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    重庆时时彩网页版投注: 一种结核杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用.pdf

    关 键 词:
    一种 结核杆菌 融合 蛋白 及其 诱导 外周血 单个 细胞 产生 细胞因子 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510698926.7

    申请日:

    2015.10.21

    公开号:

    CN105601747A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C07K 19/00申请日:20151021|||公开
    IPC分类号: C07K19/00; C12N15/62; G01N33/68; G01N33/569; A61K39/116; A61K39/04; A61P31/06 主分类号: C07K19/00
    申请人: 中山大学
    发明人: 黄曦; 李丽炎; 杨锟; 田国宝; 吴敏昊
    地址: 510080 广东省广州市越秀区中山二路74号
    优先权:
    专利代理机构: 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人: 胡辉
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510698926.7

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种结核杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用。本发明的融合蛋白包含PPE41、ESAT-6和PE25三个蛋白,蛋白之间通过连接肽连接。本发明提供的融合蛋白与现有的刺激物相比,其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。同时,本发明融合蛋白刺激PBMC产生大量结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等结核相关因子,且这一刺激诱导反应不受卡介苗的干扰。本发明将更有效的提高结核病的检出率,对结核病的控制具有积极的意义。本发明的融合蛋白作为刺激物,可应用于结核病致病及免疫预防机制的研究,以及进一步的对结核病的控制中。

    权利要求书

    1.一种融合蛋白,其特征在于,包含PPE41、ESAT-6和PE25三个蛋白,蛋白之间通过连接
    肽连接。
    2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于:连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS
    (SEQIDNO:3)。
    3.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于:PPE41、ESAT-6和PE25蛋白为全序列蛋
    白或表达抗原活性的部分功能区域多肽。
    4.根据权利要求1~3所述的融合蛋白,其特征在于:该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-
    6-连接肽-PE25、PPE41-连接肽-PE25-连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-PPE41-连接肽-PE25、
    ESAT6-连接肽-PE25-连接肽-PPE41、PE25-连接肽-PPE41-连接肽-ESAT-6或PE25-连接
    肽-ESAT-6-连接肽-PPE41。
    5.根据权利要求1~3所述的融合蛋白,其特征在于:该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-
    6-连接肽-PE25。
    6.根据权利要求5所述的融合蛋白,其特征在于:融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接
    肽-PE25的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
    7.根据权利要求6所述的融合蛋白,其特征在于:编码融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-
    连接肽-PE25的核酸序列如SEQIDNO:2所示。
    8.权利要求1-7任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞
    因子的融合蛋白。
    9.权利要求1-7任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。
    10.权利要求1-7任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。

    说明书

    一种结核杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用

    技术领域

    本发明属于分子生物学技术中的蛋白领域,具体涉及一种结核杆菌融合蛋白及其
    在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用。

    背景技术

    结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,可侵及许
    多脏器,以肺部结核感染最为常见。结核病的传染主要是发生在病人未被发现并进行治疗
    之前,1名结核病患者平均可传染15人。因为在未发现患病前,新发病人没有采取任何预防
    手段,在与家庭成员、同事、同学等密切接触的过程中,接触者就容易被结核菌感染。全世界
    约有1/3的人口感染结核杆菌,每年新发结核病人约900万,每年约有300万人死于结核病,
    结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。根据世卫组织2014年10月22日
    出版的《2014年全球结核病报告》显示,2013年有900万人染上结核病,150万人死亡,约95%
    的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家。中国是全球22个结核病高负担国家之一,活
    动性肺结核病人数居世界第二位。

    作为一种典型的胞内感染菌,结核分枝杆菌感染机体,其免疫机制主要是以T细胞
    为主的细胞免疫。结核分枝杆菌通过呼吸道进入肺部,定植于肺泡巨噬细胞,逃逸宿主免疫
    防御机制;同时,原肺泡中未活化的树突状细胞(Dendriticcells,DC)抗菌活性弱,但可
    将结核分枝杆菌吞噬并迁移到其他组织,通过MHC将抗原提呈于T淋巴细胞导致其活化,活
    化的T淋巴细胞可产生多种细胞因子(INF-γ、IL-2与TNF-α等),这些细胞因子可激活其他
    免疫细胞,并共同作用于病灶中的结核分枝杆菌。根据这一免疫机制,通过对已感染结核分
    枝杆菌的患者及健康人血液中的细胞因子进行分析对比,发现感染结核分枝杆菌的患者其
    血液中INF-γ、IL-2、TNF-α的浓度明显升高。

    对于已经感染了结核分支杆菌的患者,当已经免疫过的特异性淋巴细胞在再次接
    触结核杆菌时,仍然会分泌相应的细胞因子。为研究结核分枝杆菌的致病机制及免疫机制,
    研究人员使用体外诱导外周血单个核细胞(PBMC)产生结核相关细胞因子的方式。外周血是
    人类免疫系统研究的主要对象,其中的PBMC包括淋巴细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细
    胞)、单核细胞和树突状细胞。将已经感染了结核分枝杆菌的患者的外周血采出,提取其中
    的PBMC,并采用结核相关抗原对其进行刺激,PMBC即可对抗原发生免疫反应,产生相应的细
    胞因子。由于直接使用结核分枝杆菌进行实验具有相当的危险性,不利于进行大量研究,因
    此研究人员采用提取的结核分枝杆菌抗原蛋白进行研究实验。结核菌素纯蛋白衍生物
    (PPD)是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的活性物质,其主要成分是蛋白质。PPD可以刺激T
    细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子,但对于已经经过卡介苗(BCG)免疫个体的样本,PPD同样
    能够刺激其提取出来的PBMC产生结核相关细胞因子,因此PPD的特异性较低,还需寻找特异
    性更好的刺激物。

    发明内容

    为了解决上述问题,寻找特异性更好的刺激物,本发明的目的在于提供一种结核
    杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用。

    本发明所采取的技术方案是:

    一种融合蛋白,包含PPE41、ESAT-6和PE25三个蛋白,蛋白之间通过连接肽连接。

    优选的,连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS(SEQIDNO:3)。

    优选的,PPE41、ESAT-6和PE25蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域
    多肽。

    优选的,该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25、PPE41-连接肽-PE25-
    连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-PPE41-连接肽-PE25或ESAT6-连接肽-PE25-连接肽-
    PPE41、PE25-连接肽-PPE41-连接肽-ESAT-6、PE25-连接肽-ESAT-6-连接肽-PPE41。

    优选的,该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25。

    优选的,融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25的氨基酸序列如SEQID
    NO:1所示。

    优选的,编码融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25的核酸序列如SEQID
    NO:2所示。

    上述任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子
    的融合蛋白。

    上述任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。

    上述任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。

    本发明的有益效果是:

    1)本发明提供了一种可以刺激PBMC产生结核相关细胞因子的融合蛋白,与现有的刺
    激物相比,其作用更高效、敏感性更强、特异性更高、刺激效果好。在本发明融合蛋白的作用
    下,PBMC可高效产生结核杆菌抗原特异性的IFN-γ、IL-2、TNF-α等结核相关因子,并且这
    一刺激诱导反应不受BCG(卡介苗)的干扰。

    2)本发明选用的连接肽链为经过设计、筛选的可以显著提高融合蛋白活性的短
    肽。目前蛋白领域研究中常用的连接肽主要有(Gly4Ser)3,而本发明所采用的连接肽氨基
    酸序列为GGGGSGGGSGGSGS,使得PPE41-ESAT-6-PE25融合蛋白中各自蛋白的空间构象及活
    性得到更好的实现,与混合肽、或其他融合蛋白相比,本发明融合蛋白的特异性及诱导效果
    具有明显的进步。本发明提供的融合蛋白对结核病致病及免疫预防机制的研究有重要意
    义,从而对结核病的控制具有积极的意义。

    附图说明

    图1为ELISA检测各组PBMC在融合蛋白PPE41-ESAT-6-PE25作用下分泌细胞
    因子IL-2的情况;

    图2为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平;

    图3为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌TNF-α的水平;

    图4为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平;其中本发明融合蛋白的连接肽为
    GGGGSGGGSGGSGS;(Gly4Ser)3-融合蛋白组的连接肽(Gly4Ser)3,其他序列均与本发明融合
    蛋白相同;

    图5为ELISPOT检测各组PBMC分泌IFN-γ的水平;实验组孔中含有本发明融合蛋白,阳
    性对照组中含有植物凝集素PHA;

    图6为ELISPOT检测不同处理组中PBMC分泌IFN-γ的水平。

    具体实施方式

    一种融合蛋白,包含PPE41、ESAT-6和PE25三个蛋白,蛋白之间通过连接肽连接。

    优选的,连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGSGGSGS(SEQIDNO:3)。

    更优选的,连接肽的碱基序列如SEQIDNO:4所示。

    优选的,PPE41、ESAT-6和PE25蛋白为全序列蛋白或表达抗原活性的部分功能区域
    多肽。

    优选的,该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25、PPE41-连接肽-PE25-
    连接肽-ESAT-6、ESAT6-连接肽-PPE41-连接肽-PE25或ESAT6-连接肽-PE25-连接肽-
    PPE41、PE25-连接肽-PPE41-连接肽-ESAT-6、PE25-连接肽-ESAT-6-连接肽-PPE41。

    优选的,该融合蛋白为PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25。

    优选的,融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25的氨基酸序列如SEQID
    NO:1所示。

    优选的,编码融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25的核酸序列如SEQID
    NO:2所示。

    上述任一项所述的融合蛋白能够诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子
    的融合蛋白。

    上述任一项所述的融合蛋白作为结核病检测抗原的应用。

    上述任一项所述的融合蛋白在结核病预防治疗中作为刺激物的应用。

    上述任一项所述的融合蛋白作为刺激物,应用于结核病致病及免疫预防机制的研
    究,以及进一步的对结核病的控制中。

    以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。

    实施例1:PPE41-ESAT-6-PE25融合蛋白目的基因合成及原核表达载体的构建

    编码PPE41、ESAT-6和PE25蛋白的基因分别为ppe41基因ID:885945,esat-6基因ID:
    862098,pe25基因ID:885703。利用其全序列或者表达抗原活性的部分功能区域序列,设
    计引物。


    1)分别用PPE41、ESAT-6和PE25的上下游引物,用PCR分别扩增PPE41、ESAT-6和PE25
    的目的片段,使用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增并回收上述片段。

    2)采用人工合成方式合成两种带有连接肽核苷酸序列的核苷酸链,其中一种核苷
    酸链(下文简称连接肽链1)两端分别包含PPE41和ESAT-6部分序列,中间为连接肽的碱基
    序列(SEQIDNO:4),另一种核苷酸链(下文简称连接肽链2)两端分别包含ESAT-6和PE25
    部分序列,中间也为连接肽的碱基序列(SEQIDNO:4)

    3)取PPE41DNA模板、连接肽链1的DNA模板各1μl,用PPE41的上游引物和连接肽链1的
    下游引物进行重叠PCR,获取PPE41-连接肽融合基因;切胶回收融合片段作为模板,同时
    加入ESAT-6的DNA模板,再用PPE41的上游引物和ESAT-6的下游引物进行重叠PCR,获取
    PPE41-连接肽-ESAT-6融合基因;同理,用PPE41的上游引物和连接肽链2的下游引物进行
    重叠PCR,获取PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽融合基因,切胶回收融合片段;最后用PPE41
    的上游引物和PE25的下游引物进行重叠PCR,获取PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽PE25融合
    基因(其核酸序列如SEQIDNO:2所示),切胶回收融合片段。

    将PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽PE25融合基因片段连接到pMD19-T载体上。挑
    取单克隆,菌液PCR筛选阳性克隆,最后酶切鉴定。将表达载体pET-28a和上述阳性克隆的
    质粒进行双酶切(BamHⅠ和HindⅢ),目的基因乙醇沉淀回收,载体过柱回收。然后用T4DNA
    Ligase对酶切的载体和目的片段进行连接,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21感受态细胞
    中。挑取单克隆,菌液PCR鉴定与双酶切鉴定后获得的阳性菌落进行测序鉴定。选取鉴定正
    确的重组菌进行保种,备用。

    实施例2:融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25的诱导表达和纯化

    取上述实施例1鉴定正确的含有PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25目的基因片段
    (碱基序列如SEQIDNO:2所示)的重组表达菌接入20ml含卡那抗性的LB培养基中,37
    ℃,250rpm,振荡培养6h。高压灭菌2L的LB培养基,每个1L的锥形瓶中放500ml,共分为4个
    瓶子。每个瓶子中加入2.5ml活化后的菌液,37℃,250rpm,振荡培养约3h,使菌液OD600为
    0.5。把锥形瓶放入冷水中,并对摇床降温,冷却后再诱导。每瓶中加入IPTG,使其终浓度为
    0.5mM,放入20℃摇床,200rpm,诱导20小时。离心:4℃,5000rpm,45min。离心后,弃上清,加
    入悬菌缓冲液重悬,随后将液体转移至50ml离心管中,每管内液体量30ml,放在-20℃冻
    存。反复冻融3个循环,冰浴超声破碎菌体后离心:4℃,7000rpm,45min。吸取离心所得上清、
    过滤,把滤液收集到新的50ml离心管中,分别收集上清、沉淀。SDS-PAGE蛋白电泳,考马斯
    亮蓝染色后观察结果,确定该重组菌可以正确表达目的蛋白。对所得的重组菌进行扩大诱
    导培养,对诱导表达的目的蛋白进行收集和纯化,即可获得纯化后的融合蛋白PPE41-连接
    肽-ESAT-6-连接肽-PE25(其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示),以下简称PPE41-ESAT-6-
    PE25。

    实施例3:密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)

    使用新鲜肝素锂或肝素钠的采血管或真空采血管无菌抽取待检人员外周静脉血4ml,
    颠倒使抗凝剂和血液混匀待用。准备2个15ml离心管,分别加入与采血量等体积的注射用
    生理盐水和淋巴细胞分离液。将新鲜肝素抗凝血与生理盐水混匀后,匀速缓慢加入分离液
    中,22℃,1800g离心20min,离心后,可见PBMCs细胞存在于云雾状层中。吸取PBMCs细胞层
    至新的15ml离心管内,用RPMI-1640培养液补齐至12ml,于22℃,600g离心10min。倒掉上
    清,用RPMI-1640培养液补齐至5ml,轻轻吹打沉淀重悬后,于22℃,350g离心10min。弃
    上清,加入0.5ml-1ml无血清培养基重悬细胞。采用台盼蓝染色手工计数法或使用合适的
    设备自动计数。根据计数结果,用无血清培养基将其稀释为所需浓度的PBMC细胞悬液。

    实施例4:ELISA检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性患者的PBMC分泌IL-2的作用

    1)分别选取PPD(结核菌素试验)阳性结核患者、未感染结核分枝杆菌的人的肝素钠抗
    凝外周静脉血样本,按实施例3中的密度分层法分离PBMC,经过细胞计数后使用无血清培
    养基将PBMC稀释到2.5×106个/ml的浓度,将细胞接种至96孔板中,每孔加入2.5×105个
    细胞,将实施例2制备的融合蛋白PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25用无血清培养基
    稀释为浓度5μg/ml的工作液,向实验孔中加入已配制好的融合蛋白工作液,37℃、5%CO2
    条件下孵育18小时,取细胞培养液进行相关细胞因子的检测。

    2)采用预先包被了抗人IL-2单克隆抗体的ELISA板,加入上步所提细胞培养上
    清液,室温孵育2小时,用Washbuffer清洗ELISA板3-5次,往检测孔中加入抗人IL-2抗
    体,室温孵育1小时,然后去除抗体,用Washbuffer清洗ELISA板3-5次,再加入HRP标记
    的二抗,37℃孵育1小时,然后去除二抗,用Washbuffer清洗ELISA板3-5次,加入配制
    好的TMB显色底物,室温下避光显色20分钟,最后加入终止液终止显色,30分钟内用酶标仪
    进行结果分析。

    检测结果如图1所示,从中可以看出与健康人相比,PPD阳性患者的PBMC在经
    过融合蛋白PPE41-ESAT-6-PE25刺激后其IL-2的分泌量有明显提高。

    实施例5:酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性的PBMC
    分泌IFN-γ水平

    1)选取PPD(结核菌素试验)阳性结核患者的肝素钠抗凝外周静脉血样本,按实施例3
    中的密度分层法分离PBMC,经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5×106个/ml
    的浓度备用。

    2)选择PVDF膜检测板(预先使用抗人IFN-γ单克隆抗体包被过夜,4℃条件保
    存)作为反应板,每孔加入2.5×105个上步制备的PBMC,每个样本设置3个检测孔,分别是
    空白对照(加入无血清培养基)、实验孔(加入实施例2制得的融合蛋白进行刺激,浓度为5
    μg/ml)和阳性对照孔(加入植物凝集素PHA进行刺激,浓度为5μg/ml),37℃、5%CO2培养
    箱中孵育16-20小时。

    3)取出检测板,弃培养上清液,用PBS冲洗检测板3-4遍,再用PBS洗板1-2
    次,每次来回轻轻晃动5下,最后一次洗板后拍干。在每个孔中加入100μl标记抗体工作液,
    置37℃孵育1小时。弃液体,用PBS洗板3-5次,每次来回轻轻晃动5下,最后一次洗板后
    拍干,每孔加入酶结合物工作液,置37℃孵育1小时。弃液体,用PBS洗板5次,每次来
    回轻轻晃动5下,最后一次洗板后拍干,每孔加入100μl的显色液,置37℃避光显色5-
    10分钟至斑点大小肉眼清晰可见,弃液体,用去离子水或自来水洗涤检测板正反面及底座
    3-5遍,扣干孔里的水,终止显色,将板放入37℃烘箱干燥4小时或者室温干燥过夜。显色
    结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

    实验分析结果如图2所示,从中可以看出PPD阳性的PBMC在经过本发明融合
    蛋白刺激后其IFN-γ的分泌量有明显提高。

    实施例6:ELISPOT方法检测本发明融合蛋白诱导PPD阳性的PBMC分泌TNF-α水

    1)选取PPD阳性结核患者的肝素钠抗凝外周静脉血样本,密度分层法分离PBMC,经过
    细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5×106个/ml的浓度备用。

    2)采用ELISPOT检测的方法,选择PVDF膜检测板(预先使用抗人TNF-α单克隆抗
    体包被过夜,4℃条件保存)作为反应板,每孔加入2.5×105个PBMC,每个样本设置3个
    检测孔,分别是空白对照、实验孔(加入实施例2制得的融合蛋白)和阳性对照孔(加入植
    物凝集素PHA),37℃、5%CO2培养箱中孵育16-20小时。第二天依次加入生物素标记抗人
    TNF-α单克隆抗体、酶结合物工作液,显色液。显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分
    析仪进行自动分析。

    上述实验分析结果如图3所示,从中可以出PPD阳性的PBMC在经过本发明融合
    蛋白刺激后其TNF-α的分泌量有明显提高。

    实施例7:本发明融合蛋白对外周血单个核细胞产生结核相关细胞因子的诱导作
    用实验

    实验方法:

    本实验设置5组,各组的实验设置如下所述:

    阴性对照组:将PPD阳性结核患者的PBMC加入到PVDF膜检测板(预先使用抗人IFN-γ
    单克隆抗体包被过夜,4℃条件保存)中,每孔加入2.5×105个PBMC,再加入50μl无血清培
    养基进行培养;

    阳性对照组:与阴性对照组相同,将相同数量的PBMC加入到相同的PVDF膜检测板
    中,再加入等体积含植物凝集素PHA的无血清培养基进行培养;

    本发明融合蛋白组:与阴性对照组相同,将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测板中,
    再加入等体积含实施例2制备的融合蛋白的无血清培养基进行培养,融合蛋白的工作液浓
    度为5μg/μl;

    (Gly4Ser)3-融合蛋白组:与阴性对照组相同,将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测
    板中,再加入等体积含(Gly4Ser)3-融合蛋白的无血清培养基进行培养;(Gly4Ser)3-融合
    蛋白浓度为5μg/μl;所述(Gly4Ser)3-融合蛋白为PPE41-连接肽(Gly4Ser)3-ESAT-6-连接
    肽(Gly4Ser)3-PE25,其中连接肽(Gly4Ser)3的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID
    NO:5);

    蛋白混合物组:与阴性对照组相同,将相同数量的PBMC加入到PVDF膜检测板中,再加入
    等体积含蛋白PPE41、ESAT-6-和PE25的无血清培养基进行培养,PPE41、ESAT-6-和PE25浓
    度均为5μg/μl;

    将上述5组细胞均在37℃、5%CO2培养箱中孵育16-20小时;分别取出检测板,弃培养
    上清液,用PBS冲洗检测板3-4遍,再用PBS洗板1-2次,每次来回轻轻晃动5下,最后一次洗
    板后拍干。在每个孔中加入生物素标记抗人IFN-γ单克隆抗体工作液,置37℃孵育1小时。
    弃液体,用PBS洗板3-5次,每次来回轻轻晃动5下,最后一次洗板后拍干,每孔加入酶结合
    物工作液,置37℃孵育1小时。弃液体,用PBS洗板5次,每次来回轻轻晃动5下,最后一次洗
    板后拍干,每孔加入100μl的显色液,置37℃避光显色5-10分钟至斑点大小肉眼清晰可
    见,弃液体,用去离子水或自来水洗涤检测板正反面及底座3-5遍,扣干孔里的水,终止显
    色,将板放入37℃烘箱干燥4小时或者室温干燥过夜。显色结果用CTLImmunoSpotS6
    ELISpot分析仪进行自动分析。

    实验结果:

    实验分析结果如图4所示,从中可以看出用在相同面积内,本发明融合蛋白刺激PBMC
    所得的斑点数(152)明显多于(Gly4Ser)3-融合蛋白组(112)和蛋白混合物组(71),说明本
    发明将蛋白PPE41、ESAT-6-和PE25进行融合表达后,可显著提高PBMC产生结核相关细胞
    因子的能力,并且本发明中对连接肽的改进也带来了不可预料的效果,现常用的连接肽
    (Gly4Ser)3用于连接PPE41、ESAT-6和PE25融合表达后效果不及本发明改进后的连接肽
    GGGGSGGGSGGSGS。说明使用本发明连接肽GGGGSGGGSGGSGS能够提高本发明融合蛋白的活
    性,诱导PBMC分泌细胞因子的效果更好。

    实施例8:特异性融合蛋白分别诱导健康人、经BCG免疫的健康人及PPD阳性患者
    的PBMC分泌IFN-γ对比

    1)分别选取健康人、经BCG(卡介苗)免疫的健康人和PPD阳性患者的肝素钠抗凝外
    周静脉血样本,密度分层法分离PBMC,经过细胞计数后使用无血清培养基将其稀释到2.5
    ×106个/ml的浓度备用。

    2)采用ELISPOT检测INF-γ分泌的方法,选择PVDF膜检测板(预先使用抗人
    IFN-γ单克隆抗体包被过夜,4℃条件保存)作为反应板,每孔加入2.5×105个PBMC,每个
    样本设置3个检测孔,分别是阴性对照(加入无血清培养基)、实验组(加入本发明融合蛋白)
    和阳性对照组(加入植物凝集素PHA),37℃、5%CO2培养箱中孵育16-20小时。

    3)第二天依次加入生物素标记抗人IFN-γ单克隆抗体、酶结合物工作液,显色液。
    显色结果用CTLImmunoSpotS6ELISpot分析仪进行自动分析。

    实验检测结果如图5所示,从结果中可以看出,未感染结核病的健康人和经BCG
    免疫的健康人的PBMC细胞不会被本发明融合蛋白(实施例2制备的融合蛋白)诱导分泌
    IFN-γ,即没有出现斑点,只有PPD阳性样本的实验孔中有斑点,说明本发明融合蛋白的刺
    激作用不受BCG的影响,对感染结核病的外周血单个核细胞(PBMC)具有很好的特异性。

    实施例9:PPE41-ESAT-6-PE25融合蛋白与不同融合蛋白的刺激效果对比

    采用分子克隆方法分别获得对PPE41、ESAT-6和PE25蛋白以不同顺序进行连接的
    融合蛋白,包括PPE41-ESAT-6-PE25、PPE41-PE25-ESAT-6、ESAT6-PPE41-PE25、ESAT6-
    PE25-PPE41、PE25-PPE41-ESAT-6和PE25-ESAT-6-PPE41。

    分别选用以下融合蛋白对PPD阳性结核患者的PBMC进行处理,并用ELISPOT法
    检测各组中PBMC分泌IFN-γ的水平,各组所用到的融合蛋白分别为:

    PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-PE25(简称PPE41-ESAT-6-PE25)、

    PPE41-连接肽-PE25-连接肽-ESAT-6(简称PPE41-PE25-ESAT-6)、

    ESAT6-连接肽-PPE41-连接肽-PE25(简称ESAT-6-PPE41-PE25)、

    ESAT6-连接肽-PE25-连接肽-PPE41(简称ESAT-6-PE25-PPE41)、

    PE25-连接肽-PPE41-连接肽-ESAT-6(简称PE25-PPE41-ESAT-6)、

    PE25-连接肽-ESAT-6-连接肽-PPE41(简称PE25-ESAT-6-PPE41)、

    PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv1978(简称PPE41-ESAT-6-Rv1978)、

    PPE41-连接肽-ESAT-6-连接肽-Rv3425(简称PPE41-ESAT-6-Rv3425);

    其中Rv1987和Rv3425分别为RD2区和RD11区相应基因编码的蛋白;

    上述连接肽的氨基酸序列均为GGGGSGGGSGGSGS(SEQIDNO:3);同时设置阴性对照
    (无血清培养基)和阳性对照(用植物凝集素PHA处理);具体的处理过程和检测方法同以
    上实施例所述。

    实验检测结果如图6所示,从中可以看出,融合蛋白PPE41-ESAT-6-PE25处理组中
    检测的斑点数最多,其次是PPE41、ESAT-6和PE25按其他顺序连接而成的融合蛋白,而
    PPE41、ESAT-6和其他抗原蛋白(Rv1978、Rv3425)连接而成的融合蛋白对PBMC的刺激效果
    最差。说明本明发将PPE41、ESAT-6和PE25三种抗原蛋白通过特定连接肽连接而成的融
    合肽产生了不可预料的效果,具有可特异性显著诱导外周血单个核细胞产生结核相关细胞
    因子(INF-γ、IL-2与TNF-α等)的能力,尤其是融合肽PPE41-ESAT-6-PE25产生的诱导效
    果最为显著。)

    上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限
    制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均
    应为等效的置换方式,都包含在本发明的?;し段е?。

    <110>中山大学


    <120>一种结核杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用


    <130>


    <160>5


    <170>PatentInversion3.5


    <210>1

    <211>416

    <212>PRT

    <213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)



    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(217)..(217)

    <223>Xaacanbeanynaturallyoccurringaminoacid


    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(292)..(292)

    <223>Xaacanbeanynaturallyoccurringaminoacid


    <400>1


    MetHisPheGluAlaTyrProProGluValAsnSerAlaAsnIleTyr

    151015



    AlaGlyProGlyProAspSerMetLeuAlaAlaAlaArgAlaTrpArg

    202530



    SerLeuAspValGluMetThrAlaValGlnArgSerPheAsnArgThr

    354045



    LeuLeuSerLeuMetAspAlaTrpAlaGlyProValValMetGlnLeu

    505560



    MetGluAlaAlaLysProPheValArgTrpLeuThrAspLeuCysVal

    65707580



    GlnLeuSerGluValGluArgGlnIleHisGluIleValArgAlaTyr

    859095



    GluTrpAlaHisHisAspMetValProLeuAlaGlnIleTyrAsnAsn

    100105110



    ArgAlaGluArgGlnIleLeuIleAspAsnAsnAlaLeuGlyGlnPhe

    115120125



    ThrAlaGlnIleAlaAspLeuAspGlnGluTyrAspAspPheTrpAsp

    130135140



    GluAspGlyGluValMetArgAspTyrArgLeuArgValSerAspAla

    145150155160



    LeuSerLysLeuThrProTrpLysAlaProProProIleAlaHisSer

    165170175



    ThrValLeuValAlaProValSerProSerThrAlaSerSerArgThr

    180185190



    AspThrGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlySer

    195200205



    MetThrGluGlnGlnTrpAsnPheXaaGlyIleGluAlaAlaAlaSer

    210215220



    AlaIleGlnGlyAsnValThrSerIleHisSerLeuLeuAspGluGly

    225230235240



    LysGlnSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlyGlySerGlySer

    245250255



    GluAlaTyrGlnGlyValGlnGlnLysTrpAspAlaThrAlaThrGlu

    260265270



    LeuAsnAsnAlaLeuGlnAsnLeuAlaArgThrIleSerGluAlaGly

    275280285



    GlnAlaMetXaaSerThrGluGlyAsnValThrGlyMetPheAlaGly

    290295300



    GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlySerMetSerPhe

    305310315320



    ValIleThrAsnProGluAlaLeuThrValAlaAlaThrGluValArg

    325330335



    ArgIleArgAspArgAlaIleGlnSerAspAlaGlnValAlaProMet

    340345350



    ThrThrAlaValArgProProAlaAlaAspLeuValSerGluLysAla

    355360365



    AlaThrPheLeuValGluTyrAlaArgLysTyrArgGlnThrIleAla

    370375380



    AlaAlaAlaValValLeuGluGluPheAlaHisAlaLeuThrThrGly

    385390395400



    AlaAspLysTyrAlaThrAlaGluAlaAspAsnIleLysThrPheSer

    405410415



    <210>2

    <211>1257

    <212>DNA

    <213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)


    <400>2

    atgcatttcgaagcgtacccaccggaggtcaactccgccaacatatatgccggccccggt60


    cctgactcgatgttggctgccgccagggcgtggaggtcgttggatgtggaaatgacggcc120


    gtgcagaggtcgttcaaccgaacgctgctgtctctgatggacgcctgggcgggtccagtg180


    gtgatgcagttgatggaggcagccaagccgtttgtcaggtggctgaccgacctctgtgtg240


    cagctgtctgaggtcgagaggcagatccacgagatcgtgcgggcctatgaatgggcacat300


    cacgatatggtgcccctggcgcagatctacaacaaccgtgctgagaggcagattctgatc360


    gacaacaacgcgcttgggcaattcactgcgcagatcgccgacctcgaccaagaatatgac420


    gacttctgggacgaggacggagaggtgatgagggactacaggcttcgggtgtcggatgcg480


    ttgtcgaagttgactccgtggaaggcgccgccgccgatcgcccacagtaccgtgttggtc540


    gcaccggtgtcacccagcacggcgtcatcgcgtacagacacttagggcggcggcggctcc600


    ggcggcggctccggcggctccggctccatgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatc660


    gaggccgcggcaagcgcaatccagggaaatgtcacgtccattcattccctccttgacgag720


    gggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtac780


    cagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaac840


    ctggcgcggacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcact900


    gggatgttcgcatagggcggcggcggctccggcggcggctccggcggctccggctccatg960


    tcttttgtgatcacaaatcccgaggcgttgaccgtggcggccacggaggtacgacggatt1020


    cgcgatcgtgcgatccaaagcgatgctcaggtggccccgatgacaaccgctgtgcggcct1080


    ccggctgcggatctggtgtcggagaaggcggcgacgttcctggtcgagtacgcaaggaag1140


    tatcggcagaccatcgctgcggcggcggtggttcttgaggagtttgcgcacgccttgacc1200


    actggcgccgataagtatgcgaccgccgaggccgacaacatcaagacctttagttaa1257



    <210>3

    <211>14

    <212>PRT

    <213>人工组合序列


    <400>3


    GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySerGlySer

    1510



    <210>4

    <211>42

    <212>DNA

    <213>人工组合序列


    <400>4

    ggcggcggcggctccggcggcggctccggcggctccggctcc42



    <210>5

    <211>15

    <212>PRT

    <213>人工组合序列


    <400>5


    GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer

    151015

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