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    关 键 词:
    纤维化 疾病 成像
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980142170.0

    申请日:

    2009.09.11

    公开号:

    CN102196823A

    公开日:

    2011.09.21

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A61K 49/00申请公布日:20110921|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 49/00申请日:20090911|||公开
    IPC分类号: A61K49/00; C08G69/10; C08G69/48 主分类号: A61K49/00
    申请人: 日东电工株式会社
    发明人: 新津洋司郎; 俞磊; 赵刚; S·万; 王兴河; 刘健; S·库马尔达什; 田中康进; 梶原庆子; 高桥博一; 宫崎美代乃
    地址: 日本大阪
    优先权: 2009.08.07 JP 2009-184806; 2008.09.12 US 61/096,488
    专利代理机构: 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人: 左路;林晓红
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980142170.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.05.31|||2011.11.23|||2011.09.21

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了使具有纤维化特征的细胞和/或一部分组织成像的试剂和方法,以及确定和/或诊断纤维化疾病的试剂和方法。本发明还公开了聚合物缀合物,其可包含可检测标记、类视黄醇和聚合物。所述聚合物缀合物可用于使一部分组织成像,将可检测标记输送至一部分组织或细胞和/或诊断病症或者疾病。

    权利要求书

    1.具有纤维化特征的细胞和/或组织的成像剂,其包含类视黄醇和可检测标记。2.权利要求1的成像剂,其中所述类视黄醇包含视黄醇。3.权利要求1或2的成像剂,其中所述成像剂用于体内成像。4.权利要求1-3任一项的成像剂,其中所述成像剂用于纤维化疾病成像。5.权利要求1-4任一项的成像剂,其包含聚合物缀合物,所述聚合物缀合物包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元:[Chem.1]其中:m独立地是1或2;n独立地是1或2;A1和A2各自独立地是氧或者NR7;A3和A4各自独立地是氧或者NR8;A5和A6各自独立地是氧或者NR9;R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵、碱金属、类视黄醇和包含可检测标记的基团组成的组;R7、R8和R9各自独立地是氢或者C1-4烷基;o、p、q和r各自独立地是0、1或者更大,其中o、p、q和r的总和是2或者更大;以及条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是包含可检测标记的基团,以及R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是类视黄醇。6.聚合物缀合物,其包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元:[Chem.2]其中:m独立地是1或2;n独立地是1或2;A1和A2各自独立地是氧或者NR7;A3和A4各自独立地是氧或者NR8;A5和A6各自独立地是氧或者NR9;R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵、碱金属、类视黄醇和包含可检测标记的基团组成的组;R7、R8和R9各自独立地是氢或者C1-4烷基;o、p、q和r各自独立地是0、1或更大,其中o、p、q和r的总和是2或更大;以及条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是包含可检测标记的基团,及R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是类视黄醇。7.权利要求6的聚合物缀合物,其中所述聚合物进一步包含式(V)的至少一种重复单元:[Chem.3]其中:s独立地是1或2;A7和A8各自独立地是氧或者NR12;R12是氢或者C1-4烷基;R10和R11各自独立地选自任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵和碱金属。8.权利要求6或7的聚合物缀合物,其中所述聚合物进一步包含式(VI)的至少一种重复单元:[Chem.4]其中R13是氢、铵或者碱金属。9.权利要求6-8任一项的聚合物缀合物,其中可检测标记包含选自钆(III)、钇-88和铟-111的金属。10.权利要求6-9任一项的聚合物缀合物,其中可检测标记包含选自如下的配体:二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。11.权利要求6-10任一项的聚合物缀合物,其中可检测标记包含选自如下的配体:二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。12.权利要求6-11任一项的聚合物缀合物,其中可检测标记是顺磁性金属螯合物。13.权利要求12的聚合物,其中所述顺磁性金属螯合物包含:[Chem.5]14.权利要求6-11任一项的聚合物缀合物,其中可检测标记是染料。15.权利要求14的聚合物缀合物,其中所述染料包含德克萨斯红。16.权利要求6-15任一项的聚合物缀合物,其中m是1。17.权利要求6-15任一项的聚合物缀合物,其中m是2。18.权利要求6-17任一项的聚合物缀合物,其中n是1。19.权利要求6-17任一项的聚合物缀合物,其中n是2。20.权利要求7-19任一项的聚合物缀合物,其中s是1。21.权利要求7-19任一项的聚合物缀合物,其中s是2。22.制造权利要求6-21任一项的聚合物缀合物的方法,其包括:将包含式(VII)的重复单元和式(VIII)的重复单元中的至少一种重复单元的聚合反应物溶解或者部分溶解于溶剂中以形成溶解的或者部分溶解的聚合反应物;[Chem.6]其中:Z是1或者2;A9和A10是氧;及R14、R15和R16各自独立地选自氢、铵和碱金属;以及使所述溶解的或者部分溶解的聚合反应物与第二种反应物反应,其中所述第二种反应物包含包含可检测标记的基团或者类视黄醇;以及加入第三种反应物,其中所述第三种反应物包含包含可检测标记的基团、配体或者类视黄醇;条件是如果第二种反应物包含包含可检测标记的基团或者配体,则第三种反应物包含类视黄醇,以及如果第二种反应物包含类视黄醇,则第三种反应物包含包含可检测标记的基团或者配体。23.权利要求22的方法,其中所述第二种反应物包含类视黄醇。24.权利要求22或者23的方法,其中所述第三种反应物包含包含可检测标记的基团。25.权利要求22或者23的方法,其中所述第三种反应物包含配体。26.权利要求25的方法,其中所述配体选自:二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。27.权利要求22-26任一项的方法,其进一步包括加入第四种反应物,其中所述第四种反应物包含金属。28.权利要求27的方法,其中所述金属选自钆(III)、钇-88和铟-111。29.纤维化疾病的诊断剂,其包含权利要求1-5任一项的成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物。30.组合物,其包含权利要求1-5任一项的成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂,以及选自药物可接受的赋形剂、载体和稀释剂的至少一种。31.将可检测标记输送至一部分组织的方法,包括将一部分组织或者细胞与权利要求1-5任一项的至少一种成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物接触。32.使一部分组织成像的方法,包括将一部分组织或者细胞与权利要求1-5任一项的至少一种成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物接触。33.诊断疾病或者病症的方法,包括将一部分组织或者细胞与权利要求6-21任一项的至少一种聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物接触。34.权利要求31-33任一项的方法,其中所述组织是纤维组织。35.使纤维化疾病成像的方法,包括给有需要的对象施用有效量的权利要求1-5的成像剂、权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求30的组合物的步骤,以及检测所施用的成像剂、聚合物缀合物或者组合物中包含的所述标记的步骤。36.确定纤维化疾病的方法,包括将从施用了权利要求1-5任一项的成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物的对象中检测到的标记的信号强度和/或信号分布与参考信号强度和/或参考信号分布进行对比的步骤。37.监测纤维化疾病的方法,包括将从施用了权利要求1-5任一项的成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物的对象中在第一个时间点检测到的标记的信号强度和/或信号分布与在从所述对象中在晚于第一个时间点的第二个时间点检测到的标记的信号强度和/或信号分布进行对比的步骤。38.确定纤维化疾病治疗作用的方法,包括将从施用了权利要求1-5任一项的成像剂和/或权利要求6-21任一项的聚合物缀合物和/或权利要求29的诊断剂和/或权利要求30的组合物的对象中在第一个时间点检测到的标记的信号强度和/或信号分布与从所述对象中在晚于第一个时间点的第二个时间点检测到的标记的信号强度和/或信号分布进行对比的步骤,其中第一个时间点在所述对象接受纤维化疾病治疗之前,第二个时间点在所述对象已经接受纤维化疾病治疗之后,或者第一个时间点在所述对象接受第一次纤维化疾病治疗之后,第二个时间点在所述对象接受在第一次纤维化疾病治疗之后进行的第二次纤维化疾病治疗之后。

    说明书

    纤维化疾病的成像剂

    技术领域

    相关申请的交叉引用

    本申请要求2008年9月12日提交的系列号No.61/096488的美国临时专利申请和2009年8月7日提交的日本专利申请No.2009-184806的优先权,所述专利申请的全部内容通过引用并入本文。

    本文公开了涉及有机化学、药物化学、生物化学、分子生物学和医学领域的组合物和方法。本文公开的实施方案具体涉及使细胞和/或一部分组织(例如具有纤维化特征的细胞和/或组织)成像的试剂和方法,以及涉及确定和/或诊断纤维化疾病的试剂和方法。

    背景技术

    纤维化或者体内过量的纤维结缔组织产生与许多疾病或者失调相关,如肝纤维化、胰腺纤维化、声带瘢痕以及多种形式的癌症。纤维化疾病是具有这种纤维化的特征的一组疾病,其可发生在多种组织如肝脏中。例如,肝纤维化,一种纤维化疾病,例如是肝脏内部在组织损伤后伤口愈合而导致激活肝星形细胞(HSC)所致,所述肝组织损伤是由乙型或者丙型肝炎病毒引起的病毒性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、营养不良相关的糖尿病、寄生虫、感染性疾病如肺结核或梅毒、由于心脏病导致的肝内充血或者输胆管道的病症等所致,这反过来过量产生和分泌沉积在间质组织中的细胞外基质(ECM)如多种类型的胶原分子和纤连蛋白。肝纤维化的最终阶段是肝硬化,这可以导致肝衰竭、肝细胞癌等。

    已经采取各种方法尝试抑制器官或者组织中的纤维化。一种方法是抑制一种或多种星形细胞的活化,其中这样的细胞的活化特征在于增加细胞外基质(ECM)的产生。其它方法可涉及抑制胶原蛋白的产生,如通过促进胶原蛋白降解或者控制胶原蛋白代谢。然而,使纤维化组织复原的方法还不存在,且当大部分已经由纤维化组织取代至受影响的组织不能正常发挥功能的程度时,实际上除了移植以使得这个组织复原之外别无他法。因此,关键是早期检测纤维化疾病以及提供抗纤维化治疗。

    纤维化疾病的诊断通常是通过对怀疑纤维化的组织进行活组织检查。然而,由于活组织检查是一种高侵入性技术,可导致并发症如感染、出血、疼痛和其它组织损伤,因此进行了关于纤维化疾病的非侵入性诊断方法的各项研究。例如,报道了尝试使扩散加权的MR成像分析值和肝硬化的存在相关联(Aube?et?al.,J?Radiol.2004;85(3):301-6),尝试通过检测其特征性特性(如通过CT、MRI或者超声波检查检测肝脏的形态学改变)确定肝硬化的存在(Kudo?et?al.,Intervirology.2008;51?Suppl?1:17-26),以及尝试通过生物化学指示剂(如透明质酸盐和凝血酶原指数)确定肝硬化的存在(Oberti?et?al.,Gastroenterology.1997;113(5):1609-16)。然而,这些方法中无一是令人满意的,需要开发进一步的诊断技术。

    此外,JP,A,2009-518372公开了视黄酰-PEG(12)-Lys-OH的合成,其作为诊断性造影剂适于纤维化的诊断性成像,但是文中未描述这种物质真的适用于作为造影剂。

    发明概述

    技术问题

    本发明主要目的是提供纤维化疾病的成像剂,使用所述成像剂对纤维化疾病的成像方法,包含所述成像剂的纤维化疾病的诊断剂,使用所述诊断剂诊断纤维化疾病的方法等。

    问题解决方案

    在纤维化疾病的新型诊断方法的研究中,本发明人发现可以通过施用包含类视黄醇和可检测标记的成像剂在体内非侵入性检测纤维化疾病以达到本发明的目的。尽管已知包含维生素A的载体将药物输送给肝星形细胞(WO?2006/068232),但是还完全未知可以通过包含类视黄醇和可检测标记的成像剂在体内非侵入性地检测纤维化疾病。

    本发明涉及如下:

    (1)具有纤维化特征的细胞和/或组织的成像剂,所述成像剂包含类视黄醇和可检测标记。

    (2)上文(1)的成像剂,其中所述类视黄醇包含视黄醇。

    (3)上文(1)或(2)的成像剂,其中所述成像剂用于体内成像。

    (4)上文(1)-(3)任一项的成像剂,其中所述成像剂用于纤维化疾病成像。

    (5)上文(1)-(4)任一项的成像剂,其包含聚合物缀合物,所述聚合物缀合物包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元:

    [Chem.1]

    其中:

    m独立地是1或2;

    n独立地是1或2;

    A1和A2各自独立地是氧或者NR7;

    A3和A4各自独立地是氧或者NR8;

    A5和A6各自独立地是氧或者NR9;

    R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵、碱金属、类视黄醇及包含可检测标记的基团组成的组;

    R7、R8和R9各自独立地是氢或者C1-4烷基;

    o、p、q和r各自独立地是0、1或者更大,其中o、p、q和r的总和是2或者更大;以及

    条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是包含可检测标记的基团,及R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是类视黄醇。

    (6)包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物:

    [Chem.2]

    其中:

    m独立地是1或2;

    n独立地是1或2;

    A1和A2各自独立地是氧或者NR7;

    A3和A4各自独立地是氧或者NR8;

    A5和A6各自独立地是氧或者NR9;

    R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自由任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵、碱金属、类视黄醇以及包含可检测标记的基团组成的组;

    R7、R8和R9各自独立地是氢或者C1-4烷基;

    o、p、q和r各自独立地是0、1或者更大,其中o、p、q和r的总和是2或者更大;以及

    条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是包含可检测标记的基团,以及R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个是类视黄醇。

    (7)上文(6)的聚合物缀合物,其中所述聚合物进一步包含式(V)的至少一种重复单元:

    [Chem.3]

    其中:

    s独立地是1或者2;

    A7和A8各自独立地是氧或者NR12;

    R12是氢或者C1-4烷基;

    R10和R11各自独立地选自由任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵和碱金属组成的组。

    (8)上文(6)或(7)的聚合物缀合物,其中所述聚合物进一步包含式(VI)的至少一种重复单元:

    [Chem.4]

    其中R13是氢、铵或者碱金属。

    (9)上文(6)-(8)任一项的聚合物缀合物,其中所述可检测标记包含选自钆(III)、钇-88和铟-111的金属。

    (10)上文(6)-(9)任一项的聚合物缀合物,其中所述可检测标记包含配体,所述配体选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。

    (11)上文(6)-(10)任一项的聚合物缀合物,其中所述可检测标记包含配体,所述配体选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。

    (12)上文(6)-(11)任一项的聚合物缀合物,其中所述可检测标记是顺磁性金属螯合物。

    (13)上文(12)的聚合物缀合物,其中所述顺磁性金属螯合物包含:

    [Chem.5]

    (14)上文(6)-(11)任一项的聚合物缀合物,其中所述可检测标记是染料。

    (15)上文(14)的聚合物缀合物,其中所述染料包含德克萨斯红(Texas-Red)。

    (16)上文(6)-(15)任一项的聚合物缀合物,其中m是1。

    (17)上文(6)-(15)任一项的聚合物缀合物,其中m是2。

    (18)上文(6)-(17)任一项的聚合物缀合物,其中n是1。

    (19)上文(6)-(17)任一项的聚合物缀合物,其中n是2。

    (20)权利要求(7)-(19)任一项的聚合物缀合物,其中s是1。

    (21)权利要求(7)-(19)任一项的聚合物缀合物,其中s是2。

    (22)一种制造(6)-(21)任一项的聚合物缀合物的方法,包括:

    将包含式(VII)的重复单元和式(VIII)的重复单元中的至少一种重复单元的聚合反应物(reactant)溶解或者部分溶解于溶剂中以形成溶解或者部分溶解的聚合反应物;

    [Chem.6]

    其中:

    Z是1或2;

    A9和A10是氧;及

    R14、R15和R16各自独立地选自氢、铵和碱金属;以及

    使所述溶解或者部分溶解的聚合反应物与第二种反应物反应,其中所述第二种反应物包含包含可检测标记的基团或者类视黄醇;及

    加入第三种反应物,其中第三种反应物包含包含可检测标记的基团、配体或者类视黄醇;条件是如果第二种反应物包含包含可检测标记的基团或者配体,则第三种反应物包含类视黄醇,以及如果第二种反应物包含类视黄醇,则第三种反应物包含包含可检测标记的基团或者配体。

    (23)上文(22)的方法,其中第二种反应物包含类视黄醇。

    (24)上文(22)或(23)的方法,其中第三种反应物包含包含可检测标记的基团。

    (25)上文(22)或(23)的方法,其中第三种反应物包含配体。

    (26)上文(25)的方法,其中所述配体选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。

    (27)上文(22)-(26)任一项的方法,进一步包括加入第四种反应物,其中所述第四种反应物包含金属。

    (28)上文(27)的方法,其中所述金属选自钆(III)、钇-88和铟-111。

    (29)纤维化疾病的诊断剂,其包含上文(1)-(5)任一项的成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物。

    (30)组合物,其包含上文(1)-(5)任一项的成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂,以及选自药物可接受的赋形剂、载体和稀释剂的至少一种。

    (31)一种将可检测标记输送至一部分组织的方法,包括使一部分组织或者细胞与上文(1)-(5)任一项的至少一种成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂和/或上文(30)的组合物接触。

    (32)一种使一部分组织成像的方法,包括使一部分组织或者细胞与上文(1)-(5)任一项的至少一种成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物或上文(30)的组合物接触。

    (33)一种诊断疾病或者病症的方法,包括使一部分组织或者细胞与上文(6)-(21)任一项的至少一种聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂和/或上文(30)的组合物接触。

    (34)上文(31)-(33)任一项的方法,其中所述组织是纤维组织。

    (35)一种使纤维化疾病成像的方法,包括给有需要的对象施用有效量的上文(1)-(5)任一项的成像剂、上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(30)的组合物的步骤,以及检测所施用的成像剂、聚合物缀合物或者组合物中含有的所述标记的步骤。

    (36)确定纤维化疾病的方法,包括将从施用了上文(1)-(5)任一项的成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂和/或上文(30)的组合物的对象中检测的标记的信号强度和/或信号分布与参考信号强度和/或参考信号分布进行对比的步骤。

    (37)监测纤维化疾病的方法,包括将从施用了上文(1)-(5)任一项的成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂和/或上文(30)的组合物的对象中在第一个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布与在第一个时间点之后的第二个时间点从所述对象中检测的信号强度和/或参考信号分布进行对比的步骤。

    确定纤维化疾病治疗作用的方法,包括将从施用了上文(1)-(5)任一项的成像剂和/或上文(6)-(21)任一项的聚合物缀合物和/或上文(29)的诊断剂和/或上文(30)的组合物的对象中在第一个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布与在第一个时间点之后的第二个时间点从所述对象中检测的信号强度和/或参考信号分布进行对比的步骤,其中第一个时间点在对象接受纤维化疾病治疗之前,第二个时间点在对象接受了纤维化疾病治疗之后;或者,第一个时间点在对象接受第一次纤维化治疗之后,第二个时间点在对象接受在第一次纤维化疾病治疗之后进行的第二次纤维化治疗之后。

    本文描述的一些实施方案涉及聚合物缀合物,其可包含选自本文所述式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元。

    本文描述的其它实施方案涉及将可检测标记输送至一部分组织或者细胞的方法,其可包括使所述一部分组织或者细胞与本文所述至少一种聚合物缀合物接触。

    本文描述的再其它的实施方案涉及使一部分组织或者细胞成像的方法,其可包括使所述一部分组织或者细胞与本文描述的至少一种聚合物缀合物接触。

    本文描述的再其它的实施方案涉及诊断疾病或者病症如具有纤维化特征的疾病或者病症的方法,所述方法可包括使一部分组织与本文描述的至少一种聚合物缀合物接触。

    本文描述的一些实施方案涉及本文描述的至少一种聚合物缀合物在输送可检测标记至一部分组织或者细胞中的用途。

    本文描述的其它实施方案涉及本文描述的至少一种聚合物缀合物在使一部分组织或者细胞成像中的用途。

    本文描述的再其它的实施方案涉及本文描述的至少一种聚合物缀合物在诊断疾病或者病症如具有纤维化特征的疾病或者病症中的用途。

    本文描述的一些实施方案涉及输送可检测标记至一部分组织或者细胞中的本文描述的聚合物缀合物。

    本文描述的其它实施方案涉及使一部分组织或者细胞成像的本文描述的聚合物缀合物。

    本文描述的再其它的实施方案涉及诊断疾病或者病症如具有纤维化特征的疾病或者病症的本文所述聚合物缀合物。

    本发明的有益效果

    尽管本发明的成像剂的精确机制还未完全阐明,但是推测类视黄醇作为α-SMA(平滑肌肌动蛋白)阳性ECM(细胞外基质)产生细胞如激活的星形细胞的靶向剂起作用,且使得可以通过向其输送标记物质而检测所述细胞。

    由于本发明的成像剂使得可以非破坏性地、优选非侵入性地在体内检测纤维化疾病,因此消除了由于常规活组织检查所致并发症的危险,因此可以明显减轻检查对象的负担。此外,由于其可以使检查对象的范围扩大,因此便于纤维化疾病的早期检测,使得有效地减缓所述疾病的进展。因此,本发明对于人类医学和兽医学具有巨大贡献。

    此外,本发明的成像剂使得可以非破坏性、优选非侵入性地在同一个体体内随着时间而观测纤维化疾病,这样可以高精确性地评估所述疾病的治疗。

    这些及其它实施方案在下文更详细地描述。

    附图简述

    图1图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGA-DOTA的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚谷氨酸(polyglutamate)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。

    图2图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGA-DTPA的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚谷氨酸和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。

    图3图示说明了制备的聚合物缀合物类视黄醇-PGGA-DOTA的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。

    图4图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGGA-DTPA的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。

    图5图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGA-[(DOTA)钆(III)]的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚谷氨酸和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)钆(III)。

    图6图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGA-[(DTPA)钆(III)]的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚谷氨酸和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)钆(III)。

    图7图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGGA-[(DOTA)钆(III)]的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)钆(III)。

    图8图示说明了制备聚合物缀合物类视黄醇-PGGA-[(DTPA)钆(III)]的反应流程,所述聚合物缀合物包含类视黄醇、聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)钆(III)。

    图9图示说明了与德克萨斯红(TR)-聚谷氨酸(PGA)-胆固醇即德克萨斯红-PGA-胆固醇对比,德克萨斯红(TR)-聚谷氨酸(PGA)-类视黄醇即TR-PGA-类视黄醇的细胞摄取。

    图10示出随着时间的过去纤维化DMA大鼠模型的MRI成像。

    图11是DMA大鼠模型肝脏中PGGA-[(DPTA)钆(III)]和类视黄醇-PGGA-[(DPTA)钆(III)]的钆(III)的随着时间的相对光密度绘图。在大鼠肝脏中检测到的类视黄醇-PGGA-[(DPTA)钆(III)]的钆(III)的量高于在纤维化DMA大鼠模型的肝脏中检测到的PGGA-[(DPTA)钆(III)]的钆(III)的量。

    图12图示说明了在施用成像剂之后5分钟(上)和90分钟(下)肝硬化小鼠(左)和正常小鼠(右)的荧光信号的强度和分布。荧光信号的强度用平均辐射亮度(Avg?Radiance,p/s/cm2/sr)表示。

    图13示出在施用成像剂之后5-90分钟在肝硬化小鼠(实心圆)和正常小鼠(实心方块)的肝脏(左侧)和小肠(右侧)的荧光信号强度随着时间的改变。

    图14图示说明了在施用伴有(上面)或无(下面)VA的成像剂之后90分钟在肝硬化小鼠(左侧)和正常小鼠(右侧)的肝脏中荧光信号的定位。

    图15示出在施用成像剂之后90分钟在肝硬化小鼠和正常小鼠肝脏中CyTM5.5/FITC双阳性面积与CyTM5.5-阳性总面积的比率(平均8个随机视野)。

    图16示出在施用成像剂之后90分钟在肝硬化小鼠和正常小鼠肝脏中CyTM5.5/FITC双阳性细胞的数目与CyTM5.5-阳性细胞的总数的比率(平均8个随机视野)。

    实施方案描述

    纤维化的早期诊断可以提供更多的机会以找到适当治疗方法。目前,诊断纤维化的唯一临床可用的准许方法是活组织检查。然而,活组织检查需要切除组织进行检查。非侵入性方法使取组织的需要以及与外来物体插入所述对象体内相关的危险最小化。这种非侵入性方法会为诊断纤维化提供一直以来未曾满足的选择。

    除非特别定义,则本文所用所有技术和科学用语均具有本领域技术人员通常理解的相同含义。除非特别指出,本文引用的所有专利、申请、公开的申请及其它出版物以其全部内容通过引用并入本文。除非特别指出,在一个术语具有多个定义的情况中,以在这个章节的定义为准。

    本文所用术语“酯”以其普通含义使用,因此包括具有式-(R)n-COOR′的化学部分,其中R和R′独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环上的碳键合)及杂脂环(通过环上的碳或者杂原子键合),其中n是0或者1。

    本文所用术语“酰胺”以其普通含义使用,因此包括具有式-(R)n-C(O)NHR′或-(R)n-NHC(O)R′的化学部分,其中R和R′独立地选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环上的碳键合)和杂脂环(通过环上的碳或者杂原子键合),其中n是0或者1。酰胺可以包含在附着于本文所述药物分子的氨基酸或者肽分子中,从而形成前药。

    本文公开的化合物上的任何胺、羟基或者羧基侧链可以被酯化或者酰胺化。用于实现酯化或者酰胺化的程序和特定基团为本领域技术人员已知,且可易于在参考资料中发现,如Greene?and?Wuts,Protective?Groups?in?Organic?Synthesis,3rd?Ed.,John?Wiley?&?Sons,New?York,NY,1999,所述文献以其全部内容通过引用并入本文。

    如本文所用,“烷基”是指直链或者支链烃链,其包含完全饱和的(无双键或者三键)烃基团。烷基基团可具有1-20个碳原子(在本文任何时候出现时,数值范围“1-20”均是指在指定范围内的每个整数;如“1-20个碳原子”是指所述烷基基团可由1、2、3个碳原子等直至且包括20个碳原子组成,但是该定义也涵盖未指定数值范围的术语“烷基”)。所述烷基基团也可以是具有1-10个碳原子的中等大小的烷基。所述烷基基团也可以是具有1-5个碳原子的较低级烷基。所述化合物的烷基基团可以被称作“C1-C4烷基”或者相似名称。仅为了举例说明,如“C1-C4烷基”表示在烷基链中有1-4个碳原子,即所述烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基(sec-butyl)和叔丁基(t-butyl)。典型的烷基基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

    所述烷基基团可以是取代或者未取代的。当取代时,取代基是单独及独立地选自如下基团的一种或多种基团:烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环)烷基、羟基、?;さ聂腔?、烷氧基、芳氧基、?;?、酯、巯基、烷硫基(alkylthio)、芳硫基(arylthio)、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺、N-酰胺、S-磺酰胺、N-磺酰胺、C-羧基、?;さ腃-羧基、O-羧基、异氰基(isocyanato)、硫氰基(thiocyanato)、异硫氰基(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、氧硫基(sulfenyl)、亚硫?;?sulfinyl)、磺?;?磺酰)、卤代烷基(如一-、二-和三-卤代烷基)、卤代烷氧基(如一-、二-和三-卤代烷氧基)、三卤代甲烷磺?;?、三卤代甲烷亚磺酰胺基,以及氨基,包括单取代和双取代的氨基基团,及其?;さ难苌?。在取代基被描述为是“任选取代的”任何地方,所述取代基可以是用上述取代基之一取代。

    如本文所用,“芳基”是指碳环(所有碳)单环或者多环芳族环系统,其具有完全离域化pi-电子系统(delocalized?pi-electron?system)。举例的芳基基团包括但不限于苯、萘和薁(azulene)。本发明的芳基基团可以是取代或者未取代的。当取代时,氢原子由取代基置换,除非另外指出取代基,所述取代基是独立地选自如下基团的一种或多种基团:烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环)烷基、羟基、?;さ聂腔?、烷氧基、芳氧基、?;?、酯、巯基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰胺、N-酰胺、S-磺酰胺、N-磺酰胺、C-羧基、?;さ腃-羧基、O-羧基、异氰基、硫异氰基、硝基、甲硅烷基、氧硫基、亚硫?;?、磺?;?、卤代烷基(如一-、二-和三-卤代烷基)、卤代烷氧基(如一-、二-和三-卤代烷氧基)、三卤代甲烷磺酰、三卤代甲烷磺酰胺,以及氨基,包括单取代和双取代的氨基基团,及其?;さ难苌?。

    “顺磁性金属螯合物”是一种复合物,其中配体与顺磁性金属离子结合。例如包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)-钆(III),DOTA-钇-88,DOTA-铟-111,二乙烯三胺五乙酸(DTPA)-钆(III),DTPA-钇-88,DTPA-铟-111。

    “类视黄醇”是由以头-尾方式连接的四个类异戊二烯单位组成的一类化合物的成员,见G.P.Moss,″Biochemical?Nomenclature?and?Related?Documents,″2nd?Ed.Portland?Press,pp.247-251(1992)?!拔谹”是性质上呈现出视黄醇的生物活性的类视黄醇的一般描述词语。如本文所用,类视黄醇是指天然及合成的类视黄醇,包括第一代、第二代和第三代类视黄醇。举例的天然发生的类视黄醇包括但不限于:(1)11-顺式-视黄醛(retinal),(2)全反式视黄醇,(3)棕榈酸视黄酯,(4)全反式视黄酸,以及(5)13-顺式-视黄酸。此外,术语“类视黄醇”涵盖视黄醇、视黄醛和视黄酸。

    “纤维化”在本文以其普通含义使用,是指器官或者组织中作为修复或者反应过程一部分的纤维疤痕样结缔组织的发生?!耙斐O宋笔侵钙鞴倩蛘咦橹邢宋毯垩岬拮橹姆⑸锏剿鸷λ銎鞴倩蛘咦橹墓δ艿某潭??!跋宋膊 痹诒疚氖侵妇哂凶橹宋卣鞯娜魏渭膊?,包括但不限于肝纤维化、肝硬化、声带瘢痕(vocal?cord?scarring)、声带粘膜纤维化、喉纤维化、肺纤维化、骨髓纤维化、心肌梗塞,以及心肌梗塞后心肌纤维化。在本发明中,纤维化疾病典型是其中α-SMA阳性细胞外基质产生细胞如肝星形细胞参与的那些疾病。

    如本文所用,“接头”和“接头基团”是指连接一个化学组分与另一化学组分的一或多个原子。举例的接头基团包括相对低分子量的基团,如酰胺、酯、碳酸酯和醚,以及较高分子量的接头基团,如聚乙二醇(PEG)。

    应理解在本文所述的具有一或多个手性中心的任何化合物中,如果绝对立体化学未明确表示,则每个中心可独立地是R-构型或者S-构型或者其混合物。因此,本发明提供的化合物可以是对映体纯的或者是立体异构体混合物。此外,应理解在本文所述的具有产生几何异构体的可被定义为E或者Z的一或多个双键的任何化合物中,每个双键可独立地是E或者Z或者其混合物。同样,也包括所有互变异构形式。

    如本文所用,除非特别指出,任何?;せ?、氨基酸及其它化合物的缩写根据其一般用途均是公认的缩写,或者根据IUPAC-IUP?Commission?on?Biochemical?Nomenclature(见Biochem.11:942-944(1972))命名。

    本发明一方面涉及纤维化疾病的成像剂,其包含类视黄醇和可检测标记。

    本发明中的类视黄醇可靶向α-SMA阳性ECM产生细胞,如参与纤维化疾病的激活的星形细胞。尽管靶向α-SMA阳性ECM产生细胞的机制还未完全阐明,但推测例如与RBP(视黄醇结合蛋白)特异性结合的类视黄醇通过所述细胞表面上的某一类型的受体而结合和/或被摄入所述细胞中。

    可用于本发明中的类视黄醇包括但不限于类视黄醇衍生物,如视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯、脂肪族醇与视黄酸的酯、阿维A酯、维甲酸、异维甲酸、阿达帕林、阿维A(acitretine)、他扎罗汀,及棕榈酸视黄醇酯,以及维生素A类似物如芬维A铵(4-HPR)和贝沙罗汀。类视黄醇也包括Rexinoid,即类视黄醇X受体(RXR)选择性的类视黄醇化合物,如贝沙罗汀。

    其中,视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯(如乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、硬脂酸视黄酯,及月桂酸视黄酯)以及脂肪族醇与视黄酸的酯(如乙基视黄酸酯)从特异性靶向所述ECM产生细胞的效力的角度看来是优选的。在另一实施方案中,本发明中的类视黄醇不包含视黄酸和/或视黄酸衍生物。因此,这些实施方案中的优选类视黄醇包括视黄醇、视黄醛、视黄醇和脂肪酸的酯等。

    对于本发明而言,类视黄醇还包括所有类视黄醇异构体,如顺式/反式异构体。这种异构体的具体实例包括但不限于如全反式视黄醇、全反式视黄酸、11-顺式-视黄醛和13-顺式-维甲酸(retinoic)。所述类视黄醇可以由一或多个取代基取代。本发明中的类视黄醇包括分离状态的类视黄醇以及在使用可以溶解或者保持所述类视黄醇的介质的溶液中或者混合物中的状态的类视黄醇。

    本发明的中的可检测标记(或者简称为“标记”)包括可以通过任何现有检测手段检测的任何标记。检测手段包括但不限于如肉眼、光学检测设备(如光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、体内成像仪器)、X-射线设备(如平片(plain)X-射线设备、CT(计算机断层扫描)设备)、MRI(磁共振成像)设备、核医学设备(如闪烁扫描设备、PET(正子发射断层扫描)设备、SPECT(单光子发射计算机断层扫描)设备)、超声设备和温度记录设备。适于每种检测方式的标记为本领域技术人员已知,及在如Lecchi?et?al.,Q?J?Nucl?Med?Mol?Imaging.2007;51(2):111-26中描述。

    适于通过肉眼和光学检测仪器检测的标记包括如各种荧光标记和发光标记??梢允褂玫木咛宓挠獗昙前ǖ幌抻谌鏑yTM系列(如CyTM2、3、5、5.5、7)、DyLightTM系列(如DyLightTM?405、488、549、594、633、649、680、750、800)、Alexa?Fluor(R)系列(如Alexa?Fluor(R)405、488、549、594、633、647、680、750)、HiLyte?FluorTM系列(如HiLyte?FluorTM?488、555、647、680、750)、ATTO系列(如ATTO?488、550、633、647N、655、740)、FAM、FITC、德克萨斯红、GFP、RFP和Qdot。在本发明中,适于体内成像的荧光标记是例如发射活体高度透过性的且对自体荧光如近红外线波长的荧光不敏感的波长的荧光的那些标记,或者呈现出强荧光强度的那些标记。这样的荧光标记包括但不限于如CyTM系列、DyLightTM系列、Alexa?Fluor(R)系列、HiLyte?FluorTM系列、ATTO系列、德克萨斯红、GFP、RFP、Qdot及其衍生物。

    可以使用的特定发光标记包括但不限于如鲁米诺、荧光素、光泽精和水母荧光素。

    适于通过X-射线检测设备检测的标记包括如各种造影剂??梢允褂玫奶囟ㄔ煊凹涟ǖ幌抻谌绲庠?、碘离子及含碘化合物。

    适于通过MRI设备检测的标记包括如各种金属原子及含有所述金属原子的化合物,如所述金属原子的复合物。特别可以使用但不限于如钆(gadolinium)(III)(钆(III))、钇-88(88Y)、铟-111(111In)、这样的金属原子与配体的复合物、超顺磁性氧化铁(SPIO)以及氧化锰(MnO),其中所述配体如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。

    包含顺磁性金属螯合物的基团是适于通过MRI设备检测的标记的一个实例。在一些实施方案中,所述顺磁性金属螯合物可包括如下基团之一:

    [Chem.7]

    适于通过核医学设备检测的标记包括各种放射性同位素及含有所述放射性同位素的化合物,如所述放射性同位素的复合物??梢允褂玫姆派湫酝凰匕ǖ幌抻谌顼?99m(99mTc)、铟-111(111In)、碘-123(123I)、碘-124(123I),碘-125(125I)、碘-131(131I)、铊-201(201Tl)、碳-11(11C)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、氟-18(18F)、铜-64(64Cu)、镓-67(67Ga)、氪-81m(81mKr)、氙-133(133Xe)、锶-89(89Sr)和钇-90(90Y)。含有放射性同位素的化合物包括但不限于如123I-IMP、99mTc-HMPAO、99mTc-ECD、99mTc-MDP、99mTc-tetrofosmin、99mTc-MIBI、99mTcO4-、99mTc-MAA、99mTc-MAG3、99mTc-DTPA、99mTc-DMSA和18F-FDG1。

    适于通过可以使用的超声检查设备检测的标记包括但不限于如纳米粒子和脂质体。

    本发明的成像剂可以只从上述类视黄醇和标记中形成,或者可以通过使这两种成分结合或者封入除了所述组分之外的载体中而形成。因此,本发明的成像剂除了类视黄醇和标记之外还可包含载体。这样的载体不是特别限制的,可以使用医药领域已知的任何载体,但是优选可包封类视黄醇或者可以与其结合的那些载体。

    举例的但不限于此的这样的载体包括脂质,例如,磷脂如甘油磷酸酯,鞘脂如鞘磷脂,固醇如胆固醇,植物油如大豆油或罂粟籽油,矿物油,卵磷脂如蛋黄卵磷脂,聚合物,及包含不限于聚合物的配体的载体。其中优选可以形成脂质体的那些载体,例如天然磷脂如卵磷脂,半合成的磷脂如二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或者二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油?;字R掖及?DOPE)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC),以及胆固醇。配体可以是可以形成螯合物的单齿配体或者多齿配体。

    特别优选的载体是可以避免被网状内皮系统捕获的那些载体,例如包括阳离子脂质如N-(α-三甲胺乙酰)-双十二烷基-D-谷氨酰氯(TMAG)、N,N′,N″,N″′-四甲基-N,N′,N″N″′-四棕榈酰精胺(TMTPS)、2,3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)、N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、二月桂酰溴化铵(DDAB)、1,2-二油烯氧基-3-三甲基铵基丙烷(DOTAP)、3b-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)、1,2-肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE),及氯化O,O′-ditetradecanoyl-N-(α-三甲胺乙酰)二乙醇胺(DC-6-14)。

    所述类视黄醇和/或标记与本发明载体的结合或者所述类视黄醇和/或标记包封入所述载体中也是可行的,通过化学和/或物理方法使所述类视黄醇和/或标记结合或者包封入所述载体中。例如,所述类视黄醇和/或标记可以直接附着于载体。在一个实施方案中,所述类视黄醇和/或标记可以通过所述类视黄醇和/或标记的氧、硫、氮和/或碳原子附着于所述载体。在其它实施方案中,类视黄醇和/或标记可进一步包含接头基团。在一个实施方案中,所述类视黄醇和/或标记可以通过接头基团附着于载体。所述接头基团可相对较小。例如,所述接头基团可包含胺、酰胺、醚、酯、羟基、羰基或者硫醚基团?;蛘?,所述接头基团可相对较大。例如,所述接头基团可包含烷基、芳基、芳基(C1-6烷基)(如苯基-(CH2)1-4-)、杂芳基或者杂芳基(C1-6烷基)基团。在一个实施方案中,所述接头可以是-NH(CH2)1-4-NH-。在另一实施方案中,所述接头可以是-(CH2)1-4-芳基-NH-。例如,所述接头基团可以代替氢附着于所述类视黄醇和/或标记的碳。所述接头基团可以通过使用本领域技术人员已知的方法加入载体中。

    或者,所述类视黄醇和/或标记结合或者包封入所述载体中也可以通过在制备成像剂时使所述类视黄醇和/或标记与载体混合而进行?;蛘?,当所述载体包含不限于聚合物的配体时,可能使标记可以通过由所述配体支持的磁共振成像或者核医学检测设备检测。

    本发明的成像剂中类视黄醇的量可优选为1-10000纳摩尔/微升(nmol/μL),更优选10-1000nmol/μL。标记的量可以是本领域已知的那些量,但是根据各种因素如类视黄醇的量及载体的性质可适当增加或者减少。所述与载体的结合或者包封入其中可以在所述标记固定(support)在所述载体上之前进行,或者可以在混合所述载体、类视黄醇和标记的同时进行,或者通过混合类视黄醇与其上已经固定标记的载体进行。因此,本发明还涉及产生纤维化疾病的成像剂的方法,所述方法包括使类视黄醇与任何现有的标记的制剂结合的步骤。

    本发明载体的形式可以是任何形式,只要可以携带标记至靶胞外基质产生细胞即可,非限制性地例如包括大分子微团、脂质体、乳状液、微球体以及纳米球。当所述载体是脂质体形式时,考虑到类视黄醇与载体的结合或者包封入其中的效力,类视黄醇与作为载体的形成脂质体的脂质的摩尔比率优选是8∶1至1∶4,更优选是4∶1至1∶2。

    本发明的成像剂的载体可含有在其内部、附着于其外部的标记,或者可以与所述标记混合,只要所述类视黄醇以可以发挥靶向剂功能的构型存在即可?!胺⒒影邢蚣凉δ堋痹诒疚氖侵负欣嗍踊拼嫉某上窦劣氩缓欣嗍踊拼嫉某上窦料啾雀杆?、有效和/或更大量地到达靶细胞(即胞外基质产生细胞)和/或由靶细胞摄取,这可以通过例如将本发明的成像剂加入靶细胞培养物中,在预定时间之后分析所述标记存在的部位,从而证实上述结果。例如如果在其达到靶细胞的最晚时间,类视黄醇至少部分暴露在所述成像剂的外面,则在结构上可以符合上述要求。所述类视黄醇是否至少部分暴露在所述成像剂的外面,可以通过将所述成像剂与特异性结合的物质如视黄醇结合蛋白(RBP)接触,并研究其与成像剂的结合而评估。例如通过调节所述类视黄醇和标记和/或任选载体的配制比率,可以实现类视黄醇在其达到靶细胞的最晚时间至少部分暴露在所述成像剂外面。

    在一个实施方案中,所述载体是聚合物,其可包含式(V)的重复单元:

    [Chem.8]

    其中:s可以独立地是1或者2;A7和A8各自可以独立地是氧或者NR12;R12可以是氢或者C1-4烷基;R10和R11各自可以独立地选自任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵和碱金属;

    和/或包含式(VI)的重复单元:

    [Chem.9]

    其中R13可以是氢、铵或者碱金属。当R13是氢时,式(VI)的重复单元是谷氨酸重复单元。

    在这个实施方案中,R10、R11和R13中的至少一个可以由类视黄醇和/或可检测标记取代,由此所述类视黄醇和可检测标记均包含在成像剂中?;痪浠八?,类视黄醇和可检测标记可以结合式(V)的A7和/或A8,或者结合与式(VI)的C=O结合的O原子。然而,类视黄醇和可检测标记可以结合聚合物的其它部分。在一优选的实施方案中,R10、R11和R13中的至少一个由可检测标记取代,R10、R11和R13中的至少一个由类视黄醇取代。

    因此,本发明的成像剂可包含或者由如下文定义的聚合物缀合物组成。此外,本发明一方面涉及所述聚合物缀合物本身。所述聚合物缀合物可包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元:

    [Chem.10]

    其中:m可独立地是1或者2;n可独立地是1或者2;A1和A2各自可以独立地是氧或者NR7;A3和A4各自可以独立地是氧或者NR8;A5和A6各自可以独立地是氧或者NR9;R1、R2、R3、R4、R5和R6各自可以独立地选自任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵、碱金属、类视黄醇及包含可检测标记的基团;R7、R8和R9各自可以独立地是氢或者C1-4烷基;o、p、q和r各自可以独立地是0、1或者更大数值,其中o、p、q和r的总和是2或者更大数值;条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一个是包含可检测标记的基团,及R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一个是类视黄醇。举例的碱金属包括锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)和铯(Cs)。在一个实施方案中,所述碱金属是钠。

    许多其它重复单元可包含在所述聚合物缀合物中,其包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元。在一些实施方案中,本文描述的聚合物缀合物可进一步包含式(V)的重复单元:

    [Chem.11]

    其中:s可独立地是1或者2;A7和A8各自可以独立地是氧或者NR12;R12可以是氢或者C1-4烷基;R10和R11各自可以独立地选自任选取代的C1-10烷基、任选取代的C6-20芳基、铵和碱金属。

    一个实施方案提供了如本文描述的聚合物缀合物,其进一步可包含式(VI)的重复单元:

    [Chem.12]

    其中R13可以是氢、铵或者碱金属。当R13基团是氢时,则式(VI)的重复单元是谷氨酸重复单元。

    各种可检测标记可以是本文所述聚合物缀合物的一部分,例如含有选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物。在一些实施方案中,所述可检测标记可包括金属。例如,所述金属可选自钆(III)、钇-88和铟-111。在一些实施方案中,所述可检测标记可包括配体。合适的配体包括但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。在一个实施方案中,所述可检测标记可包括选自二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的配体。

    包含顺磁性金属螯合物的基团是合适的可检测标记的实例。在一些实施方案中,所述顺磁性螯合物可包含如下基团之一:

    [Chem.13]

    合适的可检测标记的另一实例是染料,如德克萨斯红或者其衍生物。

    [Chem.14]

    多种类视黄醇可用于本文描述的聚合物缀合物中,例如含有选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物。合适的类视黄醇包括视黄醇、视黄醛、视黄酸、Rexinoid,或者其衍生物或类似物。举例的视黄醇包括维生素A、全反式视黄醇、棕榈酸视黄酯及乙酸视黄酯。一个举例的视黄醛是11-顺式-视黄醛。Rexinoid是对于类视黄醇X受体(RXR)选择性的类视黄醇。一个举例的Rexinoid是类视黄醇贝沙罗汀。其它类视黄醇衍生物和类似物包括阿维A酯、阿维A、他扎罗汀、贝沙罗汀、阿达帕林和芬维A铵。在一些实施方案中,所述类视黄醇可选自视黄醇、视黄醛、视黄酸、全反式视黄醇、全反式视黄酸、棕榈酸视黄酯、11-顺式-视黄醛和13-顺式-视黄酸。在一个实施方案中,所述类视黄醇可包括维生素A。在另一实施方案中,所述类视黄醇可包括视黄醇。

    包含可检测标记的基团可以通过许多不同方式与聚合物缀合。在一个实施方案中,包含可检测标记的基团可直接附着于所述聚合物。例如包含可检测标记的基团可以直接附着于式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元。在一个实施方案中,包含可检测标记的基团可以通过包含可检测标记的基团的氧、硫、氮和/或碳原子直接附着于所述聚合物。在其它实施方案中,包含可检测标记的基团可进一步包含接头基团。在一个实施方案中,包含可检测标记的基团可通过接头基团附着于所述聚合物,如附着于式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元。所述接头基团可相对较小。例如所述接头基团可包含胺、酰胺、醚、酯、羟基、羰基或者硫醚基团?;蛘?,所述接头基团可以相对较大。例如所述接头基团可包含烷基、芳基、芳基(C1-6烷基)(如苯基-(CH2)1-4-)、杂芳基或者杂芳基(C1-6烷基)。在一个实施方案中,所述接头可以是-NH(CH2)1-4-NH-。在另一实施方案中,所述接头可以是-(CH2)1-4-aryl-NH-。例如,接头基团可以代替氢附着于包含可检测标记的基团的碳原子。所述接头基团可以通过使用本领域技术人员已知的方法加入所述聚合物中,例如加入至式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元。

    与包含可检测标记的基团一样,所述类视黄醇可以通过许多不同方式与所述聚合物缀合。在一个实施方案中,所述类视黄醇可以直接附着于所述聚合物。例如,所述类视黄醇可以直接附着于式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元。在一个实施方案中,所述类视黄醇可以直接通过其氧、硫、氮和/或碳原子附着于所述聚合物。所述类视黄醇也可以通过接头基团与所述聚合物缀合,例如与包含式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合。本文针对包含可检测标记的基团的所述接头基团也可以与所述类视黄醇一起使用。所述接头基团可以通过使用本领域技术人员已知的方法加入聚合物例如式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元和/或所述类视黄醇中。

    在一些实施方案中,式(I)中的m可以是1。在一个实施方案中,式(I)中的m可以是2。在一些实施方案中,式(II)中的n可以是1。在一个实施方案中,式(II)中的n可以是2。在一些实施方案中,式(III)中的s可以是1。在其它实施方案中,式(III)中的s可以是2。

    在一些实施方案中,本文所述聚合物缀合物可包含碱金属,例如锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)和铯(Cs)。在一个实施方案中,所述碱金属可以是钠或者钾。在一个实施方案中,所述碱金属可以是钠。

    包含式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的至少两个不同重复单元的聚合物可以是共聚物。此外,包含式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物可以是共聚物,其包含非式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的其它重复单元。

    式(I)的重复单元的数目和式(II)的重复单元的数目各自可独立地选择,可以在很大范围内变化。在一个实施方案中,式(I)的重复单元的数目可以在大约50-5000个范围内,优选大约100-2000个。同样,在一些实施方案中,式(II)的重复单元的数目可以在大约50-5000个范围内,优选大约100-2000个。

    相似地,式(III)的重复单元的数目和式(IV)的重复单元的数目各自可以独立地选择且可以变化。在一个实施方案中,式(III)的重复单元的数目可以在大约50-5000个范围内,优选大约100-2000个。在一些实施方案中,式(IV)的重复单元的数目可以在大约50-5000个范围内,优选大约100-2000个。

    基于重复单元的总数,聚合物缀合物中式(I)的重复单元的百分比可以在较大范围内变化。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含直至大约99%(摩尔百分比)的式(I)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)的式(I)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)式(I)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)式(I)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)式(I)的重复单元。在另一实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)式(I)的重复单元。

    基于重复单元的总数,聚合物缀合物中式(II)的重复单元的百分比也可以在较大范围内变化。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含直至大约99%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。在另一实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)式(II)的重复单元。

    基于重复单元的总数,聚合物缀合物中式(III)的重复单元的百分比可以在较大范围内变化。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含直至大约99%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。在另一实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)式(III)的重复单元。

    同样,基于重复单元的总数,聚合物缀合物中式(IV)的重复单元的百分比可以在较大范围内变化。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含直至大约99%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。在一个实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。在另一实施方案中,基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数,所述聚合物缀合物可包含大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)式(IV)的重复单元。

    如果所述聚合物缀合物中存在一或多个式(V)的重复单元,基于重复单元的总数,所述聚合物缀合物中式(V)的重复单元的百分比可以在较大范围内变化。相似地,如果所述聚合物缀合物中存在一或多个式(VI)的重复单元,基于重复单元的总数,所述聚合物缀合物中式(VI)的重复单元的百分比可以在较大范围内变化。举例的实施方案在表1中示出。

    [表1]

    ??重复单元
    ??聚合物缀合物中摩尔百分比
    ??式(V)
    ??大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)
    ??式(VI)
    ??大约1%(摩尔百分比)至99%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至50%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至30%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至20%(摩尔百分比)

    ??大约1%(摩尔百分比)至10%(摩尔百分比)

    所述摩尔百分比基于所述聚合物缀合物中重复单元的总摩尔数。

    在一个实施方案中,可检测标记可以非共价地装入或者部分装入本文所述聚合物缀合物的聚合物基质内。例如,本文所述聚合物缀合物可以各种形式存在,包括颗粒、薄片、棒状、纤维、薄膜、泡沫、悬浮液(在液体或者气体中)、凝胶、固体或者液体形式。这些不同形式的大小和形状不受限制。游离的和非缀合的可检测标记如本文所述那些标记可以与形成基质的本文所述聚合物缀合物混合并非共价地装入或者部分装入其中。相似地,所述类视黄醇可以非共价地装入或者部分装入本文所述聚合物缀合物的聚合物基质内。

    所述聚合物缀合物中可检测标记的量可以在较大范围内变化。在一个实施方案中,基于所述可检测标记与聚合物缀合物的质量比,所述聚合物缀合物可包含的可检测标记的总量为大约0.5%至50%(重量/重量)(可检测标记与聚合物缀合物重量比)。在一个实施方案中,基于所述可检测标记与聚合物缀合物的质量比(相同基础),所述聚合物缀合物可包含的可检测标记的总量为大约0.5%至40%(重量/重量)。在一个实施方案中,基于所述可检测标记与聚合物缀合物的质量比(相同基础),所述聚合物缀合物可包含的可检测标记的总量为大约1%至30%(重量/重量)。在一个实施方案中,基于所述可检测标记与聚合物缀合物的质量比(相同基础),所述聚合物缀合物可包含的可检测标记的总量为大约1%至20%(重量/重量)。在一个实施方案中,基于所述可检测标记与聚合物缀合物的质量比(相同基础),所述聚合物缀合物可包含的可检测标记的总量为大约1%至10%(重量/重量)。

    所述聚合物缀合物中存在的类视黄醇的量也可以在较大范围内变化。在一些实施方案中,所述类视黄醇可以是所述聚合物缀合物总量的大约1%至50%(重量/重量)(其中所述类视黄醇的量包含在所述聚合物缀合物总量内)。在其它实施方案中,所述类视黄醇可以是所述聚合物缀合物总量的大约10%至30%w/w(相同基础)。在其它实施方案中,所述类视黄醇可以是所述聚合物缀合物总量的大约20%至40%w/w(相同基础)。

    可以优选选择所述可检测标记的量、所述类视黄醇的量以及式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元的百分比量,以提供聚合物缀合物溶解度高于包含基本相同量的相同试剂的可比的聚谷氨酸缀合物的溶解度。在一个实施方案中,所述聚合物缀合物溶解度高于相应聚谷氨酸缀合物溶解度。通过在0.9wt.%NaCl水溶液中在大约22摄氏度(℃)形成包含至少5mg/mL聚合物缀合物的所述聚合物缀合物溶液,并确定光学澄清度,从而测量溶解度。光学澄清度可以通过比浊法确定,例如通过本领域技术人员已知的目测法或者通过适当仪器分析法进行。所得溶解度与相似形成的聚谷氨酸缀合物溶液的溶解度相比示出改良的溶解度,通过在更大pH值范围的更大光学澄清度而证实。因此,当包含在0.9wt.%NaCl水溶液中至少5mg/mL聚合物缀合物的检测的聚合物缀合物溶液在大约22℃在更大pH范围具有高于可比的检测的聚谷氨酸缀合物溶液的光学澄清度时,所述聚合物缀合物溶解度高于包含基本相同量试剂的相应聚谷氨酸缀合物的溶解度。本领域技术人员理解“可比的”聚谷氨酸缀合物是一种对照材料,其聚合物部分具有与对比的所述聚合物缀合物(包含式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元)基本相同的分子量。

    所述聚合物缀合物可含有一或多个手性碳原子。所述手性碳(可以用星号*表示)可具有rectus(右手)或者sinister(左手)构型,因此所述重复单元可以是外消旋、对映体或者对映体富集的构型。除非另作说明,如本文别处所用符号“n”和“*”(标示手性碳)具有与上述相同含义。

    包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物可以通过不同方式制备。在一个实施方案中,可以将第一种聚合反应物溶解或者部分溶解于溶剂中,形成第一种溶解或者部分溶解的聚合反应物。然后使第一种溶解或者部分溶解的聚合反应物与第二种反应物反应,形成第二种聚合反应物。在一个实施方案中,第二种反应物可包含具有可检测标记的基团。在另一实施方案中,第二种反应物可包含类视黄醇。在一个实施方案中,所述类视黄醇可以是视黄醇或者其衍生物。在另一个实施方案中,第二种反应物可包含配体如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、(1,2-乙二基二硝基)四乙酸(EDTA)、乙二胺、2,2′-联吡啶(bipy)、1,10-菲罗啉(phen)、1,2-双(二苯基膦基)乙烷(DPPE)、2,4-戊二酮(acac)和草酸酯(ox)。在一个实施方案中,第二种反应物可包含选自羟基和胺的取代基。

    第一种聚合反应物可包含能形成包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物的任何合适材料。在一个实施方案中,所述聚合反应物可包含式(VII)的重复单元:

    [Chem.15]

    其中z可独立地是1或者2;A9和A10各自可以独立地是氧;R14和R15各自可以独立地选自氢、铵和碱金属。

    在另一实施方案中,第一种聚合反应物可包含式(VIII)的重复单元:

    [Chem.16]

    其中R16可选自氢、铵和碱金属。

    然后可以使第二种聚合反应物与第三种反应物反应形成中间产物,或者在一些实施方案中形成包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物。如果有必要或者需要,第二种聚合反应物可以溶解或者部分溶解于溶剂中,形成第二种溶解或者部分溶解的聚合反应物。在一个实施方案中,第三种反应物可包含包含可检测标记的基团。在另一实施方案中,第三种反应物可包含类视黄醇。在一个实施方案中,所述类视黄醇可以是视黄醇或者其衍生物。在其它实施方案中,第三种反应物可包含配体,如针对第二种反应物所述那些配体。在一个实施方案中,第二种反应物可包含选自羟基和胺的取代基。

    如果第二种或者第三种反应物是配体,则在加入所述配体之后可以加入第四种反应物,其中第四种反应物包括金属。举例的金属包括但不限于钆(III)、钇-88和铟-111。

    游离的可检测标记和/或类视黄醇与所述聚合物缀合物的混合物可以通过不同方式形成,如形成其中一些或者全部可检测标记和/或类视黄醇装入或者部分装入其中的基质。这种混合物可含有例如缀合和非缀合的可检测标记和/或类视黄醇。

    所述聚合物反应物可以溶解或者部分溶解于各种溶剂中以备与包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体混合。在一个实施方案中,所述溶剂可包含亲水性溶剂,如极性溶剂。合适的极性溶剂包括质子溶剂如水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甲酸和乙酸。其它合适的极性溶剂包括非质子溶剂如丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二噁烷。在一个实施方案中,所述溶剂可以是水溶剂,例如水。

    可以通过使用常规机械技术进一步帮助所述聚合反应物溶解或者部分溶解于溶剂中。例如,可以在溶剂中振荡或者搅拌所述聚合物缀合物,以诱导溶解或者部分溶解。在一个实施方案中,对所述聚合物和溶剂进行超声处理。超声是应用声能如超声能量的作用,以搅拌样品中的粒子。超声可以使用例如超声波浴或者超声探针进行。聚合物溶解的程度可以通过改变机械振荡或者搅拌或者超声条件的强度和持续时间而控制??梢越腥魏纬中奔涞恼竦?、搅拌或者超声处理。例如,可以对所述混合物超声处理几秒钟至几小时。在一个实施方案中,可以在溶剂中对所述聚合物缀合物超声处理大约1分钟至大约10分钟。在一个实施方案中,可以在溶剂中对所述聚合物缀合物超声处理大约5分钟。

    在一个实施方案中,包含可检测标记的基团和/或配体可以加入所述聚合物缀合物溶液中。包含可检测标记的基团和/或配体在其与所述聚合物缀合物混合之前可以或者不可以溶解或者部分溶解于溶剂中。如果包含可检测标记的基团和/或配体溶解或者部分溶解于溶剂中,则所述溶剂可包括亲水性溶剂,如极性溶剂。合适的极性溶剂包括质子溶剂如水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甲酸、乙酸和丙酮。其它合适的极性溶剂包括非质子溶剂,如丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二噁烷。

    同样,在一个实施方案中,所述类视黄醇可以加入所述聚合物反应溶液中。所述类视黄醇在其与所述聚合物反应物混合之前可以或者不可以溶解或者部分溶解于溶剂中。如果所述类视黄醇溶解或者部分溶解于溶剂中,则所述溶剂可包括亲水性溶剂,如极性溶剂。合适的极性溶剂包括质子溶剂如水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甲酸、乙酸和丙酮。其它合适的极性溶剂包括非质子溶剂,如丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二噁烷。

    在包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体加入所述聚合物反应溶液中之后,例如通过使用移液管加入,可以进行另外的混合。例如,可以振荡或者搅拌包含所述聚合物反应物和包含可检测标记的基团的溶液。在一个实施方案中,可以对包含所述聚合物缀合物及包含可检测标记的基团的溶液进行超声处理??梢越腥魏纬中奔涞恼竦?、搅拌或者超声处理。例如,可以对所述混合物进行超声处理几秒钟至几小时。

    在一个实施方案中,所述聚合物反应物与包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体在其溶解于溶剂之前混合在一起。在一个实施方案中,溶剂或者溶剂混合物可以加入所述聚合物反应物与包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体的混合物中。在所述溶剂或者溶剂混合物加入所述聚合物反应物及包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体中之后,一种或多种所述聚合物反应物及包含可检测标记的基团、类视黄醇和/或配体可以溶解或者部分溶解。所述溶剂或者溶剂混合物可包含如下一或多种成分:水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甲酸、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃和1,4-二噁烷。在一个实施方案中,所述溶剂混合物可包含醇和水。在一个实施方案中,所述溶剂混合物可包含乙醇和水。

    任选地,然后可以分离和/或纯化包含包含可检测标记的基团和类视黄醇的聚合物缀合物??梢允褂帽玖煊蚣际跞嗽币阎氖实狈椒ǚ掷牒?或纯化本文所述聚合物缀合物。然后可以通过本领域技术人员已知的任何适当方法干燥所述聚合物缀合物。例如,在一个实施方案中,可以冻干所述聚合物缀合物。冻干所述组合物的条件可以改变。在一个实施方案中,所述混合物可以在大约-30℃至-10℃温度范围内冻干。在一个实施方案中,所述混合物可以在大约-20℃温度冻干。一旦已经任选分离和干燥包含包含可检测标记的基团和类视黄醇的所述聚合物缀合物,随后可将其在合适条件下贮存。例如,所述组合物可以贮存在如上述适于冻干的温度下。

    在溶解或者部分溶解的聚合反应物与第二种反应物反应之前、大约同时或者之后可以进行与第三种反应物反应。在一些实施方案中,在与第三种反应物反应之前,所述溶解或者部分溶解的聚合物反应物可以与第二种反应物的至少一部分反应。在一个实施方案中,在加入至少一部分第二种反应物之后形成的中间化合物可以在加入第三种反应物之前分离。在另一实施方案中,可以加入第三种反应物而不用分离在加入第二种反应物之后形成的中间化合物。在其它实施方案中,在与第三种反应物反应的大约同时,溶解或者部分溶解的聚合物反应物可以与第二种反应物的至少一部分反应。在一个实施方案中,在与第三种反应物反应之后,溶解或者部分溶解的聚合物反应物可以与第二种反应物的至少一部分反应。在一个实施方案中,在加入至少一部分第三种反应物之后形成的中间化合物可以在加入第二种反应物之前分离。

    在一些实施方案中,如果加入包括金属的第四种反应物,则该第四种反应物可以与第三种和/或第二种反应物大约同时加入。在一个实施方案中,第四种反应物可以在第三种和/或第二种反应物之后加入。在一个实施方案中,具有如本文所述那些配体的中间化合物可以在加入第四种反应物之前分离。在另一实施方案中,第四种反应物可以加入具有配体的中间化合物中而不用分离所述中间化合物。

    在一个实施方案中,产生所述聚合物缀合物的方法可包括使溶解或者部分溶解的聚合反应物与第二种反应物和/或第三种反应物在存在偶联剂的条件下反应??梢允褂萌魏魏鲜实呐剂?。在一个实施方案中,所述偶联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1,1′-羰基-二咪唑(CDI)、N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑-[4,5-b]吡啶-1-基-亚甲基]-N-甲基甲烷六氟磷酸铵N-氧化物(HATU)、2-[(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HBTU)、2-[(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HCTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-六氟磷酸鏻(PyBOP(R))、溴代-三-吡咯烷基-六氟磷酸鏻(PyBroP(R))、2-[(1H-苯并三唑l-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸铵(TBTU)以及苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)。

    可以使用可以进行反应的任何合适的溶剂。在一个实施方案中,所述溶剂可以是极性非质子溶剂。例如,所述溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)以及N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)。

    在另一实施方案中,所述反应可进一步包括使溶解或者部分溶解的聚合反应物在存在催化剂的条件下反应??梢允褂么俳龇从Φ娜魏未呋?。在一个实施方案中,所述催化剂可包含4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。

    在一个实施方案中,包含选自式(I)和式(II)的至少一种重复单元的聚合物可以使用聚谷氨酸和氨基酸(如天冬氨酸和/或谷氨酸)开始产生?;蛘?,在另一实施方案中,所述聚合物可以通过首先将起始聚谷氨酸材料转变成其盐形式而产生。聚谷氨酸的盐形式可以通过使聚谷氨酸与合适的碱如碳酸氢钠反应而获得。氨基酸部分可以附着于聚谷氨酸的悬垂的(pendant)羧酸基团。聚谷氨酸的平均分子量可以在较大范围内变化,但是优选为大约10000-500000道尔顿,更优选大约25000-300000道尔顿。这种反应可用于产生聚-(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)或者聚-(γ-L-谷氨酰-谷氨酰胺)。

    在一个实施方案中,所述氨基酸在附着于聚谷氨酸之前被?;せ疟;?。适于这个反应的?;さ陌被岵糠值囊桓鍪道侨缦率境龅腖-天冬氨酸二-叔-丁酯盐酸盐:

    [Chem.17]

    聚谷氨酸与氨基酸的反应可以在存在任何合适溶剂的条件下进行。在一个实施方案中,所述溶剂可以是非质子溶剂。在一优选的实施方案中,所述溶剂可以是N,N′-二甲基甲酰胺。

    在一个实施方案中,可以使用偶联剂如EDC、DCC、CDI、DSC、HATU、HBTU、HCTU、PyBOP(R)、PyBroP(R)、TBTU和BOP。在其它实施方案中,可以使用催化剂(如DMAP)催化聚谷氨酸与氨基酸反应。

    在反应完成后,如果所述氨基酸的氧原子被?;?,则可以使用已知方法如使用合适的酸(如三氟乙酸)除去?;せ?。如果需要,得自聚谷氨酸与氨基酸反应的聚合物的盐形式可以通过用合适的碱溶液如碳酸氢钠溶液处理所述聚合物的酸形式而形成。

    所述聚合物可以通过本领域技术人员已知的方法回收和/或纯化。例如,所述溶剂可以通过合适方法回收,例如旋转蒸发。此外,可以将反应混合物过滤进酸性水溶液中以诱导沉淀。然后可以过滤所得沉淀,并用水洗涤。

    在一些实施方案中,包含选自式(I)和式(II)的至少一种重复单元的聚合物也可以包含上述式(VI)的重复单元。形成这种聚合物的一种方法是通过用聚谷氨酸开始,使其与氨基酸如天冬氨酸和/或谷氨酸反应,反应量为基于聚谷氨酸低于1.0当量的氨基酸。例如,在一个实施方案中,基于聚谷氨酸的0.7当量氨基酸可以与聚谷氨酸反应,由此所得聚合物的大约70%的重复单元包含所述氨基酸。如上所述,氨基酸的氧原子可以使用合适的?;せ疟;?。在一个实施方案中,所述氨基酸可以是L-天冬氨酸或者L-谷氨酸。在另一实施方案中,氨基酸的氧原子可以用叔丁基基团?;?。如果氨基酸的氧原子被?;?,则?;せ趴梢酝ü褂靡阎椒ㄈ绾鲜实乃?如三氟乙酸)除去。

    在一些实施方案中,包含选自式(III)和式(IV)的至少一种重复单元的聚合物可以使用聚谷氨酸开始产生。如前文所述,包含选自式(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物也可以包含式(V)的重复单元。形成这种聚合物的方法是通过使用聚谷氨酸和/或其盐开始,并加入低于1.0当量的氨基酸如L-天冬氨酸或者L-谷氨酸。

    包含选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的一或多种重复单元的聚合物可以通过使用各种相应的起始单体合成,使用本领域技术人员已知的方法进行。

    可以通过各种方式进行包含可检测标记的基团与所述聚合物酸或者其盐形式的缀合,如使包含可检测标记的基团与各种聚合物共价结合。相似地,可以通过各种方式使类视黄醇与所述聚合物酸或者其盐缀合。使前述基团与所述聚合物缀合的一种方法是使用加热方法(如使用微波方法加热)?;蛘?,可以在室温进行缀合??梢允褂帽玖煊蚣际跞嗽蓖ǔR阎暮?或本文所述的适当溶剂、偶联剂、催化剂和/或缓冲液形成所述聚合物缀合物。

    在一个实施方案中,本文所述聚合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和/或(IV)的重复单元的聚合物)可以与如本文所述那些可检测标记缀合。在一个实施方案中,所述可检测标记可以是德克萨斯红-NH2(Texas?Red-NH2)。

    [Chem.18]

    在一个特殊的实施方案中,包含选自式(I)、式(II)和式(V)的至少一种重复单元的聚合物可以与DCC、德克萨斯红-NH2染料、吡啶和4-二甲基氨基吡啶反应。在一个实施方案中,可以将所述反应加热直至在大约100℃-150℃温度范围内。在另一实施方案中,所述材料的加热时间可以在5-40分钟范围内。如果需要,可以将反应混合物冷却至室温。本领域技术人员已知的合适方法可用于分离和/或纯化所述聚合物缀合物。例如,可以将反应混合物过滤进酸性水溶液中。然后可以过滤形成的任何沉淀并用水洗涤。任选地,所述沉淀可以通过任何合适方法纯化。例如,可以将沉淀移至丙酮中并溶解,所得溶液可以再次过滤进碳酸氢钠溶液中。如果需要,所得反应溶液可以在水中用纤维素膜透析,及冻干和分离所述聚合物。

    或者,包含可检测标记的基团和/或类视黄醇可以与氨基酸如谷氨酸和/或天冬氨酸反应,其中包含可检测标记的基团和/或类视黄醇与所述氨基酸偶联(如共价键合)。然后可以使所述氨基酸-标记和/或氨基酸-类视黄醇化合物与聚谷氨酸或者其盐反应,形成包含选自式(II)和式(II)的至少一种重复单元的聚合物缀合物。包含可检测标记的基团和/或类视黄醇也可以附着于用于形成聚合物缀合物一部分的单体,所述聚合物缀合物如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的重复单元的聚合物缀合物。然后可以使用本领域技术人员已知的方法聚合所述单体以形成聚合物缀合物。例如,包含可检测标记的基团和/或类视黄醇在聚合之前可以附着于谷氨酸。相似地,包含可检测标记的基团和/或类视黄醇可以附着于L-γ-谷氨酰谷氨酰胺和/或γ-L-谷氨酰谷氨酰胺。然后可以使用本领域技术人员已知的方法聚合具有附着的包含可检测标记的基团和/或类视黄醇的所得单体形成聚合物缀合物。

    在所述聚合物缀合物形成之后,也可以测量与所述聚合物非共价键合的任何游离量的物质??梢允褂帽玖煊蚣际跞嗽币阎姆椒ㄖな祷静淮嬖谟卫氲目杉觳獗昙呛?或类视黄醇。

    上述聚合物缀合物可以在水溶液中形成纳米颗粒。以相似方式使聚合物缀合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)形成纳米颗粒。这种纳米颗??捎糜谟畔仁渌涂杉觳獗昙侵裂≡竦淖橹?。

    本发明的成像剂和化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)可用于诊断纤维化疾病。因此,本发明进一步涉及纤维化疾病的诊断剂,其包含本发明的成像剂和/或化合物,以及涉及诊断纤维化疾病的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的成像剂、化合物或者诊断剂的步骤,以及检测所施用的成像剂、化合物或者诊断剂中含有的所述标记的步骤。

    一个实施方案提供了组合物,其可包含本文所述试剂(如成像剂或者诊断剂)和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)以及选自药物可接受的赋形剂、载体和稀释剂的至少一种成分。在一些实施方案中,提供了本文揭示的化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)的前药、代谢物、立体异构体、水合物、溶剂化物、多晶型(polymorph)以及药物可接受的盐。

    “前药”是指在体内被转变为母体药物的物质。前药通常是有益的,因为在一些情况中,其比母体药物更易于施用于对象。例如其通过口服施用可以是生物可利用的,而母体药物则不是。前药在药物组合物中也可以具有与母体药物相比改良的溶解度。前药的没有限制性的一个实例是一种化合物,其作为酯(“前药”)施用以在其中水溶性对于流动性是不利的情况中促进被传输经过细胞膜,但是一旦在细胞内部水溶性是有益的情况中其随后被代谢水解为羧酸这种活性成分。前药的另一实例可以是与酸性基团键合的短肽(聚氨基酸),其中所述肽被代谢以显示活性部分。选择和制备合适的前药衍生物的常规方法在例如Design?of?Prodrugs,(ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985)中描述,所述文献在此以其全部内容通过引用并入本文。

    术语“前药酯”是指本文公开的化合物的衍生物,通过加入在生理条件下被水解的任何一些酯形成基团而形成。举例的前药酯基团包括新戊酰氧甲基、乙酰氧甲基、2-苯并[c]呋喃酮基、茚满基和甲氧基甲基,以及本领域已知的其它这种基团,包括(5-R-2-氧代-1,3-二氧环戊烯-4-基)甲基基团。前药酯基团的其它实例可见于例如T.Higuchi?and?V.Stella,in″Pro-drugs?as?Novel?Delivery?Systems″,Vol.14,A.C.S.Symposium?Series,American?Chemical?Society(1975);以及″Bioreversible?Carriers?in?Drug?Design:Theory?and?Application″,edited?by?E.B.Roche,Pergamon?Press:New?York,14-21(1987)(提供了可用作含有羧基的化合物的前药的酯的实例)。上述参考文献在此均以其全部内容通过引用并入本文。

    术语“药物可接受的盐”是指对被施用其的生物体不引起显著刺激作用及不消除所述化合物的生物学活性和性质的化合物的盐。在一些实施方案中,所述盐是化合物的酸加成盐。药物盐可以通过使化合物与无机酸如氢卤酸(如氢氯酸或者氢溴酸)、硫酸、硝酸、磷酸等反应而获得。药物盐也可以通过使化合物与有机酸反应而获得,所述有机酸如脂肪族或者芳香族羧酸或者磺酸,例如乙酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、烟碱酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、水杨酸或者萘磺酸。药物盐也可以通过使化合物与碱反应形成盐而获得,所述盐如铵盐,碱金属盐如钠盐或者钾盐,碱土金属盐如钙盐或者镁盐,有机碱盐如双环己基胺、N-甲基-D-葡糖胺、三(羟基甲基)甲胺、C1-C7烷基胺、环己胺、三乙醇胺、乙二胺,以及氨基酸盐如精氨酸盐、赖氨酸盐等。

    如果药物制剂的制造包括均匀混合药物赋形剂与盐形式的活性成分,则需要使用非碱性药物赋形剂,即使用酸性或者中性赋形剂。

    在多个实施方案中,本文揭示的试剂或者化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)可以单独使用,与本文揭示的其它物质或者化合物组合使用,或者与在本文所述治疗领域具有活性的一种或多种其它物质组合使用。

    另一方面,本发明涉及药物组合物,其包含一种或多种生理学可接受的表面活性物质、载体、稀释剂、赋形剂、光滑剂、悬浮剂、成膜物质和包膜辅助剂,或者这些物质的组合;以及本文揭示的试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)。治疗用途的可接受的载体或者稀释剂为制药领域熟知,在例如Remington′s?Pharmaceutical?Sciences,18th?Ed.,Mack?Publishing?Co.,Easton,PA(1990)中描述,所述文献以其全部内容通过引用并入本文。防腐剂、稳定剂、染料、甜味剂、香味剂(fragrance)、芳香剂(flavoring?agent)等可提供在所述药物组合物中。例如,可以加入苯甲酸钠、抗坏血酸及对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。此外,可以使用抗氧化剂和悬浮剂。在多个实施方案中,醇、酯、硫酸脂族醇等可用作表面活性剂;蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、轻质无水硅酸盐、铝酸镁、硅酸铝镁、合成的硅酸铝、碳酸钙、碳酸氢钠、磷酸氢钙、羧甲基纤维素钙等可用作赋形剂;硬脂酸镁、滑石、氢化油等可用作光滑剂;椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆油可用作悬浮剂或者润滑剂;作为碳水化合物如纤维素或者糖的衍生物的醋酸邻苯二甲酸纤维素或者作为聚乙烯衍生物的乙酸甲酯-甲基丙烯酸酯共聚物可用作悬浮剂;增塑剂如邻苯二甲酸酯等可用作悬浮剂。

    术语“药物组合物”是指本文公开的试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)与其它化学成分如稀释剂或者载体的混合物。所述药物组合物便于将所述物质和/或化合物施用于生物体。现有的施用试剂和/或化合物的多种技术包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠道外施用以及局部施用。药物组合物也可以通过使所述试剂和/或化合物与无机酸或者有机酸反应而获得,所述酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲基苯磺酸、水杨酸等。

    关于药物组合物所用术语“载体”是指便于试剂和/或混合物掺入细胞或者组织中的化学化合物。例如,二甲基亚砜(DMSO)通常用作载体,因为其便于许多有机化合物被生物体的细胞或者组织摄取。

    术语“稀释剂”是指在水中稀释的化学化合物,其将溶解感兴趣的试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)以及稳定所述试剂和/或化合物的生物学活性形式。溶解于缓冲溶液中的盐在本领域用作稀释剂。一种常用的缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水,因为其与人血液的盐条件相似。由于缓冲盐可以在低浓度控制溶液的pH,因此缓冲的稀释剂很少改变试剂和/或化合物的生物活性。术语“生理可接受的”是指载体或者稀释剂不消除所述试剂和/或化合物的生物活性和性质。

    在本发明的试剂中,所述标记可包含在所述试剂的内部、可附着于其外面,或者可以与其混合,只要类视黄醇以可以发挥靶向分子的功能的构型存在即可。因此,所述试剂可以用合适的材料如肠衣或者随着时间而分解的材料覆盖,或者可以掺入合适的药物释放系统中。

    本文描述的药物组合物本身可以施用于人患者,或者在与其它活性成分(如组合治疗)或者合适的载体或者赋形剂混合的药物组合物中施用。配制和施用本发明的试剂和/或化合物的技术可见如“Remington′s?Pharmaceutical?Sciences,”Mack?Publishing?Co.,Easton,PA,18th?edition,1990及Hyojun?Yakuzaigaku(Standard?Pharmaceutics),Ed.by?Yoshiteru?Watanabe?et?al.,Nankodo,2003所述。

    合适的施用途径可例如包括口服、直肠、经粘膜、经皮、经鼻、耳内、局部或者肠道施用;肠道外施用,包括肌内、皮下、静脉内、动脉内、门静脉内、淋巴内、淋巴结内、骨髓内、鞘内、直接心室内、脑室内、腹膜内、鼻内、大脑内、眼内注射,以及肺内、呼吸道内、气管内、支气管内、子宫内或者气管内施用。在一些实施方案中,所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)也可以持续或者控制释放施用方式施用,包括长效注射(depot?injection)、渗透泵、丸剂(pill)、经皮施用片剂(包括电转运)等,用于以预定的速率进行持久的和/或定时的、脉冲的施用。

    所述药物组合物可以配制成适于每种施用途径的剂型??梢源尤魏我阎问胶头椒ㄖ惺实毖≡裾庵旨列秃团渲品椒?。

    举例的适于口服的剂型包括但不限于粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳状液、凝胶和糖浆,举例的适于肠道外施用的剂型包括注射剂如注射溶液、注射悬浮液、注射乳状液,以及在使用时制备的注射形式。肠道外施用的制剂可以是这样的构型,如水溶液或者非水溶液等渗的无菌溶液或者悬浮液。

    所述药物组合物可以通过如常规的混合、溶解、颗?;?、制成糖衣、水飞、乳化、包封、包埋(entrapping)或者压片等方式生产。

    药物组合物可以通过常规方式配制,使用一种或多种生理可接受的包含赋形剂和辅助剂的载体,其促进活性化合物加工成可药物学使用的制剂。根据选择的施用途径确定适当的配制。任何熟知的技术、载体和赋形剂均可适当使用,且为本领域已知;如在Remington′s?Pharmaceutical?Sciences及上述Standard?Pharmaceutics中描述。

    注射剂(injectable)可以制备成常规形式,制备为液体溶液或者悬浮液,适于在注射之前在液体中配制成溶液或者悬浮液的固体形式,或者乳状液。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等。此外,如果需要,可注射的药物组合物可含有少量无毒性辅助物质,如增湿剂、pH缓冲剂等。生理相容的缓冲液包括但不限于Hanks′s溶液、Ringer′s溶液或者生理盐水缓冲液。如果需要,可以使用增强吸收的制备物(例如脂质体)。

    对于经粘膜施用,适于透过屏障的渗透剂可用于所述制剂中。

    如通过推注或者持续注入的肠道外施用的药物制剂,其包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外,可以将活性化合物的悬浮液制备成适当的油相注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或者载体包括脂肪油如芝麻油,或者其它有机油如大豆油、葡萄柚油和杏仁油,或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或者甘油三酯,或者脂质体。注射用水相悬浮液可含有增加该悬浮液粘性的物质,如羧甲基纤维素钠、山梨醇或者葡聚糖。任选地,所述悬浮液也可含有合适的稳定剂或者增加所述化合物溶解度的试剂,以使得可以制备高浓缩的溶液。注射用制剂可以单位剂量形式存在,如与加入的防腐剂一起存在于安瓿或者多剂量容器中。所述组合物可以是如在油或水相载体中的悬浮液、溶液或者乳状液这样的形式,及可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂?;蛘?,所述活性成分可以是粉末形式,用以在使用之前与合适的载体如无菌的无热原水组建。

    对于口服施用,所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)可易于通过组合所述试剂和/或活性化合物与本领域熟知的药物可接受的载体进行配制。这种载体使得本发明的制剂和/或化合物被配制为片剂、药丸、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂(slurry)、悬浮液等形式,由治疗的患者口服??诜囊┪镏票肝锟赏ü楹纤鍪约梁?或化合物与固体赋形剂、任选研磨所得混合物及加工所述颗?;旌衔?,如果需要,加入合适的辅助剂,之后获得片剂或者糖衣核心。合适的赋形剂特别是充填剂,如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨醇;纤维素制备物,如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要,可以加入分散剂,如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者褐藻酸或者其盐如藻酸钠。为糖衣核心提供合适的包被。为此,可以使用合适的糖溶液,其可以任选含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、涂漆(lacquer)溶液以及合适的有机溶剂或者溶剂混合物。在片剂或者糖衣中可以加入染料或者色素,以鉴别或者鉴定施用的活性化合物剂量的不同组合。为此,可以使用浓缩的糖溶液,其任选可含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、涂漆(lacquer)溶液以及合适的有机溶剂或者溶剂混合物。在片剂或者糖衣中可以加入染料或者色素,以鉴别或者鉴定施用的活性化合物剂量的不同组合。

    可口服使用的药物制备物包括由明胶制成的推入契合(push-fit)胶囊,以及由明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制成的软的密封胶囊。所述推入配合(push-fit)胶囊可含有与充填剂如乳糖、结合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或者硬脂酸镁以及任选稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中,所述试剂和/或活性化合物可以溶解或者悬浮于合适液体中,如脂肪酸油、液体石蜡或者液体聚乙二醇。此外,可以加入稳定剂??诜┯玫乃兄萍辆κ鞘视谡庵质┯玫募亮?。

    对于经口腔黏膜施用,所述组合物可以是以常规方式配制的片剂或者锭剂形式。

    对于通过吸入方式施用,所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)以从压缩包或者喷雾器中气雾剂喷雾形式便利地施用,使用合适的气雾喷射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或者其它合适气体。在加压气雾剂的情况中,剂量单位可以通过提供阀门以输送计量的量而确定??梢耘渲坪兴鍪约梁?或化合物与合适的粉末基质如乳糖或者淀粉的粉末混合物的如明胶胶囊和药筒,用于吸入器和吹药器中。

    本文进一步公开了制药学领域熟知的各种药物组合物,包括用于眼内、鼻内和耳内输送的药物组合物。对于这些用途的合适渗透剂为本领域熟知。眼内输送的药物组合物包括水溶性形式的所述试剂和/或化合物的眼用水溶液,如眼药水,或者凝胶糖胶质(gellan?gum)(Shedden?et?al.,Clin.Ther.,23(3):440-50(2001))或者水凝胶(Mayer?et?al.,Ophthalmologica,210(2):101-3(1996));眼用软膏;眼用悬浮,如微粒,悬浮于液体载体介质中的含有药物的小聚合颗粒(Joshi,A.,J.Ocul.Pharmacol.,10(1):29-45(1994)),脂质可溶的制剂(Alm?et?al.,Prog.Clin.Biol.Res.,312:447-58(1989))和微球体(Mordenti,Toxicol.Sci.,52(1):101-6(1999));以及眼用膜剂(ocular?inserts)。所有上述参考文献均以其全部内容通过引用并入本文。这种合适的药物制剂对于稳定性和舒适性而言最常用且优选配制为无菌的等渗及缓冲的制剂。鼻内输送的药物组合物也可以包含滴剂和喷雾剂,其通常制备为在许多方面模拟鼻的分泌物,以保证维持正常的鼻毛功能。如在以其全部内容通过引用并入本文的Remington′s?Pharmaceutical?Sciences,18th?Ed.,Mack?Publishing?Co.,Easton,PA(1990)中所公开及本领域技术人员所熟知,最常用及优选的合适的制剂是等渗的、略缓冲为pH5.5-6.5的制剂,最常用及优选包括抗微生物防腐剂和合适的药物稳定剂。耳内输送的药物制剂包括悬浮液和软膏,以局部用于耳内。这种耳用制剂的常用溶剂包括甘油和水。

    所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)也可以配制为经直肠施用的组合物,如含有常规栓剂基质如可可油或者其它甘油酯的栓剂或者灌肠剂。

    除了前述制剂之外,也可以将所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)配制成贮库型制备物。这种长效制剂可以通过植入形式(例如皮下或者肌内植入)或者通过肌内注射形式施用。因此,例如所述试剂和/或化合物可以用合适的聚合材料或者疏水性材料(例如作为在可接受的油中的乳状液)或者离子交换树脂配制,或者配制为适度溶解的衍生物,如适度溶解的盐。

    对于疏水性试剂或者化合物,合适的药物载体可以是共溶剂系统,其包含苯甲醇、非极性表面活性剂、水溶性有机聚合物和水相。常用的共溶剂系统是VPD共溶剂系统,其是3%w/v苯甲醇、8%w/v非极性表面活性剂Polysorbate?80TM和65%w/v聚乙二醇300在纯乙醇中制成一定体积的溶液。自然地,共溶剂系统的比例可以显著改变而不破坏其溶解度和毒性特性。此外,共溶剂组分的身份可以改变:例如可以使用其它低毒性非极性表面活性剂代替POLYSORBATE?80TM;聚乙二醇的组分比例可以改变;其它生物相容的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮可以代替聚乙二醇;以及其它糖或者多糖可以代替葡萄糖。

    或者,可以应用疏水性药物试剂或者化合物的其它输送系统。脂质体和乳状液是熟知的疏水性药物的输送运载体或者载体。也可以应用某些有机溶剂如二甲基亚砜,但是其通常具有较大毒性。此外,所述试剂和/或化合物可以通过使用持续释放系统输送,如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质。多种持续释放的基质已经确定并且为本领域技术人员熟知。根据其化学性质,持续释放的胶囊可以在几小时或者几周直至几百天的时间持续释放所述试剂和/或化合物。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性,可以应用额外的蛋白质稳定策略。

    用于细胞内施用的试剂可以通过使用本领域技术人员熟知的技术施用。例如,这种试剂可以包封在脂质体中。在脂质体形成时水溶液中存在的所有分子均掺入该水相内部。所述脂质体内容物既被?;っ庥谕獠课⒒肪称苹?,而且由于脂质体与细胞膜融合也被有效地输送进细胞的细胞质中。所述脂质体可以用组织特异性抗体包被。所述脂质体将靶向并由希望的器官选择性摄取?;蛘?,小的疏水性有机分子可以直接细胞内施用。

    其它治疗剂或者诊断剂可以掺入所述药物组合物中?;蛘呋蛘吡硗?,药物组合物可以与含有其它治疗剂或者诊断剂的其它组合物组合使用。

    所述试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物或者其药物组合物可以通过任何合适方式给患者施用。施用方法的非限制性实例包括:(a)通过口服途径施用,包括以胶囊、片剂、颗粒剂、气雾剂、糖浆或者其它这种形式施用;(b)通过非口服途径施用,如经直肠、阴道、尿道内、眼内、鼻内或者耳内途径施用,包括以水相悬浮液、油相制备物等或者以滴剂、喷雾剂、栓剂、油膏、软膏等形式施用;(c)通过注射施用,如皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内、眼眶内、囊内、脊柱内、胸骨内等方式注射,包括使用输液泵施用;(d)局部施用,如通过直接注入肾脏或者心脏内,如通过贮库型植入(depot?implantation);以及局部(topically)施用;本领域技术人员认为将所述活性化合物与活组织接触的其他适合方法。

    适于施用的药物组合物包括其中含有有效实现其指定目的的量的活性成分的组合物。作为剂量要求的本文公开的化合物的有效量根据施用途径、治疗的动物类型(包括人)以及具体动物的身体特性而确定。所述剂量可以被调整(tailor)以达到所需效果,但是将根据如体重、饮食、同时的药物治疗这样的因素及医学领域中技术人员认识到的其它因素而定。更具体地,有效量是指化合物有效预防、减轻或者改善疾病的症状或者延长治疗对象的生存期的量。有效量的确定为本领域技术人员所熟知,特别是根据本文提供的详细描述而更易于进行。

    正如本领域技术人员所易于理解的,施用的体内剂量和特定的施用模式的效力根据治疗的哺乳动物的年龄、体重和物种、应用的具体试剂和/或化合物以及应用的这些试剂和/或化合物的具体用途而有所不同。有效的剂量水平是实现所需的结果必需的剂量水平,有效剂量水平的确定可以由本领域技术人员通过使用常规的药物学方法实现。一般来说,产物的人体临床应用在较低剂量水平开始,剂量增加直至达到所需的结果?;蛘?,可接受的体外研究可用于确定本发明方法鉴别的组合物的有效剂量和施用途径,使用确定的药物学方法进行。

    在非人动物研究中,潜在产物的应用在较高剂量水平开始,降低剂量直至需要的作用不再实现或者不利的副作用消失。根据所需的效果和治疗指征,所述剂量范围可以很广。一般来说,剂量可以是大约10微克/千克(μg/kg)至100mg/kg体重,优选大约100μg/kg-10mg/kg体重?;蛘?,如本领域技术人员所已知,剂量可以基于患者的表面积计算。

    本发明描述的药物组合物的精确配制、施用途径和剂量可以由各个医生根据患者的状况选择(见例如Fingl?et?al.1975,in″The?Pharmacological?Basis?of?Therapeutics″,该文献在此以其全部内容通过引用并入本文,特别参见第一章第一页)。一般来说,给患者施用的组合物的剂量范围可以是大约0.5-1000mg/kg患者体重。所述剂量可以是在一或多天内的单次剂量或者两或多次剂量,根据患者需要确定。在对于至少一些情况中试剂和/或化合物的人用剂量已经确定的例子中,本发明将使用这些相同的剂量,或者使用是确定的人用剂量的大约0.1%-500%、优选大约25%-250%的剂量。在未确定人用剂量的情况中,如在新发现的药物组合物的情况中,合适的人用剂量可以从ED50或者ID50值或者得自体外或者体内研究的其它合适数值中推导,如通过在动物中进行的毒性研究和效力研究中限定。

    应注意主治医生已知由于毒性或者器官功能障碍而怎样及何时终止、中断或者调整施用方案。相反,如果临床应答不足够(排除毒性),主治医生也已知调整治疗至较高水平。在治疗疾病中施用的剂量的数量级根据治疗的病症和施用途径而不同。病症的严重性可例如部分通过标准预后评价方法评估。进一步地,给药和可能的给药频率也根据各个患者的年龄、体重和应答而有所不同。与上述相应的程序可用于兽医学中。

    尽管精确的剂量会基于每一种(drug-by-drug)确定,在大多数情况中,关于剂量可以进行一些概括。成人患者的日剂量方案可以是例如口服剂量为0.1mg至2000mg每种活性成分,优选1mg至500mg,如5至200mg。在其它实施方案中,每种活性成分的静脉内、皮下或者肌内注射的剂量为0.01mg至100mg,优选0.1mg至60mg,如使用1至40mg。在施用药物可接受的盐的情况中,剂量可以以游离碱计算。在一些实施方案中,每天施用所述组合物1-4次?;蛘?,本发明的组合物可以通过持续静脉内注入方式施用,优选剂量为每种活性成分最多1000mg/天。正如本领域技术人员所理解,在某些情况中可能需要施用的本发明公开的试剂和/或化合物的量超过或者远远超过上述优选的剂量范围,以有效及攻击性地治疗特定的进展性疾病或者感染。在一些实施方案中,施用所述制剂和/或化合物持续治疗一段时间,例如施用一周或更久,或者施用几个月或者几年。

    剂量和间隔时间可以个别调整,以提供所述活性成分的血浆水平足以维持调节作用或者最小有效浓度(MEC)。所述MEC对于每种试剂和/或化合物而有所不同,但是可以从体外数据中估计。实现MEC必需的剂量依赖于个体特性及施用途径。然而,HPLC测定或者生物测定可用于确定血浆浓度。

    也可以使用MEC值确定剂量间隔。应该使用在10-90%时间、优选在30-90%时间及最优选在50-90%时间内维持血浆水平高于MEC的方案施用组合物。

    在局部施用或者选择性摄取的情况中,所述药物的有效局部浓度与血浆浓度可以不相关。

    施用的组合物的量可以根据治疗的对象、对象的体重、疾病的严重性、施用方式以及主治医生的判断而确定。

    可以使用已知方法评估本文揭示的试剂和/或化合物(如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物缀合物)的效力和毒性。例如,共有某些化学组分的特定试剂和/或化合物或者所述试剂和/或化合物的子集(subset)的毒理学可以通过确定对于细胞系如哺乳动物优选人细胞系的体外毒性而建立。这种研究的结果通常对在动物如哺乳动物或者更特别在人体中的毒性是预示性的?;蛘?,特定试剂和/或化合物在动物模型如小鼠、大鼠、兔或者猴中的毒性可以使用已知方法确定。特定试剂和/或化合物的效力可以使用一些公认的方法确定,如体外方法、动物模型或者人体临床试验。现有的几乎每一类病症的公认的体外模型包括但不限于癌症、心血管疾病和各种免疫功能失调。相似地,可接受的动物模型可用于确定治疗这种病症的化学药品的效力。当选择一种模型确定效力时,技术人员可以通过现有技术指导选择合适的模型以及施用途径和方案。当然,人体临床试验也可用于确定一种试剂和/或化合物在人体中的效力。

    本发明的试剂或者组合物可以任何构型提供,但是从贮存稳定性的角度可以是在使用时可以制备的构型,例如使得医生和/或药剂师、护士、其它医辅人员等可以在治疗场所或者在其附近制备的构型。在这种情况中,本发明的试剂或者组合物以含有至少一种必须的组成元素的一或多个容器形式提供,在使用之前制备,如在使用前24小时内,优选在使用前3小时内,及更优选在使用前即刻制备。当进行制备时,可以适当使用通常在制备场所可获得的试剂、溶剂、制备设备等。

    本发明因此还涉及本文揭示的试剂、化合物或者组合物的制备试剂盒,所述试剂盒包含一或多个容器,所述容器中包含单一或者组合的类视黄醇和/或可检测标记和/或任选构成载体的物质和/或制备所述试剂、化合物或者组合物必需的任选其它成分。本发明还涉及以这种试剂盒形式提供的所述试剂、化合物或者组合物必需的组成元素。本发明的试剂盒除了上述成分之外,还可含有如关于制备本发明的试剂、化合物或者组合物的方法或者施用方法的说明书、电子记录介质如CD或者DVD等。此外,本发明的试剂盒可包含完善本发明的试剂、化合物或者组合物的所有组成元素,但是不需要总是包含所有组成元素。因此,本发明的试剂盒不需要包含在医疗机构、实验室等通??苫竦玫氖约粱蛘呷芗?、等如无菌用水、生理盐水或者葡萄糖溶液。

    如果需要,所述试剂、化合物和组合物可以存在于包装或者分配装置中,所述包装或者分配装置可含有具有活性成分的一或多个单位剂量形式。所述包装可例如包含金属或者塑料薄片,如透明包装。所述包装或者分配装置可以附带给药说明书。所述包装或者分配装置可以附带管理药物的生产、使用或者销售的政府机构规定的关于容器的通知,这种通知反映了政府机构对用于人用或者兽用给药形式的批准。这种通知例如可以是由美国食品药品管理局对药品处方批准的标签或者批准的产品插页。也可以在相容的药物载体中配制包含本发明的试剂和/或化合物的组合物,并且标记治疗的指定病症。

    本发明的试剂、化合物和组合物适于在体内检测纤维化疾病。因此,其适于非破坏性地、优选非侵入性地检测纤维化疾病。术语“非破坏性地”在本文是指不破坏进行检测的组织。例如,当进行检测的组织是肝脏时,该术语包括通过剖腹手术暴露肝脏,或者使用内窥镜获得肝脏表面图像,但是不包括切取肝脏及在其内部探查。另一方面,术语“非侵入性地”在本文是指检测所述成像剂内含有的标记,而不有意地损伤活体,且一般包括从活体外部检测,但是也涵盖了通过自然孔如口腔、鼻腔、肛门、尿道、耳道和阴道插入检测仪如内窥镜或者超声探针以检测所述标记。

    本发明的试剂、化合物如包含选自式(I)、(II)、(III)和(IV)的至少一种重复单元的聚合物和共聚物以及组合物可具有许多不同用途。在一些实施方案中,本文所述的试剂、化合物或者组合物可用于输送可检测标记至一部分组织或者细胞。在一个实施方案中,本文所述的试剂、化合物或者组合物可用于诊断疾病或者病症如具有纤维化特征的疾病或者病症。在另一个实施方案中,本文所述的试剂、化合物或者组合物可用于使一部分组织或者细胞成像。在一些实施方案中,所述组织可以是纤维组织。

    在一个实施方案中,本发明涉及使纤维化疾病成像的方法,所述方法包括给有需要的对象施用有效量的本发明的试剂、化合物或者组合物的步骤,以及检测所施用的试剂、化合物或者组合物中包含的标记的步骤。所述有效量在本文是指例如使得在施用后可以在生物体的至少一个部位在至少一个时间点检测所述标记的量。优选不引起超出施用所带来的有益作用的副作用的量。这种量可以通过使用培养细胞在体外测试而适当确定,或者在模型动物如小鼠、大鼠、狗或者猪体内进行测试而确定,这种测试方法为本领域技术人员熟知。这种测试的实例已经在上文论述。此外,本发明的成像剂、化合物或者组合物中包含的类视黄醇、标记及任选载体的剂量为本领域技术人员已知,或者可以通过上述测试方法等适当确定。

    作为施用途径,有包括口服和肠道外施用的许多不同途径,例如包括口服、静脉内、肌内、皮下、局部、肺内、呼吸道内、气管内、支气管内、经鼻、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、骨髓内、淋巴结内、淋巴内、大脑内、鞘内、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内和子宫内施用途径。

    在一个实施方案中,本发明提供了确定纤维化疾病的方法,包括对比从施用本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中检测的标记的信号强度和/或信号分布与参考信号强度和/或参考信号分布的步骤。

    标记的信号强度在本文是指从所述标记发出的各种信号的强度或者相似测量值,如荧光信号、发光信号、磁性信号和放射性信号,且一般通过适当的检测方式测量,具体实例已经在上文论述。信号强度可以是得自整个对象的那些信号,或者是得自对象的指定部位或者区域的那些信号。信号强度也可以是测量的部位的面积或者体积的平均值或者整合值。在信号强度随着时间改变的情况中,本发明方法的信号强度可以是指定时间点的信号强度,或者可以是指定时期内的整合信号强度。

    标记的信号分布在本文是指对象内所述标记发出的信号的位置信息,其可以是二维或者三维的。通过该信号分布与器官的解剖学相关位置或者与组织的结构信息(如CT图像、MRI图像或者超声图像)的匹配,可以鉴别信号从哪个组织发出。在信号分布随着时间而改变的情况中,本发明的方法的信号分布可以是在特定时间点的信号分布,或者可以是指定时期内的整合信号分布。

    在本发明的方法中,可以评估信号强度与信号分布的组合。同时评估信号的强度和位置使得可以更精确地确定。

    参考信号强度和/或参考的信号分布在本文是指在已知不具有纤维化疾病并施用了本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中测量的标记的信号强度和/或信号分布(也称作“阴性信号强度和/或阴性信号分布”),或者在已知患有纤维化疾病并施用了本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中测量的标记的信号强度和/或信号分布(也称作“阳性信号强度和/或阳性信号分布”)。例如,如果在检测对象中检测的标记的信号强度和/或信号分布与阴性信号强度和/或阴性信号分布相似(或者无显著差异),则可以确定所述对象是纤维化疾病阴性的,以及如果所述对象的信号强度显著高于阴性信号强度和/或如果所述对象的信号分布显著大于阴性信号分布,则可以确定所述对象是纤维化疾病阳性的。此外,如果在检测对象中检测的标记的信号强度和/或信号分布与阳性信号强度和/或阳性信号分布相似(或者无显著差异),则可以确定所述对象是纤维化疾病阳性的。

    本发明进一步涉及监测纤维化疾病的方法,包括对比从施用本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中在第一个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布与从施用本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中在第一个时间点之后的第二个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布的步骤。例如,如果在第二个时间点的信号强度低于在第一个时间点的信号强度,则可以确定所述纤维化疾病得以改善;相反,如果在第二个时间点的信号强度高于第一个时间点的信号强度,则可以确定所述纤维化疾病恶化。此外,例如,如果在第二个时间点的信号分布比在第一个时间点的信号分布范围缩小,则可以确定所述纤维化疾病得以改善;相反,如果在第二个时间点的信号分布比在第一个时间点的信号分布范围扩大,则可以确定所述纤维化疾病恶化。

    本发明的方法可包括给对象施用本发明的试剂、化合物或者组合物的步骤,和/或在至少两个单独的时间点检测施用的试剂、化合物或者组合物中包含的标记的步骤,和/或确定可检测标记的信号强度和/或信号分布的步骤,之后进行上述对比步骤。

    本发明还涉及确定纤维化疾病治疗作用的方法,包括对比从施用本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中在第一个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布与从施用本发明的试剂、化合物或者组合物的对象中在第一个时间点之后在第二个时间点检测的标记的信号强度和/或信号分布的步骤,其中第一个时间点在所述对象接受纤维化治疗之前,第二个时间点在所述对象接受纤维化治疗之后,或者第一个时间点在所述对象接受第一次纤维化疾病治疗之后,第二个时间点在所述对象接受在第一次纤维化疾病治疗之后进行的第二次纤维化疾病治疗之后。例如,如果在第二个时间点的信号强度低于在第一个时间点的信号强度,则可以确定所述纤维化疾病得以改善,及因此确定所述治疗是成功的;相反,如果在第二个时间点的信号强度高于第一个时间点的信号强度,则可以确定所述纤维化疾病恶化,及因此所述治疗不太成功或者不成功。此外,例如,如果在第二个时间点的信号分布比在第一个时间点的信号分布范围缩小,则可以确定所述纤维化疾病得以改善及因此所述治疗是成功的;相反,如果在第二个时间点的信号分布比在第一个时间点的信号分布范围扩大,则可以确定所述纤维化疾病恶化,及因此所述治疗不太成功或者不成功。

    本发明的方法可包括治疗所述对象的纤维化疾病的步骤,和/或给所述对象施用本发明的试剂、化合物或者组合物的步骤,和/或在至少两个单独的时间点检测所施用的试剂、化合物或者组合物中包含的标记的步骤,和/或确定可检测标记的信号强度和/或信号分布的步骤,之后进行上述对比步骤。

    在本文公开的本发明的方法中,术语“对象”是指任何活的个体,优选动物,更优选哺乳动物,更优选人。在本发明中,所述对象可以是健康的或者患有一些疾病,当进行纤维化疾病的成像、诊断、确定或者监测时,其一般是指患有或者怀疑患有纤维化疾病的对象,当确定纤维化疾病治疗作用时,其一般是指已经接受或者将接受纤维化疾病治疗的对象。

    在本文公开的本发明的方法中,术语“治疗”包括为了治愈、暂时减轻或者预防疾病之目的的所有类型的医学可接受的预防和/或治疗干预。例如,术语“治疗”包括各种目的的医学可接受的干预,包括延缓或者终止纤维化疾病的进展、使病损消退或者消失、预防纤维化疾病的发生以及防止复发。

    本领域技术人员理解在不偏离本发明精神的范围内可以对本发明进行多种不同修改。因此,应理解本发明的形式只是举例说明而不是限制本发明的范围。

    实施例

    提供如下实施例是为了进一步描述本文所述的实施方案,无限制本发明范围之意。

    实施例1

    类视黄醇-PGA-DOTA的合成

    根据图1所示一般方案如下制备类视黄醇-PGA-DOTA聚合物缀合物:将PGA(150mg)溶解于DMF(15mL)中。加入视黄醇(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将该混合物搅拌24小时。然后加入pNH2-Bn-DOTA(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将所得混合物搅拌24小时。然后加入稀HCl溶液(0.2M)以诱导沉淀。将该混合物搅拌2分钟并在10000rpm离心15分钟。收集固体沉淀物,用水洗涤,及用碳酸氢钠溶液(0.5M)再溶解。将该混合物在水中透析24小时。将产物类视黄醇-PGA-DOTA聚合物缀合物冻干。该产物的身份通过1H-MR证实。

    实施例2

    类视黄醇-PGA-DTPA的合成

    根据图2所示一般方案如下制备类视黄醇-PGA-DTPA聚合物缀合物:将PGA(150mg)溶解于DMF(15mL)中。加入视黄醇(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将该混合物搅拌24小时。然后加入pNH2-Bn-DTPA(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将所得混合物搅拌24小时。然后加入稀HCl溶液(0.2M)以诱导沉淀。将该混合物搅拌2分钟并在10000rpm离心15分钟。收集固体沉淀物,用水洗涤,及用碳酸氢钠溶液(0.5M)再溶解。将该混合物在水中透析24小时。将产物类视黄醇-PGA-DTPA聚合物缀合物冻干。该产物的身份通过1H-NMR证实。

    实施例3

    类视黄醇-PGGA-DOTA的合成

    根据图3所示一般方案如下制备类视黄醇-PGGA-DOTA聚合物缀合物:将聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)(PGGA,150mg)溶解于DMF(15mL)中。加入视黄醇(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将该混合物搅拌24小时。然后加入pNH2-Bn-DOTA(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将所得混合物搅拌24小时。然后加入稀HCl溶液(0.2M)以诱导沉淀。将该混合物搅拌2分钟并在10000rpm离心15分钟。收集固体沉淀物,用水洗涤,及用碳酸氢钠溶液(0.5M)再溶解。将该混合物在水中透析24小时。将产物类视黄醇-PGGA-DOTA聚合物缀合物冻干。该产物的身份通过1H-NMR证实。

    实施例4

    类视黄醇-PGGA-DTPA的合成

    根据如下图4所示一般方案制备类视黄醇-PGGA-DTPA聚合物缀合物:将Poly(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)(PGGA,150mg)溶解于DMF(15mL)中。加入视黄醇(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将该混合物搅拌24小时。然后加入pNH2-Bn-DTPA(10mg)、EDC(50mg)和DMAP(50mg)。将所得混合物搅拌24小时。然后加入稀HCl溶液(0.2M)以诱导沉淀。将该混合物搅拌2分钟并在10000rpm离心15分钟。收集固体沉淀物,用水洗涤,及用碳酸氢钠溶液(0.5M)再溶解。将该混合物在水中透析24小时。将产物类视黄醇-PGGA-DTPA聚合物缀合物冻干。该产物的身份通过1H-NMR证实。

    实施例5

    类视黄醇-PGA-[(DOTA)钆(III)]的合成

    根据图5所示一般方案如下制备类视黄醇-PGA-[(DOTA)钆(III)]聚合物缀合物:将类视黄醇-PGA-[(DOTA)(45mg)溶解于EDTA缓冲液(10mL)中。加入钆(III)(5mg)在EDTA中的溶液(1mL)。将该混合物搅拌4小时及倒入碳酸氢钠溶液(50mL)中,并在水中透析。将产物类视黄醇-PGA-[(DOTA)钆(III)]冻干。

    实施例6

    类视黄醇-PGA-[(DTPA)钆(III)]的合成

    根据图6所示一般方案如下制备类视黄醇-PGA-[(DTPA)钆(III)]聚合物缀合物:将类视黄醇-PGA-[(DTPA)(45mg)溶解于EDTA缓冲液(10mL)中。加入钆(III)(5mg)在EDTA中的溶液(1mL)。将该混合物搅拌4小时及倒入碳酸氢钠溶液(50mL)中,并在水中透析。将产物类视黄醇-PGA-[(DTPA)钆(III)]冻干。

    实施例7

    类视黄醇-PGGA-[(DOTA)钆(III)]的合成

    根据图7所示一般方案如下制备类视黄醇-PGGA-[(DOTA)钆(III)]聚合物缀合物:将类视黄醇-PGA-[(DOTA)(45mg)溶解于EDTA缓冲液(10mL)中。加入钆(III)(5mg)在EDTA(1mL)中的溶液。将该混合物搅拌4小时及倒入碳酸氢钠溶液(50mL)中,并在水中透析。将产物类视黄醇-PGGA-[(DOTA)钆(III)]冻干。

    实施例8

    类视黄醇-PGGA-[(DPTA)钆(III)]的合成

    根据图8所示一般方案如下制备类视黄醇-PGGA-[(DTPA)钆(III)]聚合物缀合物:将类视黄醇-PGGA-[(DTPA)(45mg)溶解于EDTA缓冲液(10mL)中。加入钆(III)(5mg)在EDTA中的溶液(1mL)。将该混合物搅拌4小时及倒入碳酸氢钠溶液(50mL)中,并在水中透析。将产物类视黄醇-PGGA-[(DTPA)钆(III)]冻干。PGGA-[(DTPA)钆(III)]中钆(III)的量通过ICP-MS确定为8%。

    PGGA-[(DPTA)钆(III)]的合成

    将PGGA-[(DTPA)](45mg)溶解于EDTA缓冲液(10mL)中。加入钆(III)(5mg)在EDTA中的溶液(1mL)。将该混合物搅拌4小时及倒入碳酸氢钠溶液(50mL)中,并在水中透析。将产物PGGA-[(DTPA)钆(III)]冻干。PGGA-[(DTPA)钆(III)]中钆(III)的量通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)确定为3%。

    实施例9

    德克萨斯红-聚(L-谷氨酸)-类视黄醇(TR-PGA-类视黄醇)的合成

    将聚(L-谷氨酸(PGA,95.6mg)置于50mL圆形烧瓶中。在该瓶中加入无水DMF(15mL),将该悬浮液搅拌30分钟。加入视黄醇(5.5mg)、EDC(12.7mg)和微量DMAP。将该混合物搅拌40小时。在反应混合物中加入德克萨斯红(1mg在1mL?DMF中)、EDC(300μL,5mg/mL?DMF)和HOBt(300μL,1mg/mL?DMF)。将该混合物搅拌15小时。然后将该反应混合物倒入0.2NHCl水溶液(75mL)中。将所得混合物移至离心管中并离心。弃去上清液。将固体溶解于0.5N?NaHCO3水溶液(大约60mL)中。然后将该溶液用去离子水透析,通过0.45微米多孔醋酸盐针头式过滤器(cellular?acetate?syringe?filter)过滤并冻干?;竦肨R-PGA-类视黄醇(93mg),通过1H-NMR和UV-Vis光谱鉴定。

    实施例10

    德克萨斯红-聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺)-类视黄醇(TR-PGGA-类视黄醇)的合成

    将聚(L-γ-谷氨酰谷氨酰胺(PGGA,95.5mg)置于50mL圆形烧瓶中。在该瓶中加入无水DMF(6mL),将该悬浮液搅拌30分钟。加入视黄醇(5.0mg)、EDC(16.3mg)和微量DMAP。将该混合物搅拌40小时。在反应混合物中加入德克萨斯红(TR)(1mg在1mL?DMF中)、EDC(300μL,5mg/mL?DMF)和HOBt(300μL,1mg/mL?DMF)。将该混合物搅拌15小时。然后将该反应混合物倒入0.2N?HCl水溶液(75mL)中。将所得混合物移至离心管中并离心。弃去上清液。将固体溶解于0.5N?NaHCO3水溶液(大约60mL)中。然后将该溶液用去离子水透析,通过0.45微米多孔醋酸盐针头式过滤器(cellular?acetate?syringe?filter)过滤并冻干?;竦肨R-PGGA-类视黄醇(91mg),通过1H-NMR和UV-Vis光谱鉴定。

    实施例11

    德克萨斯红-聚(L-谷氨酸)-胆固醇(TR-PGA-胆固醇)的合成

    将聚(L-谷氨酸(PGA,99.7mg)置于50mL圆底烧瓶中。在该瓶中加入无水DMF(15mL),将该悬浮液搅拌30分钟。加入胆固醇(5.9mg)、EDC(10.7mg)和微量DMAP。将该混合物搅拌40小时。在反应混合物中加入德克萨斯红(1mg在1mL?DMF中)、EDC(300μL,5mg/mL?DMF)和HOBt(300μL,1mg/mL?DMF)。将该混合物搅拌15小时。然后将该反应混合物倒入0.2N?HCl水溶液(75mL)中。将所得混合物移至离心管中并离心。弃去上清液。将固体溶解于0.5N?NaHCO3水溶液(大约60mL)中。然后将该溶液用去离子水透析,通过0.45微米多孔醋酸盐针头式过滤器(cellular?acetate?syringe?filter)过滤并冻干?;竦肨R-PGA-胆固醇(90mg),通过1H-NMR和UV-Vis光谱鉴定。

    实施例12

    HSC-T6细胞对类视黄醇化合物的摄取

    将表达维生素A结合蛋白受体的HSC-T6细胞在前一天接种在96孔平板中(100μL培养基/孔)。将如实施例9-11所述制备的TR-PGA-类视黄醇,、TR-PGGA-类视黄醇和TR-PGA-胆固醇溶解在水中,产生大约2-4mg/mL母液。将该溶液用培养基稀释并在室温保温15分钟。将15μL加入细胞中。在溶液中孵育细胞之后,除去培养基。将细胞用DPBS洗涤一次,加入新鲜培养基(100μL培养基/孔)。使用BioTek?FLx800?96-孔平板荧光阅读器读取并记录吸光度(激发和发射波长分别为560nm和590nm)。结果示于图8。

    图8对比了德克萨斯红-非阳离子聚合载体-类视黄醇的细胞摄取与德克萨斯红-非阳离子聚合载体-胆固醇的细胞摄取。更大的吸光度表明更大的光密度和更多的细胞摄取。因此,图8示出所述类视黄醇组合物比胆固醇组合物导致更多的细胞摄取。

    实施例13

    磁共振成像

    使用膝线圈(knee?coil)在造影前和造影后在GE?3T?MR扫描仪上获得小鼠图像。成像参数如下TE:minful,TR=250ms,FOV:8和24层面/层块(slices/slab),及1.0mm冠状层厚。给肝硬化DMA大鼠模型施用的如实施例8所述获得的检测化合物类视黄醇-PGGA-[(DPTA)钆(III)]和PGGA-[(DPTA)钆(III)]的注射剂量是0.05mmol金属离子/kg(对每种化合物在每个时间点n=3)。将所述化合物通过尾静脉注射进麻醉的小鼠中,在注射造影剂之前及注射造影剂之后5分钟、15分钟和60分钟获得图像(见图9)?;竦妙?III)的平均相对光密度,在图10中示出。

    实施例14

    肝硬化模型小鼠的体内成像

    具有四氯化碳诱导的肝硬化的小鼠模型(在后文也称作“肝硬化小鼠”)和正常小鼠用于在生物体外非侵入性地观测病灶。

    作为肝硬化小鼠,为4周龄的C57BL/6J雄性小鼠(Charles?River)腹膜内注射用橄榄油1∶10稀释的CCl4(1μL/g体重),一周注射两次,共28周。作为正常小鼠(对照组),使用20周龄C57BL/6J雄性小鼠。

    在观测之前2周开始,与往常一样用无苜蓿饲料饲养小鼠,以降低得自胃肠道中饲料的自体荧光作用。为了降低由于皮毛导致的信号减少的程度,除去腹部和背部的毛发。

    作为检测生物体内部信号的荧光探针,使用CyTM5.5-标记的零乱(scramble)siRNA(有义:5′-CyTM5.5-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3′(SEQ?ID?NO:1);反义:5′-CyTM5.5-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3′(SEQ?ID?NO:2);在后文也称作″siRNA?scr-CyTM5.5″)。作为载体,使用Lipotrust?SR(Hokkaido?System?Science?Co.,Ltd.)(后文也称作″Liposome″)。作为预混合物溶液,在无核酸酶水中制备100mM维生素A(视黄醇(Sigma),后文称作VA;溶解于二甲基亚砜中)、1mM?Lipotrust?SR(溶解于无核酸酶水中)和稀释为10μg/μL的siRNA?scr-CyTM5.5。首先,将Lipotrust?SR和VA以1∶1(mol/mol)比率混合,旋动搅拌15秒,然后置于室温下避光5分钟以形成复合物。向此复合物中加入10μg/μL的siRNA?scr-CyTM5.5,轻轻混合,获得本发明的成像剂(VA-Lip-Cy)?;竦玫某上窦恋某煞质牵合喽杂?00μL成像剂,100nmol(28.6mg)视黄醇、100nmol(62.6mg)形成Liposome的阳离子脂质和10μg的CyTM5.5-标记的SiRNA。这种成像剂其中至少一部分类视黄醇在最晚到达靶细胞之前暴露于成像剂的外面。相似地产生没有VA的成像剂(Lip-Cy)。将这些成像剂通过尾静脉缓慢地施用于在异氟烷(isoflurane)气体麻醉下的体重为30g的小鼠,施用量为100μl/小鼠。

    在施用之前及在施用之后5-90分钟,使用IVIS成像系统(XENOGEN,IVIS(R)200)随着时间观测小鼠的荧光部位,并量化荧光信号。为了进行量化,基于组织扩散模型(Tissue-Diffusion?Model)理论测量物理量(光子/秒;后文也称作p/s)代替测量发光强度(计数),在校准激发光源(以平均效力表示(Avg?Efficacy))之后,测量值以平均辐射率用数字表示(Avg?Radiance,/s/cm2/sr)并绘图。在此,“p/s/cm2/sr”是“光子/秒/平方厘米/球面度”的缩写,其中球面度是立体角的单位。

    在施用90分钟之后,处死小鼠,取出肝脏,用4%低聚甲醛固定及用石蜡包埋,制成薄片样品。将该样品用α-SMA-FITC(Sigma,F3777)染色,以证实siRNA?scr-CyTM5.5信号的细胞内定位。此外,分析CyTM5.5和FITC阳性区域相对于总CyTM5.5-阳性区域的比率(α-SMA重叠/CyTM5.5阳性区域)以及CyTM5.5和FITC阳性细胞数与CyTM5.5-阳性细胞总数的比率(α-SMA重叠/CyTM5.5阳性细胞)。

    在施用VA-Lip-Cy的肝硬化(Cirrhosis)小鼠和正常(Normal)小鼠中,从在开始施用之后5分钟观测肝脏(Liver)中信号,但是在肝硬化小鼠中的信号显著强于在正常小鼠中的信号。相反,在肝硬化小鼠肠道(Intestine)中的信号示出几乎无改变,而在正常小鼠中的那些信号示出在开始施用之后30分钟逐步增加(图12和13)。

    从肝脏样品的染色结果中,可以看出施用VA-Lip-Cy(VA(+))的肝硬化小鼠中α-SMA(FITC)和SiRNA(CyTM5.5)均阳性的细胞数显著大于在施用Lip-Cy(VA(-))的肝硬化小鼠或者施用VA-Lip-Cy的正常小鼠中的相应细胞数(图14-16)。

    这些结果示出,在肝硬化小鼠中,本发明的成像剂特异性标记α-SMA-阳性的激活的星形细胞,并且停留在纤维化病灶,而在正常小鼠中,本发明的成像剂不停留在肝脏中,而是移至肠道中。因此,通过在生物体外部观测和量化这种标记,可以非侵入性及简便地确定或者诊断纤维化疾病的存在与否及其严重性。此外,可以对单一个体进行非侵入性和时间性观测,从而可以高精确性地评估治疗。

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    本文标题:纤维化疾病的成像剂.pdf
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