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    一种 可溶性 B7DC 定量 检测 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110144488.1

    申请日:

    2011.05.31

    公开号:

    CN102250910A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利权人的姓名或者名称、地址的变更IPC(主分类):C12N 15/13变更事项:专利权人变更前:苏州大学变更后:苏州大学变更事项:地址变更前:215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号变更后:215137 江苏省苏州市相城区济学路8号|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/13申请日:20110531|||公开
    IPC分类号: C12N15/13; C12N5/20; C07K16/18; G01N33/577; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C12N15/13
    申请人: 苏州大学
    发明人: 陈永井; 张学光; 王勤; 白利雄; 施敏骅; 柏发蕊
    地址: 215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号
    优先权:
    专利代理机构: 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 代理人: 陶海锋
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110144488.1

    授权公告号:

    |||102250910B||||||

    法律状态公告日:

    2015.12.23|||2013.01.30|||2012.01.04|||2011.11.23

    法律状态类型:

    专利权人的姓名或者名称、地址的变更|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒,包括:本辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、洗液和终止液,其特征在于,所述试剂盒还包括:包被抗体、标准品蛋白和检测抗体,其中,所述包被抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2,所述检测抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体10D6。本发明所述可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒具有良好的特异性,可以精确地定量分析人细胞培养上清、血清、血浆和胸水等液体中的可溶性B7-DC蛋白因子的浓度;可应用在临床哮喘的鉴别诊断和治疗效果中。

    权利要求书

    1.一种核苷酸序列,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。2.一种核苷酸序列,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。3.一种核苷酸序列,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。4.一种核苷酸序列,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。5.鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2,其特征在于,所述单克隆抗体的重链具有序列表中SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:6所示氨基酸序列。6.鼠抗人B7-DC单克隆抗体10D6,其特征在于,所述单克隆抗体的重链具有序列表中SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:7所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:8所示氨基酸序列。7.杂交瘤细胞株,其特征在于,所述隆抗体杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-DC分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2),其保藏号为CGMCC?No.?4789。8.杂交瘤细胞株,其特征在于,所述隆抗体杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-DC分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6),其保藏号为CGMCC?No.?4790。9.一种可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒,包括:本辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、标准品蛋白、洗液和终止液,其特征在于,所述试剂盒还包括:包被抗体和检测抗体,其中,所述包被抗体为权利要求5所述鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2;所述检测抗体为权利要求6所述鼠抗人B7-DC单克隆抗体10D6。

    说明书

    一种人可溶性B7-DC定量检测试剂盒

    技术领域

    本发明涉及一种可定量检测人可溶性B7-DC的试剂盒,具体涉及一种利用两株特异性鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2和10D6以及B7-DCIg融合蛋白制备的用于定量检测分析可溶性B7-DC因子的酶联免疫检测试剂盒,该定量检测体系可应用遇哮喘鉴别诊断和疗效判断领域。

    背景技术

    已知许多受体/配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应,通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外,还需T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的第二信号,即协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失协同刺激信号,T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态,甚至凋亡??杉?,协同刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此,第一信号决定了T细胞活化的特异性,而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行。

    近年来,分子生物学技术广泛应用于免疫学研究,协同刺激分子被不断发现。根据其结构,这些协同刺激分子可分为两类:一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体超家族,包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL和Fas/FasL等。另一类是免疫球蛋白超家族,如B7/CD28、LAF1/ICAM-1、ICOS-GL50、PD-1/B7-DC、BTLA/HVEM和CD2/LFA-3等。这些协同刺激分子以受体/配体相互作用的方式传导信号。受体/配体一般表达在不同的免疫细胞表面,通常一个为持续性表达,一个呈诱导性表达的特征。在免疫应答的不同阶段,这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导,共同调控机体免疫反应的有效启动、适度应答和适时终止。

    PD-1(CD279)是由288个氨基酸组成的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,被认为与细胞凋亡相关而命名为程序性死亡-1(programmed?death-1,PD-1)。研究发现,PD-1分子主要在T、B、NK细胞表面呈诱导性上调表达,未成熟的T、B细胞在胸腺和骨髓内发育的特定阶段也有弱表达,PD-1分子C末端的酪氨酸残基可与下游的SHP-1、SHP-2等信号转导分子作用而抑制免疫细胞的进一步活化。B7-DC是PD-1的两个配体之一,与B7家族其它成员一样,在蛋白结构上B7-DC分子包含有IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区尾部。人B7-DC基因定位于9p24.2,可以编码247个氨基酸,其cDNA全长为1.7kb。人的B7-DC?mRNA在胎盘、肝癌细胞、乳癌细胞和神经母细胞中呈高表达,但在脾脏、淋巴结、胸腺和成纤维组织中呈低表达。B7-DC不仅表达在实质器官组织,在部分抗原递呈细胞上也有适度表达,如:活化的T细胞和树突状细胞。B7-DC的分布相对较局限,主要表达于活化的单核-巨噬细胞和树突状细胞(DCs)。外周单核细胞经IL-4和GM-CSF诱导产生的DC可高表达B7-DC。大量的研究表明,B7-DC与活化的T细胞上PD-1相互作用可显著抑制效应性T细胞的生物学功能,PD-1或B7-DC的表达改变将导致PD-1/PD-L抑制途径发生异常,进而引发机体产生免疫功能亢进/低下性疾病。

    PD-1/PD-L相互作用后抑制Bcl-xL的表达,对效应性T细胞多种转录因子的表达产生抑制,如:GATA-3、Tbet和Eomes。体外应用转染PD-1或FcγRⅡ-PD-1融合蛋白基因的B淋巴瘤细胞系的研究表明,PD-1可抑制B细胞受体的刺激性信号,从而降低B细胞活化。BCR与PD-1交联后可抑制Ca2+内流及下游信号激活分子如syk、PI3K、磷脂酶-3和vav的酪氨酸残基的磷酸化。有趣的是,这种抑制效应并不需要PD-1胞浆区N端位于ITIM活化抑制基序内的酪氨酸残基参与,而是由C端的酪氨酸残基与SHP-2酪氨酸磷酸酶结合的结果。此外,PD-1也可抑制更下游的信号激活分子—丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的酪氨酸残基磷酸化而抑制B淋巴瘤细胞系的增殖。另外,以Jurkat细胞株为模型的研究结果也表明TCR与PD-1的交联可引起SHP-2的磷酸化并向PD-1的胞浆区募集。

    PD-1/B7-DC在抗原刺激下能抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,并能拮抗CD28/B7介导产生的正性信号。B7-DC与其受体PD-1的结合对T细胞的抑制作用取决于TCR与CD28传导信号的强弱,增强TCR与CD28的传导可抵消PD-1/B7-DC的抑制作用。正性信号和负性信号的相对水平,决定着免疫应答的阈值。因此,若缺乏B7-DC与PD-1的相互作用,T细胞活化所需的TCR抑制信号的阈值降低,易引起自身免疫性疾病。作为负性协同刺激信号,B7-DC在机体免疫应答过程中无论广度还是深度均扮演着重要的角色,参与淋巴细胞活化,在免疫耐受和免疫损伤方面发挥着无可替代的作用。PD-1/B7-DC途径作为一种负性调控方式,高表达于许多非淋巴组织上,在外周耐受和自身免疫病的诱导中起着重要的作用。

    支气管哮喘在全球范围内盛行,特别是在发达国家的患病率正逐年上升,其发病主要与细胞、分子免疫功能缺陷所致的Ⅰ型变态反应有关。哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞、平滑肌细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症与气道高反应有关,通常引发广泛多变的可逆性气流受限,并引起反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状,多在夜间和(或)凌晨发生。

    哮喘是由多种细胞参与的慢性气道炎症,其中T淋巴细胞在始动和调节肺部炎症反应中起主导作用,T细胞通过合成和释放炎性介质导致炎性细胞聚集到气道从而发挥其效应功能。正常情况下?,肺部只有少量的T细胞,炎症反应时T细胞大量增加。辅助性T细胞按照其功能的不同分为Th1和Th2两群。Th2型主要分泌IL-4(促进B细胞合成IgE)、IL-5(促进嗜酸性粒细胞生长与分化)、IL-9(促进肥大细胞分化)、IL-13(促进粘液分泌、诱导气道高反应性),促进变态反应性炎症的发生,被认为是致哮喘发病的主要调节细胞。Th1型通过分泌IFN-γ对Th2细胞具有拮抗作用。因此,T细胞在哮喘的气道炎症中发挥着重要作用,其活化需要两种信号,一种是TCR/CD3与抗原提呈细胞(APCs)表面的MHC-抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号;另一种是非特异性抗原刺激信号,也就是我们常说的协同刺激信号。T细胞只有识别这两种信号才能活化、增殖,发挥功能,若缺乏共刺激信号则进入不应答状态,甚至凋亡。

    PD-1/B7-DC在抗原刺激下能抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,因此在哮喘的免疫应答中发挥着重要作用。Matsumoto发现了PD-L2高表达于致敏小鼠的肺树突状细胞和巨噬细胞,并且在抗原激发阶段给予抗PD-L2抗体,导致了AHR升高以及Th2型细胞因子的产生增加。Akbari等建立了哮喘小鼠模型,通过研究发现PD-L2表达的缺乏导致了小鼠AHR增高及气道炎症增强,进而提出PD-L2的表达在哮喘始发和进展过程中具有?;ぷ饔?。

    研究发现,许多协同刺激分子能分别以细胞膜型和可溶性两种形式存在,包括CD40、OX40L、4-1BBL、CD86、CD30和CTLA-4等??扇苄苑肿涌梢酝ü鞍姿饷噶呀庀赴系哪ば头肿佣纬?,例如:B7-H3和s4-1BBL;也可以由专一的mRNA编码产生,例如:sCD86和sCTLA-4。许多可溶性协同刺激分子的表达水平具有临床诊断价值,例如,可溶性CD40L(sCD40L)是活化的CD4+?T细胞和血小板表面膜型CD40L分子裂解而来,sCD40L水平在某些自身免疫疾病的血清中异常升高,原发性血小板增多症和动脉硬化患者的血清中sCD40L水平也较高??扇苄訡D30分子在某些肿瘤和艾滋?。ˋIDS)患者的血清中也呈现高水平表达。业已表明,机体中可溶性分子和膜表面的分子一样具有相应的生物学功能,一方面,细胞膜上的分子能够通过直接的受体/配体相互作用介导协同刺激信号;另一方面,可溶性蛋白因子能够像细胞因子一样参与血液循环在免疫应答中发挥重要的调节作用,它们既能够影响邻近细胞又能够和远端细胞表面的受体相互结合,从而参与疾病的发生、发展,其发挥作用的广度和深度远远超过细胞膜表面的分子。迄今为止,因缺乏有效的检测方法,国内外尚未有对可溶性B7-DC(sB7-DC)的研究报道。

    发明内容

    本发明的发明目的是提供一种可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒。

    为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案是:一种可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒,包括:本辣根过氧化物酶标记、反应底物四甲基联苯胺、牛血清白蛋白、酶标板、洗液和终止液,所述试剂盒还包括:包被抗体、标准品蛋白和检测抗体,其中,所述包被抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体,其重链具有序列表中SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:6所示氨基酸序列;所述检测抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体,其重链具有序列表中SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:7所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:8所示氨基酸序列。

    优选的技术方案中,所述包被抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2,由保藏号为的CGMCC?No.?4789的分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2)制备的单克隆抗体;所述检测抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体10D6,由保藏号为CGMCC?No.?4790的分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6)制备的单克隆抗体。

    上述技术方案中,杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4789,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年04月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所;杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4790,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年4月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所。

    上述技术方案中,所述标准品蛋白为标准品蛋白B7-DCIg蛋白,即普通的现有技术中的B7-DCIg蛋白本。

    上述技术方案中,所述洗液选自:含体积分数0.02%~0.2%的吐温20(Tween-20)的0.002M咪唑盐溶液或者PH7.4的PBS溶液,优选为含体积分数0.02%吐温20(Tween-20)的PH7.4的PBS溶液。

    上述技术方案中,所述终止液选自:2M的硫酸或者1%HCl溶液;优选为2M的硫酸。

    上述试剂盒除包括本发明的抗细胞表面B7-DC分子的单克隆抗体外,还可包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液和标准品等。

    上述可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒可以定量分析人体血清、血浆和组织液如,胸水、腹水中可溶性B7-DC因子的表达水平;可应用在临床哮喘的鉴别诊断和治疗效果中。

    本发明同时要求?;ひ恢趾塑账嵝蛄?,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

    本发明同时要求?;ひ恢趾塑账嵝蛄?,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

    本发明同时要求?;ひ恢趾塑账嵝蛄?,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

    本发明同时要求?;ひ恢趾塑账嵝蛄?,所述核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

    本发明同时要求?;ひ恢质罂谷薆7-DC单克隆抗体8F2,所述单克隆抗体的重链具有序列表中SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:6所示氨基酸序列。

    本发明同时要求?;ひ恢质罂谷薆7-DC单克隆抗体10D6,所述单克隆抗体的重链具有序列表中SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:7所示氨基酸序列;所述单克隆抗体的轻链具有序列表中SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列,或SEQ?ID?NO:8所示氨基酸序列。

    本发明同时要求?;ひ恢衷咏涣鱿赴?,所述隆抗体杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-DC分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2),其保藏号为的CGMCC?No.?4789。

    本发明同时要求?;ひ恢衷咏涣鱿赴?,所述隆抗体杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-DC分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6),其保藏号为的CGMCC?No.?4790。

    由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:

    1.本发明所述可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒具有良好的特异性,可以精确地定量分析人细胞培养上清、血清、血浆和胸水等液体中的可溶性B7-DC蛋白因子的浓度;可应用在临床哮喘的鉴别诊断和治疗效果中。

    2.本发明所述可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒具有良好的灵敏度,可在3.125~200ng/ml的sB7-DC浓度范围内保持良好的线性关系。

    附图说明

    杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4789,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年04月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所;杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4790,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年4月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所。

    图1为实施例一中抗体鉴定图;

    图2为实施例一中抗体的特异性分析图;

    图3为实施例一中抗原表位竞争实验结果图;

    图4为实施例三中人可溶性B7-DC?ELISA试剂盒的特异性分析结果图;

    图5为实施例四中人可溶性B7-DC?ELISA试剂盒线性检测标准曲线;

    图6为实施例四中哮喘患者发作期与稳定期外周血清中sB7-DC的表达水平图;

    图7为实施例四中哮喘患者治疗前后sB7-DC动态变化图。

    具体实施方式

    下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:

    实施例一:

    (1)试剂和材料:小牛血清Hyclone公司(美国);每升RPMI1640或DMEM培养基(Gibco,美国)中添加小牛血清100ml、L-谷氨酰胺0.15g、NaHCO3?2.0g、丙酮酸钠0.11g、葡萄糖3.6g、HEPES?4.766g、2-巯基乙醇10.0ml;HAT、HT选择培养基将50倍浓度的HAT、HT选择培养基(Sigma,美国),用RPMI1640或DMEM完全培养基稀释为工作浓度;福氏佐剂(Freund’adjuvant,Sigma,美国);细胞融合剂聚乙二醇(PEG1500);Protein?G亲和层吸柱(Pharmacia,瑞典);Pristane(Sigma,美国)。细胞培养瓶、板(Nunc,丹麦);CO2培养箱、离心机(Jouan,法国),倒置显微镜(O1ympus,日本),流式细胞仪(Coulter,美国);转人B7-DC基因细胞株L929/B7-DC(本人构建)。所有细胞株经检测,均无支原体污染;6~8周龄的雌性Balb/c小鼠(上海实验动物中心)。

    (2)细胞株的培养:采用含10%?FCS的RPMI1640培养基,L929/B7-DC和L929/mock基因转染细胞株定期用抗性筛选药物Zeocin(500μg/ml)加压培养,以保持目的基因产物的稳定高表达。

    (3)动物免疫:收集生长良好的L929/B7-DC细胞,用PBS洗涤二遍后,加入丝裂霉素溶液(50μg/100μl/1×107),混匀,置于37℃,45min,PBS洗涤三遍后,再用0.3~0.4ml的生理盐水重新悬浮,与等量的IFA充分乳化,分别于颈部皮下多点及腹腔注射(1×107/只);并于初次免疫后第三周、第五周再行免疫,将细胞数量改为8×106/只,细胞的预处理及注射的部位同上,于融合前4~5天,再次腹腔注射5×106/只以加强免疫。

    (4)骨髓瘤细胞的准备:融合前10~14天,复苏小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,用含10%?FCS的DMEM培养基传代培养,待细胞生长旺盛、形态良好,且细胞活力大于95%方可用于融合。融合前24~36h用新鲜培养基将细胞浓度调整为3×105/ml。

    (5)饲养细胞的准备:于融合前1天,取Balb/c小鼠,摘除眼球致死,自来水冲洗后置于75%酒精中10min,然后固定于解剖架上,沿胸骨打开小鼠胸腔,剪下胸腺,置于200目的钢丝网中,将筛网移入盛有10ml基础培养基的平皿中,研磨胸腺,使其成为单个细胞而悬于培养基中;吸取少许细胞悬液计数,1000rpm,离心8min,用完全培养基调整细胞浓度为3~4×105/ml,于96孔培养板中,每孔加入0.1ml细胞悬液(相当于3~4×104/孔),CO2培养箱中培养。

    (6)免疫小鼠脾脏细胞的制备:取加强免疫后的小鼠按上述方法处死,处理小鼠,打开腹腔,在左后腹部取出脾脏,经研磨获取单个脾脏细胞。用苔盼蓝液作活细胞有核计数,离心(1000rpm×8min),洗涤两遍后将沉淀细胞悬于20ml?RPMI1640中,置于培养箱中备用。

    (7)细胞的融合及选择性培养:将RPMI1640或DMEM基础培养基、PEG溶液置于37℃水浴中预温。收集2×107个生长良好的SP2/0细胞,与1×108个脾脏细胞混合于50ml透明塑料离心管中,用RPMI1640洗涤两遍,1000rpm?离心8min后弃尽上清,用手指弹击管底,使两种沉淀细胞充分混匀成糊状。将塑料管置于37℃保温杯中,吸取PEG溶液1ml,将尖头吸管轻轻插入细胞悬液底部,在1min内匀速加完,且边加边轻轻搅拌,然后在水浴中静置90s。再加入预温的无血清DMEM,室温静止5min,离心(800rpm×10min)后弃上清。将沉淀细胞轻轻重悬置于40ml含2%HAT、15%FCS的DMEM培养中?;煸群蟮渭釉诤兴茄赴?6孔培养板中,100μl/孔,37℃、5%CO2培养,3~4天半量换液,10天后改用?HT培养基,2周后转用含15%FCS的DMEM培养基。

    (8)杂交瘤细胞的筛?。捍赴寺〔悸?/3~1/4培养孔时,即可吸取上清用间接免疫荧光标记法进行筛选。将生长良好的L929/B7-DC细胞用PBS洗涤后,分加于流式管中(5×105/管),加入杂交瘤细胞的培养上清(50μl/管)。于4℃反应30min,用含1%小牛血清的PBS?洗涤两遍,加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗4℃反应30min,洗涤后用FACS分析,同时以L929/mock细胞作为阴性对照细胞株。

    用稳定表达人B7-DC的293T/B7-DC基因转染细胞进行筛选和鉴定,将复测为阳性的克隆连续3次克隆化培养,最终获得2株能持续分泌特异性抗人B7-DC分子的杂交瘤细胞株,命名为10D6和8F2,流式细胞仪检测结果显示,该单抗能特异性识别人B7-DC,而不与293T/mock基因转染细胞结合(图1)。

    (9)杂交瘤细胞的克隆化培养:采用有限稀释法,将抗体反应阳性孔细胞准确计数后,用HAT选择培养基梯度稀释为50个/ml和10个/ml细胞,加100μl/孔于含有饲养细胞的96孔培养板中,37℃、5%CO2培养。适时换液并根据细胞的生长状态及时按已建立的阳性克隆的筛选方法进行复筛。选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞继续克隆,直至抗体分泌阳性率大于95%;扩大培养并及时液氮冻存。

    (10)单克隆抗体的制备:采用腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6~8周龄的雌性Balb/c小鼠,腹腔注入Pristane?0.5ml/只。一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×107/只,同时另一侧腹腔再次注入Pristane和福氏半佐的等体积混合物0.2ml/只,轻轻按摩小鼠腹部,使杂交瘤细胞分散于腹腔中。5~10天后收获腹水,离心取上清分装后-80℃保存。

    (11)抗体纯化:将腹水解冻,离心去除凝块,饱和(NH4)2SO4溶液沉淀抗体蛋白后用PBS复溶。透析去除(NH4)2SO4,样品经Protein?G亲和层吸柱再用PH2.8甘氨酸-盐酸洗脱。收集蛋白洗脱峰用PH9.0的Tris-Base调节PH至7.0,PBS透析后用紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量,其浓度的计算公式为:抗体蛋白含量(mg/ml)=OD280×1.55-OD260×0.76,结果:单克隆抗体8F2和10D6浓度分别为1.55mg/ml和1.87mg/ml。

    (12)单克隆抗体效价测定:将生长良好的L929/B7-DC细胞分于流式管中,5×105/管。分别加入杂交瘤细胞的培养上清、腹水和纯化的抗体蛋白梯度稀释液(20μl/管),于4℃反应30min,PBS洗涤后加入羊抗鼠IgG-PE,再于4℃反应30min。洗涤后用流式细胞仪分析,以出现同样阳性率及荧光强度时的最大稀释倍数为抗体的效价,结果显示:两株抗体的效价均达1:10000以上。

    (13)单抗隆抗体的类型鉴定:取杂交瘤细胞培养上清1:50、腹水1:20000稀释。取0.2ml稀释液加于含有亚类定性试剂的小试管中,室温放置1min,待其自然溶解后轻轻混匀,将亚类定性试纸条轻轻插入管中,5~10min后,试纸的一面出现与mAb重链名称相对应的兰色蛋白显色条带,此即该抗体所属的小鼠Ig亚类;而另一面出现与mAb轻链名称相对应的兰色蛋白条带,此即该mAb的轻链类型;对单克隆抗体进行测序,测得鼠抗人B7-DC单克隆抗体8F2的重链如序列表中SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列,或如SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列;所述单克隆抗体8F2的轻链如序列表中SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列,或如SEQ?ID?NO:6所示氨基酸序列;所述检测抗体为鼠抗人B7-DC单克隆抗体10D6的重链如序列表中SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列,或如SEQ?ID?NO:7所示氨基酸序列;所述单克隆抗体10D6的轻链如序列表中SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列,或如SEQ?ID?NO:8所示氨基酸序列。

    (14)单克隆抗体的特异性鉴定:将L929/mock、L929/B7-H1、L929/B7-DC和L929/B7-H3等基因转染细胞与获得的抗人B7-DC单抗反应30min,PBS?洗涤后加入PE标记的羊抗鼠IgG二抗,继续反应30min,洗涤后用FACS分析细胞标记的荧光强度。用商品化抗人B7-DC单抗(MIH18)作阳性对照。将获得的单抗10D6和8F2与mock、B7-DC、B7-H1和B7-H3等基因转染细胞进行免疫荧光标记,结果显示,该单抗能特异性识别人B7-DC,而不与mock、B7-H1和B7-H3等基因转染细胞结合(图2)。

    (15)生物素标记单抗:取待标记的抗人B7-DC单抗(10D6)200μg,加入含有1ml的0.01M?PH=9.3碳酸缓冲液透析袋中,于4℃下透析平衡过夜后,加入浓度为1mg/ml的BNHS-DMSO溶液40μl,室温避光反应4小时,再于4℃下在PH7.2?PBS中透析72小时,分装后-20℃保存。

    (16)抗体竞争实验:将L929/B7-DC细胞(5×105/管)用PBS洗涤后分别加入单克隆抗体(每管2μg),4℃孵育30min,洗涤后加入biotin标记的单抗,再4℃孵育30min,洗涤后加入streptavidine-PE,4℃孵育30min并洗涤后用流式细胞仪分析,同时设阳性和阴性对照组。

    结果显示,不同浓度的10D6均不能有效阻断Biotin标记的8F2与L929/B7-DC的结合。因此,10D6识别的抗原表位不同于8F2(图3)。

    将上述两株杂交瘤细胞株进行保藏,杂交瘤细胞株SIPD-L2(8F2)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4789,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年04月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所;杂交瘤细胞株SIPD-L2(10D6)的保藏信息为:保藏号:CGMCC?No.?4790,分类命名:分泌小鼠抗人PD-L2分子单克隆抗体杂交瘤细胞株,保藏日期:2011年4月27日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址:北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所。

    实施例二:

    一种可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒,包括以下组分:

    (1)?包被抗体:鼠抗人B7-DC单抗(8F2),30μg/管,1管;

    (2)?标准品蛋白:B7-DC?Ig蛋白(R&D),25ng/管,1管;

    (3)?检测抗体:鼠抗人B7-DC单抗(Biotin-10D6),10μg/管,1管;

    (4)?Streptavidin-HRP?(Sigma-Aldrich),1μl//管,1管;

    (5)?TMB(Sigma-Aldrich),10ml;?

    (6)?BSA(上海生工),2g/100ml,30ml;?

    (7)?ELISA板(Costar),1块;

    (8)?洗液:10×PBS,100?ml;Tween-20,0.5?ml;

    (9)?终止液:2M?H2SO4,5?ml;

    贮存条件:?

    实施例三:

    分析实施例二所述人可溶性B7-DC?ELISA试剂盒的特异性:?

    将B7.1Ig、OX40Ig、B7-DCIg和B7-H4Ig连续倍比稀释成不同的浓度??谷薆7-DC单抗(8F2)用碳酸盐缓冲液(0.01M?CBS,pH9.3)调整为3μg/ml包被ELISA检测板,4℃过夜。PBS(含0.1%?Tween?20)洗涤3次,2%?BSA?室温封闭1h。PBS洗涤3次后加入上述稀释好的商品化蛋白,室温反应2h,PBS洗涤3次。然后,加入生物素标记的单抗biotin-10D6(1μg/ml,100μl/孔),室温继续反应1h,PBS洗涤3次后,加入Streptavidin-HRP(1:3000,100μl/孔),室温反应1h,PBS洗涤6-8次,再加入HRP反应底物TMB(100μl/孔),室温反应10-15min,用2mol/L?H2SO4终止反应,用酶标仪测定OD450,每个样品设置3个复孔。

    特异性分析结果如图4所示。

    实施例四:

    采用实施例二所述可定量检测可溶性B7-DC的试剂盒定量分析人血清液体中的可溶性B7-DC蛋白因子的浓度

    (一)样品处理:

    血清样本:2500?rpm×10?min,-20℃?保存,避免反复冻融。

    (二)操作步骤:

    1.?包被抗体8F2用0.01M?CBS?(pH9.6)缓冲液配制成2.5μg/ml浓度的包被抗体工作液,按100μl/孔加入ELISA板,于4℃静置过夜;?????

    2.?弃包被液,用0.01M?PB洗板3次;加入1%BSA?200μl/孔,室温封闭1h;

    3.?弃掉封闭液,0.01M?PB洗板3次;以PBS(含0.5%BSA)为样品稀释液,准备测定样品。标准蛋白:取7个EP管,每管加入100μl稀释液并置于EP管架上;将100μl?250ng/ml?B7-H1Ig纯品蛋白加到第一个EP管,混匀后再取100μl到第二个EP管进行倍比稀释,依此类推至第7管。血清样品按100μl/孔加入ELISA板;检测抗体Biotin-10D6用抗体稀释液调整至终浓度为0.5μg/ml;

    4.?加入标准品和待测样品100μl/孔,室温反应2h;

    5.?弃尽样品后用0.01M?PB洗板3次;加入检测抗体Biotin-10D6。Streptavidin-HRP(1:3000),100μl/孔,室温反应1h;

    6.?弃尽反应液用0.01M?PB(含0.2%?Tween20)洗板5-6次;加入Streptavidin-HRP(1:3000),100μl/孔,室温反应1h;

    7.?弃尽反应液用0.01M?PB(含0.2%?Tween20)洗板8-10次;

    8.?加入反应底物TMB,100μl/孔,室温避光反应10-15min;2M?H2SO4终止;

    9.?应用酶标仪选择OD450?nm波长测定ELISA板各检测孔的OD读数;??

    (三)结果分析:

    1.?标准品OD值采用GraphPad?Software软件利用最佳的拟合曲线列出最合适的函数方程;

    2.?样品/对照孔的OD值代入方程,并乘以相应的稀释倍数,计算出样品和对照孔的相应浓度;

    3.?样品孔取复孔的平均值;

    (四)实验应用举例:

    1.?原始数据:

    2.?曲线方程:

    y?=?0.0035x?+?0.1276???

    R2?=?0.9964

    3.?制得标准曲线如图5:

    (五)精确性分析:

    方法:

    1.批内精确性分析:在同一次实验中,将三个已知浓度的样本(100,?50,?25?ng/ml)分别设20个复孔,进行sB7-DC检测,分析该试剂盒的准确性;

    2.批间精确性分析:在此不同实验室中,将三个已知浓度的样本(100,?50,?25ng/ml)分别进行sB7-DC检测,分析该试剂盒的准确性;

    结果:

    结论:变异系数CV<10%,证实检测方法均具有良好的准确性。

    (六)实验举例:

    1、分析哮喘患者发作期与稳定期外周血清中sB7-DC的表达水平,得图6;

    2、分析哮喘患者治疗前后sB7-DC动态变化,得图7。

    综上所述,可以使用本发明特异性测定可溶性B7-DC的ELISA试剂盒对哮喘进行诊断及分期,对哮喘患者在临床治疗过程中的效果进行评价。哮喘患者血清中存在sB7-DC的表达,且这种表达水平随着治疗的好转升高,直至健康者水平。所描述的试剂盒除包括本发明的抗细胞表面B7-DC分子的单克隆抗体外,还可包括血液样品收集装置以及相关溶剂、缓冲液和标准品等。

    核苷酸和/或氨基酸序列表

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