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    重庆时时彩最长单双几期没开: 龙血竭中提取总黄酮对初级感觉神经元两种钠通道电流的作用.pdf

    关 键 词:
    血竭 提取 黄酮 初级 感觉 神经元 两种钠 通道 电流 作用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010177896.2

    申请日:

    2010.05.20

    公开号:

    CN102251012A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/02申请公布日:20111123|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/02申请日:20100520|||公开
    IPC分类号: C12Q1/02; G01R19/00 主分类号: C12Q1/02
    申请人: 刘向明; 陈素
    发明人: 刘向明; 陈素
    地址: 430074 湖北省武汉市洪山区民院路708号中南民族大学
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010177896.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.08.20|||2013.04.10|||2011.11.23

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明为从龙血竭中提取的黄酮部位(血竭总黄酮)对初级感觉神经元电压门控性钠通道电流的调制作用,这种作用表现为对疼痛的发生和传导的抑制,临床上产生镇痛作用。本发明属药理学和分子生物学领域。本发明是通过两个步骤来实现的:第一步,从龙血竭中提取分离黄酮部位。第二步,应用全细胞膜片钳技术观察血竭总黄酮对初级感觉神经元电压门控性钠通道电流的调制作用。本发明首次提出血竭总黄酮对初级感觉神经元电压门控性钠通道电流的调制作用,说明了龙血竭的镇痛机理,为人类以血竭总黄酮为先导化合物研发新的镇痛药提供了理论依据。

    权利要求书

    1.从龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮),应用全细胞膜片钳技术研究血
    竭总黄酮对初级感觉神经元(三叉神经节(TG)和背根神经节(DRG))对电压门控
    性钠通道(河豚毒素不敏感型(TTX-R)和河豚毒素敏感型(TTX-S))电流的调制,
    这种作用表现为对疼痛的发生和传导的抑制,临床上产生镇痛作用。
    2.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元河豚毒素不敏
    感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:血竭总黄酮是龙血竭抑制初级感觉神经元
    TTX-R钠通道电流的有效部位,以及血竭总黄酮对初级感觉神经元河豚毒素不敏
    感型(TTX-R)钠电流峰值的浓度依赖性抑制作用。
    3.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元河豚毒素敏感
    型(TTX-S)钠通道,其特征在于:血竭总黄酮对初级感觉神经元河豚毒素敏感
    型(TTX-S)钠通道电流的抑制作用。
    4.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)细胞电压门控
    性钠通道,其特征在于:血竭总黄酮促使三叉神经节(TG)细胞河豚毒素敏感
    (TTX-S)型钠通道电流和背根神经节(DRG)河豚毒素不敏感型(TTX-R)以及河
    豚毒素敏感(TTX-S)型钠通道电流I-V曲线的峰值明显地往向去极化方向偏移
    的作用。
    5.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒素不敏
    感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常三叉神经节(TG)河豚毒素不敏感(TTX-R)
    型钠电流半激活电压为(-21.92±1.41)mv(n=10)给予1g/L血竭总黄酮成分后半
    激活电压变为(-20.91±1.83)mv(n=10,P>0.05)。
    6.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒素不敏
    感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常三叉神经节(TG)河豚毒素不敏感(TTX-R)
    型钠电流半失活电压为(-29.03±1.72)mv(n=10),给予1g/L血竭总黄酮后半
    失活电压变为(-40.75±2.34)mv(n=10,P>0.05)。
    7.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒素不敏
    感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常三叉神经节(TG)河豚毒素不敏感型钠
    电流失活后恢复的时间常数为(5.37±0.35)ms(n=10),给予1g/L血竭总黄酮
    后半失活电压变为(10.45±0.61)ms(n=10,P<0.05)。
    8.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于背根神经节(DRG)河豚毒素敏
    感型(TTX-S)钠通道,其特征在于:正常背根神经节(DRG)河豚毒素敏感(TTX-S)
    型钠电流半激活电压为(-34.6±3.7)mv(n=20)给予0.05g/L总黄酮后半激活电
    压变为(-14.7±5.6)mv(n=10)。
    9.根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于背根神经节(DRG)河豚毒素不
    敏感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常背根神经节(DRG)河豚毒素敏感(TTX-S)
    型钠电流半失活电压为(-78.1±5.8)mv(n=20),给予0.05g/L总黄酮后半失活
    电压变为(-105.6±6.4)mv(n=10)。
    10.根据权利要求1所述的在配制龙血竭和血竭总黄酮溶液时,按照从龙血
    竭中提取的终产物的质量比例关系设定龙血竭的浓度和血竭总黄酮浓度的比例
    关系,从而保证了血竭总黄酮中所含的化学成分与龙血竭中所含的化学成分在
    质量比例关系上的一致性。

    说明书

    龙血竭中提取总黄酮对初级感觉神经元两种钠通道电流的作用

    技术领域

    本发明为从龙血竭中提取的黄酮部位(血竭总黄酮)对初级感觉神经元电压
    门控性钠通道电流的调制作用,这种作用表现为对疼痛的发生和传导的抑制,临
    床上产生镇痛作用,特别是涉及药理学和分子生物学领域。

    背景技术

    疼痛是危及人类健康的主要问题之一,因此研究开发高效、无副作用的以血
    竭总黄酮为先导化合物的新型镇痛药物已成为当今临床医学和新药研究的热点
    方向。龙血竭是传统药物傣药中的一味常用药材,现代药理学实验表明,龙血竭
    对腹腔注射冰醋酸引起的小鼠扭体反应具有明显的抑制作用,提示其具有镇痛作
    用。临床疗效观察也证实其在治疗痔疮、痛经、溃疡以及急性软组织损伤等疾病
    时表现出较好的镇痛效果,急性和慢性毒理学实验则表明,龙血竭毒性很低。因
    而龙血竭中产生镇痛效应的化学成分极具开发成一种安全有效、成瘾性低的以血
    竭总黄酮为先导化合物的新型镇痛药物的潜能。

    然而目前龙血竭产生镇痛作用的药理机制和它的哪些成分产生效应尚不清
    楚。龙血竭化学成分复杂,药理作用又具有多靶点、多层次等特点,化学成分间
    还可能由于物理和化学等方面的原因在药理效应上存在着相互作用(协同或拮
    抗)。然而,目前不可能将龙血竭的所有化学成分一一提取分离,巨细无遗地研
    究这些化学成分及其组合的药理作用。种种这些原因都极大的限制了龙血竭的研
    究开发工作。

    以往对龙血竭的镇痛药理研究大都集中在对其药效的观察上,较少进行药理
    作用的分子机制研究,而且龙血竭能够明显抑制角叉菜胶引起的踝关节肿胀,
    具有一定的消炎作用,所缓解的疼痛也多是由炎症、外伤、溃疡等所引起的,其
    镇痛作用往往与其消炎作用同时出现,致使一些学者将龙血竭的镇痛作用简单
    地归纳为消炎止痛。但是ReanmongkolW等人对泰国龙血树(龙血竭基源植物的
    一种)甲醇部位的药理学研究结果表明,泰国龙血树的甲醇部位具有外周镇痛作
    用,但却不能改善致炎剂角叉菜胶引起的肿胀,这一实验结果表明,龙血竭镇痛
    作用的药理机制与消炎作用的药理机制也可能并非完全一致,两种药理作用甚
    至可能是由不同的化学成分所产生的。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是:提供一种龙血竭镇痛的作用机理,具体表现
    为从龙血竭中提取的黄酮部位(血竭总黄酮)对初级感觉神经元电压门控性钠通
    道电流的调制作用,抑制疼痛的发生和传导,为人类研发新的镇痛药提供了理论
    依据。

    本发明的目的是通过如下措施来达到:从龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄
    酮),并且应用全细胞膜片钳技术研究血竭总黄酮对初级感觉神经元电压门控性
    钠通道电流的调制作用,这种作用表现为对疼痛的发生和传导的抑制,临床上产
    生镇痛作用,在配制龙血竭和血竭总黄酮溶液时,按照从龙血竭中提取的终产物
    的质量比例关系设定龙血竭的浓度和血竭总黄酮浓度的比例关系,从而保证了
    血竭总黄酮中所含的化学成分与龙血竭中所含的化学成分在质量比例关系上的
    一致性;从龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮),应用全细胞膜片钳技术研究
    血竭总黄酮对初级感觉神经元(三叉神经节(TG)和背根神经节(DRG))对电压门
    控性钠通道(河豚毒素不敏感型(TTX-R)和河豚毒素敏感型(TTX-S))电流的调
    制,这种作用表现为对疼痛的发生和传导的抑制,临床上产生镇痛作用;根据权
    利要求1所述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元河豚毒素不敏感型(TTX-R)
    钠通道,其特征在于:血竭总黄酮是龙血竭抑制初级感觉神经元TTX-R钠通道电
    流的有效部位;根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元河豚毒
    素不敏感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:血竭总黄酮对初级感觉神经元河豚
    毒素不敏感型(TTX-R)钠电流峰值的浓度依赖性抑制作用;根据权利要求1所
    述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道,其特
    征在于:血竭总黄酮对初级感觉神经元河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道电流的
    抑制作用;根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于初级感觉神经元电压门控性
    钠通道,其特征在于:血竭总黄酮促使三叉神经节(TG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)
    型钠通道电流和背根神经节(DRG)河豚毒素不敏感型(TTX-R)以及河豚毒素敏
    感(TTX-S)型钠通道电流I-V曲线的峰值明显地往向去极化方向偏移的作用;
    根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒素不敏感型
    (TTX-R)钠通道,其特征在于:正常初级感觉神经元河豚毒素不敏感(TTX-R)型
    钠电流半激活电压为(-21.92±1.41)mv(n=10)给予1g/L血竭总黄酮成分后半激
    活电压变为(-20.91±1.83)mv(n=10,P>0.05);根据权利要求1所述的血竭总黄
    酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正
    常初级感觉神经元河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠电流半失活电压为(-29.03±
    1.72)mv(n=10),给予1g/L血竭总黄酮后半失活电压变为(-40.75±2.34)
    mv(n=10,P>0.05);根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河
    豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常初级感觉神经元河豚毒素
    不敏感型钠电流失活后恢复的时间常数为(5.37±0.35)ms(n=10),给予1g/L
    血竭总黄酮后半失活电压变为(10.45±0.61)ms(n=10,P<0.05);根据权利要求
    1所述的血竭总黄酮作用于背根神经节(DRG)河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道,
    其特征在于:正常背根神经节(DRG)河豚毒素敏感(TTX-S)型钠电流半激活电
    压为(-34.6±3.7)mv(n=20)给予0.05g/L总黄酮后半激活电压变为(-14.7±
    5.6)mv(n=10);根据权利要求1所述的血竭总黄酮作用于三叉神经节(TG)河豚毒
    素不敏感型(TTX-R)钠通道,其特征在于:正常背根神经节(DRG)河豚毒素敏
    感(TTX-S)型钠电流半失活电压为(-78.1±5.8)mv(n=20),给予0.05g/L总黄
    酮后半失活电压变为(-105.6±6.4)mv(n=10);根据权利要求1所述的在配制
    龙血竭和血竭总黄酮溶液时,按照从龙血竭中提取的终产物的质量比例关系设
    定龙血竭的浓度和血竭总黄酮浓度的比例关系,从而保证了血竭总黄酮中所含
    的化学成分与龙血竭中所含的化学成分在质量比例关系上的一致性。

    相对已有技术方法,本发明具有以下优点:

    1)建立传统药物药效物质的现代概念,拓展反向药理学的方法学,以电压
    门控性钠通道作为药物靶点,筛选出龙血竭具有生物活性的化学成分,确定其药
    效物质。

    2)根据分析药物相互作用的数学模型,判定龙血竭调制电压门控性钠通道
    电流的药效物质中各化学成分之间相互作用的类型。

    2)应用全细胞膜片钳技术,将龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮)作用
    于初级感觉神经元电压门控性钠通道,提出血竭总黄酮是龙血竭抑制初级感觉神
    经元电压门控性钠通道电流的有效部位,且这种抑制效应发生在通道的失活过程
    而非激活过程。

    3)应用全细胞膜片钳技术,将龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮)作用
    于初级感觉神经元电压门控性钠通道,提出初级感觉神经元电压门控性钠通道电
    流峰值对血竭总黄酮浓度依赖性抑制作用。

    4)应用全细胞膜片钳技术,将龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮)作用
    于初级感觉神经元电压门控性钠通道,提出血竭总黄酮使初级感觉神经元电压门
    控性钠通道电流I-V曲线往去极化方向偏移的作用。

    5)应用全细胞膜片钳技术,将龙血竭中提取黄酮部位(血竭总黄酮)作用
    于初级感觉神经元电压门控性钠通道,提出血竭总黄酮对初级感觉神经元电压门
    控性钠通道电流激活,灭活,失活回复三种状态产生的作用。

    6)在配制龙血竭和血竭总黄酮溶液时,按照从龙血竭中提取的终产物的质
    量比例关系设定龙血竭的浓度和血竭总黄酮浓度的比例关系,从而保证了血竭
    总黄酮中所含的化学成分与龙血竭中所含的化学成分在质量比例关系上的一致
    性。

    附图说明

    图1血竭总黄酮提取流程图。

    图2河豚毒素对于抑制初级感觉神经元电压门控性钠通道电流的影响。

    图3TG细胞TTX-S和TTX-R型钠通道电流的血竭总黄酮的浓度依赖性曲线。

    图4DRG细胞TTX-R型钠通道电流的血竭总黄酮的浓度依赖性曲线。

    图5血竭总黄酮对TG细胞TTX-R型钠通道电流I-V曲线的影响。

    图6血竭总黄酮对TG细胞,DRG细胞电压门控钠通道电流I-V曲线的影响。

    图7血竭总黄酮对TG细胞TTX-R型钠通道电流激活曲线的影响。

    图8血竭总黄酮对TG细胞TTX-R型钠通道电流灭活曲线的影响。

    图9血竭总黄酮对TG细胞TTX-R型钠通道电流复活曲线的影响。

    图10血竭总黄酮对DRG细胞TTX-S型钠通道电流激活曲线的影响。

    图11血竭总黄酮对DRG细胞TTX-S型钠通道电流灭活曲线的影响。

    具体实施方式

    本发明中涉及血竭总黄酮成分提取于云南传统药物傣药中的一味常用药材
    龙血竭。提取血竭总黄酮成分,流程:剑叶龙血树含脂木材粗粉-90%乙醇提
    取(回收乙醇)—醇提物(龙血竭)—经石油醚,氯仿,醋酸乙酯,甲醇提取
    —石油醚提取物,氯仿提取物,醋酸乙酯提取物,甲醇提取物—硅胶柱色谱
    分离,用石油醚和醋酸乙酯混合溶剂梯度洗脱—龙血竭黄酮部位(血竭总黄
    酮),如图1所示。

    实验对象选用1月龄左右的SPF级昆明种小鼠,体质量18~25克,雌雄不拘。记
    录液及实验用药:用于记录初级感觉神经元电压门控性钠通道电流的细胞内液成
    分为(mmol/L):CsCl?100.0;KF?40.0;CaCl2?1.0;MgCl2?2.0;乙二醇四乙酸酯
    10.0;N-双(2-羟乙基)呱嗪-N-2(乙磺酸)10.0;Na2ATP?5.0;氯化四乙铵20.0,
    用Cs-OH调PH值到7.2。细胞内液成分为(mmol/L):NaCl?145.0;KCl?5.0;CaCl2
    2.0;MgCl2?1.0;N-双(2-羟乙基)呱嗪-N-2(乙磺酸)10.0;D-Glucose?10.0;
    4-氨基吡啶1.0;氯化四乙铵20.0,用氢氧化四乙铵调PH值到7.3。在上述内、
    外液中分别加入1umol/L河豚毒素,配成用于记录电压门控性钠通道电流的细胞
    内、外液。以上所用药物中河豚毒素、乙二醇四乙酸酯、N-双(2-羟乙基)呱嗪
    -N-2(乙磺酸),氯化四乙铵及Na2ATP为Sigma公司产品,其他未注明的为国产
    分析纯。实验用药血竭总黄酮用上述的细胞外液配制成一下三种浓度0.01,0.1
    和1g/L。

    初级感觉神经元细胞采用急性分离方法获得,将小鼠麻醉后用颈椎脱臼法处
    死后,取其两侧三叉神经节,置于4℃含氧饱和的DMEM/F12培养液(Gibco,外加
    14mmol/L?NaHCO3?PH?7.4)中冲洗孵育,用虹膜剪剪碎后,采用酶解消化法[0.2g/L
    胶原酶I(Collagenase?I?Sigma)和0.1g/L胰蛋白酶(trypsin?III?Sigma)],
    在恒温水浴摇床(36℃,140r/min)孵育13分钟后,,用尖端经过热处理的pasteur
    吸管轻轻吹打数次,最后加入0.3g/L胰蛋白酶抑制剂(Trypsin?inhibitor,
    Sigma)终止消化。经200目尼龙筛过滤到35mm培养皿内,待细胞贴壁后更换外液
    两次,放在倒置显微镜(OLYMPUS公司,日本))静置15~20分钟后,进行全细胞
    膜片钳记录。整个实验均在室温22℃~25℃下进行。

    采用EPC29双通道膜片钳放大器(HEKA公司,德国)进行全细胞膜片钳记录,
    实验参数的设置、数据的采集和刺激的施加均通过计算机用pulse软件来完成,
    Bessel滤波器1频率设置为10kHz,Bessel滤波器2频率设置为2.9kHz。记录
    用玻璃微电极用玻璃毛坯管(南京六合)经PIP5拉制仪(HEKA公司,德国)两步拉制
    而成,充灌电极内液后电阻为2~5MΩ。选用直径大于30um的TG细胞进行全细胞膜
    片钳记录。将记录电极轻轻压向细胞表面,通过施加负压,使记录电极尖端与细
    胞膜之间阻抗大于1GΩ时,进行快电容自动补(C-Fast),再稍加一负压或短时电
    脉冲破膜后,进行慢电容自动补偿(C-Slow),即形成膜片钳全细胞状态.实验过
    程中,经DAD-12给药系统(ALA公司,美国)喷射给药,给药管尖端距记录细胞
    100um左右。将电位钳制在-90mV,记录初级感觉神经元电压门控性钠通道电流。

    实验资料采用pulsefit8.02软件及IGOR4.07软件进行分析处理,实验数据
    以表示。对各组数据分别进行配对t检验,以P<0.05作为显著性检验的
    标准??悸堑讲煌赴汲龅哪频缌鞑钜旖洗?,故将给药前后的钠电流峰值
    Imax作为计算依据,按照公式①来计算药物对
    钠电流峰值Imax的百分比抑制率。经对数转换以后,药物的剂量与钠通道电流的
    抑制率之间的关系曲线用Hill方程②拟合。Hill方程中I
    表示不同浓度药物对钠电流峰值的抑制率,Imax为最大抑制率,x表示药物的浓
    度,h为Hill系数,IC50表示药物的半数抑制浓度。钠电流的稳态失活曲线用
    Boltzmann方程③拟合,其中V表示条件刺激电压,I
    表示测试电压所对应的膜电流峰值,K表示曲线的斜率,V1/2表示50%最大失活时
    所对应的条件刺激电压。钠电流失活后的恢复曲线用单指数函I(t)=A0+A1e-t/τ
    ④拟合,其中t为条件刺激电压和测试电压之间的时间间隔,I表示测试电压所对
    应的膜电流峰值,τ为失活后快恢复的时间常数。

    应用全细胞膜片钳技术研究血竭总黄酮对初级感觉神经元电压门控性钠通
    道电流调制作用时,根据这两类电压门控性钠通道电流动力学特征的差异作为判
    定两类钠电流的标准。即去极化至0mv时河豚毒素敏感型(TTX-S)钠电流在5ms内
    完全失活,河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠电流则不然,如图2所示。

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞两类电压门控性钠通道电流峰值的影响:
    将膜电位钳制在-90mv,从-60mv起给予10mv步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺
    激至+60mv,激活钠通道,记录时每次给药前都用细胞外液冲洗并激活电压门控
    性钠通道电流作为空白对照,按照浓度从低到高顺序,利用DAD给药系统依次喷
    射给药,记录后再用细胞外液冲洗。记录激活的钠通道电流的峰值,按照式①计
    算出0.01,0.1,1g/L?血竭总黄酮对河豚毒素敏感型(TTX-S)钠电流的抑制率分别
    为(17.02±5.42)%,(33.23±5.12)%,(49.30±5.14)%及河豚毒素不敏感型
    (TTX-R)钠电流的抑制率分别为(13.90±2.15)%,(31.61±3.03)%,(50.12±
    3.72)%通过上述资料发现3种浓度的药物对河豚毒素敏感型(TTX-S)钠电流及河
    豚毒素不敏感型(TTX-R)钠电流都具有不同程度的抑制作用,并呈明显的浓度依
    赖性,其中高浓度的血竭总黄酮对钠电流的抑制率最大,将血竭总黄酮的剂量经
    对数转换后,得到两种类型电压门控性钠电流抑制率与药物的剂量之间的关系依
    赖性曲线,用式②Hill方程进行拟合,得到河豚毒素不敏感型(TTX-R)药物的半
    数抑制浓度(IC50)为0.9216g/L,Hill系数h=0.3804;河豚毒素敏感型(TTX-S)药
    物的半数抑制浓度(IC50)为0.1013g/L,Hill系数h=0.3280,如图3所示。

    血竭总黄酮对背根神经节(DRG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)钠通道电流的
    影响:将膜电位钳制在-90mV,采用双脉冲刺激方法观察DRG细胞TTX-R钠通道电
    流的稳态失活情况,即给予5mV步幅递增,50ms步宽,-120~-20mV的条件刺激电
    压,每一条件刺激后紧跟一固定的50ms步宽,去极化至-10mV的测试电压刺激.
    以测试电压所激活的标准化钠电流峰值I/Imax对条件刺激电压作图绘制稳态失
    活曲线,用式③拟合曲线,得出正常DRG细胞TTX-R钠通道电流的半失活电压为(-
    44.0±1.4)mV(n=50)。0.01,0.1,1g/L?3种不同浓度的血竭溶液对DRG细胞TTX-R
    钠通道电流峰值均有不同程度地抑制作用,中、高浓度的血竭溶液还影响DRG细胞
    TTX-R钠通道电流的激活过程,但对DRG细胞TTX-R钠通道电流的失活过程则没
    有影响,如图4所示,用式②拟合血竭的浓度依赖性曲线,得血竭的半数抑制浓度
    (IC50)为0.013%,95%置信区间为0.010%~0.016%,Hill系数h=0.489,95%置信
    区间为0.488~0.494.

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)型电压门控性
    钠通道电流I-V曲线的影响:将膜电位钳制在-90mv,从-60mv起,给予10mv步幅
    递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+60mv,激活并记录钠通道电流,以刺激电
    压为横轴,以激活的河豚毒素不敏感型钠电流为纵轴,得到给药前后的I-V曲线。
    3种浓度的总黄酮(0.01,0.1,1g/L)对I-V曲线的最大激活电压均无明显影响,
    如图5所示

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)型钠通道电流和
    背根神经节(DRG)河豚毒素不敏感型(TTX-R)以及河豚毒素敏感(TTX-S)型钠
    通道电流I-V曲线的影响:将膜电位钳制在-90mv,从-60mv起,给予10mv步幅递
    增、80ms步宽的去极化脉冲刺激至+60mv,激活并记录钠通道电流,以刺激电压为
    横轴,以激活的钠电流为纵轴,得到给药前后的I-V曲线。其中高浓度的血竭总
    黄酮使I-V曲线的峰值明显地向去极化方向偏移,如图6所示。

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠通道电流激
    活曲线的影响:将膜电位钳制在-90mv,从-60mv起,给予10mv步幅递增、80ms
    步宽的去极化脉冲刺激至+60mv,引出河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠通道电流。
    求出各测试电压所对应的通道电导值,并以测试电压为横轴,测试电压所对应的
    标准化电导值为纵轴,绘制给药前后电流的稳态激活曲线,用式②拟合曲线,得
    出河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠通道电流给药前后的半激活电压(V1/2)值。结
    果表明,正常三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠电流半激活电压
    为(-21.92±1.41)mv(n=10)给予1g/L总黄酮后半激活电压变为(-20.91±
    1.83)mv(n=10,P>0.05),如图7所示。

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠通道电流
    灭活曲线的影响:将膜电位钳制在-90mv.采用双脉冲刺激方法观察钠通道电流的
    稳态失活情况,即先给予10mv步幅递增、30ms步宽、-90mv~-20mv的条件刺激电
    压,每一条件刺激后紧跟一30ms步宽的测试电压刺激,河豚毒素不敏感型钠电流
    测试电压为0v。以测试电压所激活的标准化钠电流峰值对条件刺激电压作图绘制
    稳态失活曲线,并用式③拟合曲线,得出河豚毒素不敏感型钠通道电流给药前
    后的半失活电压(V1/2)值。结果表明,正常三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏
    感(TTX-R)型钠电流半失活电压为(-29.03±1.72)mv(n=10),给予1g/L总黄酮
    后半失活电压变为(-40.75±2.34)mv(n=10,P>0.05),如图8所示。

    血竭总黄酮对三叉神经节(TG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠通道电流复
    活曲线的影响:将膜电位钳制在-90mv,采用双脉冲刺激方法观察钠通道电流失活
    后的恢复情况,即在每一条件刺激电压后都施加一测试电压刺激,条件刺激电压
    和测试电压的宽度均为30ms,两次刺激的时间间隔从2ms开始,以2ms等差递增至
    36ms,河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠电流条件刺激电压和测试电压均间间隔t作图
    绘制失活后的恢复曲线,并用式④拟合曲线,得出河豚毒素不敏感(TTX-R)型钠
    通道电流给药前后失活后恢复的时间常数(τ)。结果表明,正常三叉神经节细
    胞河豚毒素不敏感型钠电流失活后恢复的时间常数为(5.37±0.35)ms(n=10),
    给予1g/L总黄酮后半失活电压变为(10.45±0.61)ms(n=10,P<0.05),如图9所
    示。

    血竭总黄酮对背根神经节(DRG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)型钠通道电流稳
    态激活曲线的影响:将膜电位钳制在-80mv.预置-120mv电压1s,然后从-60mv起
    给予10mv步幅递增、100ms步宽的去极化脉冲刺激至30mv,引出河豚毒素敏感
    (TTX-S)型钠通道电流。求出各测试电压所对应的通道电导值,并以测试电压为
    横轴,测试电压所对应的标准化电导值为纵轴,绘制给药前后电流的稳态激活曲
    线,用式②拟合曲线。得出河豚毒素敏感(TTX-S)型钠通道电流给药前后的半激
    活电压(V1/2)值。结果表明,正常背根神经节(DRG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)
    型钠电流半激活电压为(-34.6±3.7)mv(n=20)给予0.05g/L总黄酮后半激活电压
    变为(-14.7±5.6)mv(n=10),如图10所示。

    背根神经节(DRG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)型钠通道电流灭活曲线的影
    响:将膜电位钳制在-80mv.预置-120mv电压1s,施予100ms步宽,阶跃10mv,
    -120~-40mv系列条件脉冲刺激,在每一个条件脉冲后紧跟一固定去极化至-10mv,
    步宽50ms的测试脉冲,用以测试脉冲刺激所激活的标准化电流值对条件脉冲电压
    作图,并用式③拟合曲线,得出河豚毒素敏感型钠通道电流给药前后的半失活电
    压(V1/2)值。结果表明,正常背根神经节(DRG)细胞河豚毒素敏感(TTX-S)型
    钠电流半失活电压为(-78.1±5.8)mv(n=20),给予0.05g/L总黄酮后半失活电
    压变为(-105.6±6.4)mv(n=10),如图11所示。

    在当前乃至今后相当长的一段时间,对于安全有效、成瘾性低的新型以血竭
    总黄酮为先导化合物的镇痛药物的开发,会是临床药物开发的最主要方向之一,
    本发明首次提出总黄酮成分对TG细胞TTX-S和TTX-R钠通道电流调制作用,说
    明了它的镇痛,麻醉作用,为人类研制开发新一代的镇痛,麻醉药提供了坚实的
    理论依据。

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    本文标题:龙血竭中提取总黄酮对初级感觉神经元两种钠通道电流的作用.pdf
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