土鞲胁《竞说鞍椎闹刈榭固灏浇禾褰鹂帕P纬傻慕禾褰鹬刈榭固甯春衔锞韧扛苍诮鸨甑?30上。检测线160为亲和纯化的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗,质控线170为羊抗鼠IgG抗体。

    结合图2、图3和图4,加样孔210对应样品垫120的位置;检测线160及质控线170裸露于观察窗220中,方便观察。

    这种甲型流感病毒的检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的抗甲型流感病毒核蛋白。检测时,样品中的甲型流感病毒核蛋白先和胶体金重组抗体复合物结合,由于毛细管作用,反应复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动,若样品是感染了流感病毒,到达检测线160时,遇到包被在硝酸纤维素膜140上的抗甲型流感病毒核蛋白的鼠单抗,就会形成鼠单抗-甲型流感病毒核蛋白-胶体金重组抗体复合物,从而富集在检测线160上,形成红色沉淀线;未结合的金标记重组抗体则通过检测线160,被羊抗鼠IgG抗体捕获,富集在质控线170上,形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品没有感染流感病毒,反应复合物到达检测线160时,遇到捕获抗体就不会形成复合物,反应复合物通过检测线160,仅富集在质控线170上形成红色沉淀线,此时判为阴性结果。

    此外,在其他实施方式中,甲型流感病毒的检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体除应用在上述甲型流感病毒的检测试剂盒外,还可以用于其他甲型流感病毒检测试剂盒或设备中。

    本领域技术人员可以理解,将上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等),或将上述抗甲型流感病毒核蛋白的重组抗体作为包被抗体(例如ELISA),则可用于其他形式的甲型流感病毒检测试剂或设备。

    上述重组抗体与鼠源性抗体相比,既保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了鼠单抗配经?;岱⑸翘匾煨苑从?,因此,从临床诊断应用方面来看,上述重组抗体比鼠源性抗体更具有应用价值。

    以下为具体实施例部分。

    实施例中FreestyleCHO-S细胞、转染试剂FreeStyleTMMAXReagent及细胞培养基等均购自LifeTechnologies公司。PrimeStarDNA聚合酶购自Takara公司。TrizolRNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性内切酶购自NEB公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。重组甲型流感病毒NP蛋白为菲鹏生物股份有限公司生产,货号AG-CTNI-HP0005。

    实施例1

    1、引物设计与合成

    扩增VL基因的上游引物mKF,序列如SEQIDNO.9所示。

    扩增VL基因的下游引物mKR,序列如SEQIDNO.10所示。

    扩增VH基因的上游引物mHF,序列如SEQIDNO.13所示。

    扩增VH基因的下游引物mHR,序列如SEQIDNO.14所示。

    2、抗体可变区基因克隆及测序

    从杂交瘤细胞FLUA-1A5中提取中RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR(RT-PCR使用的引物序列如SEQIDNo.17所示),扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上述合成的引物进行PCR。

    对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,得到图5。

    由图5可以看出,VL的mKF/mKR引物对扩增出420bp左右的目的条带,VH的mHF/mHR引物对扩增出420bp左右的目的条带。

    用琼脂糖凝胶电泳纯化回收,产物用rTaqDNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别取VH及VL基因克隆各2个克隆送Invitrogen公司进行测序。

    3、FLUA-1A5抗体可变区基因的序列分析

    将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析,并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的,其中mKF/mKR扩增出的390bp的VL基因片段中,VL基因序列为333bp,属于VII基因家族,其前方有57bp的前导肽序列;mHF/mHR引物对扩增出的402bp的VH基因片段中,VH基因序列为345bp,属于VH1基因家族,其前方有57bp的前导肽序列。

    4、重组抗体表达质粒的构建

    pFP-IgCK质粒和pFP-IgCH质粒为构建的重组抗体真核表达载体。其中,pFP-IgCK质粒已经插入人IgGk链的恒定区基因,并预留XbaI和PmlI酶切位点,pFP-IgCK载体图谱如图6所示。pFP-IgCH质粒已插入人IgG2重链恒定区基因,并预留NheI和HindIII酶切位点,质粒图谱如图6所示。

    根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果,设计FLUA-1A5抗体的VL和VH基因特异性引物,两端带有酶切位点和?;ぜ罨?。

    VL基因特异性引物包括上游引物Ab3-VHF,序列如SEQIDNO.11所示;下游引物Ab3-VHR,序列如SEQIDNO.12所示。

    VH基因特异性引物包括上游引物Ab3-VKF,序列如SEQIDNO.15所示;下游引物Ab3-VKR,序列如SEQIDNO.16所示。

    用分别VL和VH基因特异性引物PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,得到图8。

    由图8可以看出,VL基因特异性引物扩增出的VL基因片段大小约为390bp,VH基因特异性引物扩增出的VH基因片段大小约为402bp。

    VL基因片段用XbaI酶切,pFP-IgCK用XbaI/PmlI双酶切,VH基因片段和pFP-IgCH都用NheI/HindIII双酶切,将片段和载体纯化回收后VL基因连接到pFP-IgCK载体中,VH基因连接到pFP-IgCH载体中,分别得到重链和轻链的重组表达质粒。

    5、重组抗体表达质粒转染CHO细胞,产物检测

    转染前一天接种5×105/mL细胞于6孔培养板中,用含有8mM谷氨酰胺的FreestyleCHOExpressionMedium,与37℃,8%CO2的培养箱中150rpm圆周振荡培养16—22h,转染时细胞密度在1×106/mL,转染3mL细胞需要质粒3.75μg(重链和轻链表达质粒各1.875μg),转染试剂FreeStyleTMMAXReagent需要3.75μL,按照LifeTechnologies推荐的转染方法进行转染,转染72h后可以取样检测表达的重组抗体。

    6、真核表达的重组抗体检测

    用0.06MpH9.6碳酸缓冲溶液稀释人重组甲型流感病毒NP蛋白(菲鹏生物股份有限公司生产,货号AG-CTNI-HP0005),使其终浓度为8μg/mL。加入96孔聚苯乙烯板,每孔0.1mL,37℃2小时或4℃过夜。次日,用含10%小牛血清(NBS)的0.02MpH7.2PBS,0.15mL/孔,37℃封闭2小时,用于检测。转染后第六天,取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中,37℃30分钟,水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG-18#(菲鹏生物股份有限公司生产),37℃30分钟同上洗后,每孔加入100μL含0.1%(M/V)邻苯二胺,0.1%(V/V)双氧水,pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液,37℃15分钟,加入稀硫酸溶液,每孔50μL,测450nm吸收值??赵靥錺FP-IgCk和pFP-IgCH共转染的细胞上清作为阴性对照,以测定值与对照值得比2.0判定为阳性。结果如表1:

    表1


    1 1:10 1:30 1:9 1:27 1:81 空载体 PBS+NBS
    重组抗体 3.019 2.82 1.336 0.456 0.106 0.050 0.022 0.018

    由表1可以看出,成功表达出有活性的重组抗体。

    7、重组抗体纯化

    用同样的方法放大表达500mL,表达六天后细胞培养液12000rpm离心20min,上清转移到干净的瓶中,用proteinG亲和层析柱进行亲和纯化,纯化的穿透峰和吸收峰如图9所示。

    由图9可以看出,纯化后的重组抗体xxxx。

    纯化后得到10mg重组抗体,取4μg纯化的重组抗体进行还原性SDS-PAGE,4μg鼠源FLUA-1A5抗体作为对照,电泳图如图10所示。

    由图9可以看出,重组抗体在还原性SDS-PAGE中显示两条带,1条Mr为55KD(重链),另一条Mr为28KD(轻链)。

    8、重组抗体用于甲型流感病毒的检测试剂盒

    该检测试剂盒包括检测试纸及样品稀释液。其中,样品稀释液为8%NaCl溶液。配制方法:80gNaCl,加蒸馏水定容至1000mL。

    该检测试纸通过如下步骤制作:

    1)硝酸纤维素膜的制备

    包被缓冲液的配制:含6%甲醇、0.01MpH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液,0.22μm膜滤过,置4℃备用,有效期一周。1000mL6%甲醇的0.01MpH7.2PBS缓冲液配方:NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g、甲醇60mL,双蒸去离子水定容至1000mL。

    硝酸纤维素膜的制备:用包被缓冲液将抗甲型流感NP单克隆抗体(菲鹏生物股份有限公司生产,货号PAB-CTNI-AP0002)稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为T线,即为检测线,T线靠近金标垫端,距金标垫端约5mm;用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(菲鹏生物股份有限公司生产,货号BA-PAB-MU0001)稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为C线,即为控制线,C线靠近吸收垫,距吸收垫约3mm。两线距离5~8mm,均匀。37℃烘干,封装备用。

    2)、胶体金、金标记单克隆抗体的制备

    (1)溶液的配制

    ①氯金酸的配制:用双蒸去离子水溶解氯金酸,配成1%溶液,置4℃备用,有效期四个月。1000mL1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸:双蒸去离子水定容至1000mL。

    ②柠檬酸三钠的配制:用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠,配成1%溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期容至1000mL。

    ③0.1M碳酸钾的配制:用双蒸去离子水配制,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方:13.8g碳酸钾;双蒸去离子水定容至1000mL。

    ④2%PEG-20000的配制:用双蒸去离子水配制,0.22μm膜滤过,置4℃备用,有效期四个月。1000mL2%PEG-20000溶液配方:20gPEG-20000;双蒸去离子水定容至1000mL。

    ⑤标记洗涤保存液的配制:2%牛血清白蛋白(BSA),0.05%叠氮钠(NaN3),0.01MpH7.2PBS溶液,0.22μ膜滤过,置4℃备用,有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方:20gBSA,0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。

    (2)胶体金的制备:

    用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置电炉煮沸,按每100mL0.01%氯金酸加入2mL1%柠檬酸三钠,继续煮沸,直到液体呈亮红色即停止加热,冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物,有效期一周。

    (3)胶体金标记单克隆抗体的制备:

    用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2,按8~10μg抗体/mL胶体金加入实施例1中制备得到的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体,磁力搅拌器混匀30min,搅拌下加入BSA至终浓度为1%静置1小时。13000rpm、4℃离心30min,弃上清,沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次,用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬,置4℃备用,有效期一周。

    3、金标垫的制备

    (1)封闭液的配制:

    2%BSA,0.1%TritonX-100、0.05%NaN3,0.01MpH7.2PBS溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL封闭液配方:20gBSA,0.5gNaN3、1mLTritonX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。

    (2)金标垫的制备:

    将金标垫浸泡于封闭液中30min后,于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上,每毫升溶液铺20平方厘米,冷冻干燥,封装,置4℃备用。

    4、试纸条样品垫的制备

    (1)封闭液的配制:

    2%BSA,0.1%TrtionX-100、0.05%NaN3,0.01MpH7.2PBS溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL封闭液配方:20gBSA,0.5gNaN3、1mLTrtionX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。

    (2)样品垫的制备:

    将样品垫浸泡于封闭液中30min后,于37℃烘干,封装,置4℃备用。

    5、检测试纸的组装

    将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上,切成3mm宽的小条。每十小条一包,加入干燥剂,真空封装,得到所述检测试纸。

    以Binax,Inc.流感胶体金试剂盒(BinaxNOW)检出的阳性样本和阴性样本作为本试剂盒的检测样本,其中200例甲型流感病毒检测阳性样本,300例检出阴性样本,以基于鼠源FLUA-1A5抗体的检测试剂盒作为对照,检测结果见表2。结果表明,本试剂盒检出阳性标本198份,相对灵敏度为99.00%,与对照的鼠源FLUA-1A5抗体检测结果一致;300份阴性样本检出295份,其中5份为假阳,相对特异性为98.33%,而鼠源FLUA-1A5抗体检19份为假阳,相对特异性为93.67%,所以重组FLUA-1A5抗体应用于甲型流感病毒的诊断既保持了亲本鼠抗体的亲和力,同时降低了假阳性率,提高了诊断的特异性,优于基于鼠源抗体的甲型流感病毒检测试剂盒。

    表2基于鼠源抗体和重组抗体的甲型流感病毒检测试剂盒检测结果

    由表2可以看出,实施例中制得的甲型流感病毒的检测试剂盒具有较高的灵敏度和较高的相对特异性,可以用于甲型流感病毒的检测。

    以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的?;し段?。因此,本发明专利的?;し段вσ运饺ɡ笪?。












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