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    肿瘤 抗原 及其 用途
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980151110.5

    申请日:

    2009.10.19

    公开号:

    CN102257138A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利权的转移IPC(主分类):C12N 15/09变更事项:专利权人变更前权利人:大日本住友制药株式会社变更后权利人:北海道公立大学法人札幌医科大学变更事项:地址变更前权利人:日本大阪府大阪市变更后权利人:日本北海道札幌市变更事项:专利权人变更前权利人:佐藤升志登记生效日:20141120|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/09申请日:20091019|||公开
    IPC分类号: C12N15/09; A61K39/00; A61K48/00; A61P35/00; A61P37/04; C07K7/06; C07K16/30; C12N5/10; G01N33/574 主分类号: C12N15/09
    申请人: 大日本住友制药株式会社; 佐藤升志
    发明人: 佐藤升志; 塚原智英; 川口哲; 和田卓郎
    地址: 日本大阪府大阪市
    优先权: 2008.10.20 JP 2008-270078
    专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李波;高旭轶
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980151110.5

    授权公告号:

    |||102257138B||||||

    法律状态公告日:

    2014.12.10|||2013.06.19|||2012.01.04|||2011.11.23

    法律状态类型:

    专利申请权、专利权的转移|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    公开了由与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列或基本相同的氨基酸序列组成的肽,其中所述肽结合HLA抗原并被细胞毒性T细胞识别。本发明的肽可在体内或体外被用作用于诱导CTL的试剂,即癌症疫苗,并对肿瘤例如肉瘤、肾癌和其它癌症发挥治疗或改善作用。本发明的肽还可用作针对肿瘤例如肉瘤、肾癌和其它癌症的肿瘤标记物。

    权利要求书

    1.?由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽,其中所述肽结合HLA抗原并被细胞毒性T细胞(下文中称为“CTL”)识别。2.?根据权利要求1的肽,其中所述HLA抗原为HLA-A2。3.?根据权利要求2的肽,其由下述氨基酸序列组成:SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列或包含在SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列中的氨基酸残基的取代的氨基酸序列,其中在SEQ?ID?NO:4第2位上的氨基酸残基被蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代,或在SEQ?ID?NO:4?C-端的氨基酸残基被亮氨酸取代。4.?由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽。5.?用于诱导CTL的试剂,其包含根据权利要求1至4中任一项的肽作为活性成分。6.?用于诱导CTL的试剂,其包含编码由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽的核酸。7.?根据权利要求6的用于诱导CTL的试剂,其中所述多核苷酸为由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸。8.?由编码根据权利要求1至4中任一项的肽的多核苷酸组成的核酸。9.?用于诱导CTL的试剂,其包含根据权利要求8的核酸。10.?一种产生抗原呈递细胞的方法,其中所述方法的特征在于将下述中的一种:(a)根据权利要求1至4中任一项的肽,和(b)包含编码(a)的肽的多核苷酸的核酸,与具有抗原呈递能力的细胞在体外接触。11.?由根据权利要求10的方法产生的抗原呈递细胞。12.?一种诱导CTL的方法,其中所述方法的特征在于将下述中的一种:(a)根据权利要求1至4中任一项的肽,(b)包含编码(a)的肽的多核苷酸的核酸,与外周血淋巴细胞在体外接触。13.?由根据权利要求12的方法诱导的CTL。14.?特异性结合根据权利要求1至4中任一项的肽的抗体。15.?肿瘤标记物,其包含编码由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽的多核苷酸,或与所述多核苷酸互补的多核苷酸。16.?根据权利要求15的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物包含含有SEQ?ID?NO:3的核酸序列的多核苷酸或与所述多核苷酸互补的多核苷酸。17.?由下述多肽组成的一种肿瘤标记物,所述多肽由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成。18.?根据权利要求17的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同的多肽组成。19.?由下述抗体组成的肿瘤标记物,所述抗体针对由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽,或为根据权利要求14的抗体。20.?根据权利要求19的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物由针对由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽的抗体组成。21.?包含根据权利要求1至4中任一项的肽和HLA抗原的HLA四聚体。22.?由根据权利要求21的HLA四聚体组成的肿瘤标记物。23.?根据权利要求15至20和22中任一项的肿瘤标记物,其中所述肿瘤为肉瘤或肾癌。24.?用于肿瘤的诊断的试剂,其中所述试剂包含根据权利要求15至20、22和23中任一项的肿瘤标记物。

    说明书

    肿瘤抗原肽及其用途

    技术领域

    本发明涉及肿瘤抗原肽。更具体地,本发明涉及肿瘤抗原蛋白(乳头瘤病毒结合因子,PBF)的片段肽和其基因在癌症免疫领域中的用途。

    背景技术

    细胞免疫,特别是细胞毒性T细胞(下文中称为CTL)在从活体中清除肿瘤细胞、病毒感染的细胞等中发挥重要作用。CTL识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)和MHC(主要组织相容性复合体)I类抗原(在人中其被称为HLA抗原)的复合物,并攻击和杀死肿瘤细胞。

    当细胞内合成肿瘤特异性蛋白(即肿瘤抗原蛋白质)后,该肿瘤特异性蛋白通过蛋白酶的细胞内降解产生肿瘤抗原肽。得到的肿瘤抗原肽与内质网中的MHC?I类抗原(HLA抗原)结合以形成复合物,其被运输至细胞表面并作为抗原呈递。当肿瘤特异性CTL识别了作为抗原呈递的复合物时通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生展示抗肿瘤作用。对一系列这些作用的阐明使通过使用肿瘤抗原蛋白或肽作为所谓的癌症免疫治疗剂(癌症疫苗)在具有肿瘤的患者中提高肿瘤特异性CTL的疗法成为可能。

    作为代表性实例,肿瘤抗原蛋白包括非专利文献1的表1中所列的那些。此外,识别乳头瘤病毒的E2结合位点的乳头瘤病毒结合因子(PBF)(GenBank数据库登记号AF263928,?SEQ?ID?NO:2)作为可应用于包括肉瘤(例如骨肉瘤)的癌症(肿瘤)的肿瘤抗原蛋白被报导(专利文件1)。另外,鉴定了结合HLA-A24或HLA-B55抗原的肿瘤抗原肽。然而,还未发现结合HLA-A2抗原的PBF来源的肿瘤抗原肽。

    [非专利文献1]?Immunity,?vol.?10:281,?1999

    [专利文献1]?国际公开号WO?04/029248

    这些文献在此处引入作为参考。

    发明内容

    本发明待解决的问题

    本发明的一个目的是提供,例如结合HLA-A2抗原的肿瘤抗原蛋白:PBF的片段肽及其基因在癌症免疫领域中的用途。

    解决问题的手段

    在努力研究后,本发明者发现了以GenBank登记号AF263928注册的乳头瘤病毒结合因子(PBF)(SEQ?ID?NO:2)的片段肽,其为结合HLA-A2抗原的肿瘤抗原肽。

    本发明者证明了所述肿瘤抗原肽可用作在体内或体外诱导CTL的试剂,即癌症疫苗,并且所述肿瘤抗原肽对例如骨肉瘤、肾癌和其它肿瘤的肿瘤发挥治疗或改善作用。所述肿瘤抗原肽也用作例如肉瘤、肾癌和其它肿瘤的肿瘤的肿瘤标记物。

    因此,本发明包括:

    (1)由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽,其中所述肽结合HLA抗原并被细胞毒性T细胞(下文中称为“CTL”)识别。

    (2)根据(1)的肽,其中所述HLA抗原为HLA-A2。

    (3)根据(2)的肽,其由下述氨基酸序列组成:SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列;或包含在SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列中的氨基酸残基的取代的氨基酸序列,其中在SEQ?ID?NO:4第2位上的氨基酸残基被蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代,或在SEQ?ID?NO:4?C-端的氨基酸残基被亮氨酸取代。

    (4)由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽。

    (5)用于诱导CTL的试剂,其包含根据(1)至(4)中任一项的肽作为活性成分。

    (6)用于诱导CTL的试剂,其包含编码由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽的核酸。

    (7)根据(6)的用于诱导CTL的试剂,其中所述多核苷酸为由SEQ?ID?NO:3的序列组成的多核苷酸。

    (8)由编码根据(1)至(4)中任一项的肽的多核苷酸组成的核酸。

    (9)用于诱导CTL的试剂,其包含根据(8)的核酸。

    (10)产生抗原呈递细胞的方法,其中所述方法的特征在于将下述中的一种:

    (a)根据(1)至(4)中任一项的肽,或

    (b)包含编码(a)的肽的多核苷酸的核酸,

    与具有抗原呈递能力的细胞在体外接触。

    (11)由根据(10)的方法产生的抗原呈递细胞。

    (12)诱导CTL的方法,其中所述方法的特征在于将下述中的一种:

    (a)根据(1)至(3)中任一项的肽,

    (b)包含编码(a)的肽的多核苷酸的核酸,

    与外周血淋巴细胞在体外接触。

    (13)由根据(12)的方法诱导的CTL。

    (14)特异性结合根据(1)至(4)中任一项的肽的抗体。

    (15)肿瘤标记物,其包含编码由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽的多核苷酸,或与所述多核苷酸互补的多核苷酸。

    (16)根据(15)的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物包含含有SEQ?ID?NO:3的序列的多核苷酸或与所述多核苷酸互补的多核苷酸。

    (17)由下述多肽组成的肿瘤标记物,所述多肽由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成。

    (18)根据(17)的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同的多肽组成。

    (19)由下述抗体组成的肿瘤标记物,所述抗体针对由与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列组成的肽,或为根据(14)的抗体。

    (20)根据(19)的肿瘤标记物,其中所述肿瘤标记物由针对由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽的抗体组成。

    (21)包含根据(1)至(4)中任一项的肽和HLA抗原的HLA四聚体。

    (22)由根据(21)的HLA四聚体组成的肿瘤标记物。

    (23)根据(15)至(20)和(22)中任一项的肿瘤标记物,其中所述肿瘤为肉瘤或肾癌。

    (24)用于肿瘤的诊断的试剂,其中所述试剂包含根据(15)至(20)、(22)和(24)中任一项的肿瘤标记物。

    发明效果

    本发明提供了例如作为用于诱导CTL的试剂有用的肿瘤抗原肽和其基因。本发明提供的用于诱导CTL的试剂作为例如肉瘤、肾癌和其它癌症的治疗剂有用。

    附图简述

    图1为显示了CTL5A9的肽-特异性细胞毒性活性的图。纵坐标表示细胞毒性活性和横坐标表示CTL5A9细胞(效应物)数和靶细胞数的比例。

    图2为显示了CTL5A9对癌细胞系的细胞毒性作用的图。符号“+”和“-”表示有关各个细胞系的PBF表达、HLA-A0201表达和IFN-γ处理的存在或缺乏。通过变化的效应物:靶比例测定了CTL5A9对各个细胞系的细胞毒性活性。

    实施本发明的最佳方式

    1)本发明提供的肽

    在下文中可能被称为“本发明的肽”的本发明提供的肽为包含与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的肿瘤抗原肽,并且本发明的肽为上述PBF蛋白质的肽片段,并具有结合HLA抗原、优选HLA-A2抗原从而使所述肽被CTL识别的活性。

    如本文使用的,“基本相同的氨基酸序列”指没有限制的任意氨基酸序列,只要由“基本相同的氨基酸序列”组成的肽与由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽发挥类似的活性。例如,基本相同的氨基酸序列可包括在SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列中的第二位氨基酸具有蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代的或在C-端氨基酸具有亮氨酸取代的氨基酸序列。就此而论,关于HLA-A2类型的HLA(例如HLA-A0201,?-A0204,?-A0205,?-A0206,?和-A0207),呈递的抗原肽序列的通常模式(即基序)是已知的,如下表1中所示(Immunogenetics,?41,?p.?178,?1995;和J.?Immunol.,?155,?p.?4749,?1995,其在此处引入作为参考)。

    表1

    。

    本发明的肽可为来源于天然产物(例如上述PBF蛋白质)的肽或合成的肽。所述肽优选具有不超过11个氨基酸,更优选9个氨基酸的长度。

    可依照在常规肽化学中使用的方法合成本发明的肽。这些已知方法包括例如在下列文献中描述的方法:Peptide?Synthesis,Interscience,?New?York,?1966;?The?Proteins,?Vol.?2,?Academic?Press?Inc.,?New?York,?1976;?PEPUCHIDO?GOSEI?[Peptide?Synthesis],?Maruzen?Co.,?Ltd.,?1975;?PEPUCHIDO?GOSEI?NO?KISO?TO?ZIKKEN?[Basics?and?Experiments?for?Peptide?Synthesis],?Maruzen?Co.,?Ltd.,?1985;?IYAKUHIN?NO?KAIHATSU,?ZOKU?[Developments?of?Pharmaceuticals,?2nd?Series],?vol.?14:?PEPUCHIDO?GOSEI?[Peptide?Synthesis],?Hirokawa?Publishing?Co.,?1991,其在此处引入作为参考。

    通过测定肽与HLA-A2抗原的复合物能否被CTL识别,可以测定本发明的肽是否具有作为肿瘤抗原肽的活性。

    一种特定的方法包括例如在J.?Immunol.,?154,?p.?2257,?1995(其在此处引入作为参考)中描述的方法。根据所述方法,当从对HLA-A2抗原呈阳性的人中分离的外周血淋巴细胞在体外通过候选肽的加入被刺激时,可以确认由候选肽脉冲(pulsed)的特异性识别HLA-A2抗原-阳性细胞的CTL的诱导。在此情况下,通过例如使用ELISA或类似方法测量CTL响应抗原肽-呈递细胞而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量可测定这些CTL是否已被诱导??裳〉?,通过测量CTL对用51Cr标记的抗原肽-呈递细胞的细胞毒性活性也可测定CTL的诱导(51Cr释放实验,Int.?J.?Cancer,?58,?p.?317,?1994,其在此处引入作为参考)。

    对上述CTL而言,除了使用肽刺激人外周血淋巴细胞制备的CTL以外,也可使用通过例如在Int.?J.?Cancer,?39,?390-396,?1987;和N.?Eng.?J.?Med,?333,?1038-1044,?1995(其在此处引入作为参考)中描述的方法所建立的CTL。

    通过使用用于人的动物模型的实验((WO?02/47474,?和Int?J.?Cancer,?100,?565-570?(2002),其在此处引入作为参考)可测定本发明的肽的体内活性。

    此外,本发明的肽包括偶联了多个包括本发明的肽的表位的肽(即多表位肽)。

    因此,具有CTL诱导活性的多表位肽也可为本发明的肽的特定实例。

    如本文使用的,将多表位肽定义为一种肽,

    其为(i)一种特定的肽,其中本发明的肽和任意多个其它PBF来源的CTL表位(肿瘤抗原肽)被偶联;

    (ii)肽,其中本发明的肽和辅助表位被偶联;或

    (iii)肽,其中本发明的肽,任意多个其它PBF来源的CTL表位(肿瘤抗原肽)和另外的辅助表位被偶联,并且其经历抗原呈递细胞中的细胞内加工从而使得到的呈递在抗原呈递细胞上的肿瘤抗原肽诱导CTL。

    在与本发明的肽连接的表位为辅助表位的情况下,可使用的辅助表位包括来源于乙肝病毒的HBVc?128-140和来源于破伤风毒素的TT947-967,如上所述。辅助表位具有例如13至30个氨基酸左右,优选13至17个氨基酸左右的长度。

    如上所述偶联多个表位的肽(多表位肽)可通过如上所述的用于肽合成的常规方法制备??裳〉?,如上所述偶联多个表位的多表位肽也可使用常规DNA合成和基因工程程序基于编码多表位肽的多核苷酸的序列信息制备?;痪浠八?,可通过下述方法制备多表位肽:将多核苷酸插入熟知的表达载体;用得到的重组表达载体转化宿主细胞;培养得到的转化体;和从培养物中收集偶联多个表位的期望多表位肽。如前述,该程序可以例如依照在以下文献中描述的方法进行:Molecular?Cloning,?T.?Maniatis?等人,?CSH?Laboratory?(1983);和DNA?Cloning,?DM.?Glover,?IRL?PRESS?(1985),其在此处引入作为参考。

    例如,可通过上面提及的肽的体外实验或肽的体内实验使用在WO?02/47474和Int?J.?Cancer,?100,?565-570?(2002)(其在此处引入作为参考)中描述的用于人的动物模型,测定制备的偶联多个表位的多表位肽诱导CTL的活性。

    2)本发明的核酸

    在下文中可能被称为“本发明的核酸”的本发明提供的核酸包含编码本发明的上述肽的多核苷酸。

    本发明的核酸可为来自不同细胞或不同组织例如肉瘤、肾癌和其它癌症的cDNA、mRNA或cRNA??裳〉?,本发明的核酸可为合成的DNA。并且,本发明的核酸可为单链或双链的形式。例如,本发明的核酸包括:

    (a)由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸,

    (b)由编码SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列的核酸序列组成的多核苷酸,和

    (c)由编码与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的核酸序列组成的多核苷酸。

    包含本发明的多核苷酸的核酸可采用单链或双链的形式。当本发明的多核苷酸为双链时,可将其插入表达载体以产生用于表达本发明的肽的重组表达载体。因此,本发明的核酸包含通过将本发明的双链多核苷酸插入表达载体得到的重组表达载体。

    在本文中使用的表达载体可根据使用的宿主、其使用的目的等等适当地选择,并包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等等。

    例如当宿主为大肠杆菌的情况下,载体包括质粒载体例如pUC118、pUC119、pBR322和pCR3;和噬菌体载体例如λZAPII和λgt11。在宿主为酵母的情况下,载体包括pYES2,?pYEUra3等等。在宿主为昆虫细胞的情况下,载体包括pAcSGHisNT-A等等。在宿主为动物细胞的情况下,载体包括质粒载体例如pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV和pRc/CMV;和病毒载体例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

    如果需要的话,上述载体可包含不同元件例如可诱导表达的启动子,编码信号序列的基因,编码选择标记物的基因和终止子。

    此外,载体可具有表达为与硫氧还蛋白、His标签、GST(谷胱甘肽S-转移酶)等等的融合蛋白的添加的序列,以易化其分离和纯化。就此而论,可使用具有在宿主细胞中有效的合适启动子(例如lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子)的用于GST融合蛋白的载体(例如pGEX4T),具有标签序列例如Myc和His的载体(例如pcDNA3.1/Myc-His)或表达与硫氧还蛋白和His标签的融合蛋白的载体(pET32a)。

    可使用如上述产生的表达载体转化宿主,由此生成含有表达载体的转化细胞。

    在本文中可使用的宿主包括大肠杆菌(Escherichia?coli)、酵母、昆虫细胞、动物细胞等等。大肠杆菌包括大肠杆菌K-12菌株例如HB101、C600、JM109、DH5α、AD494(DE3)等等。酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)等等。动物细胞包括L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、Hela细胞、293-EBNA细胞等等。昆虫细胞包括sf9细胞等等。

    作为将表达载体引入宿主细胞的方法,可使用如上所述的适合各个宿主细胞的常规方法。例如,这些方法包括使用磷酸钙、DEAE-葡聚糖的方法,电穿孔方法或使用基因引入脂(Lipofectamine,?Lipofectin;?Gibco-BRL)的方法。在引入以后,将细胞在含有选择标记物的常规培养基中培养,由此可选择含有表达载体的转化体。

    通过在合适条件下培养得到的转化细胞可产生本发明的肽。通过标准生化纯化程序可进一步分离和纯化得到的肽。纯化程序包括盐析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、凝胶过滤层析等等。通过利用融合蛋白和标签的特征的纯化方法也可分离和纯化表达为与硫氧还蛋白、His标签、GST等等的融合蛋白的本发明的肽。

    编码本发明的肽的多核苷酸可为DNA或RNA的形式?;诒痉⒚鞯碾牡陌被嵝蛄行畔⒑捅嗦氚被嵝蛄械腄NA的序列信息可容易地产生这些本发明的多核苷酸。例如,通过常规DNA合成和通过PCR的扩增可产生多核苷酸。

    编码本发明的肽的多核苷酸包括编码上述表位肽的多核苷酸。

    包含编码本发明的肽的多核苷酸的核酸可为单链或双链形式。当本发明的多核苷酸为双链时,通过将上述多核苷酸插入表达载体可构建用于表达本发明的肽的表达载体。

    用于此目的的表达载体、宿主细胞和转化宿主细胞的方法等和上面描述的那些类似。

    3)包含本发明的肽作为活性成分的用于诱导CTL的试剂

    本发明的肽可作为具有CTL诱导活性的用于诱导CTL的试剂。被诱导的CTL能够通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生发挥抗肿瘤作用。因此,本发明的肽可为用于治疗或预防肿瘤的药物组合物的活性成分。当对具有肿瘤的患者施加包含本发明的肽作为活性成分的用于诱导CTL的试剂时,本发明的肽被呈递至抗原呈递细胞的HLA-A2抗原,特异性针对HLA-A2抗原和呈递的肽的结合的复合物的CTL可增殖从而杀死肿瘤细胞,因此可治疗或预防患者的肿瘤。

    可在对SEQ?ID?NO:2所示的PBF蛋白和HLA-A2抗原呈阳性的具有肿瘤的患者中使用包含本发明的肽作为活性成分的用于诱导CTL的试剂。例如,用于诱导CTL的试剂可用于例如预防或治疗所有种类的肉瘤,包括骨肉瘤,或癌症(肿瘤),包括肾癌。

    包含本发明的肽作为活性成分的用于诱导CTL的试剂可包含单个CTL表位(本发明的肽)作为活性成分,或与其它肽(CTL表位和辅助表位)连接的多表位肽作为活性成分。

    最近,偶联多个CTL表位(抗原肽)的多表位肽已显示在体内有效展示了CTL诱导活性。例如,Journal?of?Immunology,?1998,?161:?3186-3194(其在此处引入作为参考)描述了约30个氨基酸(mer)的多表位肽,其中偶联了来源于癌抗原蛋白PSA的HLA-A2,?-A3,?-A11,?B53限制性CTL表位(抗原肽),所述肽在体内诱导了特异性针对各个CTL表位的CTL。也证明了CTL是由偶联了CTL表位和辅助表位的多表位肽有效诱导的。当以多表位肽的形式施用用于诱导CTL的试剂时,多表位肽被掺入抗原呈递细胞;多表位肽的细胞内降解产生各个抗原肽,其结合HLA抗原以形成复合物;复合物以高密度被呈递在抗原呈递细胞的表面;特异性针对复合物的CTL在体内有效增殖;并杀死肿瘤细胞。这样完成肿瘤的治疗或预防。

    包含本发明的肽作为活性成分的用于诱导CTL的试剂可与药学上可接受的载体例如合适的佐剂混合或组合施用,从而有效建立细胞免疫。

    可使用的佐剂的实例包括在文献Clin.?Microbiol.?Rev.,?7:277-289,?1994(其在此处引入作为参考)中描述的那些。例如,佐剂包括微生物来源的成分或其衍生物,细胞因子,植物来源的成分或其衍生物,海洋生物来源的成分或其衍生物,矿物质凝胶例如氢氧化铝、溶血卵磷脂,表面活性剂例如Pluronic多元醇,聚阴离子,肽,油性乳化剂(乳化剂制剂)等等。也考虑脂质体制剂,与具有几微米直径的珠连接的微粒制剂,具有连接的脂的制剂,微球制剂,微胶囊制剂等等。

    施用的方法包括皮内、皮下、肌肉内、静脉施用等等。在制剂中的本发明的肽的剂量可根据待治疗的疾病,患者的年龄和体重等适当地调整。通常,本发明的肽在制剂中的剂量为0.0001至1000?mg,优选0.001至1000?mg,更优选0.1至10?mg,优选地每几天或几个月施用1次。

    4)包含本发明的核酸作为活性成分的用于诱导CTL的试剂

    表达本发明的核酸的细胞具有被CTL识别的特征。由此,本发明的核酸是CTL的诱导物。被诱导的CTL能够通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生发挥抗肿瘤作用。因此,本发明的核酸可为用于治疗或预防肿瘤的药物的活性成分。包含本发明的核酸作为活性成分的用于诱导CTL的试剂可治疗或预防肿瘤,例如,通过对具有肿瘤的患者施用本发明的核酸并允许其表达。

    例如,当通过以下描述的程序对肿瘤患者施用已被掺入表达载体的本发明的核酸时,肿瘤抗原肽在抗原呈递细胞中高度表达。得到的肿瘤抗原肽结合HLA-A2抗原以形成复合物,其以高密度呈递在抗原呈递细胞的表面;特异性针对复合物的CTL在体内有效增殖,并杀死肿瘤细胞。这样完成肿瘤的治疗和预防。

    可在对SEQ?ID?NO:1所示的PBF基因;所述基因的表达产物PBF蛋白;和HLA-A2抗原呈阳性的肿瘤患者中使用包含本发明的核酸作为活性成分的用于诱导CTL的试剂。例如,用于诱导CTL的试剂可用于预防或治疗所有种类的肉瘤如骨肉瘤,或癌症如肾癌。

    通过使用病毒载体的任意方法和其它方法(NIKKEI?SAIENNSU?[Nikkei?Science],?1994,?April?Issue,?pp.?20-45;?GEKKAN?YAKUZI?[The?Pharmaceuticals?Monthly],?36?(1),?23-48?(1994);?ZIKKEN?IGAKU?ZOUKAN?[Experimental?Medicine,?Supplement],?12?(15),?(1994),?和其中引用的参考,上述文献在此处引入作为参考)可实现本发明的核酸的施用并将其引入细胞。

    使用病毒载体的方法实例包括下述方法,其中将本发明的DNA掺入DNA或RNA病毒例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒和辛德比斯病毒。在这些方法中,特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。

    其它方法的实例包括将表达质粒直接注射至肌肉(DNA接种)的方法,使用脂质体、Lipofectine的方法,显微注射方法,使用磷酸钙的方法或电穿孔方法等等。特别优选DNA接种和使用脂质体的方法。

    允许本发明的核酸实际用作制药剂的方法包括体内方法,其中将核酸直接引入体内,和离体方法,其中从人个体中收集特定类型的细胞,将核酸在体外引入细胞,然后将细胞返回个体体内(NIKKEI?SAIENNSU?[Nikkei?Science],?1994,?April?Issue,?pp.?20-45;?GEKKAN?YAKUZI?[The?Pharmaceuticals?Monthly],?36?(1),?23-48?(1994);?ZIKKEN?IGAKU?ZOUKAN?[Experimental?Medicine,?Supplement],?12?(15),?(1994),?和其中引用的参考,上述文献在此处引入作为参考)。优选体内方法。

    在通过体内方法施用的情况下,依照待治疗的疾病、症状等通过合适的施用途径施用本发明的核酸。例如,可静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内等施用本发明的核酸。在通过体内方法施用的情况下,可以不同制剂例如液体制剂施用本发明的核酸,通常将所述液体制剂配制为包含本发明的核酸作为活性成分的可注射的制剂,如果需要可在其中加入药学上可接受的载体。此外,在包含本发明的核酸的脂质体或膜融合的脂质体(例如,仙台病毒(HVJ)-脂质体)的情况下,其可为脂质体制剂例如悬浮剂、冷冻制剂和离心浓缩的冷冻制剂的形式。

    在制剂中的本发明的核酸的量可根据待治疗的疾病,患者的年龄和体重等适当地调整。当核酸中的多核苷酸的量为0.0001至100?mg,优选0.001至10?mg时,通常优选每几天或几个月施用一次本发明的核酸。

    最近,编码偶联了多个CTL表位(抗原肽)的多表位肽的多核苷酸或编码偶联了一个或多个CTL表位和辅助表位的多表位肽的多核苷酸已显示在体内具有有效诱导CTL的活性。例如,Journal?of?Immunology,?1999,?162:?3915-3925(其在此处引入作为参考)描述了编码多表位肽的DNA(小基因),其中偶联了HBV-来源的6个HLA-A2限制性抗原肽,3个HLA-A11限制性抗原肽和辅助表位,所述DNA在体内有效诱导了针对各个CTL表位的CTL。

    因此,通过偶联编码本发明的肽的一个或多个多核苷酸和任选地偶联编码其它肽的另外多核苷酸制备的多核苷酸在得到的多核苷酸被引入合适的表达载体后,可用作用于诱导CTL的试剂的活性成分。与上述类似的施用方法和方式也可应用于此类型的用于诱导CTL的试剂。

    5)本发明的抗原呈递细胞

    如上所述的本发明的肽和核酸可如下所述地在体外使用,用于治疗肿瘤患者。例如,通过在体外将本发明的肽或核酸与具有抗原呈递能力的细胞接触,可以产生抗原呈递细胞。例如,本发明提供了在细胞表面呈递HLA-A2抗原和本发明的肽的复合物的抗原呈递细胞和产生所述细胞的方法,其中通过在体外将来源于肿瘤患者的具有抗原呈递能力的分离的细胞与本发明的肽或核酸接触而得到所述抗原呈递细胞。

    如本文使用的,“具有抗原呈递能力的细胞”不限于特定细胞,只要所述细胞在细胞表面表达能够呈递本发明的肽的HLA-A2抗原。特别地,优选具有高抗原呈递能力的树突细胞。

    为了从上述具有抗原呈递能力的细胞制备本发明的抗原呈递细胞而加入的物质可为本发明的肽或核酸。

    本发明的抗原呈递细胞可通过下述方法获得:从肿瘤患者中分离具有抗原呈递能力的细胞,用本发明的肽在体外刺激细胞,并允许抗原呈递细胞呈递HLA-A2抗原和肽的复合物Cancer?Immunol.?Immunother.,?46:82,?1998;?J.?Immunol.,?158,?p.?1796,?1997;?和Cancer?Res.,?59,?p.?1184,?1999,?上述文献在此处引入作为参考)。当使用树突细胞时,可通过例如使用Ficoll方法从肿瘤患者的外周血中分离淋巴细胞、去除非粘附细胞、在GM-CSF和IL-4的存在下培养粘附细胞以诱导树突细胞、和培养并用本发明的肽刺激树突细胞而制备本发明的抗原呈递细胞。

    在通过将本发明的核酸引入上述具有抗原呈递能力的细胞中而制备本发明的抗原呈递细胞的情况下,核酸可为DNA或RNA形式。例如,在核酸为DNA的情况下,这些程序可参照例如Cancer?Res.,?56,?p.?5672,?1996;和J.?Immunol.,?161,?p.?5607,?1998(上述文献在此处引入作为参考)进行,在核酸为DNA的情况下,这些程序可参照例如J.?Exp.?Med.,?184,?p.?465,?1996(其在此处引入作为参考)进行。

    如上所述的抗原呈递细胞可作为用于诱导CTL的试剂的活性成分。包含抗原呈递细胞作为活性成分的用于诱导CTL的试剂优选地包含盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基等等以稳定地维持抗原呈递细胞。施用的方法包括静脉内、皮下、皮内施用??山乖实菹赴魑钚猿煞值挠糜谟盏糃TL的试剂返回患者的体内,因此可在对本发明的PBF呈阳性的患者体内有效诱导特异性CTL,结果可治疗肿瘤。

    6)本发明的CTL

    本发明的肽和核酸可在体外用于治疗肿瘤患者,如下所述?;痪浠八?,本发明的肽或核酸和外周血淋巴细胞可在体外接触以诱导CTL。例如,本发明提供了通过在体外将来源于肿瘤患者的外周血淋巴细胞和本发明的任意肽或核酸接触而诱导的CTL,和诱导CTL的方法。

    例如在黑色素瘤的情况下,已在过继性免疫疗法中观察到治疗作用,其中在体外大量培养来自患者的肿瘤浸润T细胞,接着将其返回患者中(J.?Natl.?Cancer.?Inst.,?86:1159,?1994,?其在此处引入作为参考)。并且,在小鼠黑色素瘤的情况下,当在体外用肿瘤抗原肽TRP-2刺激脾细胞以增殖特异性针对肿瘤抗原肽的CTL和对移植了黑色素瘤的小鼠施用上述CTL后发现了转移的抑制(J.?Exp.?Med.,?185:453,?1997)。这是基于特异性识别抗原呈递细胞的HLA抗原和肿瘤抗原肽的复合物的CTL的体外增殖的结果。因此,认为用本发明的肽或核酸刺激来自患者的外周血淋巴细胞以增殖肿瘤特异性CTL和之后将上述CTL返回患者中的疗法是有效的。

    CTL可用作用于治疗或预防肿瘤的试剂的活性成分。用于治疗或预防肿瘤的试剂优选地包含盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、培养基等等以稳定地维持CTL。施用的方法包括静脉内、皮下、皮内施用。通过将包含CTL作为活性成分的用于治疗或预防肿瘤的试剂返回对本发明的PBF呈阳性的患者的体内,患者体内的CTL的细胞毒性作用被增强,从而杀死肿瘤细胞和因此可治疗肿瘤。

    7)针对本发明的肽的抗体

    本发明提供了特异性结合本发明的肽的抗体。本发明的抗体不限于特定形式,并可为针对本发明的肽产生的多克隆或单克隆抗体。

    本发明的抗体不限于特定抗体,只要所述抗体特异性结合本发明的肽,如上所述。本发明的抗体的实例包括特异性结合由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽的抗体。

    制备这些抗体的方法是已熟知的,也可依照这些常规程序(Current?protocols?in?Molecular?Biology,?Edited?by?Ausubel?等人?(1987),?Published?by?John?Wiley?and?Sons,?Sections?11.12?to?11.13;?Antibodies:?A?Laboratory?Manual,?Edited?by?Lane,?H,?D.?et.?al.,?Published?by?Cold?Spring?Harber?Laboratory?Press,?New?York,?1989,?其在此处引入作为参考)制备本发明的抗体。

    例如,本发明的肽(例如由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽)被用作免疫原,使用常规方法用本发明的肽免疫非人动物例如兔以从免疫的动物的抗血清中得到抗体。另一方面,在单克隆抗体的情况下,可通过骨髓瘤细胞和通过用本发明的肽(例如由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽)免疫非人动物例如小鼠得到的脾细胞的融合制备的杂交瘤细胞得到单克隆抗体Current?protocols?in?Molecular?Biology,?Edited?by?Ausubel?等人,?(1987),?Published?by?John?Wiley?and?Sons,?Sections?11.4?to?11.11,?其在此处引入作为参考)。

    可通过使用取决于宿主的多种佐剂增强免疫学反应制备针对本发明的肽的抗体。这些佐剂包括弗氏佐剂,矿物质凝胶例如氢氧化铝、溶血卵磷脂,Pluronic多元醇,聚阴离子,肽,油性乳化剂,匙孔血兰蛋白(keyhole?limpet?hemocyanin),表面活性剂例如二硝基酚和人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。

    如上所述,可使用常规程序通过用本发明的肽适当地免疫动物制备识别本发明的肽的抗体和进一步中和其活性的抗体。所述抗体可用于亲和层析、免疫学诊断等等。免疫学诊断可适当地选自免疫印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、荧光或发光测量方法。这些免疫学诊断对表达本发明的PBF基因的癌例如肉瘤和肾癌的诊断有效。

    8)肿瘤标记物

    (i)与本发明的多核苷酸相关的肿瘤标记物

    本发明的肿瘤标记物的特征在于其由上述本发明的多核苷酸(编码包含与SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸)和/或与其互补的多核苷酸组成。

    例如,本发明的肿瘤标记物可包括由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸和/或与其互补的多核苷酸组成的肿瘤标记物。

    如本文使用的,互补多核苷酸(互补链、反向链)指与由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸(为了方便,本文中将其称为“正向链”)的序列具有碱基互补关系(基于例如A:T和G:C的碱基配对)的多核苷酸。

    正向链多核苷酸可不仅包含由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸,而且包含由与上述互补链的核酸序列具有互补关系的核酸序列组成的多核苷酸。

    上述正向链多核苷酸和上述互补链(反向链)多核苷酸中的每一种都可以单链或双链的形式用作肿瘤标记物。

    例如,本发明的肿瘤标记物可为由SEQ?ID?NO:3的核酸序列组成的多核苷酸,或由其互补序列组成的多核苷酸。

    可使用例如软件Primer?3?(HYPERLINK,?//www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)或Vector?NTI?(Infomax)基于例如SEQ?ID?NO:3的核酸序列设计本发明的肿瘤标记物。例如,可使用通过将本发明的上述基因的核酸序列应用于软件Primer?3或Vector?NTI得到的引物或探针的候选序列,或包含候选序列的至少一部分的序列作为引物或探针。

    可根据标记物的具体应用适当地选择本发明的肿瘤标记物的长度。

    在本发明的一个实施方案中,通过评估受试者的生物组织,特别是疑为被肿瘤(肉瘤或肾癌)侵袭的待检测的组织中的本发明的肽的基因表达的存在或缺乏或水平(量)进行肿瘤的检测(诊断)。在此情况下,可使用本发明的上述肿瘤标记物作为特异性识别和扩增由本发明的肽的基因或由其衍生的多核苷酸的表达而产生的RNA的引物,或作为特异性检测RNA或由其衍生的多核苷酸的探针。

    在使用本发明的肿瘤标记物作为检测肿瘤的引物的情况下,引物可包括优选地具有15至30bp碱基长度的引物。在使用本发明的肿瘤标记物作为检测探针的情况下,探针可包括优选地具有15至27bp碱基长度的探针。

    可依照常规程序,使用本发明的肿瘤标记物作为用于已知特异性检测特定基因的方法的引物或探针,所述方法包括RNA印迹、RT-PCR、原位杂交方法等等。

    本发明的肿瘤标记物对肿瘤的诊断和检测(诊断疾病的存在或缺乏和疾病的程度)有用。例如,可通过测定在受试者的生物组织(疑为被肿瘤侵袭的组织)和健康个体的其对应组织之间的本发明的肽的基因的基因表达水平的差异,使用本发明的肿瘤标记物进行肿瘤的诊断。在此情况下,基因表达水平的差异不仅包括基因表达的存在或缺乏,在同时在受试者和健康个体的组织中检测到基因表达的情况下还包括在受试者和健康个体之间的基因表达量的2倍或更高倍的差异,优选3倍或更高倍的差异。例如,由于在肿瘤中引起了本发明的肽的基因的表达,其组织展示了所述基因的表达且所述基因表达的量为健康个体对应组织中的2倍或更高倍,优选3倍或更高倍的受试者被疑为患有肿瘤。

    (ii)与本发明的抗体相关的肿瘤标记物

    本发明提供了作为肿瘤标记物的能够特异性识别本发明的肽的抗体,在下文中有时将其称为本发明的抗体。更具体地,本发明提供了由特异性识别本发明的肽(其由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成)的抗体组成的肿瘤标记物。

    在多种肉瘤和肾癌中,已经发现PBF基因是特异性和高度表达的。因此,检测这些基因的表达产物(肽)的存在或缺乏或其表达程度使人们能够特异性检测上述肿瘤例如肉瘤和肾癌的存在或缺乏或程度,从而可诊断疾病。

    因此,上述抗体可作为工具(肿瘤标记物)用于诊断受试者是否患有肿瘤或通过在受试者中检测上述肽的存在或缺乏或表达程度诊断受试者患有的疾病的程度。

    本发明的抗体不限于特定形式,并可为针对本发明的肽(具体地,由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽)产生的多克隆或单克隆抗体。制备抗体的方法是已熟知的,也可依照这些常规程序产生本发明的抗体Current?protocols?in?Molecular?Biology,?Sections?11.12?to?11.13?(2000),?其在此处引入作为参考)。例如,当本发明的抗体为多克隆抗体时,可如下述得到多克隆抗体:通过使用常规程序纯化在大肠杆菌等中表达的本发明的肽或使用常规程序合成本发明的肽;用所述肽免疫非人动物例如兔;和使用常规程序从免疫动物的抗血清中得到多克隆抗体。另一方面,在本发明的抗体为单克隆抗体的情况下,可从杂交瘤细胞中得到单克隆抗体,所述杂交瘤细胞通过使用常规方法在大肠杆菌等中表达并之后纯化的本发明的肽免疫非人动物例如小鼠;和对从免疫动物中得到的脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合(Current?protocols?in?Molecular?Biology,?Edited?by?Ausubel?等人,?(1987)?Published?by?John?Wiley?and?Sons,?Sections?11.4?to?11.11,?其在此处引用作为参考)而制备。

    用作制备抗体的免疫原的本发明的肽(特别是由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肽)可通过如下程序得到:DNA克??;质粒的构建;转染至宿主细胞;培养转化体;和基于本发明提供的基因的序列信息(SEQ?ID?NO:3)从培养物中收集所述肽。这些程序可例如依照本领域技术人员已知的方法或在文献:Molecular?Cloning,?T.?Maniatis?等人,?CSH?Laboratory?(1983);?DNA?Cloning,?DM.?Glover,?IRL?PRESS?(1985)(其在此处引用作为参考)中描述的方法进行??筛荼痉⒚魈峁┑陌被嵝蛄行畔ⅲ⊿EQ?ID?NO:4)通过常规化学合成(肽合成)产生本发明的肽。详见上述部分1)和2)。

    (iii)与本发明的肽相关的肿瘤标记物

    本发明提供了作为肿瘤标记物的能够特异性识别针对本发明的肽的抗体的肽。例如,本发明提供了由本发明的肽(其由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成)组成的肿瘤标记物。

    可通过使用本发明的肽(多肽)作为诊断试剂和在从疑为患有肿瘤的患者取得的样品例如血液、疑为被肿瘤侵袭的组织等中检测这样的抗体的存在而诊断肿瘤。在如上部分1)中描述了产生本发明的肽的方法。

    例如,可通过下述检测针对PBF的抗体:收集患者的血液或对疑为被肿瘤侵袭的组织进行取样,例如通过活检;使用常规程序从其中制备肽;和依照常规程序使用本发明的肽作为已知的检测方法例如蛋白质印迹、ELISA和其它方法的探针。

    为诊断肿瘤,可在受试者的组织和对应正常组织的样品中测定针对本发明的肽的抗体的量的差异。在此情况下,肽量的差异包括蛋白质存在或缺乏,和蛋白质的量相差至少2倍、优选3倍的情况。

    例如,由于在肿瘤例如肉瘤和肾癌中引起本发明的肽的基因表达,如果在受试者的组织样品中存在针对基因的表达产物(本发明的肽)的抗体,且测定出在受试者的组织样品中存在的针对本发明的肽的抗体是正常组织样品中的2倍或更高倍的量、优选3倍或更高倍的量,则怀疑受试者患有肿瘤疾病。

    (iv)与HLA四聚体相关的肿瘤标记物

    本发明还提供了包含本发明的肽和HLA-A2抗原的HLA四聚体和由HLA四聚体组成的肿瘤标记物。

    如本文使用的,HLA四聚体指这样形成的四聚体:通过生物素化其中HLA抗原的α链和β-2微球蛋白与肽(抗原肽)相联系的复合物(HLA单体),并将复合物结合至抗生物素蛋白(Science,?279:2103-2106?(1998);?Science,?274:94-96?(1996),?其在此处引入作为参考)。目前,多种包含不同抗原肽的HLA四聚体是可购买到的(例如,从Medical?&?Biological?Laboratories?Co.,?Ltd.),并且可容易地产生包含本发明的肽和HLA-A2抗原的HLA四聚体。

    实例包括包含由SEQ?ID?NO:4的氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽和HLA-A2抗原的HLA四聚体。

    优选地用荧光标记HLA四聚体从而可容易地通过已知检测手段例如流式细胞仪、荧光显微镜等选择或检测与其连接的CTL。例如,使用藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、?多甲藻黄素-叶绿素-蛋白(PerCP)等等标记HLA四聚体。

    制备HLA四聚体的方法是熟知的,见文献:Science,?279:2103-2106?(1998);?Science,?274:94-96?(1996),其在此处引入作为参考。如下简短地解释所述方法。

    首先,将HLA-A2?α-链表达载体和aβ-2微球蛋白表达载体引入能够表达蛋白质的大肠杆菌或哺乳动物细胞中以表达蛋白质。优选使用大肠杆菌例如BL21?;旌系玫降牡ヌ錒LA-A2复合物和本发明的肽以形成可溶性HLA-肽复合物。然后,用BirA酶在HLA-A2?α-链的C-端生物素化HLA-肽复合物。以4:1的摩尔比例混合生物素化HLA-肽复合物和荧光标记的抗生物素蛋白,使得可以制备HLA四聚体。在上述各个步骤中,优选地通过凝胶过滤等纯化蛋白质。

    (v)肿瘤检测的方法(诊断方法)

    本发明提供了使用上述本发明的肿瘤标记物检测(诊断)肿瘤的方法。

    例如,根据本发明的检测(诊断)方法为下述方法,其中收集患者的血液,或移除待检测的疑为被肿瘤侵袭的组织的部分,例如通过活检;检测和测量识别包含PBF-来源的肿瘤抗原肽和HLA抗原的复合物的CTL的量;和由此诊断肿瘤疾病例如肉瘤、肾癌等的存在或缺乏或程度。例如,当对具有肿瘤的患者施用治疗剂以改善肿瘤时,也可使用根据本发明的检测(诊断)方法检测(诊断)疾病的改善的存在或缺乏或程度。此外,可使用根据本发明的检测(诊断)方法,用于例如选择可应用包含本发明的肽或核酸作为活性成分的药物组合物的肿瘤患者和进一步用于测定药物组合物的治疗效果。

    根据本发明的检测(诊断)方法包括以下步骤:

    (a)将受试者的生物样品与本发明的肿瘤标记物接触的步骤;

    (b)检测作为指示物的肿瘤标记物,从而检测在生物样品中包含的识别PBF-来源的肿瘤抗原肽和HLA抗原的复合物的CTL的量的步骤;

    (c)基于(b)的结果判断受试者是否患有肿瘤的步骤。

    在本文中使用的生物样品可包括从患者的生物组织(例如疑为被肿瘤侵袭的组织和其周围组织,血液等)中制备的样品或标本。例如,生物样品可包括从所述组织中制备的含RNA的样品或包含通过进一步制备所述样品得到的多核苷酸的样品,或包含从所述组织制备的肽或抗体的样品,或包含从所述组织中制备的外周血淋巴细胞的样品。

    取决于用作测量靶的生物样品的类型,如下述具体实施根据本发明的诊断方法。

    ((v)-1)在使用RNA作为待测量的生物样品的情况下

    当使用RNA作为测量靶时,可通过具体包括以下步骤(a)-(c)的方法检测肿瘤:

    (a)将从受试者的生物样品中制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸与上述本发明的肿瘤标记物(本发明的多核苷酸和/或与其互补的多核苷酸)结合的步骤,

    (b)使用肿瘤标记物作为指示物,测量与肿瘤标记物结合的来源于生物样品的RNA或由其转录的互补多核苷酸的步骤,和

    (c)基于(b)的测量结果判断受试者是否患有肿瘤的步骤。

    当使用RNA作为测量靶时,通过检测和测量样品来源的RNA中的本发明的基因的表达水平实施根据本发明的检测(诊断)方法。例如,可通过已知方法例如RNA印迹、RT-PCR,DNA芯片分析,原位杂交分析等等,使用由上述多核苷酸(本发明的多核苷酸和或与其互补的多核苷酸)组成的本发明的肿瘤标记物作为引物或探针实施根据本发明的检测(诊断)方法。

    在应用RNA印迹的情况下,可通过使用上述本发明的肿瘤标记物作为探针检测和测量样品来源的RNA中的本发明的基因表达的存在或缺乏或水平。例如,如下实施所述方法:用放射性同位素(例如32P,?33P等等;?RI)、荧光物质等等标记本发明的肿瘤标记物(互补链);将标记的肿瘤标记物与来源于受试者的生物样品中已使用常规程序被转移至尼龙膜等的RNA杂交;然后通过使用放射性检测器(BAS-1800II,?FUJIFILM?Corporation)或荧光检测器检测和测量标记的肿瘤标记物(RI或荧光物质)的标记物信号来检测和测量由肿瘤标记物(DNA)和RNA形成的双链??裳〉?,可如下实施所述方法:使用AlkPhos直接标记和检测系统(Amersham?Pharmacia?Biotech)按照其实验方案标记肿瘤标记物(探针DNA),然后将其与来源于患者的生物样品中的RNA杂交;和使用Multi?Bio?Imager?STORM?860?(Amersham?Pharmacia?Biotech)检测和测量标记的肿瘤标记物的标记物信号。

    在应用RT-PCR的情况下,可通过使用上述本发明的肿瘤标记物作为引物来检测和测量样品来源的RNA中的本发明的基因表达的存在或缺乏或水平。例如,如下实施所述方法:使用常规程序由来源于受试者的生物样品的RNA制备cDNA;在将所述cDNA与由本发明的肿瘤标记物制备的一对引物(结合上述cDNA(负链)的正向引物和结合正链的反向引物)杂交后,使用常规程序进行PCR,从而可以使用cDNA作为模板扩增本发明的基因;然后检测得到的扩增的双链DNA。扩增的双链DNA的检测可通过例如下述方法实现,在一个方法中上述PCR使用已事先用RI或荧光物质标记的引物进行并检测得到的标记的双链DNA;或在一个方法中使用常规程序将得到的双链DNA转移至尼龙膜等并与用作探针的标记的肿瘤标记物杂交,由此检测双链DNA??赏ü鏏gilent?2100?Bioanalyzer?(Yokogawa?Analytical?System)测量得到的标记的双链DNA产物。此外,可如下实施RT-PCR:使用SYBR?Green?RT-PCR试剂(Applied?Biosystems)按照方案制备RT-PCR反应混合物;使用ABI?PRISM?7700?Sequence?Detection?System?(Applied?Biosystems)实施反应;和检测反应产物。

    例如,在应用DNA芯片分析的情况下,如下实施所述方法:制备DNA芯片,在上面连接上述本发明的肿瘤标记物作为DNA探针(单链或双链);将DNA芯片与使用常规程序从来源于患者的生物样品的RNA中制备的cRNA杂交;将得到的由DNA和cRNA形成的双链与由本发明的肿瘤标记物制备的标记的探针结合;和检测与标记的探针结合的双链。

    ((v)-2)在使用肽作为待测量的生物样品的情况下

    当使用肽作为测量靶时,通过检测本发明的肽和测量其量实施根据本发明的检测(诊断)肿瘤的方法。例如,可通过包括以下步骤的方法实施根据本发明的方法:

    (a)将从受试者的生物样品中制备的肽与涉及抗体的本发明的肿瘤标记物(PBF-识别抗体)结合的步骤,

    (b)使用肿瘤标记物作为指示物,测量与肿瘤标记物结合的来源于生物样品中的肽的步骤,和

    (c)基于(b)的测量结果判断受试者是否患有肿瘤的步骤。

    例如,通过使用抗体(识别本发明的肽的抗体)作为本发明的肿瘤标记物,根据已知方法例如蛋白质印迹检测和定量本发明的肽而实施所述方法。

    可如下实施蛋白质印迹:使用本发明的肿瘤标记物作为一次抗体,之后使用用放射性同位素例如125I、荧光物质、酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))等标记的标记抗体作为二次抗体,其为结合一次抗体的抗体;检测和测量从标记的化合物的放射性同位素、荧光物质等中得到的信号,例如使用放射性检测器(例如,BAS-1800II,?FUJIFILM?Corporation)或荧光检测器??裳〉?,可如下实施蛋白质印迹:在使用本发明的肿瘤标记物作为一次抗体以后,使用ECL?Plus?Western?Blotting?Detection?System?(Amersham?Pharmacia?Biotech)根据其实验方案用于检测;使用Multi?Bio?Imager?STORM?860?(Amersham?Pharmacia?Biotech)测量信号。

    ((v)-3)在使用抗体作为待测量的生物样品的情况下

    当使用生物样品中存在的抗体作为测量靶时,通过检测生物样品中针对本发明的肽的抗体和测量其量,实施根据本发明的检测(诊断)肿瘤的方法。例如,可通过使用肽相关的本发明的肿瘤标记物并与上述((v)-2)类似地进行程序而实施根据本发明的方法。

    ((v)-4)在使用肿瘤抗原特异性CTL作为待测量的生物样品的情况下

    当使用外周血淋巴细胞中存在的肿瘤抗原特异性CTL作为测量靶时,通过检测在生物样品中特异性针对本发明的肽的CTL和测量其量来实施根据本发明的检测(诊断)肿瘤的方法。例如,可依照如文献(Science,?274:94,?1996,?其在此处引入作为参考)中描述的方法通过制备由荧光标记的HLA抗原和本发明的肽形成的复合物的四聚体(HLA四聚体)和使用所述四聚体通过流式细胞仪定量疑为患肿瘤的患者的外周血淋巴细胞中的特异性针对抗原肽的CTL来实施根据本发明的方法。

    ((v)-5)肿瘤的诊断

    例如,可通过测量受试者的血液和疑为被肿瘤侵袭的待测组织中本发明的肽的基因表达水平,作为基因表达产物的本发明的肽的量,针对本发明的肽的抗体的量或特异性针对本发明的肽的CTL的量来实施肿瘤的诊断。任选地,可通过将所述基因或所述肽的表达水平与对应正常组织中的该水平相比较并测定受试者组织和对应正常组织二者之间的差异来实施诊断。

    可通过测量受试者和正常个体的平行生物样品实施受试者的待测组织和对应正常组织之间的基因、肽、抗体或CTL的量(水平)的比较。当测量不是平行进行时,可使用有关本发明的肽的基因表达水平、本发明的肽的量、针对本发明的肽的抗体的量或特异性针对本发明的肽的CTL的量的结果的平均值或统计中间值作为正常值实施比较,通过在均一条件下进行正常组织的多个样品(至少2个,优选3个或更多,和更优选5个或更多样品)的测量得到所述平均值或统计中间值。

    例如可取决于与正常个体组织中相比,受试者组织中的本发明的肽的基因表达水平、本发明的肽的量、针对本发明的肽的抗体的量或特异性针对本发明的肽的CTL的量是否为2倍或更高倍,优选3倍或更高倍来测定受试者是否患有肿瘤。

    通过以下实施例进一步说明本发明,但这些实施例不在任何方面限制本发明。

    实施例1

    肽的合成和其与HLA-A?0201的结合亲和力的测量

    通过Fmoc方法合成如SEQ?ID?NO:4所示的肽。通过HLA?I类稳定性测定(J?Immunol,?2004,?173:1436,?其在此处引入作为参考)测量肽与HLA-A0201的结合亲和力。在此测定中,使用来源于流感基质蛋白的肽(RYLRDQQLLGI,?SEQ?ID?NO:5)作为阳性对照和使用鼠H-2Kb结合肽VSV8?(RGYVYQGL,?SEQ?ID?NO:6)作为阴性对照。一式三份进行测定。通过用FITC-标记的抗-HLA-A2单克隆抗体BB7.2(购自ATCC)染色并通过流式细胞仪测量荧光信号,和根据以下方程%MFI增加=?[(MFI?具有给定肽?-?MFI?无肽)/(MFI?无肽)]?x?100测定平均荧光强度增加百分比(%MFI增加),检测测量的肽和HLA-A0201的结合亲和力。对阳性对照的流感基质蛋白来源的肽(SEQ?ID?NO:5),%MFI增加±标准差(SD)为44.9?±?6.8;对阴性对照的H-2Kb结合肽VSV8?(SEQ?ID?NO:6)为5.6?±?8.2;和对SEQ?ID?NO:4所示的肽为74.5?±?6.6,表明SEQ?ID?NO:4所示的肽结合HLA-A0201。

    实施例2

    抗原肽特异性CTL的频率分析

    将来自5名具有骨肉瘤的PBF阳性患者的淋巴细胞在有限稀释条件下进行混合淋巴细胞肽培养(有限稀释/混合淋巴肽培养;LD/MLPC)以诱导肽特异性CTL(Cancer?Sci.,?2008,?99:368-375,其在此处引入作为参考)。对2名患者:患者1号和2号,收集50ml外周血以分离外周血单核细胞(PBMC)。在含有1%人血清和补充50?μg/ml?SEQ?ID?NO:4所示的肽的AIM-V培养基(Invitrogen)中在室温培养PBMC?60分钟。用肽刺激的PBMC以2x105个细胞/200?μl/孔铺在U形底96孔微量滴定板中并在含有10%人血清、20?U/ml?IL-2和10?ng/ml?IL-7的AIM-V培养基中培养。在培养开始7天后,用包含IL-2、IL-7和SEQ?ID?NO:2所示的肽的AIM-V培养基替换各个孔中的一半培养基以进行第二次刺激。使用培养开始14至21天后的细胞用于四聚体的频率分析。

    对3名患者:患者3、4和5号,使用磁性抗-CD8微珠(Miltenyi?Biotec)从PBMC分离CD8阳性细胞。用SEQ?ID?NO:4所示的肽刺激CD8阳性细胞60分钟并通过放射失活。使用含有10%人血清、20?U/ml?IL-2和10?ng/ml?IL-7的AIM-V培养基在48孔微量滴定板中培养每孔1.0?×?105个至2.1?×?105?个的CD8阳性细胞以及2?×?105个至5?×?105个细胞/孔的经放射的肽刺激的CD8阳性细胞。培养7天后,加入如上所述的经放射的肽刺激的CD8阳性细胞以进行第二次刺激。使用培养开始后13至23天的细胞用于四聚体的频率分析。使用SEQ?ID?NO:4所示的肽制备的PE标记的HLA-A0201/PBF四聚体(MBL)用于分析。

    使用HIV来源的肽制备的FITC标记的HLA-A0201/HIV四聚体(MBL)用作阴性对照。使用LD/MLPC方法培养的部分淋巴细胞与PE标记的HLA-A0201/PBF四聚体或与FITC标记的HLA-A0201/HIV四聚体(各10?nM,?在25?μl?PBS中)在室温培养15分钟,然后染色。再加入PE-Cy5-标记的抗-CD8抗体(eBioscience)并孵育15分钟,然后染色。然后,细胞用PBS洗2次,在0.5?%甲醛水溶液中固定,并用流式细胞仪FACScan分析。认为同时用PE-Cy5-标记的抗-CD8抗体和用PE-标记的HLA-A0201/PBF四聚体染色的活细胞是四聚体阳性和肽特异性CTL。使用以下方程测定特异性针对SEQ?ID?NO:2所示的肽的CTL频率:频率=四聚体阳性孔数/(检查的孔总数xLD/MLPC开始时每孔的CD8阳性细胞数)。有关5名患者的CTL频率的结果显示于表3。在5名患者中,3名患者:患者2、3和4号分别具有5?×?10-6,?2?×?10-7,?和5?×?10-7的频率。发现诱导了特异性针对SEQ?ID?NO:4所示的肽的CTL。

    表2

    实施例3

    抗原肽特异性CTL的建立

    为培养T细胞,使用通过用EB病毒转化的来自对HLA-A0201呈阳性的健康个体的B细胞得到的B细胞系:NS-EBV-B细胞,和通过用EB病毒转化的来自对HLA-A0201呈阴性的具有骨肉瘤患者的B细胞得到的B细胞系:LCL-S2000细胞(J?Orthop?Sci.,?2003,?8:554-559,?其在此处引用作为参考)。将实施例2中发现的呈四聚体阳性的患者4号的孔中的T细胞以单细胞/孔铺在96孔微量板中。每孔加入2?×?104?个经放射并用SEQ?ID?NO:4所示肽刺激的NS-EBV-B细胞和8x104个经放射的同种异体PBMC,在含有10%人血清,200?U/ml?IL-2和10?ng/ml?IL-7的200?μl?AIM-V培养基中培养。在培养开始后14和21天,用含有1?×?104个经放射并用SEQ?ID?NO:4所示肽刺激的NS-EBV-B细胞,1?×?104?个LCL-S2000细胞和8?×?104个经放射的同种异体PBMC的新鲜培养基替换100?μl培养基。培养开始35天后,使用HLA-A0201/PBF四聚体分析所有孔中的某些细胞。

    收集四聚体阳性孔中的细胞,并在U形底96孔微量板上以2?×?103个细胞/孔在含有10%人血清,200?U/ml?IL-2和7.5?μg/ml植物血球凝集素P以及1?×?103个经放射的同种异体PBMC的100?μl?AIM-V培养基中培养。7天后,对每孔加入含有10%人血清和IL-2的100?μl?AIM-V培养基。14天后,在收集所有生长的细胞后,将0.5至1?×?106个细胞加入48孔微量板的各孔,并在含有10%人血清和IL-2的AIM-V培养基中培养。将建立的细胞系取名为CTL5A9。通过51Cr释放实验(J?Immunol,?2002,?169:1611-1618,?其在此处引入作为参考)测量CTL的细胞毒性活性。

    使用骨肉瘤细胞系:?U2OS?(U2OS,见图2)和OS2000?(OS2000,见图2),?红白血病细胞来源的细胞系:?K562?(K562,?见图1和2),?和成淋巴细胞系:?T2?(T2,?见图1)作为靶细胞。U2OS细胞为HLA-A0201阳性和PBF阳性,OS2000细胞为HLA-A0201阴性和PBF-阳性,和T2细胞为HLA-A0201阳性和PBF阴性。用100μCi?51Cr标记靶细胞1小时。在用51Cr标记后,用或不用50?μg/ml的SEQ?ID?NO:4所示肽刺激T2细胞1小时。用或不用100U/ml干扰素-γ处理U2OS细胞48小时。图1显示了CTL5A9对抗用或不用肽刺激的T2细胞和对K562细胞的细胞毒性活性。CTL5A9仅对用肽刺激的细胞显示了细胞毒性活性。

    图2显示了CTL5A9对骨肉瘤细胞系U2OS和OS2000的细胞毒性活性。CTLA5A9对PBF阳性和HLA-A0201阳性的U2OS细胞具有细胞毒性,对PBF阳性但HLA-A0201阴性的K562细胞没有细胞毒性。当U2SO细胞中的HLA-A0201表达量被干扰素-γ的处理提高时,U2SO细胞倾向于被CTL5A9伤害。这些结果证明CTL5A9识别在癌细胞中产生的PBF来源的抗原肽和HLA-0201的复合物,由此展示细胞毒性活性。

    工业适用性

    本发明提供了例如肿瘤抗原蛋白PBF及其基因作为用于诱导CTL的试剂的用途??墒褂帽痉⒚鞯挠糜谟盏糃TL的试剂治疗具有肉瘤、肾癌等的患者。

    SEQ?ID?NO:3至6所示的氨基酸序列为合成肽的序列。

    [序列表]

    ?????????????????????????序列表

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    <110>??Sato,?Noriyuki

    ???????Dainippon?Sumitomo?Pharma?Co.,?Ltd.

    ?

    <120>??肿瘤抗原蛋白质及其用途

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    <130>??669412

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    <150>??JP2008-270078

    <151>??2008-10-20

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    <160>??6????

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    <170>??PatentIn?版本3.5

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    <210>??1

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    <212>??DNA

    <213>??智人

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