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    重庆时时彩不定胆玩法: 一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 同时 检测 番茄 环斑 病毒 芥菜 花叶 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110168930.4

    申请日:

    2011.06.21

    公开号:

    CN102253212A

    公开日:

    2011.11.23

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20110621授权公告日:20131225终止日期:20170621|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20110621|||公开
    IPC分类号: G01N33/577 主分类号: G01N33/577
    申请人: 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心
    发明人: 于翠; 杨翠云; 代欢欢; 张舒亚
    地址: 200135 上海市浦东新区民生路1208号
    优先权:
    专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 31100 代理人: 陈静
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110168930.4

    授权公告号:

    |||102253212B||||||

    法律状态公告日:

    2018.07.10|||2013.12.25|||2012.01.04|||2011.11.23

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法。本发明人将针对两种植物病毒的捕获抗体分别固定在不同微球上,并且还根据病毒自身因素以及混合体系的特点,优化了检测抗体、微球以及标记物等的用量、比例,建立了液相芯片检测方法,从而大大提高了病毒检测的敏感性和准确率,最大限度降低了背景信号的产生。

    权利要求书

    1.一种同时检测番茄环斑病毒(Tomato?ringspot?virus)和南芥菜花叶病毒
    (Arabis?mosaic?virus)的方法,其特征在于,该方法包括:
    (1)提供已包被抗体的微球,其包括微球1和微球2,微球1上固定有抗
    番茄环斑病毒的捕获抗体,微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体;将
    待测样品与已包被抗体的微球混合,从而使待测样品中的番茄环斑病毒和/或南
    芥菜花叶病毒与捕获抗体及微球形成“病毒-捕获抗体-微球”复合物;所述的
    微球1和微球2具有不同的微球识别信号;
    (2)将步骤(1)形成的复合物与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测
    抗体和抗南芥菜花叶病毒的检测抗体混合,从而形成“检测抗体-病毒-捕获抗
    体-微球”复合物;
    (3)检测(2)形成的复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物,
    从而确定待测样品中番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的存在与否以及存在的
    量;
    附加条件是待测样品、已包被抗体的微球、检测抗体的混合,可依次进行,
    也可同时进行。
    2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的捕获抗体是多克隆抗体。
    3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的检测抗体是单克隆抗体;
    并且,所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10±5μg/mL;或者所述的
    抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6±3μg/mL。
    4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的可检测标记物是生物素,
    步骤(2)中还包括加入链亲和素-藻红蛋白。
    5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的链亲和素-藻红蛋白与
    抗番茄环斑病毒的检测抗体的质量比是(0.3-0.4)∶1;或所述的链亲和素-藻红蛋
    白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是(0.2-0.3)∶1。
    6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述已包被抗体的微球中,每
    种微球的量为(6-10)×104个/mL。
    7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的微球1与带有可检测标
    记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体的体积比是1∶3;所述的微球2与带有可检
    测标记物的抗南芥菜花叶病毒的体积比是1∶2。
    8.一种用于同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的液相芯片,其特征
    在于,其包括微球1和微球2,微球1上固定有抗番茄环斑病毒的捕获抗体,
    微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体。
    9.一种用于检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的试剂盒,其特征在于,
    其包括:
    (a)权利要求7所述的已包被抗体的微球;
    (b)带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体,其浓度是10±5
    μg/mL;以及
    (c)带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体,其浓度是6±3
    μg/mL。
    10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述的可检测标记物是生
    物素,且该试剂盒还包括:链亲和素-藻红蛋白。

    说明书

    一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法

    技术领域

    本发明属于生物技术及植物检疫领域;更具体地,本发明涉及一种同时检
    测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法。

    背景技术

    ELISA和多种PCR是目前病毒检测的主要方法。然而,目前国内缺乏大多
    数检疫性病毒的抗体(实际检测中多从国外高价购买)。同时,基于抗体的ELISA
    检测方法灵敏度有限。另一方面,PCR检测技术受RNA提取质量、模本DNA含
    量、引物和PCR条件等多因素影响,在实际检测过程中可能存在较高的假阳性
    或假阴性风险。此外,通常的ELISA和PCR方法都仅针对一种病毒的检测,尽
    管有报道利用多重PCR同时检测多重病毒,但本申请人在实际应用中发现三重
    以上PCR检测方法受待检病毒种类、检测样品、引物和PCR条件等多重因素的
    影响,检测结果重复性很差、难以推广应用。

    液相芯片(Liquid?chip)是在液态悬浮体系中进行生物分子互作反应的一类
    新型生物芯片技术,又称为多功能悬浮点阵(Multi-analyte?suspension?array,
    MASA)、Flexible?multi-analyte?profiling(xMAP)或流式荧光技术等。液相芯片体
    系是由许多大小均一的圆形微球为主要基质所构成,通常微球由聚苯乙烯制
    成。目前开发的液相芯片技术和检测装置如Luminex?100/200,Bio-Rad?
    VersArray?ChipRe?ader)。

    液相芯片技术已被应用于病原体、细胞因子、肿瘤标志物和激素等的诊断
    检测。目前,国内外还未见利用液相芯片技术对植物病毒进行高通量检测的报
    道。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的
    方法。

    在本发明的第一方面,提供一种同时检测番茄环斑病毒(Tomato?ringspot?
    virus,ToRSV)和南芥菜花叶病毒(Arabis?mosaic?virus,ArMV)的方法,该方法包
    括:

    (1)提供已包被抗体的微球,其包括微球1和微球2,微球1上固定有抗
    番茄环斑病毒的捕获抗体,微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体;将
    待测样品与已包被抗体的微球混合,从而使待测样品中的番茄环斑病毒和/或南
    芥菜花叶病毒与捕获抗体及微球形成“病毒-捕获抗体-微球”复合物;所述的
    微球1和微球2具有不同的微球识别信号;

    (2)将步骤(1)形成的复合物与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测
    抗体和抗南芥菜花叶病毒的检测抗体混合,从而形成“检测抗体-病毒-捕获抗
    体-微球”复合物;

    (3)检测(2)形成的复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物,
    从而确定待测样品中番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的存在与否以及存在的
    量;

    附加条件是待测样品、已包被抗体的微球、检测抗体的混合,可依次进行,
    也可同时进行。

    在另一优选例中,所述的捕获抗体是多克隆抗体。

    在另一优选例中,所述的捕获抗体的包被浓度是40±20(较佳地,40±10)
    μg/mL。

    在另一优选例中,所述的检测抗体是单克隆抗体;并且,所述的抗番茄环
    斑病毒的检测抗体的浓度是10±5μg/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检
    测抗体的浓度是6±3μg/mL。

    在另一优选例中,所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10±3
    μg/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6±2μg/mL。

    在另一优选例中,所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10±2
    μg/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6±1μg/mL。

    在另一优选例中,所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10±1
    μg/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6±0.5μg/mL。

    在另一优选例中,所述的可检测标记物是生物素,步骤(2)中还包括加入链
    亲和素-藻红蛋白。

    在另一优选例中,所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体
    的质量比是(0.3-0.4)∶1;或所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检
    测抗体的质量比是(0.2-0.3)∶1。

    在另一优选例中,所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体
    的质量比是0.35∶1;或所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检测
    抗体的质量比是0.25∶1。

    在另一优选例中,所述已包被抗体的微球中,每种微球的量为(6-10)×104
    个/mL。

    在另一优选例中,所述已包被抗体的微球中,每种微球的数量为(7-9)×104
    个/mL;更佳地为8×104个/mL。

    在另一优选例中,两种微球是等量混合的。

    在另一优选例中,所述的微球1与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的
    检测抗体的体积比是1∶3;所述的微球2与带有可检测标记物的抗南芥菜花叶
    病毒的体积比是1∶2。

    在本发明的另一方面,提供一种用于同时检测番茄环斑病毒(ToRSV)和南
    芥菜花叶病毒(ArMV)的液相芯片,其包括微球1和微球2,微球1上固定有抗
    番茄环斑病毒的捕获抗体,微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体。

    在另一优选例中,所述的捕获抗体是多克隆抗体。

    在本发明的另一方面,提供一种用于检测番茄环斑病毒(ToRSV)和南芥菜
    花叶病毒(ArMV)的试剂盒,其包括:

    (a)所述的已包被抗体的微球;

    (b)带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体,其浓度是10±5
    μg/mL(较佳地是10±3μg/mL;更佳地是10±2μg/mL;进一步更佳地是10±1
    μg/mL);以及

    (c)带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体,其浓度是6±3
    μg/mL(较佳地是6±2μg/mL;更佳地是6±1μg/mL;进一步更佳地是6±0.5
    μg/mL)。

    在另一优选例中,所述的试剂盒中,所述的可检测标记物是生物素,且该
    试剂盒还包括:链亲和素-藻红蛋白。

    在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:标准品和/或对照品。

    在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:杂交液,洗涤液等。

    本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而
    易见的。

    具体实施方式

    本发明人经过广泛的研究,将针对两种植物病毒的捕获抗体分别固定在不
    同微球(Beads)上,并且本发明人还根据病毒自身因素以及混合体系的特点,优
    化了检测抗体、微球以及标志物(标记物)等的用量、比例,建立了液相芯片检
    测方法,从而大大提高了病毒检测的敏感性和准确率,最大限度降低了背景信
    号的产生?;诖送瓿闪吮痉⒚?。

    术语

    如本文所用,“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”、与“一抗”
    可互换使用,都是指用于固定于微球上的、特异性抗一种病毒或病毒蛋白的抗
    体。作为本发明的优选方式,所述的捕获抗体是抗病毒的多克隆抗体。

    如本文所用,“检测抗体”、“第二抗体”、与“二抗”可互换使用,都
    是指特异性抗一种病毒或病毒蛋白的抗体。对于同一种病毒而言,相应的捕获
    抗体和检测抗体是不同的,并且可同时结合于所述的病毒或病毒蛋白上的不同
    表位。作为本发明的优选方式,所述的检测抗体是抗病毒的单克隆抗体。

    如本文所用,所述的“微球识别信号”是指位于微球上的,用于区别不同
    的捕获抗体的识别信号。为了方便起见,对于固定有同一种捕获抗体的微球,
    微球识别信号优选是相同的。优选的,所述的微球识别信号是荧光信号,并且,
    对于固定有不同种捕获抗体的微球,荧光的色彩是不同的,对于固定有同种捕
    获抗体的微球,荧光的色彩优选是相同的。

    如本文所用,所述的“可检测标记物”是指与检测抗体结合或耦联的、用
    于显示(或作为显示标志的)检测抗体与相应的病毒或病毒蛋白发生结合的信
    号。

    在本发明的优选方式中,所述的可检测标记物是生物素,该生物素作为显
    示标志,当与链霉菌亲和素偶联的藻红蛋白(链亲和素-藻红蛋白,又称为PE
    标记的链亲和素,SA-R-PE)结合后,通过激光激发产生荧光信号。

    基本原理

    本发明的基本原理是双抗夹心法结合液相芯片技术。双抗夹心法常规的做
    法是将一抗固定于载体,然后一抗与抗原反应,洗涤后再与带标记的二抗反应,
    洗涤,最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。

    对上述双抗夹心法进行改进的是将所述的一抗固定于携带特定可检测信
    号的微球上,制备液相蛋白芯片,通过采用液相蛋白芯片进行检测的原理是:
    使单个微球通过检测通道,并使用两种激光同时对微球上的微球识别信号和可
    检测信号进行检测。一种激光激发的是微球上的微球识别信号,根据微球上的
    不同种识别信号,可以将微球分类,从而将各个不同的结合反应区分开来。另
    一种激光激发的是可检测信号,目的是确定微球上结合的可检测信号的数量,
    从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此,通过两种激光的同时检测,可
    以确定被结合的检测物的种类和数量。

    本发明优化了各试剂用量和条件参数,以在检测多于一种病毒时提交效率
    和准确性。

    抗体包被微球

    所述的液相芯片包括2种不同的微球,所述的微球上固定有不同的捕获抗体,
    其中,所述的捕获抗体为抗番茄环斑病毒的抗体和抗南芥菜花叶病毒的抗体。

    本发明中,将捕获抗体固定在微球上的详细操作程序可用常规方法,例如
    按照Luminex公司的产品说明书或网站:www.luminexcorp.com中所述的方法
    进行偶连,从而得到不同微球与相应捕获抗体形成的耦连物。

    所述的不同的微球是具有不同微球识别信号的微球,由于带有不同的微球识
    别信号,使不同微球之间可被区分。在本发明的优选方式中,所述的微球识别信号
    为荧光信号,并且,微球上的荧光信号因固定于微球上的相应的捕获抗体的不同而
    不同。

    本发明所述的微球可以采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。
    并且,所述的微球的平均直径为1-100μm;更优选的,所述的微球的平均直径为
    2-50μm,更优选的,所述的微球的平均直径为2-10μm。在另一优选例中,本发
    明所用的微球是一种直径5.5-5.6μm,以不同荧光标记的微球。

    在本发明的一种优选方式中,在一个反应体系中(如约20μL体系),每一种固
    定有不同的捕获抗体的微球的用量为(6-10)×104个/mL;更优选的为(7-9)×104
    个/mL;最优选地是8×104个/mL。

    检测方法

    为了同时地检测所述的病毒,本发明人对采用所述液相芯片的检测方法进行
    了优化,以保证能够从样品中精确地检出病毒的存在情况以及存在量,提高检出率。

    本发明人在深入研究后发现,针对同时检测番茄环斑病毒(Tomato?ringspot?
    virus,ToRSV)和南芥菜花叶病毒(Arabis?mosaic?virus,ArMV)的情况,在利用
    液相芯片进行检测时,最为关键的影响因素是检测抗体的工作浓度,微球和检
    测抗体的比例。

    本发明中,每一种检测抗体分别抗一种相应的植物病毒,且对应于相应的
    捕获抗体。在本发明的优选方式中,在利用检测抗体进行检测时,所述的抗番
    茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10±5μg/mL;较佳地是10±3μg/mL;更佳地
    是10±2μg/mL;最佳地是10±1μg/mL。所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体
    的浓度是6±3μg/mL;较佳地是6±2μg/mL;更佳地是6±1μg/mL;最佳地是6
    ±0.5μg/mL。

    在本发明的优选方式中,在利用检测抗体进行检测时,所述的微球1与带
    有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体的体积比是1∶3;所述的微球2与
    带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的体积比是1∶2。

    可选用多种可检测信号来标记所述的检测抗体。比如,所述的可检测信号
    选自:FITC、CY3、CY5、藻蓝蛋白、Alexa?Fluor?Dyes、BODIPY?Dyes、俄勒
    冈绿染料(Oregon?Green?Dyes)、得克萨斯红染料(Texas?Red?Dye),或若丹明
    (Rhodamine)。

    在本发明的一种优选方式中,采用生物素作为可检测标记物。生物素的标
    记方法是本领域技术人员熟知的。

    对应于可检测标记物的检测物质为能够与可检测标记物相结合并能够报告所
    述结合的分子(报告分子)。当采用生物素来标记检测抗体时,可采用链亲和素-
    藻红蛋白作为报告分子。

    作为本发明的优选方式,所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检
    测抗体的质量比是(0.3-0.4)∶1;较佳地为是0.35∶1。所述的链亲和素-藻红蛋
    白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是(0.2-0.3)∶1;较佳地为0.25∶1。

    本发明中,可用所述的液相芯片进行检测的样品包括任何提取自植物的提
    取物(可以是液态或固态),或由植物加工成的各类物质。

    为了消除假阳性和假阴性,宜在检测过程中设置阳性病毒对照和阴性对
    照。此外,为了获得定量结果,可以在检测过程中设置含已知浓度的病毒的标
    准品。对照或标准品的设置方法采用常规的方法。

    在本发明的实施例中,运用优化的试验条件,得出同时检测ArMV和ToRSV
    的最佳工作条件。ArMV单抗工作浓度为6μg/mL,单抗与藻红蛋白的质量比为
    1∶0.25,单抗与微球的体积比为2∶1;ToRSV最优反应条件为二抗工作浓度为10
    μg/mL,二抗与藻红蛋白的质量比为1∶0.35,二抗与微球的体积比为3∶1,液相
    芯片每次使用的样本量为10μL,检测过程为一个半小时。而ELISA检测至少需
    要50μL,检测时间为数小时以上。并且,多次试验得出结论:液相芯片的检测
    灵敏度普遍高于ELISA?5-10倍。

    试剂盒

    本发明的液相(蛋白)芯片检测试剂盒可以将液相芯片技术与免疫学方法相
    结合,对两种植物病毒进行同时进行精准、快速地定量分析。

    本发明的用于检测两种植物病毒的试剂盒包括以下组分:第一容器,以及
    装于该容器中的本发明所述的已包被捕获抗体的微球。

    在本发明的优选方式中,所述的试剂盒还包括:第二容器,以及装于该容
    器中的带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体,其浓度是10±
    5μg/mL;较佳地是10±3μg/mL;更佳地是10±2μg/mL;最佳地是10±1
    μg/mL。。

    在本发明的优选方式中,所述的试剂盒还包括:第三容器,以及装于该容
    器中的带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体,其浓度是6±3
    μg/mL;较佳地是6±2μg/mL;更佳地是6±1μg/mL;最佳地是6±0.5μg/mL。

    在本发明的另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:标准品、或对照品。
    其它用于进行杂交或酶联检测所需的试剂也可被包含在本发明的试剂盒中。

    本发明的试剂盒中还可包含使用说明书,以指导人们按照正确的流程、条
    件、剂量来实施检测。

    本发明的主要优点在于:

    第一,本发明建立了双重液相芯片方法,可以同时对某一个体样品中的番
    茄环斑病毒(ToRSV)和南芥菜花叶病毒(ArMV)进行定性和定量分析,所需的
    样本量低,准确率高。

    第二,由于对微球带有的捕获抗体、相应的检测抗体、标记物的量进行配
    比设计,从而使得两种植物病毒均可灵敏地被检测。并且,最大限度降低了不
    同分析物在杂交时存在的非特异性的结合,从而大大降低了背景信号的产生。
    同时也节省了大量时间与资金。

    下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说
    明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方
    法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,科学出版
    社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则
    百分比和份数按重量计算。

    除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟
    悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于
    本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

    I.材料与方法

    聚苯乙烯荧光微球(ArMV编号为37,ToRSV编号为19,每种均带有独特
    的荧光光谱)购自Luminex。

    链霉菌亲和素(链亲和素)-藻红蛋白(SA-R-PE)购自Invitrogen公司???br />ArMV、ToRSV的单抗和多抗均购自中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究
    所。以多抗作为捕获抗体,以单抗作为检测抗体。

    番茄环斑病毒(ToRSV)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、烟草环斑病毒(Tobacco?
    ringspot?irus,TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato?black?ring?virus,TBRV)和草莓潜隐
    环斑病毒(Strawberry?latent?ringspot?virus,SLRSV)阳性对照购自美国阿格迪
    (Agdia)公司。样本状态为带毒烟草叶片冻干粉,于4℃冰箱保存。

    阴性对照池(pool)的制备方法

    确定为阴性的植物叶片,包括豌豆、苋菜、西瓜、大豆、辣椒、黄瓜、芹
    菜、番茄等共8份,每份取100mg,按照1(叶片):10(缓冲液)加入0.01M?PB缓
    冲液(0.94g?Na2HPO4,0.45g?KH2PO4定容至1L)研磨混匀为pool,然后分装,备
    用。

    微球的准备

    微球直径为5.6μm,表面带有羧基,以共价结合生物分子。首先,将4℃保
    存的微球放置于室温20~30min,涡旋微球(2~3min为宜),按需要量(如包被
    的微球量可做200次检测,每次检测需要2000个微球,则需要4×105个微球。微
    球的商品包装规格为1.25×107/mL,则这次包被需要微球为32μL)吸取荧光微球
    加入到1.5毫升的离心管中,13000r/min离心4min去除?;ひ?,用三蒸水洗涤
    后,用400μL?0.1M?pH?6.2磷酸缓冲液重悬微球。加入10μL?50mg/mL
    Sulfo-NHS和10μL?50mg/mL?EDC,混匀后37℃作用20min。离心去上清,待用。

    微球的包被

    将待包被的微球(4×105个微球)用900μL?0.05M?MES重新悬浮,离心去上
    清,洗涤微球两次。用400μL?0.05M?MES重悬微球,加入提纯的抗ToRSV多抗
    和(或)抗ArMV多抗(各自浓度均是40μg/mL),混匀后37℃作用2~3h(期间,每
    隔15min涡旋混匀一次)。离心去上清,加入900μL?PBS-TBN(含有0.05%
    Tween-20、0.1%BSA、0.05%叠氮钠的0.01M?PBS)重悬微球,混匀后离心去上
    清,洗涤微球两次。加入200μL?PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。
    微球上单位面积的量是107-9IgG/微球。

    液相蛋白芯片单一病毒检测程序

    取10μL样本,向其中加入对应的包被好多抗的微球20μL(工作浓度为8×104
    个/mL,涡旋微球数秒),37℃避光振荡作用30min。

    加入20μL生物素标记的检测抗体(初定8μg/mL)与链亲和素-藻红蛋白
    (SA-R-PE,1mg/mL)的混合物,质量比初定为检测抗体∶链亲和素-藻红蛋白=1∶
    0.3,37℃避光震荡作用45min。

    加入100μL终止液,将悬液转移至96孔可拆卸酶标反应板,通过
    Bio-plexTM200system仪器检测荧光强度值(median?fluorescence?intensity,
    MFI),并用Bio-Plex?Manager5.0软件分析数据。

    检测2种病毒的Plex检测体系建立

    优化得出同时检测ArMV和ToRSV最佳的反应体系,两种微球分别包被上
    抗ArMV病毒和抗ToRSV病毒的多克隆抗体,等量混合(每种4×104个/mL),不同
    工作浓度、不同体积的两种检测抗体(均为生物素标记的)同时加入到一个反应
    体系中,再向其中加入链亲和素-藻红蛋白(SA-R-PE),进行测定。其它条件同
    前述方法。

    最佳试验条件的确定

    反复试验后,本发明人筛选出3个对实验影响较显著的因素,每个因素分
    为三个等级(表1),检测的抗原浓度一定(抗原按1∶100倍稀释)。按照表1的实验
    交叉反应,分别测出不同的荧光强度值。实验重复3次。

    表1、因素变化表


    液相蛋白芯片检测方法阴阳性临界值——阈值的计算

    根据统计学原理,约有99%的观测值在平均数左右三倍标准偏差

    范围内。因此确认Cutoff值的计算方法为:阈值=POOL平均MFI值+3×标准偏差。
    大于阈值的为阳性,小于阈值的为阴性。

    液相蛋白芯片特异性检测

    选取同一属的烟草环斑病毒(TRSV)、番茄黑环病毒(TBRV)、草莓潜隐环
    斑病毒(SLRSV)按照前面“最佳试验条件的确定”的方法,同时检测荧光强度
    值。

    液相蛋白芯片技术的与ELISA方法的比较

    将ArMV和ToRSV的阳性对照进行梯度稀释,得到10-3×,10-4×,5×10-4,
    10-5×,5×0-5×,10-6×稀释度的病毒样品,用于测试各方法的灵敏度。

    II.实施例

    实施例1、最佳试验条件的确定

    经交叉反应,液相芯片检测ArMV和ToRSV最佳条件如表2。

    表2检测ArMV和ToRSV最佳试验条件的确定


    实施例2、液相蛋白芯片检测方法阴阳性临界值

    经确认为阴性的7份叶片,用液相蛋白芯片方法检测。计算阈值:POOL平
    均MFI值+3×标准偏差。检测ArMV和ToRSV的阈值经计算分别为346.3和
    133.7。待检样品用液相芯片检测所得的MFI值,与阈值比较,如果大于阈值则
    为阳性,小于阈值为阴性。

    实施例3、液相蛋白芯片特异性检测

    分别使用建立的检测ArMV和ToRSV的液相芯片方法(检测条件见表2)检测
    TRSV、TBRV和SLRSV样本。结果表明TRSV、TBRV和SLRSV均为阴性,而
    检测ArMV和ToRSV样本则各自呈现阳性。使用双重液相芯片方法同时检测两
    种病毒时,同时可呈现阳性。得到的结果见表3。

    表3、液相蛋白芯片特异型检测结果(MFI值)


    *注:(37)和(19)表示微球编号。

    以上结果说明,所建立的液相芯片方法在单一病毒时特异性好,而同时检
    测ArMV和ToRSV时,两者的MFI值均远远大于实施例2中的阈值,可用于两种
    病毒的同时检测。

    实施例4、液相蛋白芯片与ELISA试剂盒比较

    使用本发明上述制备的液相蛋白芯片和商品化的ELISA试剂盒(购自Agdia
    公司南芥菜花叶病毒检测试剂盒和番茄环斑病毒检测试剂盒)同时检测梯度稀
    释的ArMV和ToRSV阳性对照。

    根据实施例2中的阈值,可知液相芯片检测ArMV的灵敏度可至5×10-4,检
    测ToRSV的灵敏度可至5×10-5。

    ELISA检测样品时,按照试剂盒厂家的说明书进行;判断原则为:当样品
    OD405/阴性对照OD405值明显大于2时,可判为阳性,等于2判为可疑样品。

    结果测算出ELISA检测ArMV的灵敏度为10-4倍。而检测ToRSV的灵敏度约
    为5×10-4~5×10-5。因此液相芯片的检测灵敏度普遍高于ELISA?5-10倍(表4)。

    表4、ELISA和液相芯片的灵敏度比较


    在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献
    被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,
    本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申
    请所附权利要求书所限定的范围。

    关于本文
    本文标题:一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法.pdf
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