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    重庆时时彩后二大小单双: 用于种子分析的去除特定种子组织或结构的设备.pdf

    关 键 词:
    用于 种子 分析 去除 特定 组织 结构 设备
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980142061.9

    申请日:

    2009.08.20

    公开号:

    CN102197309A

    公开日:

    2011.09.21

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 35/02申请公布日:20110921|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 35/02申请日:20090820|||公开
    IPC分类号: G01N35/02; G01N33/48 主分类号: G01N35/02
    申请人: 先锋国际良种公司
    发明人: J·科普
    地址: 美国依阿华州
    优先权: 2008.08.22 US 61/090950; 2008.08.29 US 61/092863
    专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 彭武;杨炯
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980142061.9

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.02.05|||2011.11.23|||2011.09.21

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    公开了一种减少用于选择商业规模生产或研究的种子的资源的设备。收集作为选择的候选的种子的样本并对其给予标识符。从候选种子去除特定组织或结构。对候选种子或去除的组织或结构执行测试或分析。记录测试或分析的结果并使之与种子的标识符关联。评估该结果并决定是否选择候选种子用于商业生产或用于研究。节约了与在试验地或温室中种植植物和从生长的植物获取组织样本关联的时间、空间和劳动。

    权利要求书

    1.?一种用于对商业规模生产或研究的种子进行的资源高效选择的设备,包括:a.种子组织或结构去除工具,能够提供相对于种子的特定组织或结构而言的高度可控的一种种子组织或结构去除力;b.种子支架,具有种子组织或结构去除位置;c.电动定位器和控制器,适于使所述工具和支架之一或二者相对于彼此移动;d.从而使得所述工具的去除力能够选择性地受操纵以用于所述去除位置。2.?根据权利要求1所述的设备,其中所述去除工具包括具有激光束的激光器,并且所述去除力包括烧蚀。3.?根据权利要求1所述的设备,其中所述工具包括喷水器、磨削器、钻机、穿孔器、刀片、刮刀或喷砂器。4.?根据权利要求1所述的设备,其中所述支架是由底部和侧壁定义的凹槽或腔。5.?根据权利要求4所述的设备,其中所述底部和侧壁具有表面特性,所述表面特性包括使激光束漫射的相对于激光束的表面角度、表面纹理、表面涂层或表面处理中的一项或多项。6.?根据权利要求1所述的设备,其中所述支架包括可转移的构件。7.?根据权利要求6所述的设备,其中所述可转移的构件包括轮子。8.?根据权利要求7所述的设备,还包括由磁体吸引的种子上的构件或涂层,所述轮子包括位于所述去除位置处的磁体。9.?根据权利要求8所述的设备,还包括所述轮子上的多个磁体以提供多个种子支架和去除位置。10.?根据权利要求1所述的设备,还包括多个种子支架。11.?根据权利要求10所述的设备,其中所述多个种子支架是包括板或托盘的单个构件的一部分,所述多个种子支架是所述板或托盘中的腔、泡或凹槽或从所述板或托盘延伸的腔、泡或凹槽。12.?根据权利要求11所述的设备,其中所述多个种子支架包括所述板或托盘中的凹槽,所述凹槽包括控制着激光束的表面反射的表面特性。13.?根据权利要求12所述的设备,其中所述表面特性包括相对于激光束的表面角度、表面纹理、表面涂层或表面处理中的一项或多项。14.?根据权利要求1所述的设备,还包括:计算机,用于存储数据并使数据与特定种子关联。15.?一种对种子执行激光烧蚀的设备,包括:a.种子支架;b.所述种子支架具有使非漫射的激光反射最小化的表面。16.?根据权利要求15所述的设备,其中所述种子支架包括由底部和侧壁定义的凹槽或腔,还包括用于使种子在所述凹槽或腔中居中的锥形埋头底部。17.?根据权利要求16所述的设备,还包括位于可索引的行和列的阵列中的多个凹槽或腔。18.?根据权利要求16所述的设备,其中所述凹槽或腔形成在金属材料中。19.?根据权利要求18所述的设备,其中所述金属是铝。20.?根据权利要求19所述的设备,其中铝中的所述凹槽或腔被着色、涂覆粉末、喷砂和阳极化。21.?根据权利要求16所述的设备,其中所述凹槽或腔具有比种子的最长尺寸更大的直径。22.?根据权利要求16所述的设备,其中所述凹槽或腔用于容纳单个种子。23.?根据权利要求16所述的设备,其中所述凹槽或腔由底部和侧壁定义,所述底部和侧壁由塑料、橡胶、纸、纸板、合成材料或其它非常坚硬的材料形成。24.?一种用于商业规模生产或研究的种子的资源高效选择的设备,包括:a.种子组织或结构去除工具,具有用于种子组织或结构去除的辐射;b.种子支架,具有种子组织或结构去除位置和辐射漫射特性;c.电动定位器和控制器,用于选择性把所述辐射引导到所述去除位置。25.?根据权利要求24所述的设备,其中所述辐射包括光束,所述光束的一种源包括激光器。26.?根据权利要求24所述的设备,其中通过烧蚀实现种子组织或结构去除。27.?根据权利要求24所述的设备,其中所述种子支架包括可转移的构件,该可转移的构件具有多个种子支架和去除位置。28.?根据权利要求27所述的设备,其中所述种子支架和去除位置包括种子定向和保持特性。29.?根据权利要求28所述的设备,其中所述种子定向和保持特性由磁体提供。30.?根据权利要求29所述的设备,还包括由位于每个种子支架和去除位置的磁体吸引的种子上的构件或涂层。

    说明书

    用于种子分析的去除特定种子组织或结构的设备

    技术领域

    本发明涉及一种用于分析种子并基于分析决定种子及其其随后的用法的设备,具体地讲,涉及用于高效并且有效地去除特定种子组织或结构以便能够实现对种子或者它的去除的组织或结构的测试和分析的设备。

    背景技术

    现有技术中的问题

    种子公司的主要目标在于培育出生长成为对于种植者而言在商业上希望获得的植物的种子。种子公司把大量资源用于商业上希望获得的种子的研发。

    常规研发技术趋于是费时费力的并且需要大量土地和空间。研究中所涉及的所有种子或很多种子种在研究用地上。在从种子产生植物之后,从每个植物采集组织样本。组织样本被运送到实验室以推断种子和种子的植物的研发所需的信息。

    这些方法在工业上是熟知的。土地、劳动和机器的资源成本很高。

    能够使用数千(如果没有数万的话)英亩的试验地。用于耕地、种植、维护、获得植物组织样本、运送到实验室和在实验室进行分析的工人和机器的适合的数量很大。时间也是一种因素和成本。必须等待做出关于植物及其种子是应该用于生产商贸规?;蛑肿?、还是应该用于进一步研究的决定,直至可以获得来自产生的植物的组织样本。

    典型过程如下。把已知亲本(parentage)、表型/显型或基因型的种子种在温室中或室外的试验地中。统计学上有效数量的植物必须在田地里或温室中生长。这涉及大量物理空间和劳动。在植物已出现之后,从植物获取组织样本。进行测试以识别样本的基因组成或其它特性。这个过程当然花费大量时间。植物必须生长到能够以非破坏的方式获取组织样本的程度。必须非常仔细地处理样本并把其送到实验室。在能够识别关注的基因之前必须进行基因检测。

    具有以下的过程能够比较有益:通过该过程,能够接触并测试(遗传方面或其它方面)相关遗传物质或组织、部位或结构而不必从种子开始种植植物。本领域技术人员能够理解到:可以大量节约劳动、时间和空间。

    从多数生长的植物获得具有相关细胞物质的组织样本并不难。常规地,利用工具(例如,手工操作的叶穿孔器)从生长的植物去除相对较小的部分或组织的样本。如果正确操作,则在小的叶穿孔通常不会在很大程度上影响植物的健康或生活力/生存力(viability)的意义上,样本的去除是非破坏性的。例如,叶穿孔用于去除相关的细胞以用于植物的分析。虽然这种叶样本不会有害于植物、并且相对比较容易运送到实验室并存储,但从种子公司试验地中的通常数量的植物获得植物组织样本仍需投入大量劳动和时间。需要来到处于生长位置的每个植物并采集/获取叶样本。

    生长出测试地植物的种子也具有相关的细胞物质。然而,接触种子的细胞物质并对种子的细胞物质执行测试或化验分析、却不在很大程度上影响种子的生活力或发芽势则完全是另一回事。多数种子及其部位的相对较小的尺寸是一个原因。另一原因是:一些种子中的相关组织或结构仅为整个种子的一种子集,并且常常在外壳里面。这使得难以仅接触或采集相关物质。另外,一些种子具有使得难以进行非破坏性取样的构成/构造。玉米种子的坚固外层或组织(果皮)是一个例子。难以在不使用破坏或损伤种子的方法的情况下去除样本。另外,所有这些问题阻碍了对多个种子的高吞吐量接触和取样。在从小物体精确去除特定组织或结构以触及其它特定组织或结构、并且高效地实现这种操作的方面,提出了很大挑战。

    因此,产业中需要实质地减少用于评估植物及其种子的潜在商业生产、或者在植物和种子研发方面的进一步用途的资源。现有技术中还需要设备用于去除和/或接触种子的特定组织或结构(包括按照非破坏性和相对较高吞吐量方式实现该目的)。

    发明内容

    本发明的一个方面是一种减少用于选择商业规模生产的种子的资源的设备。收集作为可能选择的候选的种子,并对每个种子给予标识符。从单个候选种子去除特定组织或结构,以露出该候选种子的特定组织、部位或结构,或者获得对该候选种子的特定组织、部位或结构的接触,或者分离并收集特定组织、部位或结构。对候选种子的露出的组织或去除的组织执行测试或分析。评估所述测试或分析的结果,并且能够决定是否选择该候选种子类型用于例如商业生产。能够记录该结果,并把结果与种子的标识符相关联。本发明避免了在试验地或温室中种植植物和从生长的植物获取组织样本的时间、空间和劳动。能够直接从种子以相对较高吞吐量快速地做出决定。

    根据本发明一方面的设备能够包括一种种子支架和一种协同工作以允许去除特定种子组织或结构的工具。种子支架把种子与其它种子隔离,并把该种子提供给该工具以进行组织去除。随后能够测试种子中露出的组织、或从种子去除的组织。

    在本发明的另一方面,一种设备包括:受控激光器,从种子烧蚀、切削、分离或去除组织、部位或结构以按照相对快速并且准确的方式获得或露出所希望的种子的部分、而不实质影响种子生活力或发芽势。能够测试或分析种子的相关露出部位或组织,和/或能够测试或分析种子的去除的部位或组织。

    在另一方面,一种设备包括自动化步骤或自动化部件,其中能够把多个候选种子移动到组织去除站,去除特定组织、部位或结构,并且测试和评估剩余种子、或它的去除的组织、或者这二者。测试或评估能够包括但不限于在细胞、分子或纳米级水平上的遗传、物理或化学分析。

    附图说明

    A.附图

    图1是根据本发明一个方面的流程图;

    图2是图示出相对于用于实施图1的第一特定例子1的设备和功能的方框图;

    图3是根据例子1的本发明的一个方面的图解性局部透视图;

    图4A-C是图3的板18的俯视图;

    图4D是来自板18的一个凹槽(well)的放大局部剖视图,进一步显示玉米种子在凹槽中的定位;

    图5A和5B是典型玉米种子的放大俯视剖视图和侧视剖视图;

    图6A图示出在激光烧蚀之前把多个玉米种子存放在板18的相应各个凹槽中的一种方法;

    图6B以图表的方式图示出把单个种子存放在板18的每个凹槽中的另一种方法;

    图7是一种允许实现设计板18的每个凹槽的烧蚀区域的设计的软件模板的平面图;

    图8A是图示出从种子去除组织、从而在种子的一个表面上留下直角棱柱形状的腔的激光烧蚀的放大侧视立视图;

    图8B是图8A的激光烧蚀的种子的放大俯视图;

    图9A-C图示出通过种子的激光烧蚀(特别地,去除果皮的一部分以露出或去除种子胚乳的一部分)获得的直角棱柱腔80的各种视图;

    图10A-C显示种子的另一种烧蚀图案,即具有直角棱柱腔的组合的一种腔;

    图11A-C显示能够在单个谷粒中激光烧蚀出的图案的另一例子,这里,即一种呈矩形的第一通道、和与第一通道分隔开并围绕着第一通道的一种呈矩形的第二通道;

    图12A-C显示种子中的激光烧蚀图案的另一例子的各种视图,这里,即穿过果皮的直角棱柱以露出或烧蚀种胚的一部分;

    图13A-C类似于图10A-C但图示出了对激光的控制以产生更加圆形的图案;

    图14A-C类似于图11A-C但图示出了对激光的控制以产生圆形的图案;

    图15是根据本发明的另一实施例的例子2的示图,其中从种子的激光烧蚀得来的碎片通过真空被收集到容器中,其中测试或分析所述碎片或去除的组织而非种子中露出的组织;

    图16是根据例子2的设备的局部剖视侧视图;

    图17是用于去除由对一组种子进行的激光烧蚀产生的碎片的可选的真空系统的比例缩小的图解性示图,其中所述一组种子中的每个种子位于托盘或板的凹槽中;

    图18是使用激光进行切割的可选的种子切割器、以及基于磁性的种子保持和定向系统的图解性图示。

    具体实施方式

    A.概述

    为了更好地理解本发明,将详细描述本发明的几个示例性实施例。将会频繁地参考附图。参考数字和字母将用于指示附图中的某些部件和位置。除非另外指出,否则在所有附图中,相同的参考数字或字母将用于指示相同或相似的部件和位置。

    B.示例性实施例的背景

    主要在玉米和玉米种子的情况下描述示例性实施例。然而,应该理解,这只是能够用于本发明的各方面的种子的一个例子。另外,主要示例性实施例的背景是去除玉米粒的相对较少量的组织或结构以(a)露出并测试种子的特定内部组织或结构或(b)测试去除的组织或结构。有意地控制所述去除操作以最小化或避免对种子生活力或发芽势的不利影响。然而,如果应用需要,本发明能够用于去除实质上较多的组织,甚至达到威胁或破坏种子生活力的程度。

    实施例能够以类似的方式应用于其它种子。例子包括但不限于:燕麦、大豆、小麦、黑麦、稻米、加拿大油菜、芸苔属、高粱、向日葵、大麦、小米、苜蓿、棉花、花生、亚麻、红花、棕榈、橄榄、蓖麻、椰子、小米、拟南芥、烟草或高粱种子。

    C.示例性一般方法

    图1图示出根据本发明一个方面的一般示例性方法200。方法200允许选择种子以用于进一步研究或商业生产、而不必从种子开始生长植物并测试植物的活组织。该方法能够避免这样的情况:为了从种子开始生长植物而使用土地、劳动、时间、装备和材料以随后采集非破坏性的样本从而分析以做出选择决定。该方法能够不破坏种子,允许相对较高的多样本的吞吐量,并且基本上是自动化的。方法200包括下述步骤。

    分析并比较不同基因型和/或不同玉米品种的多个玉米粒以识别并选择某些玉米粒是用于进一步研发还是种植以按照商业或研究级规模进行生产。该方法也适用于其它种子特定测试或分析,这对于本领域技术人员而言是显而易见的。

    1.候选种子的识别(步骤201/202)

    一个或多个因素用于决定哪些种子将会是用于评估的候选种子(图1,步骤201)。在这个例子中,预先选择一组多个个别的候选种子,每个种子具有不同性状或基因型和/或玉米品种。每个候选种子与其它候选种子分离,但与能够识别处该候选种子所基于的信息相关联(步骤202)。在整个方法中能够为每个种子保持该身份。每个种子的识别能够通过特定信息和/或通过与关于种子的信息或种子的身份相关的某种码来实现。所述某种码能够被记录或存储(例如,在计算机中记录或存储在数据库中)??梢圆捎闷渌椒?。

    候选种子的预先选择能够基于许多因素或准则中的任何因素或准则。研究的科学家选择这些因素或准则。因素和准则的类型的例子在现有技术中是公知的。一些是基因型、表型、亲本、性状或特性。在诸如以下参考文件中能够找到这些因素或准则的进一步讨论:(a)Chahal,?G.S?&?Gosal,?S.S.,?2002.?“Principles?and?Procedures?of?Plant?Breeding”,?Alpha?Science?International,?United?Kingdom;?(b)Falconer,?D.S.?1989.?“Introduction?to?Quantitative?Genetics”.?3rd?Ed.?Longman.?Burnt?Mill;和(c)Frisch,?M.?&?Melchinger,?A.E.,?2005.?“Selection?Theory?for?Market-assisted?Backcrossing.”?Genetics:?Published?Articles?Ahead?of?Print,?published?on?March?31,?2005?as?10.1534/genetics.?104.035451;它们的全部内容包含于此以资参考。

    2.单个种子的分离(步骤204)

    通过许多方法中的任何方法分离单个候选种子以提供该种子用于去除特定组织(图1,步骤204)从而接触或露出该种子的某些特定组织、部位或结构以用于测试或者收集去除的组织以用于测试。为了本说明书的描述的目的,种子的组织、部位或结构有时会统称为组织。分离的一个例子是把候选种子放到腔或凹槽中。另一例子是由某个装置抓住、固定或限制种子或者抓住种子并把种子固定或限制到某个装置(例如,利用真空;通过箝位/夹紧作用)。另一例子是把一种物质应用于被吸引或固定到表面或构件上(例如,粘合剂;磁性)的种子??梢圆捎闷渌椒??;竟δ苁枪潭ㄖ肿右杂糜谧既范腋咝У淖橹コ?、并且使种子与其它种子分离,同时保持种子的身份。

    3.特定组织的去除(步骤205)

    从种子的指定位置去除种子的组织。能够使用许多方法。在某些方法中,可以有益地首先以某方式使种子确定方位。这能够帮助去除指定的组织。

    组织去除的例子是使用激光(见图3)。如稍后更详细所述,能够精确地控制激光的强度。激光还能够从种子的一侧聚焦于一种能够有效用于仅去除组织的相对较小区域的束宽上、并且聚焦于一种相对较小的受控深度。

    激光束能够按照各种方法工作以执行组织去除。一个例子是可编程光栅扫描。对光束进行控制以相对于待去除的区域按照所编程的速度和方向进行移动。

    激光束能够聚焦在种子上并且在种子上精确移动以烧蚀它撞击的种子的部分并去除组织。烧蚀由一个资料来源定义为去除或破坏,尤其是通过切削、研磨或蒸发(汽化)来进行去除或破坏(Merriam-Webster?OnLine?Dictionary?2007)。另一资料来源把它描述为通过汽化、切割小片或其它腐蚀性处理从物体表面去除材料(WIKIPEDIA.?“Ablation”词条[online],[检索于2008-08-18].?从互联网<URL:(//en.wikipedia.org/wiki/Ablation>检索)。如本文中所使用,烧蚀表示这些动作或者表示从种子去除或分离这种种子组织的类似动作。在一些例子中,这基本上导致候选种子去除了某一组织以露出或允许接触内部组织。烧蚀可导致一片或仅几片去除的组织(更多的是在切削或切割小片的意义上如此)。另一方面,烧蚀可导致去除的组织基本上为碎片(更多的是在由烧蚀、腐蚀性处理等产生的片段或非常小的颗粒甚至灰尘状颗粒的意义上如此)。另一方面,烧蚀可导致去除的材料蒸发、升华或形成等离子体。

    激光能够以这些方式工作以从种子去除特定组织。如前面所述,能够收集去除的组织以用于测试或分析。另一方面,能够执行剩余种子的测试或分析,因为组织去除能够被设计为露出或允许接触剩余种子中的组织。

    在玉米的情况下,能够控制激光束来去除果皮的区域以便以非破坏性方式接触下面的关注的种子组织、部位或结构。如图5A和5B中的玉米粒的横截面所示,两种可能性是胚胎74或胚乳76。胚胎74通常位于种子的尖冠端67处、或者在种子的尖冠端67附近,并且离种子的一个平坦侧较近而离另一平坦侧较远。胚乳从胚胎侧大体上沿整个相反侧延伸,但在与尖冠相反的种子端处变宽、并占据大多数内部空间。因此,可以从玉米种子的一个扁平侧接触胚胎或胚乳,而不必去除很多中间的种子组织。特别地,通过必要地去除少量外种皮或果皮能够露出胚胎或胚乳。

    通过初始化和校准,能够控制激光仅去除足够的果皮以获得充分的内部接触从而能够对某一所希望的内部组织或结构进行检验?;鼓芄豢刂萍す饨鋈コ愎坏墓ひ曰竦枚阅诓康某浞纸哟ザ皇抵视跋熘肿拥纳盍蚍⒀渴?。

    通过经验测试,能够调整光束的功率和速度以满足这些目标。如图8-14中所示,去除的区域通常是玉米粒的一侧的整个区域的一小部分。典型的烧蚀深度为穿过果皮并随后刚好足以露出而不破坏目标内部组织或结构。通过合适的设置、校准和经验测试,经控制由激光产生的热量、仅去除某一种子组织、并且仅去除接触下面的关注的组织或结构所需的种子组织,则激光的操作能够不破坏种子。这种操作在这样的意义上而言是非破坏性的,即它通常不会实质上降低剩余种子的生活力或者剩余种子的发芽势。已发现,激光包括了在对烧蚀的移动、面积和深度进行的控制方面的高精度及其效率的益处。

    然而,可以采用非破坏性种子组织去除的其它方法。一个例子是喷水器或腐料喷射器(例如,可从Berkeley?Chemical?Research,?Inc.,?Berkeley,?CA?94706-026;?Flow?International?Corporation,?Kent,?WA?USA;和其它公司商购获得)。另一例子是具有合适尺寸的钻头和刀尖(例如,在各个商业点或者在线从Robert?Bosch?Tool?Corporation可购得的镌刻、切削、磨削、雕刻、砂磨或刳钻钻头尖端)的磨削工具(例如,Dremel?brand?MultiProTM旋转工具)。在2007年11月13日提交的序列号为11/939,402的美国申请中阐述了从种子去除组织的其它工具或方法的另外的描述和说明,该申请已转让给本申请的所有者并且其全部内容包含于此以资参考。图18的系统(序列号为11/939,402的申请中也更详细地描述了该系统)提供了通过切下种子的一片而从种子去除组织的特定例子。在图18的例子中,切削工具是激光。

    4.种子特异分析(步骤206)

    许多分析能够应用于已去除组织之后的种子、或者应用于从种子去除的组织。一个例子是遗传分析。通过现有技术中已知的方法,例如胚胎的露出允许执行化验检验以检测核酸,从所述核酸能够获得关于种子的遗传信息。

    一个这种方法的例子如下。烧蚀的种子能够浸没在为任何数量的聚合酶链式反应(PCR)分析制备的PCR混合液中。检测器能够产生代表PCR的某一方面的信号,从所述信号能够获得基因型分型。这种信号及其使用的细节是公知的??缮坦夯竦酶髦諴CR检测器。一个例子是用于PCR的光学检测器(例如,Chromo4TM?Real-Time?PCR?Detector?from?Bio-Rad?Laboratories,?Inc.,?Life?Science?Research?Group,?2000?Alfred?Nobel?Drive,?Hercules,?CA?94547?USA)。

    核苷酸序列能够用于从其它有机体(具体地讲为其它植物,更具体地讲为其它单子叶植物)分离相应序列。以这种方式,各种方法(诸如,PCR、杂交等)能够用于基于这种序列的序列同源性来识别这种序列或者这种序列的片段。

    在PCR方法中,寡核苷酸引物能够设计为用于PCR反应以扩增源于提取自任何关注的植物的互补DNA(cDNA)或基因组DNA中的相应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是现有技术中广泛已知的并且公开于例如以下文件:Innis?et?al.,?eds.?(1990)?PCR?Protocols:?A?Guide?to?Methods?and?Applications?(Academic?Press,?New?York);Innis?and?Gelfand,?eds.?(1995)?PCR?Strategies?(Academic?Press,?New?York);和Innis?and?Gelfand,?eds.?(1999)?PCR?Methods?Manual?(Academic?Press,?New?York),其全部内容包含于此以资参考。已知的PCR方法包括但不限于:使用配对引物、巢式引物、单特异引物、简并引物、基因特异引物、载体特异(vector-specific)引物、半相合(partially?mismatched)引物的方法等。

    在杂交技术中,核苷酸序列的全部或一部分用作一种探针,所述探针选择性地杂交到存在于来自所选择的有机体中的克隆基因组DNA片段或互补DNA片段的群体(即,基因组或互补DNA信息库)之中的其它相应核苷酸序列。杂交探针可以是基因组DNA片段、互补DNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸,并且可以利用一种可检测基(诸如,32P)或任何其它可检测标志对杂交探针做标记。用于制备用于杂交的探针和构造基因组信息库的方法在现有技术中是广泛已知的。

    为了在各种条件下实现特异杂交,这种探针包括了独特的、并且通常在长度方面为至少大约10个核苷酸、或在长度方面为至少大约20个核苷酸的序列。这种探针可用于扩增通过PCR从所选择的植物获得的相应序列。这种技术可用于从所希望的有机体分离另外的编码序列、或者作为诊断检验以用于确定在有机体中存在着编码序列。杂交技术包括了对涂覆DNA信息库(斑块或集群)的杂交筛选。

    这种序列的杂交可以在严格条件下执行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件:在该条件下,与杂交到其它序列相比,探针将会在更大的可检测的程度上杂交到它的目标序列(例如,背景的至少2倍)。严格条件是依赖于序列的并且在不同环境中是不同的。通过控制杂交和/或清洗条件的严格度,能够识别与探针100%互补的目标序列(同源探测)。

    另一分析能够是细胞级分析。关于玉米的例子描述于Gabriella?Consonni?et?al.,?“ Genetic?Analysis?as?a?Tool?to?Investigate?the?Molecular?Mechanisms?Underlying?Seed?Development?in?M

    另一例子是纳米级分析。参见例如Georg?H.H.?et?al.,?“Analysis?of?Detergent-Resistant?Membranes?in?Arabidopsis.?Evidence?for?Plasma?Membrane?Lipid”,?Plant?Physiol.?2005?January;?137(1):104-116,其全部内容包含于此以资参考。

    化学分析是另一例子。例如,能够执行各种测试以识别组织的化学性状。

    当然可以采用其它处理或分析。组织去除步骤为这些分析提供了样本。本领域技术人员熟悉能够对种子进行的不同的分析和测试。

    5.从候选种子进行的选择(步骤211)

    一旦分析已完成,来自分析的结果或信息能够用于例如区分一个种子与其它种子、或者识别该种子的性状。这能够用于优先于另一种子选择一个种子,或者因为种子的性状而选择该种子。一个例子是通过基因型分型被指示为比其它基因型更加抗旱的种子。通过利用激光对种子进行有效的非破坏性烧蚀(或种子组织的其它去除)以及通过合适的基因型分型检验,能够识别出一种表现出抗旱基因组成的种子。

    如图1中所示意性地图示,能够从多个不同候选种子中进行选择。识别并收集不同的候选种子1,2,…,n(步骤202)。通过步骤204、205和206处理第一样本种子(步骤203),并且记录源自步骤206的测试的结果或数据(步骤207)。类似地处理一个或多个其它样本种子(例如,样本2,3,…,n)(步骤204-206),并且与每个种子的识别信息(202)关联地为每个种子存储测试结果(207)。这为两个或更多样本之间的比较(步骤210)以及为随后视为所希望的(例如,用于进一步研究或商业生产)两个或更多种子之间的选择(步骤211)提供了一个基础。如图1中所示,样本之间的比较可以是基于能够利用样本的种子特异测试进行分析的各种因素中的任何因素的。

    很重要地,非破坏性组织去除和分析允许进行这种识别,而不必种植种子并等待测试来自种子的生长植物的组织样本,或者不必为植物使用土地或温室空间、劳动和补给品并使种子生长成为植物。对于种子组织的受控、精确、非破坏性的去除用于测试,或者用来接触用于测试的相关下面组织或结构,则所述对于种子组织的受控、精确、非破坏性的去除允许:基于种子的组织、而非基于从种子生长的植物来进行分析从而做出选择??梢岳斫?,对于种子公司的选择过程,这代表了潜在的时间、劳动和资源(包括土地资源)的大量节约。受控、精确、非破坏性的组织去除能够基本上实现自动化,由此提高植物选择过程的吞吐量和效率。

    关于玉米种子,至少外部(果皮)组织的去除是比较困难的。过去不认为对种子大规模地、且高效和/或非破坏性地执行这样的操作是实用或者可行的。玉米种子的果皮78(图5A和5B)是相对比较结实的种子组织(稍微有点像指甲)并且难以与下面的种子组织结构分离。任何去除果皮的一部分以露出玉米粒里面的组织或结构的操作都费时费力并且很困难。这在现有技术中是众所周知的。已尝试了各种方法以去除果皮。一些方法包括化学浴(浸渍/浸泡)或机械方法(例如,磨削)。这些方法需要仔细的工人并且很耗时。它们也往往会破坏种子。

    露出玉米种子的内部组织的重要原因在于接触雄性和雌性遗传物质以检验并且评估遗传内容。这允许研究者能够了解种子是否包含关注的基因。如果种子包含关注的基因,则种子随后被识别为用于进一步研究的候选种子,或者作为候选种子用来生产商业规模的种子。方法200的受控制力用于以非破坏性方式去除特定种子组织。这继而允许测试和分析、种子选择、以及随后为进一步使用所选择的种子的种植和发芽。一种进一步使用是从所选择的种子培育商业规模的种子;诸如种子公司的商业种子产品。

    但补充地或者替代地,从种子去除组织提供了来自用于测试的种子的样本。该方法不仅能够用于去除果皮的一部分,还能够用于去除特定类型和数量的内部组织(例如,胚乳或胚胎)。例如,激光的受控操作能够烧蚀果皮的区域、以及紧挨着位于果皮下面的胚胎的一部分。能够收集并测试源自烧蚀的碎片(即,去除的组织)。该碎片基本上是候选种子的样本。碎片的测试因此是种子的测试。如果适当受控制,则能够以不破坏剩余种子的方式通过激光烧蚀去除组织,从而使得剩余种子保持发芽势。然而,这不是必需的。通过从候选种子去除小的样本,能够立即测试该样本以允许快速做出关于种子及其性状的决定。因为能够对单个种子执行取样和测试(这不会破坏植物或植物的其它种子),所以该方法不仅能够快速,而且能够为多个候选种子提供相对较高的吞吐量。

    对于一种用来处理种子以从种子去除某一相对较准确数量的组织的方法,存在其它有益的应用。存在各种希望去除种子的某一部分的情况。上述方法使用各步骤来以非破坏性方式去除所希望的种子组织。对该种子组织或露出的种子组织的其它使用在本领域是公知的。

    D.特定例子1(图2-14)

    图2-14图示出图1的方法的一个特定方案。用于去除种子组织的烧蚀的工具或方法是激光。在这个特定例子中,特定种子支架用于相对于激光定位候选种子。

    图2以图表方式图示了一种实现图1的方法200的系统和设备300的方框图。准备了多个种子样本301A-N并把它们提供给种子处理系统302以用于处理和分析。种子处理系统302把样本301提供给限定了测试位置320的种子支架305。组织去除工具302可由定位器304控制以对处于测试位置320的种子进行操作,具体地讲,从种子的指定区域去除指定量的种子组织。一旦去除了组织,对种子执行种子特异测试306。如图所示,在这个例子中,在测试位置(该测试位置是与组织去除步骤相同的位置)执行测试。这能够节约时间并提高吞吐的效率。收集测试结果307,并且能够把测试结果307记录在例如计算机存储器308中。

    附图标记310-315显示这些样本的一般流程和源自样本的测试结果。这些功能中的很多功能能够基本上自动化。这允许利用最少的手工步骤处理多样本种子,从而能够增加准确性和效率。

    图3图示出能够用来实施图1和图2的示例性方法200和示例性系统300的组织去除工具的激光烧蚀系统10。

    1.组织去除工具

    在图3图示出的系统10中,激光器16是组织去除工具。一个例子是可从Synrad,?Inc.?of?Mukiteo,?Washington?(USA)商购获得的FirestarTM?f201系列,型号#FSF201SB,水冷级二氧化碳(CO2),200瓦激光器。激光器16具有典型特性和可调节能力(例如,功率或强度)。

    CO2型激光器已证明了效率以及合理的成本和高功率能力。它工作于红外波长。它广泛用于切削和焊接,但也频繁用于手术操作,因为大多数生物组织中的水吸收CO2激光器的光的频率。能够使用其它类型的气体激光器,正如能够使用其它类型的激光器(例如,化学、金属蒸汽、固态(例如,YAG)和半导体激光器)。

    激光器16通?;岚ㄒ恢止庋Х庾白榧?诸如,光束传输部件(参见图8的附图标记130))以聚焦并控制激光束。也会使用常规辅助装备,诸如电源、控制电路等。如同从Synrad可获得这些光学装置和附件一样,通??梢源蛹す馄鞴┯ι袒蛑圃焐袒竦谜庑┕庋ё爸煤透郊?。利用上述FSF201SB激光器,使用一种光束传输系统,所述光束传输系统传送来自密封的激光器的原始激光束、并把激光束聚焦在切削种子的位置(例如,测试位置)。光学系统的例子是具有5”聚焦透镜的Haas?Laser?Technologies?Inc.?1.25”系列光束传输系统。能够使用典型类型激光切削系统中的任何一种(包括全飞行光路或飞行光学(flying?optics)、混合式和枢轴束)来精确控制激光束相对于其目标应用的移动。

    通过经验测试和校准,激光器16能够设置用来烧蚀图案或者把种子的一侧的区域烧蚀到相对可控的深度。按照制造商的设置指令,激光器16能够构造为用来产生为玉米粒的表面的所希望的烧蚀而设计的具有某一宽度、功率、调制和颜色的激光束132,以去除果皮的区域并提供对果皮下面的组织的接触,并且以非破坏性方式实现这样的操作。

    应该理解,能够如此准确而精密地控制激光器以致于如果需要则可以在玉米粒的表面上蚀刻标志、字母或数字。一种用途将会是直接在种子上标记种子样本的身份。

    为了足以控制玉米种子的组织去除的位置、尺寸和深度,组织去除工具在理想情况下应该具有预定的空间分辨率。烧蚀能够在种子上有所变化。在整个板18上,烧蚀能够因种子而异。烧蚀能够在这些方面变化:去除的组织的量(例如,面积和体积)、去除的组织的位置或者去除哪个组织(例如,果皮、胚乳和/或胚胎)。如果目的是露出用于遗传测试的细胞,则激光烧蚀能够切开种子的特定组织、部位或结构的内部。在一个例子中,烧蚀的种子能够随后被放入到溶液(或者把溶液加入到对种子进行烧蚀处的凹槽40)中以提取DNA,然后对其进行分析。该溶液和DNA提取方法对于本领域技术人员而言是公知的。

    应该理解,其它形式的能量或力能够用于从种子去除组织或结构。先前已提到了一些例子。

    在激光烧蚀的这个例子中,作为烧蚀模式的激光能量的设置和应用类似于医学(通常是外科手术)或生物应用中的激光烧蚀。尤其是,种子类似于人体软组织,因为它是生物体并且包含大量的水。

    物质的性质及其吸收能量的能力在很大程度上影响这个过程。因此,烧蚀激光的波长应该具有最小的吸收深度。尽管这些激光能够平均达到低功率,但它们能够提供如下的峰值强度和能量密度(fluence):

    强度(W/cm2)=平均功率(W)/焦点面积(cm2)

    峰值强度(W/cm2)=峰值功率(W)/焦点面积(cm2)

    能量密度(J/cm2)=激光脉冲能量(J)/焦点面积(cm2)

    而峰值功率是

    峰值功率(W)=脉冲能量(J)/脉冲持续时间(s)。

    种子的激光烧蚀类似于激光软组织手术。高度聚焦的激光束与软组织的相互作用基本上汽化了具有高含水量的软组织。这种激光能够产生非常小的切口。CO2激光器波长(例如,10,600?nm)由含水的生物组织高度吸收。它们也常常比固态Er:YAG激光器更便宜,所述固态Er:YAG激光器的特征也在于被水所高度吸收的波长。

    类似于针对几种类型的眼睛屈光手术(例如,LASIK和LASEK)的角膜的表面烧蚀,执行了种子的烧蚀。通过利用聚焦激光束照射固体来从固体去除材料。在低激光通量的情况下,材料由所吸收的激光能量加热并且蒸发或升华。在高激光通量的情况下,材料通常被转换成等离子体。通常,激光烧蚀是指利用脉冲激光去除材料,但如果激光强度足够高则可以利用连续波激光束来烧蚀材料。

    吸收激光能量的深度、以及相应地由单个激光脉冲去除的材料的量,取决于材料的光学性质和激光波长。激光脉冲能够在非??淼某中奔?毫秒到飞秒)和通量的范围上变化,并且能够被精确地控制。

    激光装置的类型能够包括但不限于:移动材料、混合和全飞行光路系统。移动材料具有一种静止的切削头,并在切削头下方移动材料。它需要较少的光学装置,但需要移动正被烧蚀的工件或材料?;旌霞す馄魈峁┮恢止ぷ魈?,工作台沿一个轴线移动并沿较短轴线移动切削头。全飞行光路的特征在于一种静止工作台和一种沿两个水平维度在工件上方移动的切削头(具有激光束)。光束移动的另一例子是通过旋转或振动镜。镜子按照可以在表面上描绘出所希望的图案的方式移动。

    激光接触该表面的点应该是在在激光的光学系统的焦平面上,并且通常与它的焦点同义。这个点通常很小(例如,取决于波长小于几分之一毫米)。当激光束经过表面时,仅这个焦点里面的区域受到显著影响。由激光传输的能量改变焦点下面的材料的表面。它可以加热表面并随后汽化该材料,或者该材料也许可能破裂(已知为“碎裂”或“瓦解”)并从表面脱落/剥落。这是如何去除材料。

    通过对控制器编程以使激光束随着时间经过特定图案,能够在物体(诸如,种子)上刻出不同的图案。仔细地调节光束的轨迹以实现一致的材料的去除深度。避免交叉路径。也考虑光束移动的速度。改变光束的强度和分布允许更大的灵活性。例如,通过改变每个脉冲期间打开的激光的时间的比例(称为“占空比”),能够针对材料适当地控制传输到表面的功率。

    本领域技术人员能够理解,下面是控制激光操作的因素:

    (a)相对于种子移动激光束的电机的速度;

    (b)激光的瓦数(通常为规定的量,例如75瓦),

    (c)激光的频率(控制当激光撞击种子时产生的热量)。

    此外,其它操作能够影响激光取样??梢允褂醚顾蹩掌?例如,30?psi)从激光撞击的区域去除碎片。真空是另一种选择。

    经鼓风机或真空泵的通风能够用于去除在这个过程产生的烟雾、并且用于去除种子表面上的碎片,以允许激光继续必要地雕刻材料。

    2.种子支架

    每个种子能够固定在适当位置以便由组织去除工具进行组织去除。一个例子是包括由介于底部和开口顶部之间的侧壁所限定的凹槽或腔的容器。图3和4A-D图示出按照行和列(八行A-H和十二列1-12)的索引矩阵排列的多个(九十六个)凹槽40的多凹槽容器或板18。每个凹槽位置能够由行/列(例如,A/1,A/2,……H11,H12)索引。以这种方式,能够相对于放置种子的特定凹槽记录关于凹槽中的种子的识别信息,以维持所述板18中的每个种子及其身份之间的关联。如图4A中所示,在这个例子中,凹槽40在板18的顶部42上均匀地分隔开。九十六个凹槽40对应于植物繁殖检验或很多实验室测试中使用的常规数量的种子或样本。

    板18可以是各种材料和结构中的任何材料和结构。它的基本功能是相对于组织去除工具把每个种子固定在静态位置、并且使每个种子与其它种子分离,因此在种子之间不存在混合。

    板18的一个例子具有下面的特性。它是具有圆柱形的机加工凹槽40的固体金属。金属的例子包括但不限于铝、钢或黄铜或它们的合金??梢圆捎闷渌鹗?。另一方面,能够使用塑料。塑料的例子是丙烯酸塑料??梢圆捎闷渌牧?。例子是橡胶或金属箔。材料应该与组织去除工具和它的力相兼容。

    铝的例子会是原铝(6061级)。如果使用激光束组织去除工具,则每个凹槽的侧壁和底部能够构造为用以吸收激光,降低反射,和/或引起激光的漫反射。对于金属或金属的合金,那些表面能够被涂覆粉末、阳极化、喷砂、着色或以其它方式变得粗糙/有纹理,或者构造为用以减小反射或者基本上是光漫射。

    在板18的例子中,它被设计为每个凹槽包含一个种子。每个凹槽具有帮助使种子在凹槽中居中的特定设计元件(例如,如以下所讨论的锥形底部)?;估靡恢质辜す夥瓷渥钚』蛘吖饴湫缘奈镏识园疾劢蟹勰┩扛?。例子是来自Wilmington,?DE?USA的DuPont的AlestaTM牌粉末涂料。喷砂和阳极化是改变表面(尤其是铝)以使其镜反射程度更小并且使漫反射程度更大的其它方法。也可以采用其它方法。

    对于塑料,材料自身能够是光吸收性的或者光漫射性的,或者能够在塑料中机加工或模制成型一种阻止反射的纹理。减小反射的另一方法是改变限定着凹槽的底部和/或侧壁的几何形状。对这些部分的表面进行角度加工能够帮助阻止不希望的激光束的反射离开凹槽的开放顶部。

    通过针对每个个别种子使用各个凹槽,自动地实现了每个种子与其它种子的分离(singulation)和隔离。每个凹槽40是具有锥形埋头底部58的圆筒形回转筒。

    种子的定位和定向能够以很多方式实现。关于板18,使每个凹槽40比玉米粒60的最长尺寸更宽,但具有一种锥形埋头底面58。这帮助了在凹槽40中使玉米种子60居中。典型玉米种子的形状和内部容纳物由图5A和5B图示出。需要注意的是,胚胎74在种子的尖冠端66附近,并且在一个扁平侧表面62附近。胚乳76占据与尖冠62相反的一侧和一端的很大部分。已发现:凹槽40的锥形埋头底面或底部58帮助自动在凹槽40中使玉米种子(或者任何种子或颗粒)居中。此外,通过合适的直径,凹槽40和锥形埋头孔趋于使玉米种子定位并且使种子的扁平面大体上平行于横跨凹槽40的底部的一种平面。这允许玉米种子的最大表面面积侧之一暴露于凹槽40的顶部。能够针对每个凹槽把激光设置为任何深度(见图8中的平面D)。通过初始化和经验测试,能够建立种子样本的颗粒集合的平均深度。这避免了必须为每个种子调整切削的深度。已发现,这种方式对于多数玉米种子而言可以良好工作。然而,能够对于每个种子样本不同地控制切削的深度以及烧蚀的面积,或者如果需要则能够对于不同类型的种子或不同品种的种子调整切削的深度以及烧蚀的面积,因为平均种子尺寸能够变化??梢岳斫?,激光能够在种子的相同位置上多次扫描以便以增量方式去除组织直至某一最后深度。另一方面,使用一次扫描来切削到最后深度。经验测试能够建立所希望的过程。

    图6A图示出种子支架的另一例子。起泡包装型构件100具有底板或基片,所述底板或基片具有多个孔,塑料泡形透明塑料容器102从所述多个孔延伸。在2007年9月26日提交的序列号为60/975,389的美国专利申请中能够找到进一步的细节,该申请已转让给本申请的所有者并且其全部内容包含于此以资参考。容器或泡102类似于板18的凹槽40。每个泡将会容纳种子并且把种子与其它种子分离和隔离。释放板能够可移除地粘合或附接到基片100中的孔的顶部以根据需要密封泡102的容纳物。图6A显示起泡包装100,起泡包装100构造为相对于板18的凹槽40的数量和间隔具有相同的数量和间隔的泡102。起泡包装100能够用于按照索引方式(8行×12列)存储候选种子、并且释放板位于泡102上方。通过从起泡包装100去除释放板、颠倒板18并且空的凹槽位于起泡包装100上方并且凹槽40和泡102对齐、并且随后颠倒起泡包装100和板18以把种子从起泡包装100转移到板18,则能够容易地把96个样本转移到板18的96个凹槽。但起泡包装100的另一用途能够作为板18的替代物。能够放置起泡包装100以使孔朝上、并且在孔上方没有任何释放板。单个种子粒能够放入到每个泡中。组织去除工具能够随后如参照板18所描述那样被操纵、以移动到第一泡102中的种子并对该种子进行操纵,然后移动到下一种子和泡,等等。

    可以采用其它种子支架。例如,具有带有储槽或托架的头的一种基座或销钉可用于固定单个种子,使该种子与其它种子隔离,以使得该种子能够被提供给组织去除工具并由组织去除工具操作。架子中的导管或者挤压和密封容器是能够隔离单个种子并把单个种子固定在适当位置以进行组织去除的装置的其它例子。

    图18图示出另一种子支架的例子。在系统150中,轮子154与种子填充装置152同步地旋转。轮子154具有围绕其周长均匀分隔开的多个磁体156A-F。每个种子60已在先前涂有或蘸有磁性或铁基涂料158。同步并且大体上同时地,种子60B从种子填充器152掉落。前面掉落的种子60c(种子60c通过使得铁基涂料158被吸引到磁体156C上的磁性吸引的作用而固定到磁体156C)朝着激光器16的激光束132旋转。种子60D处于测试位置并且通过激光束132去除组织。已处理的种子60E朝着刮刀162移动。通过刮刀162把种子60F从它的磁体156F敲掉。因此,系统150类似地使单个种子与别的种子彼此分离和隔离,并使用组织去除工具。另外,即使没有诸如凹槽或泡的容器,每个种子也非常均匀地定位。事实上,通过把磁性涂料158(例如,可从11?Hawthorn?Parkway,?Vernon?Hills,?IL?60061?USA的Rust-olcum商购获得的磁性引物涂料或者可从Kling?Magnetics,?PO?Box?348?343?Rt.?295-Chatham,?NY?12037?USA商购获得的磁性墙壁涂料)放置在每个种子60上的相同位置(这里,在它的冠部上),系统150大体上均匀地定位每个种子。它能够更均匀地并且自动地相对于激光束132沿相同的大体方向使每个种子60定向。在2007年11月13日提交的序列号为11/939,402的美国申请中能够找到关于像系统150的系统的进一步的细节,该申请已转让给本申请的所有者并且其全部内容包含于此以资参考。该包含于此以资参考的申请公开了应用于种子的外部的一部分上的金属或铁磁材料的运用。种子能够随后被自动吸引到(永磁体或电磁体的)的磁场。根据种子上的磁性涂料的位置,种子能够自动地沿预定方向定位。这将会允许该组合用于相对于组织去除工具定位并固定种子。

    系统150还能够使用自动化的种子填充器或运动系统按照有序的方式移动种子填充滑槽110B,从而使得在激光处理之后种子60被放入到托盘或泡包装100B的各凹槽或泡中(参见种子60A-F如何顺序地按照行和列的形式终止地进行存放)。另一方面,自动化的电动定位器或运动控制器能够以这种有序的方式相对于滑槽110B移动托盘100B。

    能够编程并且自动化的种子填充器或其它类似的种子或颗粒处理部件能够从多个供货商获得,包括Mangelegg?58?CH-6430?Schwyz,?Switzerland的Elmor?Angewandt?Elektronik的ElmorTM产品。这种机器能够每次掉落一个种子、或者顺序地填充多凹槽容器(像是多凹槽板18或多泡起泡或泡包装)。其它类型的小颗粒处理器或传送带能够用于移动、分离、转移或以其它方式处理单个种子。这种机器的另一来源是Visser?International?Trade&Engineering?B.V.,P.O.?box?5103,3295?ZG’s-Gravendeel,?The?Netherlands的填充器和包装器(包括用于种子的)。

    虽然图18中的系统150图示出使用激光器切下每个种子的薄片或一部分,但通过适当设置和控制,系统150能够用于仅烧蚀或去除少量的表面组织,如参照系统10所述。这将会需要当种子60处于激光束路径时轮子154至少暂时地停止,并且激光束132在种子60的整个一侧上进行光栅扫描。

    3.自动化处理

    可商购获得的装备能够用于使得所述系统10的许多功能为自动化或半自动化的。例子如下。

    如图3中所示,板或其它种子支架18能够在激光器16的移动的范围中位于底座12上。在这个例子中,板18包含九十六个分隔开的凹槽40,每个凹槽40确定尺寸以容纳单个玉米粒60。

    已发现利用系统10能够以自动化的方式相对较快速地完成多个种子(这里,96个)。然而,由于利用激光能量执行种子的烧蚀,所以如何把每个种子提供给激光束并非无关紧要的琐事。类似地,对于可能用于组织去除的其它力(例如,喷水、磨削)也存在复杂性。

    底座12(平台、工作台等)支撑着框架14,框架14继而支撑着自动化的组织去除工具。在图3中,该工具是可编程地经由一种XYZ定位器系统20或其它电动定位装置或系统而可移动的激光器16。

    能够使用可商购获得的各种电动定位器中的任意定位器。图3以图表方式图示出可移动的轨道22能够通过计算机控制的电机24沿框架14的顶部移动?;埽╟arriage)26能够通过计算机控制的电机28在轨道22上移动。激光器16能够在滑架30上相对于板18的顶表面上下移动,通过电机32对此进行计算机控制?;?0在附连到滑架26的臂上移动。如图3中所示,这允许实现激光器16相对于板18发生移动的多个自由度。相对于种子支架发生的组织去除工具的三维移动的方法能够有所不同。种子支架能够相对于激光器移动,或者二者能够相对于彼此移动。

    控制器36(诸如,可商购获得的控制器)能够与计算机38通信。计算机38包括允许用户对XYZ定位器20和相应的激光器16相对于板18中的每个凹槽40的移动进行编程的软件??刂破?6将会通过会控制电机24、28和32的接线盒34中的某种电源来执行该程序,以非常准确地定位激光器16及其光束32,并在种子上移动光束。以这种方法,能够完成96个凹槽托盘18的每个凹槽40中的单个种子的自动化的激光烧蚀、而无需手工劳动或控制。

    具有可编程控制的定位器系统的例子可从Synrad获得并且由诸如以下公司制造:New?Hyde?Park,?New?York?USA的Techno?Inc.;Shirley,?New?York?USA的Anorad?Corp;和Pittsburgh,?PA?USA的Aerotech,?Inc。

    其它自动化的例子将会包括如前所讨论的种子填充器。它能够用于移动单个种子并把该种子掉落到种子支架的指定凹槽、泡或指定位置。

    另外,装备能够用于在已去除组织之后把种子从凹槽、泡或其它位置移动到指定位置。一个例子将会是对每个种子60使用磁性带或其它磁性涂料或附着物,如以上参照图18所述,以允许每个种子在各位置之间的自动化移动。电磁体或其它磁化物体能够用于从一批种子60拾取单个种子60,把这些单个种子移动到单个凹槽40上方的位置,然后把这些种子存放到凹槽40中。通过反向过程,在烧蚀之后,系统能够把种子抓出每个凹槽并且把种子移动到另一地点。另一例子将会是真空系统,诸如利用普通技术人员的技能能够开发的真空系统,该真空系统能够用于从一批种子拉出种子,分离种子,把种子存放到凹槽40中,然后在适当时间去除种子。

    另外,种子支架(诸如,板18或起泡包装100、或具有凹槽或腔的其它种子支架)能够用于在分离、隔离和固定种子以由组织去除工具进行操作之外的另外的功能。凹槽40、泡102等也能够用作检验器皿。一个例子是:在组织去除之后,用于聚合酶链式反应(PCR)的液体混合物能够直接放入到凹槽40或泡102中。该反应能够发生,并且能够对其进行分析以针对诸如本领域技术人员公知的各种数据中的任何数据。这避免了必须移动和跟踪多个种子的身份。这种原地种子特异分析能够高效地并且在相对较高的多样本的吞吐量的情况下发生。分析的结果能够与每个种子的身份相关联地记录下来(例如,记录在数据库中或以其它方式记录)。这些结果能够随后以许多方式使用。

    自动化的液体处理装备也能够用于按照受控、编程的方式移动液体或液体混合物或悬浮液。例子是上述液体PCR分析。液体可用于例如组织去除之后种子的其它测试。这种液体处理装备可商购获得并且在实验室设置中广泛使用。例子是来自PerkinElmer?Life?And?Analytical?Sciences,?Inc.,?940?Winter?Street,?Waltham,?Massachusetts?02451?USA的自动化液体处理系统。

    如图3中所示,计算机38不仅能够用于方便自动化处理装备的编程,还能够用于记录和存储关于对种子执行的组织去除和/或任何种子特异分析的信息。

    其它处理部件能够包括一种用于跟踪样本或样本集的身份的子系统。条形码或其它机器可读标签或标记(例如,RF标记)能够安装在包括种子的任何容器、托架、托盘或板上。这将会允许保持样本与原始身份信息的关联。

    4.操作

    为了图3的系统10的高效、高吞吐量操作,单个玉米粒60存放在板18的每个凹槽40中。图6A图示出用于这样操作的一种可能的方法。具有96个透明塑料泡102的起泡包装100能够包含已知来源或身份的种子。剥离粘接盖(未示出)能够把种子包含在每个泡102中,即使当起泡包装100颠倒时也是如此。能够把起泡包装100带到烧蚀板18,去除剥离盖,并且颠倒和放置板18,从而使得每个凹槽40与泡102对齐。泡包装100和板18的组合能够翻转并且泡包装100的96个种子中的每个种子将会掉落到相应凹槽40和板18中。板18能够随后放置到底座12上的参考位置。在烧蚀之后,相反的过程能够用于把种子放回到泡包装100的泡102中,以根据需要传送到下一步骤。

    图6B显示另一系统。种子导管110能够与种子分离器112连通。该组合能够沿能够与凹槽40对齐的导管110传送单个种子。导管110能够移动到下一凹槽40并且传送下一个种子,等等。托盘或种子填充器可商购获得。例子已在前面给出。

    存在把种子放到凹槽40中的其它方法。一种方法是简单地手工把种子放到每个凹槽40中。这可能是优选的,因为用户能够确保种子在凹槽40中居中,并且玉米粒的平坦宽侧基本上相对于开放顶部朝上并被放入到凹槽40中。如前所述,板18能够有意地制造为针对每个凹槽40具有锥形底部58以帮助使玉米粒60在凹槽40中居中,因为这种凹槽的几何形状促进玉米种子以宽的平坦侧朝上的方式平放。

    一旦单个种子60在每个凹槽40中、并且板18在系统10的底座12上处于它的参考位置,控制器36将会利用激光器16开始烧蚀处理以从种子去除特定组织。

    如图7中所示,控制器36能够包括允许用户设计每个凹槽40的烧蚀图案的PC?38上的软件。PC?38上的计算机显示器124能够显示每个凹槽40的中心。用户能够指定或设计出关于凹槽40的特定烧蚀图案。如图7中所示,图案在水平平面中能够是矩形的(见附图标记122)。矩形图案122的尺寸能够被选择,并且甚至能够显示在计算机屏幕124上。用户还能够选择功率水平、颜色、调制和其它相关工作参数以控制如何在每个种子中烧蚀、切削、蚀刻或以其它方式形成该矩形形状以及深度。

    能够理解,利用激光器16可以实现各种图案。图8A和8B以及9A-C图示出可能的形状的一个例子。

    在这个例子中,利用光学装置130构造激光器16以产生具有0.0005切削宽度(在1/4英寸焦距处)的激光束132。形状122的尺寸是0.2平方英寸。如图8B中所示,对控制器36编程,从而使得激光束132在玉米粒60的表面上来回扫描以烧蚀或去除组织来制造出该形状。如图8B中所示,该激光束将会从形状122的一侧到另一侧切削0.0005的第一行(swath)92A。它随后将会沿稍微不同的路径返回(附图标记96B)。它将会来回扫描,逐渐蚀刻或烧蚀另外的材料、但保持矩形形状122直至到达最后深度。图8B图示出直线形路径92A到92H。实际上,存在大约30到40次扫描以完成切削出呈图7的编程形状的腔80。

    在这个例子中,仅烧蚀足够的组织以露出玉米粒中的下面相关组织或结构。通过以相对较快速的方式扫描激光束,完成种子组织的烧蚀、而没有实质不利地影响发芽生活力的过多加热或其它条件。自动化系统10能够允许以这种方式顺序烧蚀九十六个不同种子、而没有任何人力步骤。

    图8A以图表方式图示出直角棱柱形的腔80但未按照比例绘制。激光按照该形状从种子60烧蚀材料以去除外果皮并露出内部组织。这可以是胚乳。它可以是胚胎。在任何情况下,该过程能够构造为不实质影响玉米种子60的发芽的生活力。图9B和9C显示出由激光器16为该种子产生的腔80的另外的示图。

    应该理解,激光器16产生腔80的确切方式能够变化。光束132能够利用XYZ定位器来回移动,诸如图1中所示。另一方面,可存在光学方法来改变光束132的角度,或产生光束的来回扫描切削动作。

    一旦完成了板18的参考A1位置处的凹槽40中的种子60(见图4A)的激光烧蚀,激光器16将会由控制器36移动到板18的位置A2处的凹槽40上方的参考位置,并且将会执行针对该凹槽和种子的用以蚀刻形状122的激光烧蚀过程。一旦完成,激光器16将会移动到位置A3等等直至行1完成。它将会随后开始于下一行并且继续进行直至完成96个位置。

    应该理解,目标通常是去除足够的材料以获得对种子60的特定内部组织的合理接触。为了这些目的,烧蚀的区域不必绝对居中于种子60的一侧、或者它不必精确到某一深度。通过经验测试和调整、以及每个凹槽40中种子60的相对一致的定位(也就是说,尽可能一致地定位于凹槽40的中心),把激光器编程用来切削以凹槽40的中心而居中的形状122通常导致了烧蚀足够材料以获得对所希望的内部组织的合理接触。

    形状122的编程在很多系统中并不复杂。商业系统通常允许选择形状、并把形状显示在随后传送给控制器36的打印文件中。PC?38或控制器36处的合适的模板或图形用户界面(GUI)允许调整腔40的形状、面积和深度。

    图10A-C和图14A-C仅被包括以用于给出烧蚀的形状和深度能够如何变化的另外一些例子。如图10A-C中所示,在种子60的表面的顶部附近的第一较大直角棱柱腔能够产生为第一深度。较小面积的直角棱柱形能够随后蚀刻到较低深度。此外的第三种更小的直角棱柱能够蚀刻到更低深度。这产生了一种楼梯台阶型腔80B。图11A-C显示能够在种子中蚀刻两个矩形通道,较小通道与较大通道分隔开并且在较大通道里面。图12A-C图示出在胚胎上方去除矩形区域。图13A-C和14A-C显示出图案可以不是矩形,例如为圆形。当然,可以采用更复杂的形状。

    激光束的高灵活性能够产生几乎不受限制的数量的形状和深度的腔。这些形状也能够设计为非破坏性地去除组织以露出关注的下面种子组织。因为激光能够具有这种相对较窄的束宽,所以该系统允许光束相对于正被烧蚀的颗?;蛭锲返姆浅W既泛臀⑿〉亩ㄎ?。光束的光栅扫描允许对切削的最后深度实现渐进而精确的控制??裳〉?,能够把光束引导到物品或种子的非常特定的部分。例如,对于玉米粒,能够把激光烧蚀编程为用以:去除在一端位于尖冠或在尖冠附近的组织、或者去除就在另一端或者它们之间的某处附近的组织。也可以实现基于向量的激光束控制?;谙蛄康囊贫嫱及傅南吆颓?。

    一旦已烧蚀所有96个种子,它们如所希望的那样准备好进行测试以获得关于种子的信息。例如,各种遗传测试过程或检验能够用于识别存在于种子中的遗传物质。通过对种子的直接测试,植物研究者能够因此快速确定是希望种子继续用于植物培育或繁殖试验、还是用于商业生产。

    种子组织的特定部分的去除、或剩余种子部分的露出部分的使用能够被用于特定实验室检验,这可以包括直接DNA、RNA、脂质或蛋白质隔离。因此,这个实施例能够用于植物繁殖过程,其中能够直接从种子相对较快速地采集到对用于在温室的土地中发芽到成熟的具有所希望性状或特性的种子的识别。遗传分析测试的例子阐述于美国专利6,472,185和6,368,806中,其全部内容包含于此以资参考。

    如本领域所公知,通过各种技术能够在整个这种过程中已知并保持每个种子的身份及其历史。例如,在起泡包装例子中,在图6A中,条形码108或其它机器可读标签能够应用于起泡包装100,所述条形码108或其它机器可读标签使用行列索引字母/数字来在逐个凹槽的基础上识别关于起泡包装中的种子的来源和必要信息。通过在起泡包装中在板18中把每个种子保持在它的相应行列位置、并且把种子放回到起泡包装100或放入到某一其它96个凹槽托盘中,能够保持每个种子的身份。这将会允许了解具有关注的基因的种子,并且通过记录阵列的96个位置中的位置来保持它们的身份。

    E.特定例子2(图15-17)

    替代于或者在一些情况下除了去除组织以获得对候选种子的内部的接触之外,能够收集并测试或分析去除的组织(或者它的一部分)。这些测试或分析能够用于做出选择决定。

    图15以图表形式显示特定例子。它类似于图1但具有下面的主要差别。

    图15的方法400使用某一组织去除工具或方法402从候选种子401A去除特定组织。种子401A能够位于某一支架部件或位置405。在收集容器403中收集去除的组织(或者它的一部分)。对收集的去除的组织执行种子特异分析(附图标记406)。结果用于(步骤407))做出决定(例如,选择或者不选择该类型的种子401A用于进一步使用)??裳〉?,测试结果和/或决定能够由计算机408存储或使用。

    应该理解,例子1或2能够至少部分地自动化。但是,任一例子也能够适应于快速、本地样本收集和分析。例如,一种便携式激光装置能够被带到实验生长地。来自生长的玉米植物中的候选种子能够被去除、放在单个凹槽40中、并且进行激光烧蚀。能够把合适的溶液加入到凹槽40中的烧蚀的种子,把DNA提取到溶液中,去除溶液并且在遗传方面或者在其它方面进行评估?;蛘?,通过激光烧蚀去除的组织能够被放入到合适的溶液中或者进行其它检验,并且在遗传方面以其它方式评估。这些评估能够用于决定出关于获取候选种子的植物的生长地点。这避免了把样本带回到遥远的实验室和运输的开销以及跟踪哪个植物与哪个种子关联。

    图16和17图示出如何能够为了分析而收集从候选种子去除的组织的一个例子。由激光器16烧蚀种子70,诸如例子1中所讨论的那样。由激光烧蚀产生的细?;蛐】帕5难涛?在常常漂浮在空中的意义上,像烟雾)将会与种子60分开。有时它们重新形成并盖在凹槽40的侧面。这需要在每个烧蚀过程之后清洁所述板18。真空罩或头140(例如,透明塑料)能够安装在光学装置或激光器16上。它能够在凹槽40中的种子60的烧蚀期间在凹槽40上方随激光器16一起降低。通过使用穿过真空管144有效连通到真空142的真空罩140,能够基本上去除这些细粒(如果没有没有全部去除的话)以消除这个问题。

    另一方面,经由真空或以其它方式收集细小颗粒能够导致收集足够的用于测试的材料、而非测试所述种子。这将会需要激光烧蚀用于测试的关注的组织。例如,如果仅希望测试果皮,则能够控制激光器仅烧蚀果皮。去除的果皮颗粒能够通过真空被收集,然后进行测试。另一方面,如果希望测试胚乳,则激光器能够烧蚀果皮,能够忽略或去除掉所去除的果皮颗粒,然后激光器能够烧蚀露出的胚乳,它能够通过例如真空而被收集到容器中。通过去除胚胎上方的果皮、随后激光烧蚀露出的胚胎并且对胚胎颗粒进行真空收集,则能够收集胚胎组织。

    图16以简化形式图示出单个候选种子的激光烧蚀和真空收集。密封件或垫圈141会把密封罩140密封到包围着固定住种子70的凹槽40的表面。将会操作激光器16以使激光束132烧蚀种子70。真空源142(例如,真空泵)会工作以使细小颗粒从凹槽40移动到容器146中而把种子70留在适当位置。能够移除容器146并且测试所收集的来自种子70的颗粒。

    真空系统的例子包括能够去除和/或收集细粒的各种可商购获得的颗粒过滤系统或烟尘处理器??帕L崛∽氨缚纱又钊鏞ld?Saybrook,?CT?USA的AER和Kennesaw,?VA?USA的Fumex的公司商购获得。这种装备通常用在用于呈单独或组合形式的雾、灰尘、烟、烟尘和气体/蒸汽污染物的工业空气过滤/空气污染控制系统中。该系统能够包括盒式和袋式灰尘/烟尘收集器、湿灰尘收集器、静电除尘器、介质过滤系统和其它部件。

    图17图示出具有多个凹槽40的托盘能够与图16的真空提取激光烧蚀系统一起使用。这将会有助于进行对从多个候选种子去除的经烧蚀的组织的高效真空收集。

    真空收集的替换方案将会是把凝胶物质加入到每个凹槽40。凝胶将会透射激光束。激光烧蚀所导致的细粒常?;嵊赡菏占⑶倚≡谀褐?。如果使用凝胶,则可能不得不调整激光器(能够通过经验测试完成)以使用更深的切削功率??梢蕴崛?、收集并检验凝胶中收集的细粒。为了产生用于一些测试的足够量的细粒,与仅去除足够组织以露出内部组织的情况相比,激光器或者其它组织去除工具可能必须去除更多组织。

    F.选择和替换方案

    应该理解,本发明能够采用许多形式和实施例。本文详细描述的实施例仅为示例而非限制。对于本领域技术人员而言显而易见的变型被包括在本发明内。然而,以下提供选择、替换方案和变型的一些另外的例子。

    1.种子的类型

    以上描述的系统和方法能够以类似的方式应用于除玉米种子之外的种子??赡苄枰械髡?,这落在本领域技术人员的技能的范围内。

    2.组织去除工具的类型

    如前面所讨论,候选种子的组织去除能够通过不同方法或部件(统称为“工具”)来完成。激光器是这样一种工具。它能够用在一种模式中以产生小的颗粒。在另一模式中,它能够用于切下种子的一片(例如,参见图18和2007年11月13日提交的序列号为11/939,402的申请中显示和描述的类似结构的相关描述,该申请已转让给本申请的所有者并且其全部内容包含于此以资参考)。

    前面已提及其它组织去除工具。序列号为11/939,402的申请包括另外的细节和例子。

    3.种子的分析的类型

    能够对种子执行多种检验。前面已给出一些例子。一个例子是:在种子60被烧蚀或者去除组织或露出组织之后,能够把检验溶液直接放入凹槽40中。能够提取该溶液并且执行测试以识别关注的遗传物质。能够从凹槽排出溶液并且种子移动到托架或包装以准备用于进一步使用。另一方面,识别为具有关注的基因的种子能够被从它们在板18的阵列中的关联位置移除,并且丢弃剩余种子。另一替换方案是:在烧蚀之后,把种子60移动到能够执行检验的另一容器。另外类型的测试能够包括但不限于在细胞、分子或纳米级水平上的遗传、物理或化学分析。一些非限制性例子是:

    a.光谱分析;

    b.遗传分析;

    c.各种核苷酸提取和指纹识别(例如,DNA、RNA隔离);

    d.蛋白质和脂质隔离;

    e.表型;

    f.性状或特性识别;

    g.遗传标记辅助的识别和选择;

    h.高吞吐量筛选。

    本领域技术人员熟悉能够对生物组织执行的、并且针对种子在做出研发决定以及商业生产决定方面所希望或所需的分析的类型。

    遗传分析测试的一些例子如下。通过本领域中完善建立的方法能够检测与种群的成员之间的遗传多态性对应的标记。这些方法包括例如基于PCR的序列特异扩增方法、限制片段长度多态性(RFLP)的检测、同工酶标记、等位基因特异杂交(ASH)的检测、植物基因组的扩增可变序列的检测、自我维持的序列复制的检测、简单序列重复(SSR)的检测、单核苷酸多态性(SNP)的检测、或者扩增片段长度多态性(AFLP)的检测。存在其它方法?;勾嬖谡攵晕锢砘蚧宰吹亩嘀址治霾⑶夷芄皇褂谜庑┓治?。

    仅提到了种子或种子组织分析的一些方法。其它方法对于本领域技术人员而言是已知的。能够分析种子的样本部分,或者分析获取样本的种子的剩余部分。样本可以是单片或者多片。它甚至可以是多个小的颗粒。一个例子是例如当激光烧蚀种子时产生的所谓碎片。如以上所讨论,碎片散布在小的颗粒中,并且可能像灰尘或烟的烟雾。能够收集碎片以进行分析。实时荧光分析是一种用来检测某些基因的存在的例子。收集激光烧蚀的种子碎片的另一例子是使用胶带,胶带的粘接侧位于种子上方并面向种子。激光能够穿过胶带或者在胶带周围经过,烧蚀种子,并导致碎片的烟雾升起。碎片将会粘到胶带。实时荧光分析能够用于分析胶带上的碎片。

    另一种选择是分析已被烧蚀的种子。例如,激光烧蚀能够去除碎片以留下具有腔的种子(例如,参见图12A-C)。能够把合适的溶液加入到腔中以把种子的遗传物质提取到溶液中。例如,为了指示一个基因或多个基因的存在,能够分析该溶液。

    a.种子分析的应用类型

    测试的应用的例子包括但不限于诸如以下的情况:

    a.用于性状或特性的植物繁殖过程;

    b.DNA或非DNA识别;

    c.用于随后在土地或温室中发芽到成熟的具有所希望性状或特性的种子的识别

    d.基于所希望性状的存在或不存在的选择

    e.基于遗传标记的存在或不存在的选择

    来自测试种子的信息的使用阐述于美国专利No.?7,227,065中,其内容包含于此以资参考。例如如下。

    除了表型观测之外,还能够检查植物的基因型。植物的基因型能够用于识别相同品种或相关品种的植物。例如,基因型能够用于确定植物的谱系。针对植物基因型的分析、比较和特征描述存在许多可用的基于实验室的技术;在这些技术之中包括同工酶电泳、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹识别(DAF)、特征序列扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)(也称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。

    如Lee,?M.,?“Inbred?Lines?of?Maize?and?Their?Molecular?Markers,”?The?Maize?Handbook,?(Springer-Verlag,?New?York,?Inc.?1994,?at?423-432)(其内容包含于此以资参考)中所讨论的同工酶电泳和RFLP已广泛用于确定遗传组成。同工酶电泳具有相对较低数量的可用标记和低数量的等位变异体。RFLP允许更好地辨别,因为它们在玉蜀黍中具有较高程度的等位基因变异,并且能够找到较大数量的标记。在Smith?et?al.,?“An?evaluation?of?the?utility?of?SSR?loci?as?molecular?markers?in?maize?(Zea?mays?L.):?comparisons?with?data?from?RFLPs?and?pedigree”,?Theoretical?and?Applied?Genetics(1997)?vol.?95?at?163-173和Pejic?etal.,?“Comparative?analysis?of?genetic?similarity?among?maize?inbreds?detected?by?RFLPs,?RAPDs,?SSRs,?and?AFLPs,”?Theoretical?and?Applied?Genetics(1998)?at?1248-1255(其内容包含于此以资参考)中讨论的SSR优于这两种方法。与RFLP相比,SSR技术更加高效而实用;与RFLP相比,通过使用SSR,能够例行地使用更多标记位点、并且能够找到每个标记位点的更多的等位基因。单核苷酸多态性也可用于识别出:本发明的独特遗传组成、以及保留住该独特遗传组成的后代品系/子代线。多种分子标记技术可以组合使用以增强总体分辨率。

    玉蜀黍DNA分子标记连锁图谱已被快速构造并且在遗传研究中广泛实现。一项这种研究描述于Boppenmaier,?et?al.,?“Comparisons?among?strains?of?inbreds?for?RFLPs”,Maize?Genetics?Cooperative?Newsletter,?65:1991,?pg.?90,其内部包含于此以资参考。

    包括通过使用诸如同工酶电泳、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹识别(DAF)、特征序列扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和简单序列重复(SSR)的技术识别的标记的分子标记可用于植物繁殖方法。

    分子标记的一种用途是数量性状位点(QTL)映射。QTL映射是已知紧密链接到对数量性状具有可测量影响的等位基因的标记的使用。繁殖过程中的选择基于累积链接到正面影响等位基因的标记和/或从植物的基因组消除链接到负面影响等位基因的标记。

    在繁殖过程中也能够使用分子标记以选择数量性状。例如,紧密链接到等位基因的标记或包含关注的实际等位基因内的序列的标记能够用于在回交育种过程期间选择包含关注的等位基因的植物。标记还能够用于选择回交亲本的基因组以及排除供方亲体的标记。使用这种过程能够最小化保留在所选择的植物中的来自供方亲体的基因组的量。它还能够用于减小回交过程中所需的回交到回交亲本的次数。分子标记在选择过程中的使用经常称为遗传标记增强选择。

    植物繁殖的目标是组合单个品种或杂种中的多种所希望的形状。对于农作物,这些性状可包括抗病抗虫性、抗热抗旱性、减少到作物成熟的时间、更大的产量和更好的农艺质量。随着很多作物的机械收割,植物特性(诸如,发芽、生根、生长率、成熟期以及株高和穗位高)的统一性很重要。传统的植物繁殖是开发新的改进的商业作物的重要工具。

    通过利用植物的授粉方法的技术繁殖农作物。如果一个花的花粉转移到同一植物的同一花或另一花,则植物进行自花授粉。当同一科或品系内的个体用于授粉时,植物进行近缘授粉。如果花粉来自不同科或品系的不同植物上的花,则植物进行异花授粉。如本文所使用的术语“异花授粉”和“异交”不包括自花授粉或近缘授粉。

    已进行自花授粉并且为很多代的类型选择的植物在几乎所有基因位点变为纯合并且产生真实遗传后代的统一种群。两种不同纯合系之间的杂交产生针对很多基因位点为杂合的杂种植物的统一种群。两个植物(每个植物在很多基因位点为杂合)的杂交将会产生在遗传方面不同并且不会统一的杂合植物的种群。

    在美国经常称为玉米的玉蜀黍(玉米)能够通过自花授粉和异花授粉两种技术繁殖。玉蜀黍在同一植株上具有分开的雄花和雌花,雄花和雌花分别位于穗上。当风把花粉从穗吹到从穗的顶部突出的穗丝时,在玉蜀黍中发生自然授粉。

    在玉米植物繁殖过程中开发杂交玉蜀黍品种的开发包括三个步骤:(1)为初始育种杂交从多种种质池选择植株;(2)从几代的育种杂交选择的植株的自交以产生各自纯育并且高度统一的一系列近交系;(3)把选择的近交系与无关的近交系杂交以产生杂种后代(F1)。在足够量的近交之后,连续的杂交后代将会仅用于增加开发的近交的种子。优选地,近交系应该在它的95或更多的位点包括纯合等位基因。

    在玉蜀黍的近交过程期间,品系的活力降低。当两种不同近交系杂交以产生杂种后代(F1)时,活力恢复。近交系的纯合性和同质性的重要结果是:只要保持近交亲本的同质性,就可以无限繁殖规定的一对儿近交系之间的杂种。一旦已识别产生优良杂种的近交系,使用这些近交亲本能够生产杂种种子的连续供给,并且随后能够从这个杂种种子供给产生杂种玉米植株。

    近交系可用于生产单交种、双交种或三交种。当两个近交系杂交以生产F1后代时产生单交种。从成对杂交的四个近交系(A×B和C×D)产生双交种,然后两个F1杂种再次杂交((A×B)×(C×D))。从三个近交系产生三交种,其中两个近交系杂交(A×B)然后获得的F1杂种与第三近交系杂交(A×B)×C。在每一情况下,来自母本的果皮组织将会是杂种种子的一部分并?;ぴ又种肿?。

    按照现在的实施情况,大规模商业玉蜀黍杂种生产需要使用某一形式的雄性不育系统,该系统控制雄性可育性或者使雄性可育性失效。在植株中控制雄性可育性的可靠方法还为改进的植株繁殖提供了机会。对于依赖某种雄性不育系统的玉蜀黍杂种的开发而言尤其如此。存在几种能够操作玉蜀黍植株以使其雄性不育的方法。这些方法包括手工或机械去雄、细胞质遗传雄性不育、核遗传雄性不育、杀配子剂等。

    经常通过包括手工或机械去雄的雄性不育系统产生杂种玉蜀黍种子。相邻两块地的两个近交品种的玉蜀黍种在地里,在花粉散落之前从近交系之一(雌性)去除带花粉的雄穗。如果存在与外来玉蜀黍花粉的充分隔离,则去雄的近交系的雌穗将会仅由另一近交系(雄性)受精,因此所获得的种子是杂种并且将会形成杂种植物。

    通过使用细胞质雄性不育(CMS)近交系能够避免费时费力的去雄过程。作为相对于细胞核的细胞质中的遗传因子的结果,CMS近交系的植株是雄性不育的,因此在回交过程期间核连锁基因不转移。因此,仅通过玉蜀黍植株中的母本继承这个特性,因为仅母本把细胞质提供给受精的种子。CMS植株利用来自并非雄性不育的另一近交系的花粉受精。来自第二近交系的花粉可以贡献使杂种植物雄性可育的基因或者可以不贡献这种基因,根据杂种的预期用途可以优选任一选择。同一混合种子、从去雄的受精的玉蜀黍产生的部分和使用CMS系统产生的部分能够混合以确保当种植杂种植物时存在足够的花粉团可用于受精。自从二十世纪五十年代以来,CMS系统已被成功使用,并且雄性不育性状例行地回交到近交系。参见Wych,?p.?585-586,1998。

    存在几种可用的导致遗传雄性不育的方法,诸如在基因组内的分开的位置的导致雄性不育的多个变异基因(公开于Brar?et?al.的美国专利No.?4,654,465和4,727,219)和染色体易位(由Patterson在美国专利No.?3,861,709和3,710,511中描述)。所提到的这些和所有专利包含于此以资参考。除了这些方法之外,Pioneer?Hi-Bred的Albertsen?et?al.的美国专利No.?5,432,068描述了一种核雄性不育的系统,该系统包括:识别雄性可育性的决定性基因;使雄性可育性的这个决定性自然基因沉默;从基本的雄性可育性基因去除自然启动子并代之以诱导型启动子;把这个基因工程基因插回到植株中;因此产生雄性不育的植株,因为诱导型启动子未“打开”,从而导致雄性可育性基因不被转录。通过下面的方式恢复可育性:诱导或“打开”启动子,这又允许导致雄性可育性的基因被转录。

    导致遗传雄性不育的这些和其它方法中的每种方法具有其自己的益处和缺点。一些其它方法使用多种方式(诸如在植株中插入编码与雄性组织特异启动子关联的细胞毒性物质)或者反义系统,在所述反义系统中识别可育性的关键基因并且把该基因的反义物质插入到植株中(参见Fabinjanski,?et?al.?EPO?89/3010153.8公开No.?329,308和作为WO?90/08828公布的PCT申请PCT/CA90/00037)。

    用于控制雄性不育的另一系统利用杀配子剂。杀配子剂不是遗传系统而是化学品的局部滴旋。这些化学品影响雄性可育性的关键细胞。这些化学品的应用仅在应用杀配子剂的生长期影响植株中的生育力(参见Carlson,?Glenn?R.,?美国专利No.?4,936,904)。杀配子剂的应用、应用的时机和基因型特异性经常限制该方法的效用并且它并非在所有情况下都合适。

    雄性不育近交系的使用仅是玉蜀黍杂种的生产中的一个因素。在玉蜀黍植株繁殖过程中玉蜀黍杂种的开发通常需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。玉蜀黍植株繁殖过程通过自交和选择所希望的基因型把两个或更多近交系或多种其它种质源的遗传背景组合到繁殖种群,从该繁殖种群开发新的近交系。杂种也能够用作植物繁殖材料源或用作源种群,从该源种群开发或获得新的玉蜀黍系。现有技术中已知并且在玉蜀黍植物繁殖过程中使用的植物繁殖技术包括但不限于轮回选择、混合选择、集团选择、回交、产生双单倍体、纯种繁育、开放授粉繁育、限制片段长度多态性增强选择、遗传标记增强选择和转化。经常使用这些技术的组合。使用如上所述的植物繁殖技术能够开发从杂种获得的近交系。新的近交系与其它近交系杂交,并且评估来自这些杂交的杂种以确定哪些杂种具有商业潜力。最早并且最传统的分析方法是观测基因型性状,但也可以使用基因型分析。在基本参考书之一也能够找到对繁殖方法的描述(例如,Allard,?Principles?of?Plant?Breeding,?1960;Simmonds,?Principles?of?Crop?Improvement,?1979;Fehr,?“Breeding?Methods?for?Cultivar?Development”,?Production?and?Uses,?2nd?ed.,?Wilcox?editor,?1987)。

    回交能够用于改进近交系和使用这些近交系产生的杂种?;亟荒芄挥糜诎烟囟ㄋM男宰创右桓鱿?供方亲体)转移到称为回交亲本的近交系(该回交亲本具有总体上良好的农艺特性但它缺少前述所希望的性状)。通过首先把回交亲本与供方亲体(非回交亲本)杂交,能够完成这种把所希望的性状转移到具有总体良好农艺特性的近交系。这次杂交的后代随后回交到回交亲本,然后在获得的后代中选择从非回交亲本转移的所希望的性状。通常在具有对所希望的性状的选择的四个或更多回交代之后,后代将会基本上包含除控制所希望的性状的基因之外的回交亲本的所有基因。但如果在选择期间使用分子标记或者优良种质用作供方亲体,则回交代的数量能够更少。最后的回交代随后自交以针对正被转移的基因给出纯育后代。

    也能够结合纯种繁育使用回交以开发新的近交系。例如,能够产生F1,F1回交到它的亲系之一以产生BC1。对后代进行自交并选择后代,从而新开发的近交系具有回交亲本的许多属性并且还具有非回交亲本的几个所希望的属性。

    轮回选择是在植物繁殖过程中用于改进植物的种群的方法。该方法需要各植株彼此异花授粉以形成随后种植的后代。随后通过任何数量的方法选择优良后代,包括个体植株、半同胞后代、全同胞后代、自交后代和顶交。选择的后代彼此异花授粉以形成另一种群的后代。种植这个种群并且再次选择优良植株彼此异花授粉。轮回选择是循环过程,因此能够根据需要多次重复。轮回选择的目的在于改进种群的性状。改进的种群能够随后用作用于获得杂种中使用的近交系的繁殖材料源或者用作用于综合品种的亲本。综合品种是通过几个选择的近交系的互交形成的获得的后代。当混合选择结合本申请前面讨论的分子标记增强选择使用时,混合选择很有用。

    双单倍体的生产也能够用于繁殖过程中近交系的开发。通过来自杂合植物的一组染色体(1N)的双倍产生双单倍体以产生完全纯合的个体。例如,参见Wan?et?al.,?"Efficient?Production?of?Doubled?Haploid?Plants?Through?Colchicine?Treatment?of?Anther-Derived?Maize?Callus",?Theoretical?and?Applied?Genetics,?77:889-892,?1989和美国专利申请2003/0005479。这可以是有益的,因为该过程省略了从杂合源获得纯合植物所需的自交的几代。

    已针对多种植物开发单倍体诱导系统以产生单倍体组织、植物和种子。单倍体诱导系统能够通过把选择的品系(作为雌性)与诱导系杂交从任何基因型产生单倍体植物。用于玉蜀黍的这种诱导系包括Stock?6(Coe,?1959,?Am.?Nat.?93:381-382;?Sharkar?and?Coe,?1966,?Genetics?54:453-464)、RWS(参见Geiger,?H.H.?'Application?of?the?in-vivo-haploid?induction?in?hybrid?maize?breeding',?[online],?[检索于2008-08-18].?从互联网<https://www.?uni-?hohenheim.de/%7Eipspwww/350b/indexe.html#Project3>)、KEMS(Deimling,?Roeber,?and?Geiger,?1997,?Vortr.?Pflanzenzuchtg?38:203-224)或KMS和ZMS(Chalyk,?Bylich?&?Chebotar,?1994,?MNL?68:47;?Chalyk?&?Chebotar,?2000,?Plant?Breeding?119:363-364)和不定配子体(ig)突变(Kermicle?1969?Science?166:1422-1424);其内容包含于此以资参考。

    用于获得单倍体植株的方法也公开于Kobayashi,?M.?et?al.,?Journ,?of?Heredity?71(1):9?14,1980,?Pollacsek,?M.,?Agronomie?(Paris)?12(3):247-251,?1992;?Cho-Un-Haing?et?al,?Journ.?of?Plant?Biol,?1996,?39(3):?185-?188;?Verdoodt,?L.,?et?al.,?February?1998,?96(2):294-300;?Genetic?Manipulation?in?Plant?Breeding,?Proceedings?International?Symposium?Organized?by?EUCARPIA,?Sep.?8-13,?1985,?Berlin,?Germany;?Chalyk?et?al.,?1994,?Maize?Genet?Coop.?Newsletter?68:47;?Chalyk,?S.?T.,?1999,?Maize?Genet.?Coop.?Newsletter?73:53-54;?Coe,?R.?H.,?1959,?Am.?Nat.?93:381-382;?Deimling,?S.?et?al.,?1997,?Vortr.?Pflanzenzuchtg?38:203-204;?Kato,?A.,?1999,?J.?Hered.?90:276?280;?Lashermes,?P.?et?al.,?1988,?Theor.?Appl.?Genet.?76:570-572?and?76:405-410;?Tyrnov,?V.?S.?et?al.,?1984,?Dokl.?Akad.?Nauk.?SSSR?276:735-738;?Zabirova,?E.?R.?et?al.,?1996,?Kukuruza?I?Sorgo?N4,?17-19;?Aman,?M.?A.,?1978,?Indian?J.?Genet?Plant?Breed?38:452-457;?Chalyk?S.?T.,?1994,?Euphytica?79:13-18;?Chase,?S.?S.,?1952,?Agron.?J.?44:263-267;?Coe,?E.?H.,?1959,?Am.?Nat.?93:381-382;?Coe,?E.?H.,?and?Sarkar,?K.?R.,?1964?J.?Hered.?55:231-233;?Greenblatt,?I.?M.?and?Bock,?M.,?1967,?J.?Hered.?58:9-13;?Kato,?A.,?1990,?Maize?Genet.?Coop.?Newsletter?65:109-110;?Kato,?A.,?1997,?Sex.?Plant?Reprod.?10:96-100;?Nanda,?D.?K.?and?Chase,?S.?S.,?1966,?Crop?Sci.?6:213-215;?Sarkar,?K.?R.?and?Coe,?E.?H.,?1966,?Genetics?54:453-464;?Sarkar,?K.?R.?and?Coe,?E.?H.,?1971,?Crop?Sci.?11?:543-544;?Sarkar,?K.?R.?and?Sachan?J.?K.?S.,?1972,?Indian?J.?Agric.?Sci.?42:781-786;?Kermicle?J.?L.,?1969,?Mehta?Yeshwant,?M.?R.,?Genetics?and?Molecular?Biology,?September?2000,?23(3):617-622;?Tahir,?M.?S.?et?al.?Pakistan?Journal?of?Scientific?and?Industrial?Research,?August?2000,?43(4):258-261;?Rnox,?R.?E.?et?al.?Plant?Breeding,?August?2000,?119(4):289-298;?U.S.?Pat.?No.?5,639,951;其内容包含于此以资参考。

    杂种种子生产需要消除由母本产生的花粉或者使该花粉无效?;ǚ鄣牟煌耆コ蛘呶扌峁┝俗曰ㄊ诜鄣目赡?。这种疏忽导致的自花授粉的种子可能被无意地收割并与杂种种子包装在一起。此外,因为在地里父本紧挨着母本种植,所以存在这种非常低的可能性,即雄性自交的种子能够被无意地收割并与杂种种子包装在一起。一旦种植了来自杂种袋的种子,可以识别并选择这些自花授粉的植株。这些自花授粉的植株在遗传方面等同于用于产生杂种的近交系之一。虽然存在近交系被包括在杂种种子袋中的可能性,但发生率很低,因为种子公司非常仔细以避免这种情况。需要注意的是,杂种种子被销售给种植者以生产谷物和草料而非用于繁殖或种子生产。通过植物繁殖方面的熟练人员,这些意外被包括在商业杂种种子中的近交植株在与杂种比较时能够由于它们降低的活力而被识别和选择。通过近交系的针对生长和/或繁殖特性缺少活力的外表(较矮的植株高度、小雌穗尺寸、雌穗和谷粒形状、穗轴颜色或其它特性)识别近交系。

    这些自花授粉的品系的识别也能够通过分子标记分析来完成。参见“The?Identification?of?Female?Selfs?in?Hybrid?Maize:?A?Comparison?Using?Electrophoresis?and?Morphology”,?Smith,?J.S.C?and?Wych,?R:D.,?Seed?Science?and?Technology?14,?pages?1-8?(1995),其内容明确包含于此以资参考。通过这些技术,通过分析沿着基因组的各位点的等位基因组成能够核查自花授粉的品系的纯合性。这些方法允许本文公开的本发明的快速识别。另外,参见“Identification?of?Atypical?Plants?in?Hybrid?Maize?Seed?by?Postcontrol?and?Electrophoresis”?Sarca,?V.?et?al.,?Probleme?de?Genetica?Teoritica?si?Aplicata?Vol.?20(1)?pages?29-42。

    另一形式的商业杂种生产包括使用雄性不育杂种种子和雄性授粉种子的混合物。当种植时,所获得的雄性不育杂种植株由该授粉种子授粉。这种方法主要用于生产具有增强质量谷物性状(高油)的谷物,因为授粉植株中表现的预期质量谷物性状也将会表现在雄性不育杂种植物上生产的谷物中。在这种方法中,预期质量谷物性状不必通过很长的过程(诸如,相互回交选择)被包括在近交亲系中。这种方法的一种使用描述于美国专利No.?5,704,160和5,706,603中。

    在植物繁殖的技术中存在许多应该考虑的重要因素,诸如识别重要形态和生理特性的能力、为关注的基因型和表型性状设计评估技术的能力以及在新的或改进的组合中找出并利用针对所希望的性状的基因的能力。

    玉蜀黍植物繁殖过程所导致的商业玉蜀黍杂种系开发的目的在于开发新的近交系以产生杂种,该杂种组合以产生高谷物产量和优良的农艺性能。原原种的基本性状之一是产量。然而,许多其它主要农艺性状在杂种组合中很重要并且影响产量或者在其它方面在杂种组合中提供优良性能。这种性状包括收割谷物水分百分比、相对成熟度、抗茎秆断裂、抗根倒伏、谷物质量和抗病虫。另外,品系本身必须具有亲本性状的可接受性能,诸如种子产量、谷粒尺寸、花粉生产,所有这些性能影响以足够的量提供亲系的能力和杂交的质量。这些性状已显示为在遗传控制下,并且很多性状(如果不是所有性状的话)由多个基因影响。

    育种者使用多种方法帮助确定应该从分离种群选择哪些植物以及最后哪些近交系将会用于开发商业化的杂种。除了育种者使用的种质和其它技能的知识之外,选择过程的一部分取决于与统计分析的使用关联的实验设计。实验设计和统计分析用于帮助确定哪些植物、哪个科的植物以及最后哪些近交系和杂种组合针对关注的一个或多个性状显著更好或不同。实验设计方法用于估算误差从而能够更准确地确定两个近交系或两个杂种系之间的差异。统计分析包括均值的计算、变异源的统计显著性的确定和合适的方差分量的计算。习惯上使用百分之五或百分之一显著性水平确定对于给定性状发生的差异是真实的还是由于环境或实验误差所导致。植物繁殖领域的普通技术人员将会知道如何评估两个植物品种的性状以确定在由这些品种表现的两种性状之间是否存在显著差异。例如,参见Fehr,?Walt,?Principles?of?Cultivar?Development,?pages?261-286(1987),其内容包含于此以资参考。平均性状值可用于确定性状差异是否显著,优选地,在在相同环境条件下种植的植物上测量性状。

    4.可选的便携式系统

    通过使用上述处理和设备的各方面,可以把便携式激光器带到土地或温室中种植的植物,在种子或叶子在植物上的同时烧蚀种子或叶子的一小部分,收集植物的特定组织或者获得对植物的特定组织的接触,在那里分析组织或者把组织收集到与标识符关联的容器中,并且把它带回到实验室进行分析。

    5.激光雕刻以切削并且把切削的种子放到起泡包装中

    图18中公开了另一种选择。激光器16能够调整到切削模式(例如,雕刻模式),该模式能够通过合适的装置切削、分割或分开种子。这将会允许分离种子的整个片并随后收集整个片(例如,起泡包装100A的凹槽)。这能够自动化并且同步,从而能够顺序切削多个种子并且收集它们的切下的片。能够保持与获得这些片的种子的关联。一个例子是在类似索引的容器(另一起泡包装100B)中同时收集每个种子。

    6.多种子的混合分组分析(BSA)

    可以使用类似的方法和设备对多个种子执行混合分组分析(BSA)。组织去除工具能够设置为从同一凹槽(例如,板18的凹槽40)中的多个种子去除组织。随后能够通过BSA分析多个种子的组织。

    能够使用图18。能够从多个种子收集切下的片?;蛘叨喔銮邢鞯闹肿幽芄环旁谕话疾壑?。激光烧蚀能够设置为把这些多个片切成能够用于BSA的尺寸。另一方面,磨削机构能够把种子磨削成混合的细小颗粒。

    BSA的一个例子描述于S?Quarrie?et?al.,?“Bulksegregant?analysis?with?molecular?markers?and?its?use?for?improving?droughtresistance?in?maize”,?Journal?of?Experimental?Botany,?Vol?50,?1299-1306,Copyright?????????????????????????????????????????????????1999?by?Oxford?University?Press,其内容包含于此以资参考。

    7.多种子的同时取样

    可选地,能够同时对多个种子取样。一个例子是把多个种子定位在已知位置,然后同时去除或露出种子组织或每个种子的一部分。把多个种子定位在已知位置的方法被显示并描述于例如2008年12月16日提交的序列号为12/336,084的美国申请,该申请已转让给本申请的所有者并且其全部内容包含于此以资参考。一种烧蚀、去除或露出种子组织的方法是利用激光(如本文所述)。一种同时从多个种子烧蚀、去除或露出种子组织的方法是把单个激光束分成多束,其中每个激光束被控制到种子的合适位置,并且按照一定功率以及利用烧蚀或去除种子组织以产生样本(例如,用于分析的足够尺寸的种子的薄片)的其它工作特性控制每个激光束。存在许多方法为了这个目的分割激光束。在美国专利6,562,698和6,327,090中讨论了一些例子,这些专利的内容包含于此以资参考。也可以采用其它方法。

    另一方面,单个头能够包含多个激光器或者一个或多个激光束分割器,每个激光器构造为产生从种子烧蚀或去除组织的一个光束或多个光束。另外,可以存在多个头,每个头具有执行这种操作的激光器。该系统能够控制每个光束的产生和操作以及如何把每个光束引导到它的相应种子。本领域技术人员能够校准每个激光器或激光束、激光束如何定向或移动到工作位置以及用于完成多个种子的同时烧蚀或组织、薄片或样本去除的操作的特性。例如,能够用于实现这些实施例的激光器结构是被包括在激光器中的振镜头。

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