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    重庆时时彩吉祥娱乐: 一类磷光铱配合物的合成及其用于血吸虫成虫的荧光标记.pdf

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    一类 磷光 配合 合成 及其 用于 血吸虫 成虫 荧光 标记
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610060560.5

    申请日:

    2016.01.29

    公开号:

    CN105601675A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||著录事项变更IPC(主分类):C07F 15/00变更事项:申请人变更前:赣南师范学院变更后:赣南师范大学变更事项:地址变更前:341000 江西省赣州市经济技术开发区师院南路1号(赣南师范学院化学化工学院)变更后:341000 江西省赣州市经济技术开发区师院南路1号(赣南师范学院化学化工学院)|||实质审查的生效IPC(主分类):C07F 15/00申请日:20160129|||公开
    IPC分类号: C07F15/00; C09K11/06; G01N21/64 主分类号: C07F15/00
    申请人: 赣南师范学院
    发明人: 吴勇权; 范小林; 曾冠杰; 吴任苗; 江天宇; 李亿保
    地址: 341000 江西省赣州市经济技术开发区师院南路1号(赣南师范学院化学化工学院)
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610060560.5

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2018.07.31|||2017.12.19|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于寄生虫病防治的生物光学标记领域,涉及一类磷光铱配合物的合成,并用于血吸虫成虫的荧光标记。实现了磷光配合物的设计、合成以及该类铱配合物对血吸虫成虫的荧光标记。磷光铱配合物的结构是通过两个含氮芳香化合物为主配体和一个含双氮芳香化合物为辅助配体配位合成的磷光铱配合物。血吸虫成虫荧光标记方法包括如下步骤:(1)血吸虫尾蚴获得;(2)尾蚴感染小鼠;(3)血吸虫成虫获得;(4)在室温下,用5μmol/L的磷光配合物PBS缓冲液进行血吸虫成虫荧光标记;(5)通过激光共聚焦荧光显微镜采集磷光信号进行血吸虫成虫荧光成像。通过设计与合成,该类磷光铱配合物作为荧光探针用于血吸虫成虫荧光标记,成功地解决了血吸虫成虫荧光成像过程中荧光标记效果差和抗光漂白性能差的问题。

    权利要求书

    1.一种磷光铱配合物,其特征在于:具有下式结构的磷光化合物:

    其中n=0,1,2,3,4。
    2.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物,其特征在于:磷光化合物为n=3的结构式。
    3.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物,其特征在于:任意一个铱配合物可通过以下路
    线合成:

    其中PEG-Ts结构式如下:

    双齿配体结构式如下:

    将三氯化铱水合物与含亲水基的双齿配体在2-乙氧基乙醇和水的混合溶液中加热
    反应12至48小时,合成得到铱二氯桥配合物;然后,得到的铱二氯桥配合物在有机溶剂、
    水或者混合溶剂中与相应的辅助配体反应4至12小时,合成终产物。
    4.根据权利要求1-2任一项所述的一种磷光铱配合物,其特征在于:任意一种磷光铱配合物
    用于血吸虫成虫荧光标记。
    5.根据权利要求1所述的一种磷光铱配合物,其特征在于,血吸虫成虫荧光标记成像方法包
    括如下步骤:
    血吸虫尾蚴获得:新鲜的尾蚴从感染毛蚴的阳性的钉螺得到,取阳性螺于100mL锥形瓶
    中,加入清水至瓶口,在白炽灯下光照2小时左右逸出尾蚴;
    小鼠感染:将六周龄雌性小鼠四肢固定于自制架子上,腹部去毛,取温水湿润小鼠腹部
    皮肤,并将含有45-55条尾蚴的盖玻片贴于小鼠去毛的腹部皮肤上,保持20分钟使尾蚴穿透小
    鼠皮肤进行感染;
    血吸虫成虫获得:将感染后的小鼠饲养6周后,使用颈部脱臼处死,严格按照无菌操作
    要求,依次剖开腹部皮肤、腹膜,采取灌注法于肝门-肠系膜静脉中收集成虫;将收集到的成
    虫在生理盐水中漂洗3次后分配到培养皿中,加入RPMI-1640(RoswellParkMemorial
    Institute)细胞培养液培养2小时后,镜检筛选活性良好的虫体用于荧光成像;
    血吸虫成虫荧光成像:磷光配合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解准确配制成1mmol的
    母液,然后再用PBS缓冲液稀释成5μM的稀释液;移取200μL的稀释液加入到培养皿中,用
    镊子挑取成虫加入到磷光配合物稀释液中,于室温孵育5分钟至6小时后,将成虫转移到荧光
    成像器皿,在405nm激发下共聚焦荧光显微镜观察尾蚴的磷光标记情况,并采集520-620nm
    的磷光信号进行荧光成像。

    说明书

    一类磷光铱配合物的合成及其用于血吸虫成虫的荧光标记

    技术领域

    本发明属于寄生虫病防治的生物光学标记领域,更具体地,本发明涉及一类磷光铱配合
    物的合成及其用于血吸虫成虫荧光标记,本发明提供了一种新颖的血吸虫成虫荧光标记方法,
    该类磷光铱配合物具有血吸虫成虫荧光标记的有益效果。

    背景技术

    血吸虫病是一种古老的寄生虫病,对人类的生产生活有巨大的危害,是仅次于疟疾的第
    二大热带寄生虫病。血吸虫病流行于74个国家和地区,估计目前有6.52亿人口受威胁,有
    1.93亿感染者,有症状病例约1.2亿,其中2000万为严重病例,我国是血吸虫病的主要流行
    区。血吸虫病是一种典型的经水源传播的人兽共患寄生虫病,血吸虫尾蚴是感染人畜的唯一
    阶段,当血吸虫尾蚴进入人体之后,发育为童虫阶段,通过20到60天的时间再进入成虫阶
    段,在整个过程中会引起急慢性血吸虫病及相关并发症,对人体造成极大的伤害,从皮肤过
    敏皮炎,营养不良、厌食、黄疸,甚至肝硬化,晚期严重者可以致人死亡??蒲泄ぷ髡咄ü?br />不断地研究,研制出了一系列对吸虫成虫有良好的杀灭效果的抗血吸虫药物,其中吡喹酮作
    为最主要代表,且因具有安全,不良反应少,服用方法简便易行,疗效好,人体内降解快等
    特点而在国内乃至世界受到广泛的应用。但是由于对吡喹酮类药物的广泛长期大量使用,血
    吸虫已经对其产生耐药性;同时该类药物杀成虫的确切作用机理尚不明确,所以需要对该类
    药物进行持续深入的研究。按照传统的研究方法(主要为对死亡虫体的检测)来探索这些药
    物的可能作用机理,不能直接反映药物在活体上的作用方式和位点,中间环节会影响结果的
    准确性和可信度,所以需要寻求一些新的研究方法来弥补目前存在的不足。目前,荧光成像
    是一项灵敏的、非侵入式、费用低廉的可视化检测途径,其分辨率可达百纳米,可实现从细
    胞到动物的活体成像,荧光成像手段具有监测灵敏、成像迅速、可同时观测多分子事件等优
    点,因此在防治血吸虫药物机理研究方面具有广泛的应用前景。

    血吸虫成虫体壁由体被、基膜及体被下层构成,即体被细胞组成的合胞体与肌层交错在
    一起,并通过胞质小管与体被相连,使体被下层被表层无核无细胞分隔的体被所覆盖,因此
    血吸虫成虫并不具备角质层。血吸虫成虫寄生于血管中,体表与宿主血液直接接触,为了逃
    避宿主的免疫性攻击,体被覆盖了一种与宿主红细胞ab抗原相同的特异性糖类,所以成虫体
    表呈现较强的亲水性。目前,使用传统的有机小分子荧光染料作为荧光探针对生物体进行研
    究,存在以下的缺点:短波长发射有生物自发荧光干扰、光稳定性不够导致不能长时间观察
    等。同时,大部分有机小分子荧光染料亲水性差,其对血吸虫成虫的染色效果不理想,因此
    开发出对血吸虫成虫具有良好荧光标记效果的荧光染料是一项挑战。

    磷光铱配合物相比其他荧光材料,具有更大程度的MLCT特征,具有发光效率高、光稳
    定性好、发光颜色可调等优点。本发明结合磷光铱配合物优异发光性能,发明人借助铱配合
    物作为磷光探针用于血吸虫成虫荧光标记的应用,选择合适的有机配体以及对有机配体进行
    亲水性修饰,可以成功地解决血吸虫成虫荧光成像过程中荧光标记效果差和抗光漂白性能差
    的问题。

    发明内容

    本发明提供了一类磷光铱配合物,通过对这类配合物进行化学修饰上亲水性基团,使其
    具有对日本血吸虫成虫进行磷光标记的性能,并且提高了该类磷光铱配合物发光量子效率,
    可作为日本血吸虫成虫磷光标记试剂。

    本发明的铱配合物的结构是通过以两个含氮芳香化合物为双齿配体、辅以一个含双氮芳
    香化合物的配体配位合成,更具体的结构如下:


    其中n=0,1,2,3,4

    本发明化合物可按照如下合成路线制备:


    制备本发明化合物的原料和所用试剂均为已知化合物,可以在市场上获得,或可用本领
    域已知的方法制备。合成路线中第二步可按本领域已知的方法制备(参见Nonoyama,K.Bull.
    Chem.Soc.Jpn.1974,47,467-468.)

    配体与PEG-Ts在乙腈碱性溶液中加热回流即可得到含亲水基的双齿配体其
    中PEG-Ts结构式如下:


    配体结构式如下:


    将三氯化铱水合物与含亲水基的双齿配体在2-乙氧基乙醇和水的混合溶液中加热
    反应12至48小时,可合成得到相应铱二氯桥配合物;然后,得到的铱二氯桥配合物在有机
    溶剂、水或者混合溶剂中与相应的辅助配体反应4至12小时,合成终产物。

    上述任意一种磷光铱配合物作为血吸虫成虫荧光标记探针,荧光标记方法包括如下步骤:

    (1)血吸虫尾蚴获得:新鲜的尾蚴从感染毛蚴的阳性的钉螺得到,取阳性螺于100mL
    锥形瓶中,加入清水至瓶口,在白炽灯下光照2小时左右逸出尾蚴。

    (2)小鼠感染:将六周龄雌性小鼠四肢固定于自制架子上,腹部去毛,取温水湿润小鼠
    腹部皮肤,并将含有50条左右尾蚴的盖玻片贴于小鼠去毛的腹部皮肤上,保持20分钟使尾蚴
    穿透小鼠皮肤进行感染。

    (3)血吸虫成虫获得:将感染后的小鼠饲养6周后,使用颈部脱臼处死,严格按照无菌
    操作要求,依次剖开腹部皮肤、腹膜,采取灌注法于肝门-肠系膜静脉中收集成虫。将收集到
    的成虫在生理盐水中漂洗3次后分配到培养皿中,加入RPMI-1640(RoswellParkMemorial
    Institute)细胞培养液培养2小时后,镜检筛选活性良好的虫体用于荧光成像。

    (4)血吸虫成虫荧光成像:磷光配合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解准确配制成1mmol
    的母液,然后再用PBS缓冲液稀释成5μM的稀释液。移取200μL的稀释液加入到培养皿中,
    用镊子挑取成虫加入到磷光配合物稀释液中,于室温孵育5分钟至6小时后,将成虫转移到
    荧光成像器皿,在405nm激发下共聚焦荧光显微镜观察尾蚴的磷光标记情况,采集520-620
    nm的磷光信号进行荧光成像。

    发明人通过设计与合成,将磷光铱配合物用于血吸虫成虫荧光标记的研究,可以成功地
    解决成虫荧光成像过程中荧光标记效果差和抗光漂白性能差的不足。

    附图说明

    图1配合物Ir-1的吸收光谱和磷光发射光谱。

    图2配合物Ir-2的吸收光谱和磷光发射光谱。

    图3配合物Ir-2标记日本血吸虫成虫的激光共聚焦荧光成像图。

    图4配合物Ir-2标记日本血吸虫成虫头器的激光共聚焦荧光成像图。

    具体实施方式

    下文给出了本发明化合物的具体实施例,它们用实例详细说明本发明,但对本发明不构
    成任何限制。本实施例中所用的原料均为已知化合物,可以由商业途径获得,或可按相关文
    献设计方法合成。

    在下述实施例中,所涉及的理化参数由下述仪器测定的:1HNMR谱在Bruker
    Mercuryplus上采用400MHz测定,用TMS为内标;质谱数据MALDI-TOF-MS在ABSCIEX
    5800型质谱仪上获得;紫外可见吸收光谱在ShimadzuUV-2700紫外-可见吸收光谱仪上完成;
    磷光发射光谱由PerkinElmerLS-55荧光光谱仪上测定;尾蚴磷光成像在OLYMPUSFV1000
    型激光共聚焦荧光显微镜上进行采集,激光器提供波长为405nm的激发光源,根据铱配合物
    的磷光发射性质收集520nm-620nm范围内的发射磷光信号。

    实施例1

    [Ir(HO-pq)2(phen)][PF6](Ir-1)的合成


    (1)HO-pq的合成:将1mmol的4-酚基苯硼酸,1mmol的2-氯喹啉,7%当量的四(3-
    苯基膦)钯(0)和1mmol的碳酸钾加入到三颈烧瓶中,然后加入30mLTHF和H2O的混合
    溶剂。在氮气的?;は?,反应体系在70℃反应24h。冷却至室温,反应液用二氯甲烷萃取,
    水相用二氯甲烷萃取3次(10mL×3),合并有机层,用无水硫酸钠干燥,柱层析分离得到。

    (2)HO-pq铱二氯桥配合物的合成:参考文献(Nonoyama,K.Bull.Chem.Soc.Jpn.1974,
    47,467-468.)合成。0.5mmol的三氯化铱水合物和1mmol的配体HO-pq溶于25mL的2-乙
    氧基乙醇和水的混合液中(v/v=3:1),110℃反应24h,室温冷却。抽滤收集固体,分别
    用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次,得HO-pq铱二氯桥配合物。

    (3)[Ir(HO-pq)2(bpy)][PF6](Ir-1)的合成:将0.2mmol的HO-pq铱二氯桥配合物,0.4
    mmol的1,10-邻菲罗啉加入圆底烧瓶中,然后加入30mL二氯甲烷和甲醇(v/v=2:1)。在
    氮气的?;は?,反应体系在50℃反应10h。再加入10倍当量的KPF6,继续反应4h。室温
    冷却,减压抽滤收集滤液,柱层析分离得到产物。配合物Ir-1的吸收光谱和荧光光谱如图1
    所示。核磁表征数据:1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.49(s,2H),8.71(dd,J=8.2,1.2Hz,2H),
    8.52(t,J=12.8Hz,2H),8.34(q,J=9.0Hz,4H),8.16(d,J=8.7Hz,2H),8.09–7.97(m,4H),
    7.84–7.56(m,2H),7.14(t,J=7.5Hz,2H),7.01(d,J=8.9Hz,2H),6.78–6.69(m,2H),6.63(dd,
    J=8.6,2.3Hz,2H),5.98(d,J=2.2Hz,2H)。

    实施例2

    [Ir(PEG-pq)2(phen)][PF6](Ir-2)的合成


    (1)HO-pq的合成:将1mmol的4-酚苯硼酸,1mmol的2-氯喹啉,7%当量的四(3-苯
    基膦)钯(0)和1mmol的碳酸钾加入到三颈烧瓶中,然后加入30mLTHF和H2O的混合溶
    剂。在氮气的?;は?,反应体系在70℃反应24h。冷却至室温,反应液用二氯甲烷萃取,
    水相用二氯甲烷萃取3次(10mL×3),合并有机层,用无水硫酸钠干燥,柱层析分离。

    (2)三缩二乙二醇单端对甲基苯磺酸酯的合成:将1mmol三缩二乙二醇加入三颈烧瓶
    中,加入1mmoL的吡啶,用20mL的二氯甲烷溶解,在0℃冰浴中搅拌?;郝稳攵燃?br />烷溶解的1mmoL对甲基苯磺酰氯。反应3小时后用盐酸洗涤,取有机层加水洗至水溶液呈
    中性。无水硫酸钠干燥,柱层析分离得到。

    (3)配体PEG-pq的合成:将1mmol三缩二乙二醇单端对甲基苯磺酸酯,1mmol碳酸
    钾,10%当量的四丁基溴化铵加入三颈瓶中,用20mL的乙腈溶解。在80℃油浴中搅拌回
    流?;郝稳胍译嫒芙獾?mmolHO-pq。反应10h后,冷却至室温。反应液用二氯甲烷萃取,
    水相用二氯甲烷萃取3次(10mL×3),合并有机层,用无水硫酸钠干燥,柱层析分离得到。

    (4)PEG-pq铱二氯桥配合物的合成(参见文献Nonoyama,K.Bull.Chem.Soc.Jpn.1974,
    47,467-468.):0.5mmol的三氯化铱水合物和1mmol的配体PEG-pq溶于25mL的2-乙氧
    基乙醇和水的混合液中(v/v=3:1),110℃反应24小时,结束冷却室温。抽滤收集固体,
    分别用蒸馏水和无水乙醇洗涤数次,得PEG-pq铱二氯桥配合物。

    (5)[Ir(PEG-pq)2(bpy)][PF6](Ir-2)的合成:将0.2mmol的PEG-pq铱二氯桥配合物,
    0.4mmol的1,10-邻菲罗啉加入圆底烧瓶中,然后加入30mL二氯甲烷和甲醇(v/v=2:1)。
    在氮气的?;は?,反应体系在50℃反应10h。再加入10倍当量的KPF6,继续反应4h。室
    温冷却,减压抽滤收集滤液,柱层析分离得到产物。配合物Ir-2的吸收光谱和荧光光谱如图
    2所示。配合物Ir-2表征数据:1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(dd,J=8.2,1.2Hz,2H),8.51
    (dd,J=5.1,1.2Hz,2H),8.45(d,J=9.0Hz,2H),8.38(d,J=8.9Hz,2H),8.30(d,J=8.9Hz,2H),
    8.08(s,2H),8.02(dt,J=13.9,7.0Hz,2H),7.75(d,J=8.0Hz,2H),7.19(t,J=7.7Hz,2H),7.03
    (d,J=8.9Hz,2H),6.86(dd,J=8.8,2.4Hz,2H),6.80–6.72(m,2H),5.96(d,J=2.5Hz,2H),
    4.50(t,J=5.5Hz,2H),3.95–3.78(m,2H),3.76–3.62(m,2H),3.68–3.61(m,8H),3.57(s,8H),
    3.55–3.50(m,4H);MALDI-TOFMS:m/z1077.6443([M-PF6]+)。

    实施例3

    磷光配合物Ir-2对血吸虫成虫的磷光标记成像

    (1)试剂与材料

    试剂:二甲基亚砜(天津市科密欧化学试剂有限公司),PBS缓冲液自配。

    尾蚴:阳性钉螺逸出得到,阳性钉螺由江苏省血吸虫病防治研究所提供。

    小鼠:昆明小鼠,由江西省赣南医学院提供。

    (2)血吸虫尾蚴获得

    新鲜的尾蚴从感染毛蚴的阳性的钉螺得到,取阳性螺于100mL锥形瓶中,加入清水至瓶
    口,在白炽灯下光照2小时左右逸出尾蚴。

    (3)小鼠感染

    将六周龄雌性小鼠四肢固定于自制架子上,腹部去毛,取温水湿润小鼠腹部皮肤,并将
    含有50条左右尾蚴的盖玻片贴于小鼠去毛的腹部皮肤上,保持20分钟使尾蚴穿透小鼠皮肤进
    行感染。

    (4)获取成虫

    将感染后的小鼠饲养6周后,使用颈部脱臼处死,严格按照无菌操作要求,依次剖开腹部
    皮肤、腹膜,采取灌注法于肝门-肠系膜静脉中收集成虫。将收集到的成虫在生理盐水中漂洗
    3次后分配到培养皿中,加入RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute)细胞培养液培养2
    小时后,镜检筛选活性良好的虫体用于荧光成像。

    (5)成虫荧光标记成像方法

    选取磷光配合物Ir-2作为荧光标记探针,磷光配合物Ir-2用二甲基亚砜(DMSO)溶解准
    确配制成1mmol的母液,然后用PBS缓冲液稀释成5μM的稀释液。移取200μL稀释液加入
    到培养皿中,用镊子挑取成虫加入到磷光配合物稀释液中,于室温下孵育5分钟至6小时后,
    将成虫转移到荧光成像专用器皿,在405nm激发下采用激光共聚焦荧光显微镜观察尾蚴的磷
    光标记情况,并采集520-620nm的磷光信号进行荧光成像。

    (6)荧光标记结果

    具体标记结果参见图3和图4,从荧光成像图可以得出:磷光配合物Ir-2能够对血吸虫成
    虫进行荧光标记成像。

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