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    重庆时时彩1700平台: 黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法.pdf

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    黄曲霉 毒素 M1 免疫 层析 试纸 及其 制备 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110108224.0

    申请日:

    2011.04.27

    公开号:

    CN102253209A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20110427|||公开
    IPC分类号: G01N33/577; G01N33/558; G01N33/532 主分类号: G01N33/577
    申请人: 中国农业科学院油料作物研究所
    发明人: 李培武; 张道宏; 张奇; 张文; 管笛; 丁小霞; 姜俊
    地址: 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
    优先权: 2010.12.21 CN 201010598169.3
    专利代理机构: 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 代理人: 胡建平
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110108224.0

    授权公告号:

    102253209B||||||

    法律状态公告日:

    2013.07.17|||2012.01.04|||2011.11.23

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属生物检测领域?;魄苟舅豈1免疫层析试纸条,其特征在于:包括纸板,纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫,硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线,所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA),质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体;所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1,具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。

    权利要求书

    1.黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,其特征在于:包括纸板,纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫,硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线,所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物,质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体;所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,其特征在于:所述的吸水垫长16~18mm,宽2~4mm;检测垫长25~30mm,宽2~4mm;金标垫长6~9mm,宽2~4mm;样品垫长12~18mm,宽2~4mm,相邻各垫的交叠长度为1~3mm。3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,其特征在于:所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15~20mm,质控线和检测线的间距为5~10mm。4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,其特征在于:所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为75~375ng;每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50~500ng。5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,其特征在于:所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15~20nm;所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的用量为200~600ng。6.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫;(2)检测垫的制备检测线的包被:将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物配制成0.1~0.5mg/mL的包被液A;于距离硝酸纤维素膜上沿为15~20mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线,每厘米检测线上所需黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物(AFM1-BSA)的包被量为75~375ng,然后于37~40℃条件下干燥5~20分钟;质控线的包被:将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.1~0.5mg/mL的包被液B;于距检测线5~10mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得到质控线,每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50~500ng,然后于37~40℃条件下干燥5~20分钟;(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿,取出,于37~40℃条件下干燥4~10小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液B中浸湿,取出,于37~40℃条件下干燥4~10小时,于已干燥的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向进行喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为200~600ng,然后真空冷冻干燥2~6h,置干燥器中室温保存;所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9产生;(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为1~3mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条。7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于:所述的包被液A是按照下述方法配制得到的:将10~50mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA),1~2g牛血清白蛋白,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;所述的包被液B是按照下述方法配制得到的:将10~50mg兔抗鼠多克隆抗体,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得。8.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于:所述的封闭液A?是按照下述方法配置得到的:将1~2g牛血清白蛋白,2~5g蔗糖,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;所述的封闭液B是按照下述方法配制得到的:将1~2g牛血清白蛋白,0.1~0.2mL曲拉通X-100,0.3~05g聚乙烯吡咯烷酮,2~5g蔗糖,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得。9.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于:所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的标记方法为:取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液,调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL?0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30?min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30?min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;所述的标记洗涤保存液是按照下述方法配制得到的:2.0g聚乙二醇20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得。10.一种权利要求1或2所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用,其特征在于:取1mL待测液态牛乳及其制品,加入0.25~0.5mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL已稀释好的样品溶液做为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条,同时取1mL不含黄曲霉毒素M1的空白牛奶样品,加0.25~0.5mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴滴加到另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;检测结果:(1)阳性:当检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线不显色时,或者质控线显示出红色线条,而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时,判为阳性,表明待测样品中黄曲霉毒素M1的含量高于或等于0.5ng/mL;(2)阴性:当检测试纸条的质控线和检测线均显示出红色线条,并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时,判为阴性结果,表明待测样品中黄曲霉毒素M1的含量低于0.5ng/mL;(3)无效:当质控线不显色时,无论检测试纸条的检测线显示或不显示红色线条,该试纸条判为无效。

    说明书

    黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法

    技术领域

    本发明属生物检测领域,具体涉及一种黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法。

    背景技术

    黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物,是一种能引起人畜各种损害的天然有毒化合物?;魄苟舅?AFT)目前已发现20余种,其中黄曲霉毒素B1为毒性及致癌性最强的物质?;魄苟舅豈1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物,也是一种强致癌物质。当哺乳动物摄入AFB1污染的饲料后,在体内经羟基化会将AFM1分泌于乳汁当中。奶牛经摄入黄曲霉毒素B1污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定,巴氏灭菌法也无法将其杀灭,所以检测黄曲霉毒素M1不仅要检测动物饲料原料,而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒素M1的最大允许含量并将其作为强制性标准,如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)中黄曲霉毒素M1的最高允许含量为0.5?ng/mL。

    现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、免疫学分析法。前两者具有样品前处理步骤繁琐,耗时费力,仪器价格昂贵,需要专业人员操作等的缺点,而免疫学分析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、对实验人员和环境的污染危害小等优点。最常用的免疫学分析法有酶联免疫吸附法、纳米金免疫层析法等。目前已有黄曲霉毒素M1?的ELISA试剂盒问世,如德国拜发R-Biopharm公司以及美国Abraxis公司等研发的黄曲霉毒素M1?ELISA检测试剂盒。而基于纳米金的免疫层析快速检测技术因其更短的检测时间和更简单的样品前处理而显示出更大的应用价值和应用前景。但目前世界上还没有针对黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条问世。因此,研究建立一种针对黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条对于监控黄曲霉毒素M1的含量具有很重要的意义和应用价值。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是提供一种黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1,具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。

    本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为:

    黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条(见图1和图2),包括纸板,纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫,硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线,所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA),质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体;所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。

    所述的杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中国,武汉,武汉大学,保藏编号为CCTCC?NO.?C201018。其具有序列表中SEQ?Gene?No.1所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ?Gene?No.2所示的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

    抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,它由保藏编号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ?Protein?No.1所示的氨基酸序列;轻链可变区具有序列表中SEQ?Protein?No.2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素M1,对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50?为67?pg/mL。

    本发明采用的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法,步骤如下:

    (1)采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9:将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA免疫4-6次后,用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA作最后一次加强免疫,3天后进行细胞融合,采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测,用黄曲霉毒素M1作为竞争原,选择吸光值和灵敏度均较高的孔,采用有限稀释法进行克隆,克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测,如此重复克隆2-3次后,最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9;

    (2)将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,纯化即得抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。

    按上述方案,所述的吸水垫长16~18mm,宽2~4mm;检测垫长25~30mm,宽2~4mm;金标垫长6~9mm,宽2~4mm;样品垫长12~18mm,宽2~4mm,相邻各垫的交叠长度为1~3mm。

    按上述方案,所述的吸水垫为吸水纸。

    按上述方案,所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15~20mm,质控线和检测线的间距为5~10mm。

    按上述方案,所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA)的包被量为75~375ng;每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50~500ng。

    按上述方案,所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15~20nm;所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的用量为200~600ng。

    如上所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:

    (1)吸水垫的制备

    将吸水纸剪裁即得吸水垫;

    (2)检测垫的制备

    检测线的包被:

    将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物(AFM1-BSA)配制成0.1~0.5mg/mL的包被液A;于距离硝酸纤维素膜上沿为15~20mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线,每厘米检测线上所需黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物(AFM1-BSA)的包被量为75~375ng,然后于37~40℃条件下干燥5~20分钟;

    质控线的包被:

    将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.1~0.5mg/mL的包被液B;于距检测线5~10mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得到质控线,每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50~500ng,然后于37~40℃条件下干燥5~20分钟;

    (3)样品垫的制备

    将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿,取出,于37~40℃条件下干燥4~10小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;

    (4)金标垫的制备

    将玻璃纤维膜放入封闭液B中浸湿,取出,于37~40℃条件下干燥4~10小时,于已干燥的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向进行喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为200~600ng,然后真空冷冻干燥2~6h,置干燥器中室温保存;

    所述的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9产生;

    (5)试纸条的组装

    在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为1~3mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条。

    按上述方案,所述的包被液A是按照下述方法配制得到的:将10~50mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA),1~2g牛血清白蛋白,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的包被液B是按照下述方法配制得到的:将10~50mg兔抗鼠多克隆抗体,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得。

    按上述方案,所述的封闭液A?是按照下述方法配置得到的:将1~2g牛血清白蛋白,2~5g蔗糖,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的封闭液B是按照下述方法配制得到的:将1~2g牛血清白蛋白,0.1~0.2mL曲拉通X-100,0.3~05g聚乙烯吡咯烷酮,2~5g蔗糖,0.02~0.05g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得。

    按上述方案,所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的标记方法为:取50.0mL市售质量浓度为0.01%的纳米金溶液,调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL?0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30?min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30?min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;

    所述的标记洗涤保存液是按照下述方法配制得到的:2.0g聚乙二醇20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得。

    如上所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用,方法如下:取1mL待测液态牛乳及其制品,加入0.25~0.5mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL已稀释好的样品溶液做为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条,同时取1mL不含黄曲霉毒素M1的空白牛奶样品,加0.25~0.5mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴滴加到另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;

    检测结果:(1)阳性:当检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线不显色时,或者质控线显示出红色线条,而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时,判为阳性,表明待测样品中黄曲霉毒素M1的含量高于或等于0.5ng/mL;(2)阴性:当检测试纸条的质控线和检测线均显示出红色线条,并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时,判为阴性结果,表明待测样品中黄曲霉毒素M1的含量低于0.5ng/mL;(3)无效:当质控线不显色时,无论检测试纸条的检测线显示或不显示红色线条,该试纸条判为无效。

    该黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的工作原理:当待测样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上时,待测样品溶液通过毛细作用沿试纸条向吸水垫方向移动,当其移动至金标垫时,纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素?M1时,游离的黄曲霉毒素M1将和金标垫上的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体结合并一同向上泳动,其到达固定着抗原的检测线时,抗原将和黄曲霉毒素M1竞争结合纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体上有限的抗原结合位点,样品中黄曲霉毒素M1含量越高,检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体将越少,形成的显色带颜色越浅。当抗原所结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体少于一定的数量时,检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有黄曲霉毒素,未被检测线上的抗原截获的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体或纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体与黄曲霉毒素M1的结合物将继续移动到质控线并与质控线上的第二抗体结合并被富集显色,所以样品中不含黄曲霉毒素M1,即为阴性时为两条红色条带,质控线和检测线均为红色;含有一定量黄曲霉毒素M1,即为阳性时有两种情况:1、只出现一条红色质控线,检测线不显色;2、一条红色质控线和一条浅红色检测线;而质控线没有色带出现则表明试纸条失效。

    本发明的有益效果在于:

    (l)?检测黄曲霉毒素M1。本发明提供的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条使用的抗体为抗黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体,用于特异性快速检测黄曲霉毒素M1;

    (2)?操作简单。用该黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条进行检测时只需将样品溶液逐滴加到试纸条的样品垫上即可,为一步式操作,操作简单、方便;?

    (3)?检测过程不需要黄曲霉毒素M1标准溶液作为阳性对照。本发明提供的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条检测样品时不需要使用黄曲霉毒素M1标准溶液作为阳性对照,而只需用空白样品作为阴性对照即可;

    (4)?检测灵敏度高。本发明提供的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条对样品中黄曲霉毒素M1的最低检测限为0.5ng/mL。

    附图说明

    图1为本发明的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的正视图。图中:1?纸板、2?吸水垫;3?检测垫;4?金标垫;5?样品垫;6?质控线;7?检测线。

    图2为本发明的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的侧视结构示意图。图中:1?纸板;2?吸水垫;3?检测垫;4?金标垫;5?样品垫。

    图3为实施例2的的结果判定图。图中:1?对照试纸条;2?检测试纸条;3?质控线;4?检测线。

    图4为实施例3的的结果判定图。图中:1?对照试纸条;2?检测试纸条;3?质控线;4?检测线。

    图5为实施例4的的结果判定图。图中:1?对照试纸条;2?检测试纸条;3?质控线;4?检测线。

    具体实施方式

    实施例1:抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法

    抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO.?C201018的杂交瘤细胞株2C9产生,其制备方法,包括以下步骤:

    1.?采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9

    (1)?动物免疫

    ????购买6周龄BALB/c小鼠6只,免疫市售的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后,于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行,采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素完全抗原乳化,于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周,免疫方式与其相同,第四次免疫于第三次免疫3周后进行,免疫方式与第二次免疫相同,同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同,均为每鼠40μg/mL。前3次每次免疫后8天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清效价,并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度,选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫,免疫剂量为之前的2倍?;魄苟舅赝耆乖瑼FM1-BSA购于Sigma-Aldrich公司;

    (2)?细胞融合?

    于最后一次加强免疫3天后,采用50%(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂,按常规方法进行细胞融合,具体步骤:无菌条件下杀死免疫小鼠,分离脾细胞,与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5﹕1的个数比混合,用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞,用50%PEG融合,融合1分钟,然后加满RPMI-1640基础培养液,离心,移去上清,小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mLRPMI-1640基础培养液重悬,将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内,2滴/孔,置37℃二氧化碳培养箱培养,所述的RPMI-1640基础培养液为含有20%(体积百分数)胎牛血清,2%(重量百分数)生长因子和1%(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司;RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司;1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司;

    (3)?细胞株的筛选及克隆

    待细胞融合后第12天左右,细胞集落长到占孔底1/2大小,培养液变黄,即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选,筛选分两步进行,第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素M1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测,用黄曲霉毒素M1作为竞争原,选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高,灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC50值较?。?,采用有限稀释法进行克隆,克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测,如此重复克隆2-3次后,获得杂交瘤细胞株2C9。

    采用如下方法测定杂交瘤细胞株2C9抗体可变区序列:

    (1)测定提取总RNA:采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株2C9的总RNA;

    (2)合成cDNA:以步骤1获得的总RNA?为模板,oligo?(dT)?15为引物,按照SuperScriptTM-2?Ⅱ反转录酶说明书进行反转录,合成cDNA第一链;引物oligo?(dT)?15?由Invitrogen购得;

    (3)PCR法克隆可变区基因:根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物,以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为:94℃?30s、55℃?1min、72℃?1min?,扩增?30?个循环,最后?72℃延伸?10min。PCR?产物经过1%(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后,用试剂盒纯化回收DNA片段,连接到载体pMD18-T中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为:重链可变区引物为5,-AGG?TSM?ARC?TGC?AGS?AGT?CWG?G-3,(22mer)和5,-TGA?GGA?GAC?GGT?GAC?CGT?GGT?CCC?TTG?GCC?CC-3,(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基,M=A/C,R=A/G,S=C/G,W=A/T,轻链可变区引物为5,-GAC?ATT?GAG?CTC?ACC?CAG?CTT?GGT?GCC?-3,(24mer)和5,-CCG?TTT?CAG?CTC?CAG?CTT?GGT?CCC-3,(24mer);

    得到的基因序列结果:重链可变区编码基因序列长354bp,序列如SEQ?ID?NO:1所示,根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成,序列如SEQ?ID?NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长332bp,序列如SEQ?ID?NO:2所示,根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成,序列如SEQ?ID?NO:4所示。

    2.?抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的纯化

    将步骤1获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体,具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水,4℃,12000r/min离心15min,吸取上清,将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合,搅拌下缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为33?μL,室温混合30min,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃沉淀,将得到的上清液用双层滤纸过滤后,加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L?和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液,用2?mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4,4?℃预冷,缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL,4℃静置2h,然后4℃,12000r/min离心30min,弃上清,将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,对纯水透析,将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻,之后用冷冻干燥机冻干,收集冻干粉,即得纯化好的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体,将抗体置-20℃冰箱中备用;

    所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠,0.141mL醋酸加水定容至100mL所得;所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL所得。

    用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株2C9分泌的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的亚型为IgG2a。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得2C9的鼠腹水抗体的效价可达4.26×106,即鼠腹水抗体稀释4.26×106倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素M1的灵敏度为67?pg/mL,与黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2交叉反应率均小于0.1%。

    实施例2-4:黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备及应用

    下述实施例2-4使用的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为实施例1制备得到的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体。

    实施例2

    黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:

    (1)吸水垫的制备

    将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格,即得吸水垫;

    (2检测垫的制备

    检测线的包被:

    将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物AFM1-BSA配制成0.1mg/mL的包被液A;于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上,得到检测线,每厘米检测线所需黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为75ng,然后于37℃条件下干燥15分钟;

    所述的包被液A为:10mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA,1g牛血清白蛋白,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    质控线的包被:

    将兔抗鼠多克隆抗体配成0.2mg/mL的包被液B;于距检测线5mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得质控线,每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100ng,然后于37℃条件下干燥15分钟;

    所述的包被液B为将20mg兔抗鼠多克隆抗体,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的硝酸纤维素膜长25mm,宽3mm;?

    (3)样品垫的制备:

    将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格,放入封闭液A中浸湿,取出,于37℃条件下干燥6小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液A为1g牛血清白蛋白,2g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    (4)金标垫的制备:

    将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格,放入封闭液B中浸湿,取出,于37℃条件下干燥16小时,于干燥好的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为600ng,然后真空冷冻干燥6h,置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液B为1g牛血清白蛋白,0.1mL曲拉通X-100,0.3g聚乙烯吡咯烷酮,2g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的具体标记方法为:量取50.0mL质量浓度为0.01%的纳米金溶液,用0.1?mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL?0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30?min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30?min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;

    所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm;

    所述的0.1?mol/L碳酸钾水溶液为:13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶解在10?mL纯水中制成;所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中,0.22μm滤膜过滤所得;所述的标记洗涤保存液为:2.0g聚乙二醇-20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;

    (5)试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为1mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,见图1和图2。

    上述黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用:

    吸取1#和2#待测牛奶样品各1mL,加入0.25mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL已稀释好的样品溶液分别做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条;同时取1mL不含黄曲霉毒素M1的空白牛奶样品,加入0.25mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴加到另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;

    检测结果:1#检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线不显色,则判为阳性结果,表明待测样品中的黄曲霉毒素M1的含量高于0.5ng/mL,见图3-1;2#检测试纸条的质控线显示出红色线条,而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅,则判为阳性结果,表明待测样品中的黄曲霉毒素M1的含量高于或等于0.5ng/mL,见图3-2。

    实施例3

    黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:

    (1)吸水垫的制备

    将吸水纸剪裁成长18mm宽4mm的规格,即得吸水垫;

    (2)检测垫的制备

    检测线的包被:

    将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物AFM1-BSA配制成0.2mg/mL的包被液A;于距硝酸纤维素膜上沿18mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上,得到检测线,每厘米检测线所需的黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为150ng,然后于38℃条件下干燥10分钟;

    所述的包被液A为:20mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA,1.5g牛血清白蛋白,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    质控线的包被:

    将兔抗鼠多克隆抗体配成0.2mg/mL的包被液B;于距检测线8mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得到质控线,每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200ng,然后于38℃条件下干燥10分钟;

    所述的包被液B为将20mg兔抗鼠多克隆抗体,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的硝酸纤维素膜长28mm,宽4mm;?

    (3)样品垫的制备:

    将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽4mm的规格,放入封闭液A中浸湿,取出,于38℃条件下干燥5小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液A为1.5g牛血清白蛋白,2.5g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    (4)金标垫的制备:将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽4mm的规格,放入封闭液B中浸湿,取出,于38℃条件下干燥5小时,于已干燥的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为450ng,然后真空冷冻干燥4h,置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液B为1.5g牛血清白蛋白,0.1mL曲拉通X-100,?0.4g聚乙烯吡咯烷酮,2.5g蔗糖,0.02g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的具体标记方法为:量取50.0mL质量浓度为0.01%的纳米金溶液,用0.1?mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL?0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30?min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30?min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;

    所述纳米金溶液中纳米金的粒径为17nm;

    所述的0.1?mol/L碳酸钾溶液为:13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液为1mg抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶解在10?mL纯水中制成;所述的10%牛血清白蛋白溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中,0.22μm滤膜过滤所得;所述的标记洗涤保存液为:2.0g聚乙二醇-20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;

    (5)试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为2mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,见图1和图2。

    如上所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用:

    吸取待测牛奶样品1mL,加入0.3mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL稀释好的样品溶液做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条,同时取1mL空白牛奶样品,加入0.3mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴加入另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;

    检测结果:检测试纸条的质控线和检测线均显示出红色线条,并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近,判为阴性结果,表明待测样品中的黄曲霉毒素M1的含量低于0.5ng/mL,见图4。

    实施例4

    黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的制备方法,包括以下步骤:

    (1)吸水垫的制备

    将吸水纸剪裁成长17mm宽2mm的规格,即得吸水垫;

    (2)检测垫的制备

    检测线的包被:

    将黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白的偶联物AFM1-BSA配制成0.5mg/mL的包被液A;于距硝酸纤维素膜上沿20mm的位置,用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上,得到检测线,每厘米检测线所需的黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为375ng,然后于39℃条件下干燥8分钟;

    所述的包被液A为:50mg市售黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA,2g牛血清白蛋白,0.04g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    质控线的包被:

    将兔抗鼠多克隆抗体配成0.5mg/mL的包被液B;于距检测线10mm的位置,用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上,得到质控线,每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为500ng,然后于39℃条件下干燥8分钟;

    所述的包被液B为将50mg兔抗鼠多克隆抗体,0.04g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述的硝酸纤维素膜长30mm,宽2mm;?

    (3)样品垫的制备

    将玻璃纤维膜剪裁成长17mm宽2mm的规格,放入封闭液A中浸湿,取出,于39℃条件下干燥10小时,得样品垫,然后置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白,5g蔗糖,0.04g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    (4)金标垫的制备

    将玻璃纤维膜剪裁成长6mm宽2mm的规格,放入封闭液B中浸湿,取出,于39℃条件下干燥10小时,于已干燥的玻璃纤维膜上,用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液横向喷涂,每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体为200ng,然后真空冷冻干燥3h,置干燥器中室温保存;

    所述的封闭液B为2g牛血清白蛋白,0.15mL曲拉通X-100,05g聚乙烯吡咯烷酮,?5g蔗糖,0.04g叠氮化钠,0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL所得;

    所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的具体标记方法为:量取50.0mL质量浓度为0.0.1%的纳米金溶液,用0.1?mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5.5;在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL?0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液,继续搅拌30min;加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%,继续搅拌30min;于4℃放置2h后,1500r/min离心15min,取上清液,弃沉淀;将上清液12000r/min离心30?min,弃去上清液,加入50.0mL标记洗涤保存液;再以12000r/min离心30?min,弃去上清液,将沉淀用标记洗涤保存液重悬,得到5.0mL浓缩物,置4℃冰箱备用,其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL;

    所述纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm;

    所述的0.1?mol/L碳酸钾水溶液为:13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体溶解在10?mL纯水中制成;所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中,0.22μm滤膜过滤所得;所述的标记洗涤保存液为:2.0g聚乙二醇-20000,0.2g叠氮钠,0.1235克硼酸,纯水定容至1000mL,0.22μm滤膜过滤所得;

    (5)试纸条的组装:在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫,相邻各垫在连接处交叠连接,交叠长度为3mm,即得黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条,见图1和图2。

    如上所述的黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的应用:

    吸取1#和2#待测牛奶样品各1mL,加入0.4mL水,混匀,得到样品溶液,取100μL已稀释好的样品溶液分别做为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为检测试纸条,同时取1mL空白牛奶样品,加入0.4mL水,混匀,得到阴性对照溶液,取100μL阴性对照溶液,逐滴加入另一黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条的样品垫,将其作为对照试纸条,15分钟后读取结果;

    检测结果:1#检测试纸条的质控线不显色,检测试纸条的检测线显示红色线条,则判为无效,见图5-1;2#检测试纸条的质控线不显色,检测试纸条的检测线亦不显示红色线条,则判为无效,见图5-2。



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