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    重庆时时彩一星杀号稳赚: 鱼肉制品中鳕鱼种源的检测方法.pdf

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    鱼肉 制品 鳕鱼 检测 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010150291.4

    申请日:

    2010.03.17

    公开号:

    CN102191316A

    公开日:

    2011.09.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 文件的公告送达IPC(主分类):C12Q 1/68收件人:青岛捷安信检验技术服务有限公司文件名称:缴费通知书|||专利权的转移IPC(主分类):C12Q 1/68变更事项:专利权人变更前权利人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心变更后权利人:青岛捷安信检验技术服务有限公司变更事项:地址变更前权利人:266002 山东省青岛市瞿塘峡路70号变更后权利人:266071 山东省青岛市市南区宁夏路306号乙B座登记生效日:20140425|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20100317|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; G01N21/64; C12N15/11 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
    发明人: 高宏伟; 林超; 孙敏; 刘彩霞; 梁成珠
    地址: 266002 山东省青岛市瞿塘峡路70号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010150291.4

    授权公告号:

    ||||||102191316B||||||

    法律状态公告日:

    2015.06.10|||2014.05.21|||2013.05.08|||2012.01.25|||2011.09.21

    法律状态类型:

    文件的公告送达|||专利申请权、专利权的转移|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术,具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中鳕鱼的快速检测方法。方法包括PCR扩增反应液和上游引物CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。鳕鱼的快速检测方法包括鱼肉制品DNA的提取、鳕鱼种属特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用熔解曲线进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。

    权利要求书

    1.一种鳕鱼物种鉴定的快速检测方法,其特征在于其中的引物:上游引物CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3;下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。2.一种使用权利要求一所述的快速鉴定鳕鱼物种的检测方法,其特征是依次包括下列步骤:(1)待检样品的DNA提??;(2)鳕鱼CO?I基因的实时荧光PCR扩增:在装有24μL的PCR扩增反应液的反应管中加入1μL的待检样品DNA,混匀。按照下述步骤完成PCR扩增。94-95℃?2-4min,1个循环;94-95℃?10-60s,61℃?10-60s,共40个循环;95℃?15s,60℃?15s,20min内升温至95℃,95℃?15s。(3)使用熔解曲线分析PCR产物。PCR产物的熔解曲线的单一熔解峰出现在80.5±1℃。

    说明书

    鱼肉制品中鳕鱼种源的检测方法

    技术领域

    本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术,具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中鳕鱼的快速检测方法。

    背景技术

    海洋捕捞的海洋大型鱼类一直是世界各国人民喜爱的食品,也是国际贸易的重要商品种类。海洋大型鱼类在贸易中常常包括加工成鱼肉片或者鱼肉块,更包括一些鱼的内脏或者其他深加工的产品。这些产品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼种类,因此需要不受外观和加工工艺的限制来确认商品的真伪。

    基于DNA的检测方法可以从基因水平进行物种鉴定。实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点,得到研究者的普遍认可,成为基因检测和鉴定的重要工具。目前国内外还没有对鳕鱼物种的鉴定方法公开,本发明可弥补上述缺陷,完成鱼肉制品中鳕鱼种源的鉴定。

    发明内容

    本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术,具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中鳕鱼的快速检测方法??朔谛翁У募觳夥椒ㄔ谟憷嗖芳庸す讨写吹募ɡ?,为确定鳕鱼的种源提供技术手段,从而确保食品标签的一致性。

    本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组引物:上游引物CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行PCR扩增;测定熔解曲线时,在反应体系中加入荧光染料Eva?Green,染料与DNA双链结合并发出荧光,由于反应中存在少量的非特异聚合体(如引物二聚体等),能引起干扰,但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低,当扩增结束后,再缓慢加温,当DNA变性后,染料被释放,荧光减少,而非特异性结合先于特异性结合减少,对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线,通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号区分出来,同时对特异性讯号区,荧光减少的快慢与浓度的对数成正比,以此可以确定是否有引物特异性扩增产物。

    本发明涉及的鳕鱼种源快速检测方法,其中的试剂包括如下:

    (1)PCR扩增反应液

    包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、1-2U?Taq酶、0.2-0.6μmol/L?上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、1.25μL?20×Eva?Green染料(美国Biotum公司);

    其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L?pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100;

    上游引物CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。其中上游引物、下游引物体积比为:1∶1;

    使用上述试剂盒检测食品中鳕鱼种源的方法,依次包括下列步骤(1)-(3):

    (1)待检样品DNA的提取

    DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用OD260和OD280的光吸收来衡量,或者使用其他方法衡量。

    (2)鳕鱼种源的实时荧光PCR扩增

    A.在装有24μL?PCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA,混匀。

    B.检测过程中分别设阳性对照、空白对照。使用具有溯源性的阳性标准物质作为阳性对照,用已知不含鱼类成分的样品作阴性对照,用等体积的水代替模板DNA作空白对照。

    C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪,按下述反应条件完成PCR扩增:

    94-95℃??2-4min,1个循环;

    94-95℃??10-60s,61℃10-60s,共40个循环;

    95℃15s,60℃15s,20min内升温至95℃,95℃15s。

    (3)使用熔解曲线分析PCR扩增结果。

    非鳕鱼样品:熔解曲线在80.5±1℃无单一峰;鳕鱼样品:熔解曲线在80.5±1℃有单一峰。

    本发明建立了鳕鱼种源的实时荧光PCR检测方法及检测方法。本发明采用实时荧光PCR技术,该技术特异性强、灵敏度高、操作简便,特别适用于一些成分复杂的鱼肉制品中鳕鱼种源的检测。

    附图说明

    图1是实施例1中鳕鱼样品PCR产物的熔解曲线图。

    图2是实施例2中鳕鱼样品PCR产物的熔解曲线图。

    具体实施方式

    下面结合实施例对本发明做进一步说明。

    实施例1

    按下述方法检测市售鳕鱼:

    包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L?dNTP、2mmol/L硫酸镁1.5U?Taq酶、0.4μmol/L上游引物?CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。

    其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100;

    按照以下程序进行检测:

    (1)待测鱼肉样品DNA的提取

    A.称取0.5g鱼肉,剪碎,转至1.5mL离心管中。加入500μL抽提裂解缓冲液(0.05MTris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0.1M?EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2M氯化钠、pH值7.6灭菌双蒸水),充分振荡;

    B.加入蛋白酶K?60μL,10%SDS?2μL,颠倒混匀。57℃水浴10h至原料消化为清液,4000rpm离心2min,取上清;

    C.加入500μL等体积的Tris-酚,颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    D.重复上步;

    E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25∶24∶1),颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24∶1),颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    G.加入两倍体积无水乙醇,1/5体积的醋酸钠(4M),颠倒混匀10min,沉淀DNA;12000rpm离心10min,弃上清;

    H.加入600μL乙醇(70%)洗涤DNA,离心弃上清,开盖,晾干;

    I.加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。

    J.DNA提取质量:纯度OD260/OD280=1.83,浓度为101ng/μL。满足PCR反应的条件。

    (2)待测鱼片DNA的实时荧光PCR扩增

    A.在PCR反应管中加入24μL?PCR反应液A和1μL样品DNA,混匀。

    B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪,按下述反应条件完成PCR扩增:

    94-95℃2-4min,1个循环;

    94-95℃10-60s,61℃10-60s,共40个循环;

    95℃15s,60℃15s,20min内升温至95℃,95℃15s。

    (3)应用荧光定量PCR仪随机软件,分析熔解曲线结果。

    非鳕鱼样品:熔解曲线在81±1℃无单一峰;鳕鱼样品:熔解曲线在81±1℃有单一峰。单一峰分别为鳕鱼阳性标准品和待检样品的熔解曲线。没有出峰的线是空白对照,见图1

    实施例2

    按下述方法检测市售鱼内脏是否为鳕鱼来源:

    包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L?dNTP、2mmol/L硫酸镁1.5U?Taq酶、0.4μmol/L上游引物CO88F:5-GGCTTTGGGAACTGACTC-3,下游引物CO88R:5-AAAGGAGCAGGAAAGATGG-3。

    其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L?pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1%曲拉通X-100;

    按照以下程序进行检测:

    (1)待测鱼内脏样品DNA的提取

    A.称取0.5g鱼内脏,剪碎,转至1.5mL离心管中。加入500μL抽提裂解缓冲液(0.05M?Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸)、0.1M?EDTA(乙二胺四乙酸)、0.2M氯化钠、pH值7.6灭菌双蒸水),充分振荡;

    B.加入蛋白酶K?60μL,10%SDS?2μL,颠倒混匀。57℃水浴10h至原料消化为清液,4000rpm离心2min,取上清;

    C.加入500μL等体积的Tris-酚,颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    D.重复上步;

    E.在上清液中加入Tris-酚、氯仿和异戊醇(体积比为25∶24∶1),颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    F.在上清液中加入氯仿和异戊醇(体积比为24∶1),颠倒混匀10min,12000rpm离心10min,取上清;

    G.加入两倍体积无水乙醇,1/5体积的醋酸钠(4M),颠倒混匀10min,沉淀DNA;12000rpm离心10min,弃上清;

    H.加入600μL乙醇(70%)洗涤DNA,离心弃上清,开盖,晾干;

    I.加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。

    J.DNA提取质量:纯度OD260/OD280=1.87,浓度为127ng/μL。满足PCR反应的条件。

    (2)待测鱼片DNA的实时荧光PCR扩增

    A.在PCR反应管中加入24μL?PCR反应液A和1μL样品DNA,混匀。

    B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪,按下述反应条件完成PCR扩增:

    94-95℃?2-4min,1个循环;

    94-95℃10-60s,61℃10-60s,共40个循环;

    95℃15s,60℃15s,20min内升温至95℃,95℃15s。

    (3)应用荧光定量PCR仪随机软件,分析熔解曲线结果。

    单一峰分别为鳕鱼阳性标准品的熔解曲线。没有出峰的线是待检样品和空白对照,见图2。样品的熔解曲线在80.5±1℃无单一峰;据此可判定该样品不是鳕鱼来源。

    核苷酸序列表

    <110>高宏伟?林超?孙敏?刘彩霞?梁成珠

    <120>鱼肉制品中鳕鱼种源的检测方法

    <160>2

    <210>1

    <211>18

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <221>prim_bind

    <222>(1)…(18)

    <400>1

    ggctttgggaactgactc????????????18

    <210>2

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <221>prim_bind

    <222>(1)…(19)

    <400>2

    aaaggagcaggaaagatgg???????????19

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