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    重庆时时彩在哪里买到: 复合膜修饰的DNA传感器及其制备方法和在检测LIP特定编码基因片段中的应用.pdf

    关 键 词:
    复合 修饰 DNA 传感器 及其 制备 方法 检测 LIP 特定 编码 基因 片段 中的 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110097748.4

    申请日:

    2011.04.19

    公开号:

    CN102253092A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 27/26申请日:20110419授权公告日:20130529终止日期:20170419|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/26申请日:20110419|||公开
    IPC分类号: G01N27/26; G01N27/327; C12Q1/68; C12Q1/28 主分类号: G01N27/26
    申请人: 湖南大学
    发明人: 章毅; 曾光明; 晏铭; 汤琳; 黎媛萍; 刘灿; 李贞
    地址: 410082 湖南省长沙市河西岳麓山湖南大学环境科学与工程学院
    优先权:
    专利代理机构: 湖南兆弘专利事务所 43008 代理人: 赵洪;杨斌
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110097748.4

    授权公告号:

    |||102253092B||||||

    法律状态公告日:

    2018.05.04|||2013.05.29|||2012.01.04|||2011.11.23

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种复合膜修饰的DNA传感器,包括一碳糊电极,碳糊电极包括碳棒、聚四氟乙烯管、磁体和碳糊,碳糊电极的感应端包覆有敏感物质,敏感物质包括复合膜和DNA捕获探针,复合膜由依次修饰于碳糊电极表面的磁性纳米颗粒、多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及壳聚糖组成,DNA捕获探针修饰于多壁碳纳米管-金纳米粒子表面;并相应公开一种该DNA传感器的制备方法,包括制作碳糊电极和将敏感物质修饰于制得的碳糊电极感应端表面等工艺步骤;还公开该DNA传感器在检测Lip特定编码基因片段中的应用。本发明的DNA传感器,将敏感物质其修饰于碳糊电极表面,电子传导能力强和检测精度高;本发明的制备方法,成本低廉,工艺简单。

    权利要求书

    1.一种复合膜修饰的DNA传感器,包括一碳糊电极,所述碳糊电极包括碳棒和聚四氟
    乙烯管,所述碳棒内置于所述聚四氟乙烯管中,所述碳棒一端通过电线引出所述聚四氟乙烯
    管,所述碳棒另一端与一磁体相接触,所述磁体与所述聚四氟乙烯管管口间填充有碳糊,所
    述碳糊电极的感应端包覆有敏感物质,其特征在于:所述敏感物质包括复合膜和巯基化的
    DNA捕获探针,所述复合膜由依次修饰于所述碳糊电极表面的巯基化的磁性纳米颗粒、巯基
    化的多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及壳聚糖组成,所述DNA捕获探针修饰于所述多壁碳纳
    米管-金纳米粒子表面。
    2.根据权利要求1所述的复合膜修饰的DNA传感器,其特征在于:所述磁体设置于距
    所述聚四氟乙烯管的管口不大于8mm处。
    3.根据权利要求1或2所述的复合膜修饰的DNA传感器,其特征在于:所述DNA捕获
    探针的序列为5′-HS(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3′。
    4.一种如权利要求1或2或3所述的复合膜修饰的DNA传感器的制备方法,其特征在
    于,包括以下工艺步骤:
    (1)制作碳糊电极:在聚四氟乙烯管中放入碳棒,并在所述碳棒一端置入磁体,形成
    磁性区域,所述的磁体与聚四氟乙烯管管口之间用碳糊填充,碳棒另一端通过电线引出聚四
    氟乙烯管,得到碳糊电极的粗坯,再将所述粗坯进行表面处理,得到碳糊电极;
    (2)修饰碳糊电极表面:将制备好的磁性纳米颗粒和多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及
    壳聚糖溶液依次修饰到步骤(1)制得的碳糊电极的感应端表面,自然晾干后得到复合膜修饰
    的碳糊电极,再将准备好的巯基化的DNA捕获探针滴在经复合膜修饰的碳糊电极感应端表
    面,自组装后,得到复合膜修饰的DNA传感器。
    5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述磁性纳米颗粒是通过以下步骤制
    备得到:在氮气?;は轮票窮e3O4胶状沉淀,然后依次加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨
    丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸,反应后得到巯基化的磁性纳米颗粒。
    6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述多壁碳纳米管-金纳米粒子是通过
    以下步骤制备得到:将多壁碳纳米管纯化,再与半胱氨酸反应,使多壁碳纳米管巯基化,然
    后将巯基化的多壁碳纳米管与金纳米粒子反应,得到巯基化的多壁碳纳米管-金纳米粒子。
    7.一种利用如权利要求3所述的复合膜修饰的DNA传感器对木质素过氧化物酶特定编
    码基因片段进行检测的方法,包括以下步骤:
    (1)选取目标链及设计信号探针:
    选取目标链的序列为5′-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;根据目标链的序列,设计信
    号探针的序列为5′-Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;
    (2)竞争杂交反应:将所述的信号探针和待测溶液滴入所述复合膜修饰的DNA传感器
    的感应端表面,竞争反应不少于60分钟;
    (3)信号酶放大:再将pH为中性、且含有亲和素-辣根过氧化物酶的磷酸盐缓冲溶液,
    滴在竞争杂交反应后的DNA传感器的感应端表面,生理温度下反应不少于30分钟,形成辣
    根过氧化物酶信号酶联放大体系;
    (4)酶催化反应:最后以苯二酚和H2O2为底物,以含有所述辣根过氧化物酶信号酶联
    放大体系的DNA传感器为工作电极,建立三电极系统的电解池,采用计时电流法测定酶催
    化反应过程中产生的还原电流变化,若还原电流下降幅度不低于6.9%,判定待测溶液中含有
    木质素过氧化物酶特定编码基因片段,完成检测。
    8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,如果判定待测溶液中含有质素过氧化
    物酶特定编码基因片段,再根据以下的线性回归方程检测待测溶液中所述木质素过氧化物酶
    特定编码基因片段的浓度大??;
    所述线性回归方程为:DP%=(3.4908±0.1725)x+(29.8172±0.6892),其中,DP%
    为电流下降比,x为所述木质素过氧化物酶特定编码基因片段浓度的自然对数,浓度检测的
    线性范围为0.001μmol·L-1~1μmol·L-1,检测下限为1nmol·L-1。
    9.根据权利要求7或8所述的检测方法,其特征在于:所述步骤(4)中的三电极系统
    是以饱和甘汞电极作为参比电极,以铂片电极作为对电极。
    10.根据权利要求7或8所述的检测方法,其特征在于:所述电解池中进行检测的还原
    电位为-0.3V~-0.2V,所述电解池溶液为pH值为中性的磷酸盐缓冲溶液。

    说明书

    复合膜修饰的DNA传感器及其制备方法和在检测Lip特定编码基因片段中的应用

    技术领域

    本发明涉及生物传感器领域,尤其涉及一种经过膜修饰后的生物传感器及其制备方法和
    应用。

    背景技术

    采用生物传感技术检测基因片段是基因分析检测的一个趋势,其中电化学传感器受到
    广泛的关注,因为其具备响应快速,高灵敏,高选择性和可操作性强等优点。对于DNA
    传感器,常见的工作电极是金电极或者基于纳米金的筛网印刷电极,因为修饰有巯基的基因
    探针通过巯基与金的交联,很容易装配在电极表面,进行相关检测。不过,金电极价格昂贵,
    而筛网印刷电极是一次性电极,对于大量检测而言,其总花费也很可观。近年,随着新型纳
    米材料与电化学传感技术迅猛结合,一类基于顺磁性固定技术的电化学传感器得到发展迅
    速。这类传感器将碳糊填充到聚四氟乙烯(PTFE)管中,并把磁体嵌入电极前部的碳糊
    中,形成在电极前端表面具有固定磁场的碳糊电极,进而,再利用顺磁性吸引固定功能化
    的磁性纳米颗粒,构建不同的传感器用于相关目标物的特异性检测。从运行成本角度而言,
    采用经济的磁性纳米颗粒和碳糊电极代替上述两类电极进行基因片段检测,不失为一种可行
    的办法。但是有一个问题不容忽视:碳糊电极的电子传导能力明显低于金电极,会降低基因
    传感技术的检测精度。

    为了改善碳糊电极的电子传导能力,在传感器构建策略中,结合新型材料学相关特点,
    使用一些纳米材料和生物分子材料形成复合膜结构修饰在碳糊电极表面。纳米材料,例如碳
    纳米管、磁性纳米粒子和金纳米粒子等因为具有高电子传导性,能提供大比表面积,保持生
    物活性等优点,被认为是优秀的生物分子载体和信号传递媒介,可以改善电化学传感器的灵
    敏度。除了纳米材料,一种生物分子材料,壳聚糖因无毒、生物适应性强、具有成膜能力等
    特点也被广泛应用于生物传感器的构建中。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是:针对现有技术的不足,提供一种成本低、电子传导能力
    强、检测精度高的复合膜修饰的DNA传感器,还相应提供一种该DNA传感器的制备方法和
    该DNA传感器在检测木质素过氧化物酶(Lip)特定编码基因片段中的应用。

    为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:

    一种复合膜修饰的DNA传感器,包括一碳糊电极,所述碳糊电极包括碳棒和PTFE管,
    所述碳棒内置于所述PTFE管中,所述碳棒一端通过电线引出所述PTFE管,所述碳棒另一
    端与一磁体相接触,所述磁体与所述PTFE管管口间填充有碳糊,所述碳糊电极的感应端包
    覆有敏感物质,所述敏感物质包括复合膜和巯基化的DNA捕获探针,所述复合膜由依次修
    饰于所述碳糊电极表面的巯基化的磁性纳米颗粒、巯基化的多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及
    壳聚糖组成,所述DNA捕获探针修饰于所述多壁碳纳米管-金纳米粒子表面。

    作为对上述方案的进一步改进,所述磁体设置于距所述聚四氟乙烯管的管口不大于
    8mm处。

    上述技术方案中,所述DNA??捕获探针的序列优选为
    5′-HS(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3′。

    作为一个总的技术构思,本发明还提供一种上述复合膜修饰的DNA传感器的制备方法,
    包括以下步骤:

    (1)制作碳糊电极:在PTFE管中放入碳棒,并在所述碳棒一端置入磁体,形成磁性区
    域,所述磁体与PTFE管管口之间用碳糊填充,碳棒另一端通过电线引出PTFE管,得到碳
    糊电极的粗坯,再将所述粗坯进行表面处理,得到最终的碳糊电极;

    (2)修饰碳糊电极表面:将制备好的磁性纳米颗粒和多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及
    壳聚糖溶液依次修饰到步骤(1)制得的碳糊电极的感应端表面,自然晾干后得到复合膜修饰
    的碳糊电极,再将准备好的巯基化的DNA捕获探针滴在经复合膜修饰的碳糊电极感应端表
    面,自组装后,得到复合膜修饰的DNA传感器。

    上述制备磁性纳米颗粒的工艺过程优选为:在氮气?;は轮票窮e3O4胶状沉淀,然后依次
    加入聚乙二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸,反应后得到巯基化的磁
    性纳米颗粒。

    上述制备多壁碳纳米管-金纳米粒子的工艺过程优选为:将多壁碳纳米管纯化,再与半胱
    氨酸反应,使多壁碳纳米管巯基化,然后将巯基化的多壁碳纳米管与金纳米粒子反应,得到
    巯基化的多壁碳纳米管-金纳米粒子。

    本发明的DNA传感器的复合膜的修饰过程和DNA捕获探针的自组装原理如图2所示。

    作为一个总的发明构思,本发明还提供利用上述的复合膜修饰的DNA传感器(DNA捕
    获探针的序列为5′-HS(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3′)对Lip特定编码基因片段进
    行检测的方法,包括以下步骤:

    (1)选取目标链的序列,以及设计信号探针的序列:

    目标链的序列为5′-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;根据目标链的序列,设计信号探
    针的序列为5′-Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;

    (2)竞争杂交反应:将所述的信号探针和待测溶液滴入所述复合膜修饰的DNA传感器
    的感应端表面,竞争反应不少于60分钟;

    (3)信号酶放大:再将pH为中性、含有亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)的磷酸盐
    缓冲溶液滴在竞争杂交反应的DNA传感器表面,生理温度(例如37℃)下反应不少于30分
    钟,形成信号酶联放大体系;

    (4)酶催化反应:最后以苯二酚和H2O2为底物,以含有所述辣根过氧化物酶(HRP)
    信号酶联放大体系的DNA传感器为工作电极,建立三电极系统的电解池,采用计时电流法
    测定酶催化反应过程中产生的还原电流变化,若还原电流下降幅度不低于6.9%,判定待测溶
    液中含有木质素过氧化物酶特定编码基因片段,完成检测。

    上述检测方法是基于以下原理(如图3所示)完成:信号探针上标记的HRP,可以在
    H2O2存在的条件下催化分解对苯二酚,当在电解池中加入对苯二酚和H2O2后,HRP使对苯
    二酚上的一个羟基失去H+,变成双键的羰基,再由电极表面提供电子使其还原,这一过程会
    产生可检测的响应信号达到识别目的,并根据所产生的信号的强弱对应Lip特定编码基因片
    段的含量,从而实现对Lip特定编码基因片段的测定。

    上述技术方案中,所述电解池中进行检测的还原电位优选为-0.3V~-0.2V,最优选为
    -0.252V,所述电解池溶液优选为pH值中性的磷酸盐缓冲溶液。

    上述技术方案中,如果判定待测溶液中含有木质素过氧化物酶特定编码基因片段,则可
    根据目标链基因浓度与电化学杂交信号之间的线性关系,建立线性回归方程,测定待测溶液
    中含有木质素过氧化物酶特定编码基因片段的浓度的大小,线性回归方程可通过以下方法得
    到:

    重复上述检测方法的步骤(2)~(4),检测一系列已知不同浓度的Lip特定编码基因片
    段的杂交液,并根据每一特定浓度下的电流响应结果(参见图4),可得出目标链基因浓度与
    电化学杂交信号之间的线性关系,即可建立线性回归方程,通过实验,得出的线性方程为:
    DP%=(3.4908±0.1725)x+(29.8172±0.6892)(见图5),其中,DP%为电流下降比,
    I0为目标链未参与竞争杂交反应时HRP的催化还原电流,Ix为目标链
    参与竞争杂交反应时HRP的催化还原电流;x为目标链浓度的自然对数,浓度的线性范围为
    0.001μmol·L-1~1μmol·L-1,检测下限为1nmol·L-1;该线性回归方程可作为以后Lip特定编码
    基因片段浓度计算的依据。

    与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明结合新型生物分子和纳米材料,将碳纳米
    管、磁性纳米粒子和金纳米粒子等纳米材料和壳聚糖修饰于碳糊电极表面,构建电化学DNA
    传感器,极大增强碳糊电极的电子传导能力,从而提高检测精度;本发明的制备复合膜修饰
    的DNA传感器方法,成本低廉,工艺简单;利用本发明的复合膜修饰的DNA传感器对Lip
    特定编码基因片段进行检测,能高效、低成本检测基因的动态变化情况,从而可为微生物降
    解木质素的监测和控制过程提供一种有效的分子生物学工具。

    附图说明

    图1为本发明的复合膜修饰的DNA传感器的结构示意图;

    图2为本发明的复合膜修饰的DNA传感器的复合膜及捕获探针的装配示意图;

    图3为本发明的复合膜修饰的DNA传感器的杂交反应原理图;

    图4为本发明构建线性方程过程中用计时电流法检测不同浓度的Lip特定编码基因片段
    得到的电流-时间变化曲线图。

    图5为本发明的Lip特定编码基因片段含量与电流变化的线性回归图。

    图例说明:

    1、电线;2、PTFE管;3、碳棒;4、磁体;5、碳糊;6、敏感物质(复合膜结构及DNA
    捕获探针)。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步的说明。

    一种如图1所示的复合膜修饰的DNA传感器,包括一碳糊电极,碳糊电极包括碳棒3
    和PTFE管2,碳棒3内置于PTFE管2中,碳棒3一端通过电线1引出PTFE管2,碳棒3
    另一端与一磁体4相接触,磁体4设置于紧邻碳棒3一端且距PTFE管2的管口8mm处,磁
    体4与PTFE管2管口间填充有碳糊5,碳糊电极的感应端包覆有敏感物质6,敏感物质6包
    括复合膜和巯基化的DNA捕获探针(序列为5′-HS(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3′),
    复合膜由依次修饰于碳糊电极表面的巯基化的磁性纳米颗粒、巯基化的多壁碳纳米管-金纳米
    粒子、以及壳聚糖组成,DNA捕获探针修饰于多壁碳纳米管-金纳米粒子表面。

    一种上述复合膜修饰的DNA传感器的制备方法,包括以下具体步骤:

    (1)制作碳糊电极:在PTFE管中放入碳棒,紧邻碳棒一端且距PTFE管管口8mm处
    放入磁体,形成磁性区域,磁体与PTFE管管口之间用碳糊填充,碳棒另一端通过电线引出
    PTFE管,得到碳糊电极的粗坯,再将电极粗坯的表面抛光,然后用水冲洗电极表面,再依次
    用HNO3(质量分数为50%)、丙酮、水进行超声清洗,最后再用磷酸盐缓冲液冲洗,自然晾
    干,得到最终的碳糊电极;

    (2)制备磁性纳米颗粒和多壁碳纳米管-金纳米粒子复合膜:

    制备磁性纳米颗粒的工艺过程为:在氮气?;は轮票窮e3O4胶状沉淀,然后依次加入聚乙
    二醇、正硅烷乙酯、甲醇、氨丙基三甲氧基硅烷和半胱氨酸,反应后得到巯基化的磁性纳米颗
    粒;

    制备多壁碳纳米管-金纳米粒子的工艺过程为:用H2O2与硫酸混合液将多壁碳纳米管纯
    化,真空干燥后,将其与半胱氨酸反应,修饰上巯基,再将巯基化的多壁碳纳米管与金纳米
    粒子反应,得到巯基化的多壁碳纳米管-金纳米粒子

    (3)修饰碳糊电极表面:将制备好的磁性纳米颗粒和多壁碳纳米管-金纳米粒子、以及
    壳聚糖溶液依次修饰到步骤(1)制得的碳糊电极的感应端表面,自然晾干后得到复合膜修饰
    的碳糊电极,再将准备好的巯基化的DNA捕获探针(序列为
    5′-HS(CH2)6TTGTTGACGAAGGACTGCCA-3′)滴在经复合膜修饰的碳糊电极感应端表面,
    通过巯基与金的作用进行自组装,再用缓冲液冲洗,晾干后得到复合膜修饰的DNA传感器。

    利用上述实施例制得的DNA传感器,分别对浓度为0.012μmol·L-1、0.59μmol·L-1和
    0.22μmol·L-1的Lip特定编码基因片段待测样品进行测定,每一种浓度的Lip特定编码基因片
    段待测样品的检测均以下列步骤进行:

    (1)选取目标链及设计信号探针:

    选取目标链的序列为5′-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;根据目标链的序列,设计信
    号探针的序列为5′-Biotin-TGGCAGTCCTTCGTCAACAA-3′;

    (2)竞争杂交反应:将信号探针和目标链待测样品分别滴入含有捕获探针的DNA传感
    器的电极表面,37℃下竞争反应60分钟;

    (3)信号酶放大:再将含有SA-HRP的磷酸盐缓冲溶液(pH?6.98)滴在经竞争杂交反
    应的DNA传感器表面,37℃下反应30分钟,形成信号酶联放大体系;

    (4)酶催化反应:在含有1mmol·L-1对苯二酚的磷酸盐缓冲液(pH?7.38)中加入0.5
    mmol·L-1H2O2,以对苯二酚和H2O2为底物,以含有HRP信号酶联放大体系的DNA传感器
    为工作电极,以饱和甘汞电极优选作为参比电极,以铂片电极优选作为对电极,建立三电极
    系统的电解池,采用计时电流法,测定DNA传感器在还原电位-0.252V下,HRP与底物催化
    反应产生的还原电流变化(电化学测定是采用上海辰华仪器公司生产的CHI660B电化学系统
    与50mL电解池中的三电极系统相连接,以进行控制与监测),测试结果如下表1所示,由下
    表1可见,三种待测溶液的还原电流下降幅度均不低于6.9%,由此可判定三种待测溶液中均
    含有木质素过氧化物酶特定编码基因片段;

    (5)定量分析:根据下表1中所测得的还原电流下降幅度,并结合已构建的线性回归方
    程DP%=(3.4908±0.1725)x+(29.8172±0.6892),可测定出三组待测样品中Lip特定编
    码基因片段浓度值,检测结果见下表1。

    表1:三种不同浓度待测样品的检测结果

    ??待测样品μmol·L-1
    ??还原电流下降幅度%
    ??测定浓度μmol·L-1
    ??回收率%
    ??0.012
    ??14.4
    ??0.013±0.001
    ??105.8
    ??0.59
    ??27.6
    ??0.608±0.010
    ??102.1
    ??0.22
    ??24.7
    ??0.212±0.01
    ??97.4

    从上述测定结果可以清楚地看出,本方法操作简便,灵敏度高,选择性好,能够高效、
    低成本在线检测Lip特定编码基因片段含量,为微生物降解木质素的监测和控制过程提供了
    技术支持。

    以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的?;し段Р⒉唤鼍窒抻谏鲜鍪凳├?,凡
    属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的?;し段?。应当指出,对于本技术领域的普通
    技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,均应视为本发明的?;し段?。


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    本文标题:复合膜修饰的DNA传感器及其制备方法和在检测LIP特定编码基因片段中的应用.pdf
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