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    固定 基底 及其 制备 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980142052.X

    申请日:

    2009.10.23

    公开号:

    CN102197306A

    公开日:

    2011.09.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20091023|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; C07K17/00; C12N15/09 主分类号: G01N33/543
    申请人: 富士胶片株式会社; 国立大学法人东京大学
    发明人: 南高一; 都筑博彦; 上田宏; 伊原正喜
    地址: 日本国东京都
    优先权: 2008.10.24 JP 2008-274852; 2008.11.18 JP 2008-294527; 2009.05.13 JP 2009-117080
    专利代理机构: 中科专利商标代理有限责任公司 11021 代理人: 陈平
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980142052.X

    授权公告号:

    102197306B||||||

    法律状态公告日:

    2014.03.12|||2011.11.23|||2011.09.21

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    固定抗体片段的基底包括基底和至少一组抗体片段,其中每组抗体片段包括至少两种类型的分开的抗体片段,所述至少两种类型的分开的抗体片段能够识别一种类型的抗原并且以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。

    权利要求书

    1.一种固定抗体片段的基底,包括基底和至少一组抗体片段,其中每组抗体片段包括至少两种类型的分开的抗体片段,所述至少两种类型的分开的抗体片段能够识别一种类型的抗原并且以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。2.根据权利要求1所述的固定抗体片段的基底,其中所述至少两种类型的抗体片段包括VH-区多肽和VL-区多肽。3.根据权利要求1或2所述的固定抗体片段的基底,还包括聚合物层并且所述至少两种类型的抗体片段被固定在所述聚合物层上。4.根据权利要求3所述的固定抗体片段的基底,其中所述聚合物层的厚度为1nm至0.5mm。5.根据权利要求3或4所述的固定抗体片段的基底,其中所述聚合物层通过自组装单分子层结合至所述基底上。6.根据权利要求5所述的固定抗体片段的基底,其中所述自组装单分子层的厚度为0.2nm至10μm。7.根据权利要求1-6中任一项所述的固定抗体片段的基底,其用于基于所述至少两种类型的抗体片段和所述抗原之间的结合反应的生物反应器或生物传感器。8.根据权利要求1-7中任一项所述的固定抗体片段的基底,其用于表面等离子共振分析。9.一种制备固定抗体片段的基底的方法,包括:使能够识别一种类型的抗原的至少两种类型的分开的抗体片段与所述抗原接触以形成复合物,由此每种所述抗体片段与所述抗原结合;使所述复合物经由所述复合物中的所述抗体片段固定在基底上;以及从所述复合物中去除所述抗原,获得所述固定抗体片段的基底,其中所述抗体片段以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许每种所述抗体片段结合相同的所述抗原。10.根据权利要求9所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中所述至少两种类型的抗体片段包括VH-区多肽和VL-区多肽。11.根据权利要求9或10所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中所述接触包括:混合所述抗体片段和所述抗原,使得抗原的数目与由抗体片段的组合形成的分子价的比率为0.1∶1至10∶1。12.根据权利要求9-11中任一项所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中在减小所述复合物中所述抗体片段和所述抗原的亲和力的条件下进行所述去除。

    说明书

    固定化基底及其制备方法

    技术领域

    本发明涉及固定化基底和制备所述固定化基底的方法。

    背景技术

    最近,在临床检验等中正在进行利用诸如免疫反应的分子间相互作用的大量测量。在这些中,优选使用的几种技术不需要复杂的操作或标记物质,但能够以高灵敏度检测测试物质的结合量变化。此类技术的实例包括表面等离子共振(SPR)测量技术,石英晶体微天平(QCM)测量技术,和使用功能表面的测量技术,所述功能表面的范围从胶体金颗粒至超微颗粒。在这些技术中的任一种中,其上固定有待测量物质的表面是重要的。以下,表面等离子共振(SPR)测量技术将作为实例进行描述。

    通常,用于测量靶物质的测量芯片包括其中蒸镀金属膜和具有能够固定靶物质的官能团的薄膜以此顺序在透明基底(例如,玻璃)上形成的芯片。靶物质经所述官能团固定在所述金属膜的表面上。通过测量所述靶物质和测试物质之间的特异性结合反应来分析物质之间的相互作用。

    然而,靶物质和测试物质之间的相互作用仅当存在促进所述靶物质和所述测试物质之间的相互作用的物质时发生,此相互作用不能通过上述方法直接检测到。为了检测所述靶物质和所述测试物质之间的此相互作用,需要将所述测试物质和辅助物质同时提供至所述靶物质,使得该辅助物质与所述测试物质或所述靶物质接触。为此,不仅需要大量的辅助物质,而且如果难以获得所述辅助物质则测量成本将受到影响。

    另外,由于辅助物质、测试物质和靶物质需要彼此靠近地定位,因此也存在着反应效率下降的问题。

    此外,辅助物质不仅包括本身与靶物质不相互作用的物质,而且包括的确与靶物质相互作用的物质。为此,在所述辅助物质与靶物质相互作用的情况下,还存在着难以检测所述靶物质和所述测试物质之间的精确相互作用的问题。

    为了解决这些问题,例如,JOURNAL?OF?MOLECULARRECOGNITION(分子识别杂志)1999,第12卷,第316-321页公开了一种制备和固定IL-12受体复合物的方法,其中IL-2受体亚基的细胞外结构域与卷曲螺旋(亮氨酸拉链)结构域整合在一起。此文件还公开这样的复合物显示比单独的所述亚基更高的亲和力。

    然而,在此方法中存在着所需融合物质的表达水平低的问题,这是因为需要通过重组技术引入允许受体的卷曲螺旋反应的标签。另外,还存在着卷曲螺旋反应位点抑制受体与测试物质的结合活性和此方法的通用性低的问题。

    作为采用多种分子俘获一种测试物质的技术,在日本专利号3527239和4036961和日本专利申请公开(JP-A)号2006-137805中公开了一种称为分子印记(molecular?imprinting)的技术。此分子印记是一种制备人工分子识别物质的方法,其中使用有机聚合物将靶分子固定在基底上,接着去除该靶分子,从而与该靶分子的分子形状相对应的结构被作为多孔体留下。

    然而,在分子印记中,由于抗体通过聚合作用固定在基底上,因此抗原必须穿透到交联的凝胶基质结构中以便接触抗体。因此对于抗原与抗体反应需要一定时间,从而为了使物质确实地被识别,需要高度浓缩的抗原。此外,通过洗涤去除抗原的能力和抗原在去除后再次应用时的反应性往往会下降。

    JP-ANo.10-78436公开了一种测量抗原浓度的方法,其中VH-区多肽或VL-区多肽被固定在固相上,该方法利用Fv区(抗体的识别位点)的稳定性随着与抗体的结合而变化的现象。

    发明内容

    当在靶物质、测试物质和辅助物质的存在下进行检测时,需要可以以稳定的结合性质精确地检测到一种类型的测试物质和两种或更多种类型的物质之间的相互作用的固定化基底。另外,当将固定化基底用于生物反应器或生物传感器时,从生产成本的角度来看需要具有更高通用性的制备方法。

    本发明是在考虑到上述情况下完成的。本发明提供了一种具有更高通用性的固定化基底,其可以以稳定的结合性质精确地检测到一种类型的测试物质和两种或更多种类型的物质之间的相互作用。

    本发明包括下列方面:

    <1>一种固定抗体片段的基底,包括基底和至少一组抗体片段,其中每组抗体片段包括至少两种类型的分开的抗体片段,所述至少两种类型的分开的抗体片段能够识别一种类型的抗原并且以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。

    <2>根据<1>所述的固定抗体片段的基底,其中所述至少两种类型的抗体片段包括VH-区多肽和VL-区多肽。

    <3>根据<1>或<2>所述的固定抗体片段的基底,还包括聚合物层并且所述至少两种类型的抗体片段固定在所述聚合物层上。

    <4>根据<1>所述的固定抗体片段的基底,其中所述聚合物层的厚度为1nm至0.5mm。

    <5>根据<3>或<4>所述的固定抗体片段的基底,其中所述聚合物层通过自组装单分子层结合至所述基底。

    <6>根据<5>所述的固定抗体片段的基底,其中所述自组装单分子层的厚度为0.2nm至10μm。

    <7>根据<1>-<6>中任一项所述的固定抗体片段的基底,其用于基于所述至少两种类型的抗体片段和所述抗原之间的结合反应的生物反应器或生物传感器。

    <8>根据<1>-<7>中任一项所述的固定抗体片段的基底,其用于表面等离子共振分析。

    <9>一种制备固定抗体片段的基底的方法,包括:

    使能够识别一种类型抗原的至少两种类型的分开的抗体片段与所述抗原接触以形成复合物,从而使每种所述抗体片段结合所述抗原;

    使所述复合物经由所述复合物中的所述抗体片段固定在基底上;以及

    从所述复合物中去除所述抗原,以获得所述固定抗体片段的基底,其中所述抗体片段以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许每种所述抗体片段结合相同的所述抗原。

    <10>根据<9>所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中所述至少两种类型的抗体片段包括VH-区多肽和VL-区多肽。

    <11>根据<9>或<10>所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中所述接触包括混合所述抗体片段和所述抗原,使得抗原的数目与由抗体片段组合形成的分子价的比率为0.1∶1至10∶1。

    <12>根据<9>-<11>中任一项所述的制备固定抗体片段的基底的方法,其中所述去除在减小所述复合物中所述抗体片段和所述抗原的亲和力的条件下进行。

    根据本发明,可以提供具有更高通用性的固定抗体片段的基底,其可以以稳定的结合性质精确地检测到一种类型的测试物质和两种或更多种类型的物质之间的相互作用。

    附图说明

    图1是图示根据本发明的固定化基底的实例的示意图。(A)表示缺少抗原时固定化基底的示意图。(B)表示存在抗原时固定化基底的示意图。

    图2是制备根据本发明中所述的实施例的表达载体的图解。

    具体实施方式

    根据本发明的固定化基底是一种固定抗体片段的基底,其包括基底和至少一组抗体片段,其中每组抗体片段包括至少两种类型的分开的抗体片段,所述抗体片段能够识别一种类型的抗原并且以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。

    在一个实施方案中,根据本发明的固定化基底是一种固定抗体片段的基底,其包括基底和至少一组抗体片段,其中每组抗体片段包括至少两种不同的分开的抗体片段,所述至少两种不同的分开的抗体片段能够识别一种抗原并且以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。例如,本发明提供了一种固定化基底,在其上能够识别一种类型的抗原的至少两种类型的分开的抗体片段以一定的位置关系被独立地固定,所述位置关系允许每种抗体片段结合所述抗原。

    更具体地,固定抗体片段的基底可以包括,例如,基底和至少一个(例如,两个或多个)抗体片段组,所述抗体片段组由能够识别一种抗原的两种或更多种不同的和分开的抗体片段组成,并且以一定的位置关系独立地固定在基底上使得所述两种或更多种抗体片段的每一种均能够结合相同的所述抗原分子或形成单个抗原携带实体的任何物质。因此,本发明的固定抗体片段的基底可以包括两个或多个这样的抗原片段组,其可以结合相同的抗原呈递实体或分别结合不同的抗原呈递实体。

    在此,“分开的抗原片段”表示彼此不(例如,通过二硫键)连接的抗体片段。

    在本发明的固定抗体片段的基底中,由于能够识别一种抗原的至少两种分开的抗体片段以一定的位置关系被独立地固定在基底上,所述位置关系允许一组中的所述至少两种分开的抗体片段结合相同的所述抗原,所以一组中的抗体片段彼此独立并且放置在基底上彼此相邻的位置处。协作地(cooperatively)识别抗原的此类抗体片段可以显示比随机固定的抗原片段更高的亲和力。另外,由于每种抗体片段以一定的位置关系独立地固定在基底上,所述位置关系允许一组中的至少两种分开的抗体片段结合相同的抗原,并且由于每个抗体片段通过抗体的一部分结合于基底,所以允许具有抗体识别位点的结构部分以可以结合抗原的程度移动。因此,当抗原存在时,一组中的每种抗原片段可以容易地接近抗原并且可以协作地与抗原结合。因此,当抗原作为测试物质存在时,至少两种类型的分开的抗体片段可以以高亲和力和高稳定性与抗原结合。

    另外,由于通过使用抗原将抗体片段固定,所以一组中的至少两种类型的抗体片段被固定在基底上相邻的位置处,即使当每一种抗体片段对抗原具有弱亲和力。此外,由于抗体片段彼此独立,所以当它们之间的亲和力弱时,抗体片段不会彼此缔合并且可以容易地彼此独立地改变它们的角度。因此,本发明的固定化基底可以应用于其中柔性是至关重要的催化反应和/或序列反应中。

    下面进一步描述本发明。

    (I)固定化基底

    (1)基底

    本发明的基底的优选实例包括其中将官能团添加至任一种下列物质上的基底:金属氧化物,诸如玻璃、二氧化硅、氧化铝、氧化钛、氧化锆和氧化铟锡(ITO);金属氮化物,诸如氮化硅、氮化镓、氮化铝和氮化铟;和合成树脂,具体地诸如琼脂糖凝胶(Sepharose)(商品名)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚碳酸酯或环烯烃聚合物的树脂。所述官能团的实例包括氨基、羧基、马来酰亚胺基、醛基、琥珀酰亚胺基、硫醇基、肼基、异氰酸酯基、环氧基、乙烯基砜基、乙烯基和氰基。

    添加这些官能团的方法的实例包括处理表面的已知方法,诸如等离子处理、臭氧处理、使用酸和/或碱的蚀刻处理,或使用自组装单分子层的方法。从生产适合性的角度来看,优选使用自组装单分子层的方法。

    形成自组装单分子层的方法的实例包括(1-1)使用硅烷偶联剂的方法和(1-2)使用烷基硫醇的方法。下面说明各种方法。

    (1-1)使用硅烷偶联剂的方法

    在使用硅烷偶联剂的方法中,通过向上述的基底提供下述的硅烷偶联剂,可以通过硅烷偶联剂形成自组装单分子层,从而向基底提供官能团。

    作为可以用于本发明中的硅烷偶联剂,由下式A-1表示的含硅化合物可以用来形成共价键,诸如基底-氧-硅-碳,从而向基底表面提供官能团。在式A-1中,Xa表示官能团;La表示接头结构部分,诸如直链、支链或环状碳链;Ra表示氢或具有1-6个碳原子的烷基;Ya表示可水解基团;m和n各自独立地表示0-3的整数,且m和n的总和为3。

    Xa-La-Si-Ram)Yan????式A-1

    可水解基团(Ya)的实例包括烷氧基、卤素基团和酰氧基。更具体地,可水解基团(Ya)的实例包括甲氧基、乙氧基和氯。

    硅烷偶联剂的具体实例包括γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨基乙基)-γ-氨基丙基三甲氧基硅烷、γ-氨基丙基甲基二乙氧基硅烷、γ-巯基丙基三甲氧基硅烷和γ-环氧丙氧丙基三乙氧基硅烷。硅烷偶联剂的反应方法的实例包括诸如在″Effects?and?usages?of?silane?coupling?agents(硅烷偶联剂的作用和使用)″(Science&Technology?Co.,Ltd.)中所述方法的一般方法。

    硅烷偶联剂的官能团(Xa)的实例不受限制,只要官能团(Xa)可以结合下面所述的聚合物和/或复合物。官能团的实例包括诸如氨基、羧基、羟基、醛基、硫醇基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、氰基、肼基、酰肼基、乙烯基砜基、乙烯基和马来酰亚胺基的官能团。也可以使用官能团或其衍生物的组合。在这些中,官能团(Xa)优选为氨基或环氧基。

    (1-2)使用烷基硫醇的方法

    在使用烷基硫醇的方法中,将金属膜布置在上述的基底的表面上,然后在其上提供烷基硫醇。在此,“布置在基底的表面上”是指金属膜布置在基底的表面上使得其与基底直接接触的情况,以及金属膜经由另一层布置而不直接接触基底的表面的情况。

    当将金属膜用于表面等离子共振生物传感器时,构成金属膜的金属不特别地受限制,只要生成表面等离子共振。金属的优选实例包括自由电子金属,诸如金、银、铜、铝和铂。在这些中,特别优选金。这些金属可以单独使用或以它们中的两种或更多种的组合使用。此外,考虑到与上述基底的可附着性,可以在基底和金属层之间提供包括铬等的中间层。

    不特别地限制金属膜的膜厚度。当将金属膜用于表面等离子共振生物传感器时,膜厚度优选为0.1nm-500nm,且更优选1nm-300nm。当膜厚度超过500nm时,不能充分地检测到介质的表面等离子现象。此外,当提供包括铬等的中间层时,中间层的厚度优选为0.1nm-10nm。

    使用烷基硫醇涂敷金属膜的方法已经由哈佛大学的Whitesides教授进行了深入的研究,并且其细节描述在例如,Chemical?Review(化学综述),105,1103-1169(2005)中。当将金用作金属时,由下式A-2(其中n表示3-20的整数,且Xb表示官能团)表示的烷基硫醇可以用作形成有机层的化合物,从而可以基于烷基链之间的Au-S键和范德华力以自组装方式形成具有一个取向的单分子膜。自组装单分子层可以通过极为容易的方法产生,该方法包括将金基底浸没在烷基硫醇衍生物的溶液中。更具体地,官能团可以提供至基底的表面,例如,通过使用其中式A-2中的Xb表示氨基、羧基、羟基、醛基、硫醇基、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、环氧基、氰基、肼基、酰肼基、乙烯基砜基、乙烯基和马来酰亚胺基的化合物形成自组装单分子层来提供。

    HS(CH2)nXb????A-2

    在式A-2中,亚烃基的重复次数n优选为3-16的整数,且更优选为4-8的整数。亚烃基结构部分可以用多个键或诸如氮或氧的杂原子来取代。当烷基硫醇衍生物的烷基链太短时,难以形成自组装单分子层。当烷基硫醇衍生物的烷基链太长时,水溶性下降并且因此难以对其进行处理。

    自组装单分子层可以用单种类型的式A-2的烷基硫醇形成,即,具有一种类型的官能团Xb的烷基硫醇。自组装单分子层也可以由两种或更多种类型的此类烷基硫醇的混合物形成。

    不特别地限制自组装单分子层的膜厚度。当将自组装单分子层用于表面等离子共振生物传感器时,膜厚度优选为0.2nm-10μm,更优选1nm-500nm,且还更优选1nm-300nm。当膜厚度为10μm以下时,测试物质可以容易地在单层中扩散。当膜厚度为0.2nm以上时,要固定在基底上的物质的固定量可能会增加。

    在本发明中,抗体片段可以直接固定于自组装单分子层。然而,为了改善抗体片段的抗原结合效率,优选在自组装单分子层上形成聚合物层以便提供用于将抗体片段固定在基底表面上的官能团。本发明中使用的聚合物优选为亲水聚合物,并且其实例包括明胶、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、角叉菜胶、海藻酸、淀粉、纤维素,或它们的衍生物,诸如羧甲基衍生物,或可吸水膨胀的有机聚合物(例如,聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙二醇和它们的衍生物)。

    可用于本发明中的亲水聚合物的优选实例包括含羧基的合成聚合物和含羧基多糖。含羧基的合成聚合物的实例包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和它们的共聚物。更多的实例包括甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸共聚物、衣康酸共聚物、巴豆酸共聚物、马来酸共聚物、部分酯化的马来酸共聚物,和其中已经添加了酸酐的含羟基聚合物,诸如,例如JP-ANo.59-53836,第3页右上栏第2行至第6页左下栏第9行,和JP-A?No.59-71048,第3页左下栏第1行至第5页左上栏第3行中公开的那些。

    含羧基多糖的实例包括选自下列的任一种:来自天然植物的提取物,通过微生物发酵获得的产物,通过酶获得的合成产物和化学合成产物。它们的具体实例包括透明质酸、硫酸软骨素、肝素、硫酸皮肤素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、纤维素糖醛酸(cellouronic?acid)、羧甲基甲壳质、羧甲基葡聚糖和羧甲基淀粉。作为含羧基多糖,也可以使用商购产品。它们的具体实例包括羧甲基葡聚糖,诸如CMD,CMD-L和CMD-D40(商品名,均由Meito?Sangyo?Co.,Ltd.制造),羧甲基纤维素钠(由Wako?Pure?ChemicalIndustries,Ltd.制造)和海藻酸钠(由Wako?Pure?Chemical?Industries,Ltd.制造)。

    不特别地限制本发明中使用的亲水聚合物的分子量。通常,重均分子量优选为2×102至5×106,且更优选为1×104至2×106。当重均分子量小于上述范围时,抗体片段在基底上的固定量可能会减小。大于上述范围的重均分子量导致高溶液粘度,从而使得其难以进行处理。

    聚合物层在水溶液中的厚度优选为1nm-0.5mm,更优选1nm-1μm,且还更优选100nm-500nm。当厚度小于上述范围时,生理活性物质的固定量变小,使得该生理活性物质与测试物质的相互作用不太可能发生。

    当膜厚度超过上述范围时,不能保持聚合物层的均匀性,并且可能抑制测试物质扩散进聚合物膜中。特别地,当从传感器基底的一侧检测到相互作用时,所述一侧与所述传感器基底的固定亲水聚合物的表面相反,由于从检测表面至形成相互作用的部分的距离长,可能导致检测灵敏度下降。

    亲水聚合物在水溶液中的厚度可以通过例如,AFM或椭圆光度法来评估。

    当使用含羧基聚合物时,复合物可以通过官能团固定在基底上,所述官能团通过活化聚合物的羧基而提供至基底表面上?;罨然酆衔锏姆椒ǖ氖道ㄒ阎椒?,例如,其中通过使用水溶性碳二亚胺诸如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化含羧基聚合物的方法,和其中通过单独使用EDC活化含羧基聚合物的方法。具有通过使用这些方法活化的羧基的聚合物可以与具有氨基的物质反应,从而将亲水聚合物附着在基底上。

    活化含羧基聚合物的方法的实例还包括使用含氮化合物的方法。含氮化合物的具体实例包括由下式(Ia)或式(Ib)表示的化合物(其中,R1和R2各自独立地表示未取代的或取代的羰基,可以具有取代基的碳原子,或可以具有取代基的氮原子;R1和R2可以彼此连接形成5元或6元环;A表示具有取代基的碳原子,或具有取代基的磷原子;M表示形成总体上(n-1)-价抗衡离子的元素;且X表示卤素原子)。

    在式(Ia)和(Ib)中,R1和R2各自独立地表示未取代的或取代的羰基,可以具有取代基的碳原子,或可以具有取代基的氮原子,并且优选R1和R2彼此连接形成5元或6元环。含氮化合物的优选实例包括羟基琥珀酰亚胺、羟基酞亚胺、1-羟基苯并三唑、3,4-二羟基-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪,和它们的衍生物。

    含氮化合物的优选实例还包括下列化合物(Ic),(Id)和(Ie)。

    含氮化合物的优选实例包括由下式(II)表示的化合物(其中,Y和Z各自独立地表示CH或氮原子)。

    由式(II)表示的化合物的优选实例包括下列化合物(II-1)至(II-3)。

    含氮化合物的优选实例还包括由下式(II-4)表示的化合物。

    含氮化合物的优选实例还包括由下式(III)表示的化合物(其中A表示具有取代基的碳原子,或具有取代基的磷原子;Y和Z各自独立地表示CH或氮原子;M表示形成总体上(n-1)-价抗衡离子的元素;且X表示卤素原子)。

    在式(III)中,由A表示的碳原子或磷原子具有的取代基优选是具有取代基的氨基。更具体地,可优选二烷基氨基,诸如二甲基氨基,或吡咯烷基。由M表示的元素的实例包括磷原子、硼原子和砷原子。在这些中,可优选磷原子。由X表示的卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。在这些中,可优选氟原子。

    由式(III)表示的含氮化合物的具体实例包括下列的化合物(III-1)至(III-6)。

    含氮化合物的优选实例还包括由下式(IV)表示的化合物(其中A表示具有取代基的碳原子,或具有取代基的磷原子;M表示形成总体上(n-1)-价抗衡离子的元素;且X表示卤素原子)。

    由式(IV)表示的含氮化合物的优选实例包括下列的化合物(IV-1)。

    活化含羧基聚合物的方法的实例还包括使用具有吸电子基团的酚衍生物的方法。吸电子基团的σ值优选为0.3以上。具有吸电子基团的酚衍生物的具体实例包括下列的化合物(V-1)至(V-4)。

    上述碳二亚胺衍生物、含氮化合物和酚衍生物中的任一种可以单独使用,或如果需要,以其两种或更多种的组合使用。优选组合使用碳二亚胺衍生物和含氮化合物。

    活化含羧基聚合物的方法的实例还包括使用下列化合物(V-6)的方法?;衔?V-6)可以单独使用,或与碳二亚胺、含氮化合物和/或酚衍生物组合使用。

    另外,活化含羧基聚合物的羧基的方法的优选实例包括诸如JP-ANo.2006-58071的段落[0011]-[0022](即,通过用选自下列的化合物活化基底表面上的羧基从而形成羧酸酰胺基的方法:具有特定结构的脲鎓盐,具有特定结构的鏻盐或具有特定结构的三嗪衍生物);和诸如JP-ANo.2006-90781的段落[0011]-[0019](即,通过使用碳二亚胺衍生物或其盐活化基底表面上的羧基,使用具有羟基的含氮芳香杂环化合物、具有吸电子基团的酚衍生物或具有硫醇基的芳香化合物将活化的基团转变成酯基,和然后将得到的酯基与胺反应,从而形成羧酸酰胺基的方法)中所述的方法。

    含有活化羧基的聚合物可以制备为聚合物溶液并且与基底反应。备选地,本发明的含有活化羧基的聚合物可以通过使用诸如旋涂法的方法以薄膜的形式在基底上形成,并且以薄膜状态与基底反应。聚合物优选以薄膜状态与基底反应。

    如上所述,本发明的聚合物优选以薄膜状态与基底反应。作为在基底上形成薄膜的方法,可以使用已知方法??梢允褂玫拇死喾椒ǖ木咛迨道费雇坎挤?、幕涂法、铸制法(casting?method)、丝网印刷法、旋涂法、喷涂法、滑珠涂布法(slide?bead?coating?method)、狭缝及旋转法(slit?and?spinmethod)、狭缝涂布法(slit?coating?method)、模铸法(die?coating?method)、浸涂法、刮刀涂布法、刮板涂布法、流涂法(flow?coating?method)、辊涂法、绕线棒控涂布法(wire-bar?coating?method)、和转印法。这些方法描述于,例如,Yuji?Harazaki撰写的″Progress?in?Coating?Technology(涂布技术进展)(Coating?Gijutsu?no?Shinpo)″,Sogo?Gijyutsu中心(1988);″CoatingTechnology(涂布技术)(Coating?Gijutsu)″技术信息研究所有限公司(Technical?Information?Institute?Co.,Ltd.)(1999);″Aqueous?CoatingTechnology(水性涂布技术)(Suisei?Coating?no?Gijutsu)″CMC(2001);″Evolving?Organic?Thin?Film:Edition?for?Deposition(进化有机薄膜:沉积版)(Shinka-suru?Yuuki?Hakumaku:Seimaku?hen)″Sumibe?Techno?Research?Co.,Ltd.(2004);和Akira?Iwamori撰写的″Polymer?Surface?ProcessingTechnology(聚合物表面加工技术)(Polymer?Hyomen?Kako?Gaku)″,GihodoShuppan?Co.,Ltd.(2005)。在本发明中,在基底上形成薄膜的方法优选是喷涂法或旋涂法,且更优选是旋涂法,因为通过该方法可以容易地产生具有可控的膜厚度的涂层。

    (2)抗体片段

    在本发明中,能够识别一种类型抗原的至少两种类型的抗体片段被固定在上述基底上。

    在此,能够识别一种类型抗原的两种或更多种类型的抗体片段可以固定在基底上,或各自由这样的抗体片段组成的多种类型的抗体片段组可以被固定在基底上。通过使用多种类型的抗体片段组,可以用一个固定化基底识别多种类型的抗原。

    不特别地限制抗原的类型,只要其可以与抗体相互作用,并且可以根据待检测的靶物质适当地选择。此外,抗体片段可以适当地选择为能够与这样的抗原相互作用的抗体。

    可以使用任何抗体,只要两种或更多种类型的抗体片段可以单独地或协作地识别和结合一种抗原。这样的多种抗体片段的实例包括:两种或更多种类型的抗体片段,所述两种或更多种类型的抗体片段中的每种具有针对一种类型抗原上的(相同的)一个表位的抗原识别位点的至少一部分;两种或更多种类型的抗体片段,所述两种或更多种类型的抗体片段中的每种具有针对一种类型抗原上的不同表位的抗原识别位点;和抗体片段,每个所述抗体片段具有针对一个表位的多个高变区的任一个。这样的多种抗体片段也可以组合使用,只要这些抗体识别一种抗原。

    从抗原结合能力的角度来看,本发明的抗体片段的优选实例包括VH-区多肽和VL-区多肽。

    VH-区多肽和VL-区多肽的长度可以分别比抗体的VH区和VL区的长度更长或更短,只要它们可以彼此联合地结合于靶抗原。这些多肽可以通过使用常规方法从通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体产生。例如,所述多肽可以如下获得。

    首先,能够识别所需测试物质的单克隆抗体通过已知方法产生。然后编码此抗体的可变区的基因通过使用cDNA文库的方法和杂交技术来确定,接着将此基因克隆到载体中。然后从此重组载体获得编码VH和/或VL区的序列,并且将此序列片段亚克隆到表达载体中。通过在宿主细胞中表达此基因,可以获得需要量的VH和/或VL。

    为了获得来自抗体基因的VH/VL编码序列,所需的序列区可以通过用限制性酶切割而分离,从而在克隆载体中扩增,或所需序列可以通过PCR扩增。当VH和/或VL在宿主细胞中表达时,编码任何报告分子的基因也可以克隆到表达载体中,并且VH和/或VL可以与报告分子表达为融合蛋白或嵌合蛋白。

    除了上述方法以外,VH和/或VL可以通过使用蛋白酶将抗体分子蛋白水解来获得。此方法具有节省基因克隆上的时间和努力的优点。

    VH-区多肽和VL-区多肽可以是与生物分子的融合产物。此融合产物具有改善稳定性的优点。

    不特别地限制可以与VH-区多肽或VL-区多肽融合的生物分子,并且其实例包括碱性磷酸酶,蛋白G,eGFP,eYFP,β-半乳糖苷酶,GST,甲壳质结合蛋白(CBP),NusA,硫氧还蛋白,DsbA,DsbC,和麦芽糖结合蛋白(MBP)。在这些当中,为了进一步增加稳定性,优选使用MBP。

    这些融合产物可以通过常规方法制备。例如,融合产物可以通过在上述基因克隆时将编码生物分子的基因结合至载体中以便同时表达,或通过将接头添加至VH-区多肽或VL-区多肽从而与所述生物分子融合来获得。制备融合产物的方法可以根据待融合的生物分子的类型和尺寸来适当地选择。

    可以以与制备VL-区多肽和VH-区多肽的方法类似的方式制备不同于VL-区多肽和VH-区多肽的抗体片段。本领域专业技术人员可以容易地应用这样的方法。

    (3)制备固定抗体片段的基底的方法

    根据本发明的制备固定抗体片段的基底的方法包括:

    使能够识别一种类型抗原的至少两种类型的分开的抗体片段与所述抗原接触以形成复合物,从而使每种所述抗体片段结合所述抗原;

    使所述复合物经由所述复合物中的所述抗体片段固定在基底上;以及

    从所述复合物中去除所述抗原,以获得所述固定抗体片段的基底,

    其中所述抗体片段以一定的位置关系独立地固定在所述基底上,所述位置关系允许每种所述抗体片段结合相同的所述抗原。

    根据本发明的制备方法,由于由至少两种类型的抗体片段和抗原构成的复合物被固定在基底上,并且然后将该抗原从复合物去除,因此可以容易地制备固定抗体片段的基底,在所述固定抗体片段的基底中抗体片段以一定的位置关系独立地固定在基底上,所述位置关系允许在抗原的存在下每种抗体片段结合相同的所述抗原。

    根据本发明的制备方法,可以获得包括基底和至少一组(例如两组或更多组)抗体片段的固定抗体片段的基底,其中每组抗体片段包括至少两种类型的分开的抗体片段,所述抗体片段已经如上所述固定在基底上。

    当形成复合物时,由抗体片段和抗原构成的复合物可以通过已知技术形成。更具体地,通过混合上述抗体片段和抗原容易地获得所述复合物。

    可以根据抗体针对抗原的结合模式来适当地设定两种或更多种类型的抗体片段与抗原的混合比??悸堑叫什⑶椅朔乐箍乖墓喙潭?,抗原数目与通过抗体片段组合形成的分子价的比率为0.1∶1至10∶1。

    抗体片段和抗原的混合比可以根据抗体片段对抗原的亲和力、抗原本身直接固定于基底的效率等来适当地调节。通常,当预期抗原具有对抗体片段的充分亲和力时,抗原数目与由抗体片段组合形成的分子价的比率为0.1∶1至1∶1,且更优选0.1∶1至0.3∶1。另一方面,当预期抗原具有低亲和力或预期难以直接固定在基底上时,例如,当将低分子化合物等用作抗原时,优选使用增加量的抗原。更具体地,抗原数目与由抗体片段组合形成的分子价的比率优选为0.5∶1至1.5∶1。

    在此,“由抗体片段组合形成的分子价”是指由抗体片段组合形成的分子中存在的抗体结合位点的数目。即,当由抗体片段组合形成的分子构成完整的抗体分子时,分子价等于该抗体分子的分子价。当由抗体片段组合形成的分子不构成完整的抗体分子时,其价被认为是1,只要其中包含一个抗原结合位点。

    抗原可以是低分子量分子,或诸如蛋白的高分子量分子。尽管复合物可以由任何数目的分子形成,但为了便于对定量比的控制,形成复合物的分子数目优选为三个分子,诸如两个类型的抗体片段和一个抗原。

    例如,当使用抗溶菌酶VH-区多肽、抗溶菌酶VL-区多肽和溶菌酶时,由于VH-区多肽和VL-区多肽各自以1∶1的比率与抗原相互作用,因此由VH-区多肽和VL-区多肽的组合形成的分子的价为1。因此,通过将VH-区多肽,VL-区多肽,和抗原以相等的数量比,即,以1∶1∶1的比率,在水溶液中混合可以容易地获得复合物。为了防止溶菌酶直接固定在基底上导致抗体片段的结合效率下降,抗原的数量比优选小于抗原片段的价。在VH-区多肽,VL-区多肽和抗原之间的混合比优选为10∶10∶1至10∶10∶9,且优选10∶10∶1至10∶10∶3。

    当固定复合物时,通过上述步骤形成的复合物通过适当地根据提供至基底的官能团的类型进行反应而与基底连接。在此情况下,由于抗体片段的抗原结合位点通过与抗原的结合而被?;?,因此不需要额外的?;ば源?。将复合物与基底连接的方法是本领域专业技术人员所公知的。其实例包括使用上述的EDC等活化羧基并且经由氨基连接复合物的方法,或其中复合物通过马来酰亚胺基与硫醇基的反应与基底连接的方法,但本发明不限于此。

    当根据本发明的固定化基底用于利用表面等离子共振的生物传感器时,与固定化基底结合的复合物的固定量(密度)优选为10pg/mm2-20,000pg/mm2,更优选200pg/mm2-10,000pg/mm2,且仍更优选500pg/mm2-8,000pg/mm2。密度可以通过下列方法测定。当通过实际测量测定密度时,将复合物连接至基底,然后使用QCM测量技术或SPR测量技术测定与基底结合的生物分子的重量。此外,每种分子的固定量可以通过用荧光分子标记每种分子来测定。

    当从复合物去除抗原时,将复合物固定在基底上,然后去除该抗原。由于每个抗体片段独立地固定在基底上,抗原可以容易地被去除。因此,当将所述基底用作固定化基底时,不会降低抗原的结合再现性。

    容易通过使用适当的洗涤溶液来进行抗原的去除。任何溶液可以用作洗涤溶液,只要其降低复合物中抗原和抗体的亲和力。降低亲和力的条件的实例包括朝向酸性侧或碱性侧改变pH,和/或增加盐浓度。洗涤溶液根据抗体片段和抗原的类型等来变化,并且其实例包括酸性甘氨酸缓冲液,其pH可以调节至2以下;碱性NaOH溶液,其pH可以调节至10以上;和硼酸盐缓冲液,其盐浓度可以调节为0.5M以上。

    另外,可以适当地使用含精氨酸的酸性缓冲液,含胍的缓冲液或含脲的缓冲液。

    在此,可以适当地调节用洗涤溶液进行洗涤处理的条件。为了不损害抗体片段的活性,洗涤处理的时间通常为10分钟以下,并且优选1分钟以下。从再现性的角度来看,洗涤处理的时间优选为5秒以上。

    以此方式,可以获得固定抗体片段的基底,其中所述抗体片段以一定的位置关系独立地固定在基底上,所述位置关系允许一组中的每种抗体片段结合相同的所述抗原。在此固定抗体片段的基底中,独立地固定在基底上的抗体片段具有一定的自由度并且处于抗体可以结合抗原的状态下。因此,当抗原接近待结合的抗体片段时,多个抗体片段彼此接近从而结合该抗原。这样的多个抗体片段与每个抗体片段单独结合抗原的情况相比显示更高的亲和力。根据此方法。根据此方法,可以容易地获得具有这样的高亲和力的固定抗体片段的基底。

    例如,图1A和1B显示固定化基底10,其是根据本发明的固定抗体片段的基底的实例。在固定化基底10中,抗体片段18A和18B通过自组装单分子层14和聚合物层16固定在基底12上??固迤?8A和抗体片段18B通过每个抗体片段的一端结合至基底12使得每个抗体片段的另一端可以自由地运动,并且抗体片段18A和抗体片段18B以一定的位置关系独立地固定在基底12上,所述位置关系允许如果存在抗原Ag的话则所述抗体协作地结合所述抗原(参见图1A)。

    当抗原Ag接近固定化基底10时,抗体片段18A和18B识别并结合抗原Ag。当结合时,抗体片段18A和18B围绕抗原Ag彼此接近,并且结合Ag,由此抗体可以以与各个抗体独立地结合抗原的情况相比更高的亲和力与抗原结合(参见图1B)。

    如上所述,通过将由两种或更多种抗体片段和一种或多种抗原形成的复合物通过所述两种或更多种抗体片段固定在基底上,并且然后仅去除所述抗原,可以获得可以用于利用抗原-抗体反应的免疫测定中的固定抗体片段的基底。

    根据本发明,无论针对抗原的亲和力程度如何,靶抗体片段均可以以彼此相邻的相对位置被固定在基底上,所述相对位置允许每种抗体结合相同的所述抗原。

    另外,即使当抗体可利用的表位数量很少时,例如,当抗原为小分子时,由于抗体片段被固定在基底上能够协作地结合抗原的相邻位置处,因此本发明的固定抗体片段的基底具有高抗原结合比。尽管其依赖于固定在基底上的两种或更多种类型的抗体片段的量和使用的抗原类型,但例如,当固定的抗体片段的量为0.025pmol/mm2时,相对于关于该固定量的计算的理想抗原结合量,“高抗原结合比”优选地指1%以上的抗原结合比,更优选6%以上的抗原结合比,和更优选10%以上的抗原结合比。本文使用的术语“理想抗原结合量”是指基于下列假设计算的抗原的结合量:每种抗体片段以等摩尔量固定并且具有100%活性。通过将抗原的结合量除以理想抗原结合量来获得抗原结合比。更具体地,本发明中的抗原结合比如下获得:通过SPR测量技术测量抗体片段的固定量和当加入抗原时抗原的结合量,并且基于上述假设计算抗原结合比。

    (II)根据本发明的固定化基底的应用

    根据本发明的固定化基底可以应用于基于抗体片段和抗原之间的结合反应性的生物传感器或生物反应器(例如,参见″Bioreactor?Technique(生物反应器技术)″,1988,CMC?Publishing?Co.,Ltd.,和″Biochip?and?Biosensor

    (生物芯片和生物传感器)″,2006,Kyoritsu?Shuppan?Co.,Ltd.)。在此,生物反应器是指通过利用生物催化剂诸如酶、细菌细胞、细胞或细胞器引起的生化反应,应用于制备有用物质、生成能量、降解环境污染物等的反应器。在此,生物传感器术语的含义意在最广义地解释,并且是指通过将生物分子之间的相互作用转换为诸如电信号的信号来测量和/或检测靶物质的传感器。以下,将描述对生物反应器和生物传感器的应用。

    (1)对生物反应器的应用

    描述能够使用固定酶的不溶性基底进行有用物质的生成、反应等的生物反应器(例如,经审查的实用新型申请公开号(JP-Y)4-18398和4-18399)??梢越荼痉⒚鞯幕鬃魑庋牟蝗苄曰子τ糜谏锓从ζ?,所述根据本发明的基底例如是具有载体(例如,多孔材料,诸如陶瓷或聚砜)、与此基底表面结合的聚合物膜、和与此聚合物膜结合的酶和用于酶活性的辅助物质的基底的形式。

    (2)对生物传感器的应用

    通常,生物传感器由识别待测靶化学物质的受体部分和将在该受体部分处产生的物理变化或化学变化转换成为电信号的转换器部分构成。在活体中具有相互亲和力的物质的组合包括:酶和底物的组合,酶和辅酶的组合,抗原和抗体的组合,以及激素和受体的组合。生物传感器采用这样的原理,即,通过将此类组合的具有相互亲和力的物质之一固定在基底上,并且使用其作为分子识别物质,选择性地测量对应的另一种物质。根据本发明的基底可以应用为,例如,具有载体(例如,多孔材料,诸如陶瓷或聚砜)、与此基底表面结合的聚合物膜、和与此聚合物膜结合的酶和用于酶活性的辅助物质的基底,从而与常规生物传感器相比进一步改善特异性。

    例如,表面等离子共振生物传感器由含有用于传输和反射从传感器发射的光的部分和用于固定生物活性物质的部分的构件构成。根据本发明的固定化基底可以用作能够固定与事先通过洗涤已经去除的物质相同种类的物质(抗原)的构件。

    表面等离子共振现象发生是由下面的事实引起的:从光学透明物质诸如玻璃和金属薄膜层之间的边界反射的单色光的强度取决于位于所述金属的输出侧上的样品的折射率。因此,样品可以通过测量反射的单色光的强度来进行分析。

    用于利用表面等离子由光波激发的现象来分析待测量物质的性质的表面等离子测量装置的实例包括:使用已知为Kretschmann配置的系统的装置(例如,JP-A?No.6-167443)。使用上述系统的表面等离子测量装置基本上包括以棱柱体样形状形成的电介质块,在电介质块的一面上形成的以与待测量物质诸如样品溶液接触的金属膜,用于生成光束的光源,用于使所述光束以各种角度进入所述电介质块使得可以在所述电介质块和所述金属膜之间的界面处获得全反射条件的光学系统,和用于通过测量该界面处全反射的光束的强度来检测表面等离子共振状态(即,衰减全反射状态)的光检测设备。

    另外,利用衰减全反射(ATR)的类似测量装置的实例包括泄漏型测量装置,诸如″Bunko?Kenhyu″(Joumal?of?the?Spectroscopical?Society?of?Japan(日本光谱协会杂志))第47卷,第1期(1998),21-23和26-27页中所述的那些。此泄漏型测量装置基本上包括,例如,以棱柱体样形状形成的电介质块,在所述电介质块的表面上形成的镀层,在所述镀层上形成并且将与样品溶液接触的光波导层,用于生成光束的光源,用于使所述光束以各种角度进入所述电介质块使得可以在所述电介质块和所述镀层之间的界面处获得全反射条件的光学系统,和用于通过测量该界面处全反射的光束的强度来检测该导波模式的激发状态(即,衰减全反射的状态)的光检测设备。

    此系统的生物传感器的构造的实例描述于,例如,已审查的日本专利公开号(JP-B)6-27703,第4页48行至第14页15行,和图1-8,以及美国专利号6,829,073,第6栏31行至第7栏47行,和图9A和9B。

    例如,本发明的一个实施方案包括这样的结构,其中将形成平板波导层的薄层设置在基材(例如,PYREX(注册商品名)玻璃)上。所谓的波导体由波导层和基材组成。波导层可以具有多层结构,包括例如氧化物层(SiO2,SnO2,Ta2O5,TiO2,TiO2-SiO2,HfO2,ZrO2,Al2O3,Si3N4,HfON,SiON,氧化钪,或其混合物)或塑料层(例如,聚苯乙烯,聚乙烯或聚碳酸酯)。为了光束通过全内反射穿过波导层传播,波导层的折射率高于相邻介质(例如,基材或下面所述的附加层)的折射率是必要的。将衍射光栅配置在基材之上或之中,面向待测量物质的波导层表面上,或在波导层的体积内。衍射光栅可以通过压纹技术、全息技术或其它方法在基材之上或之中形成。随后,提供具有较高折射率的薄波导层以覆盖衍射光栅的上表面。衍射光栅具有将入射光会聚至波导层、允许以引导模式离开波导层、或将该模式部分地朝向传播方向传输并且部分地反射引导模式的功能。波导层的光栅区用附加层覆盖。根据需要,所述附加层可以是多层。所述附加层可以赋予选择性地检测待测量样品中的特定物质的功能。在本发明的一个优选方面,可以将具有检测功能的层布置在附加层的最外侧表面处。作为具有检测功能的层,可以使用可以固定生物活性物质的层。

    本发明的另一个实施方案包括其中将阵列式波导光栅结合至微型平板的孔中的波导(日本国家阶段公开号2007-501432)。微型平板孔的底部上的此阵列式波导光栅使得能够进行药物或化学物质的高通量筛选。

    为了检测衍射光栅波导的上层(检测区)上的生物活性物质,通过检测入射光和反射光来检测折射性质的变化。为此目的,可以使用一个或多个光源(例如,激光或二极管)和一个或多个检测器(例如,光谱仪、CCD照相机或其它光检测器)。测量折射率变化的方法的实例包括两种不同的操作方式一光谱法和角度法(angle?method)。在光谱法中,将宽谱带光束作为入射光发送至衍射光栅波导,并且例如,用光谱仪收集反射光以进行测量。通过观察共振波长(峰)的光谱位置,可以测量到衍射光栅波导的表面上或附近的折射率变化,即,生物活性物质的结合。在角度法中,将具有额定的单一波长的光聚焦以获得特定范围内的照射角,并且运送进入衍射光栅波导中。使用CCD照相机或其它光检测器测量反射光。通过测量被衍射光栅波导反射的共振角的位置,可以测量到衍射光栅波导的表面上或附近的折射率变化,即,生物活性物质的结合。

    以下,将参照实施例更详细地描述本发明的固定化基底,但本发明不限于所述实施例。此外,“份”和“%”表示以质量计的数量,除非另外指定。

    实施例

    实施例1

    (1)抗溶菌酶VH-区多肽和抗溶菌酶VL-区多肽的制备

    实施例中使用的缩写如下:

    ·LB:含1%BACTO(注册商品名)胰蛋白胨,0.5%酵母提取物和0.5%NaCl的培养基

    ·LBA:含100μg/ml氨苄青霉素的LB

    ·LBAG:含100μg/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的LB

    ·LBAG板:含100μg/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的LB琼脂培养基

    ·SOC:含2%BACTO(注册商品名)胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.05%NaCl,2.5mM?KCl,20mM葡萄糖和10mM?MgCl2的培养基

    ·TAE缓冲液:含1mM?EDTA的40mM?Tris-乙酸盐缓冲液(pH?8.3)

    ·TALON缓冲液:含300mM?NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH?7.0)

    ·TALON洗脱缓冲液:含500mM咪唑的TALON缓冲液(pH?7.0)

    ·IPTG:异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷

    ·HBS-N缓冲液:10mM?HEPES,150mM?NaCl,pH?7.4

    在所有实验中,使用用MILLI-Q(商品名,由Millipore?Co.,比尔里卡,MA,USA制造)纯化的水。此后,此纯化水称为milliQ水。除非另外指明,使用的一般试剂获自Sigma-Aldrich?Co.(圣路易斯,MO,USA),NacalaiTesque(京都,日本),Wako?Pure?Chemical?Industries,Ltd.(大阪,日本),或Kanto?Chemical?Co.Inc.(东京,日本)。低聚DNA由Texas?Genomics?Japan(东京,日本)或Invitrogen(东京,日本)合成。

    大肠杆菌(E.coli)XL10-Gold和OverExpress?C41的基因型显示在表1中,并且用于PCR的引物序列显示在表2中。

    表1

    <大肠杆菌(E.coli)>

    表2

    <引物>

    (A)表达质粒的构建

    (a)试验中使用的载体

    ·pET-MBPp-His6:pET15b载体(Merck?Chemicals?Ltd.,达姆施塔特,德国),其中插入了用含有6个组氨酸残基的His-标签的编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的基因(SEQ?ID?NO:7)。

    ·pIT2-LxE16:pIT2载体(由MRC?Cambridge,UK提供),其中插入了编码抗鸡卵溶菌酶(HEL)抗体LxE16(在东京大学工程研究院化学和生物技术系蛋白质工程实验室(Laboratory?of?Protein?Engineering,Department?ofChemistry?and?Biotechnology,Graduate?School?of?Engineering,University?ofTokyo)处分离)的单链抗体(scFv)基因(SEQ?ID?NO:8,氨基酸:SEQ?ID?NO:9)。

    (b)制备表达载体的概述

    如图2A的图解中所示,使用pET-MBPp-His6构建其中MBP和含10个组氨酸残基的His-标签(His10)分别融合至VH(HEL)(抗溶菌酶抗体LxE16的重链可变区结构域)的N-和C-末端的编码MBP-VH(HEL)-His10蛋白的表达载体pET-MBPp-VH(HEL)-His10,和其中MBP和His10分别融合至VL(HEL)(抗溶菌酶抗体LxE16的轻链可变区结构域)的N-和C-末端的编码MBP-VL(HEL)-His?10蛋白的表达载体pET-MBPp-VL(HEL)-His?10。

    首先,将含有His6的DNA片段(1)从pET-MBPp-His6中分离,然后向其中插入编码His10的DNA片段(2),从而获得pET-MBPp-His10。随后,将VH(HEL)基因(SEQ?ID?NO:10,表3)插入至pET-MBPp-His10中,从而获得pET-MBPp-VH(HEL)-His?10。此外,将VL(HEL)基因(SEQ?ID?NO:11,表4)插入至pET-MBPp-His?10中,从而获得pET-MBPp-VL(HEL)-His?10。

    表3

    表4

    (b)从pET-MBPpP-His6分离DNA片段(1)

    向含有约10μgpET-MBPp-His6的74μl水溶液中加入3μlScaI(RocheApplied?Science,巴塞尔,瑞士,10U),3μl?NotI(Roche?Applied?Science,10U),10μl?10×BSA溶液和10μl?10×H缓冲液(Roche?Applied?Science),然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,将该混合物在1%琼脂糖凝胶(在TAE缓冲液中)上进行电泳,然后切下约4,100bp的DNA条带,并使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(WIZARD?SV?Gel?And?PCRClean-Up?System)(商品名,由Promega?Co.,麦迪逊,WI制造)提取。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中。

    (c)DNA片段(2)的制备

    通过使用pET-MBPp-His6作为模板、引物(1)(SEQ?ID?NO:1)和引物(2)(SEQ?ID?NO:2)进行PCR。引物(1)是具有与10个组氨酸残基对应的核酸序列并且具有NotI位点的反向引物;并且引物(1)的退火位点位于His6编码区的下游。引物(2)是正向引物;并且引物(2)的退火位点位于pET载体的ScaI位点下游约500个碱基处。

    PCR条件如下:

    反应混合物的组成

    pET-MBPp-His6(约100μg/ml)0.5μl

    引物(1)(50μM)????????????0.5μl

    引物(2)(50μM)????????????0.5μl

    10×Pfu缓冲液(20mM?Mg2+)(Agilent?Technologies,Inc.,圣克拉拉,

    CA)

    5μl

    dNTP混合物(每种2.5mM)????4μl

    2.5U/μl?Pfu?DNA聚合酶(Agilent?Technologies,Inc.)

    0.5μl

    milliQ水?????????????????39μl

    反应循环

    1.94℃,1min

    2.94℃,30sec

    3.58℃,30sec

    4.72℃,30sec

    (25个循环的步骤2-4)

    5.72℃,10min

    6.16℃∞

    将PCR产物用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(WIZARD?SV?GelAnd?PCR?Clean-Up?System)纯化并溶解在50μl?milliQ水中。向该溶液中,加入1μl?ScaI(Roche?Applied?Science,10U),1μl?NotI(Roche?AppliedScience,10U),7μl?10×BSA溶液,7μl?10×H缓冲液(Roche?Applied?Science)和4μl?milliQ水,然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,将该混合物在1%琼脂糖凝胶(在TAE缓冲液中)上进行电泳,然后切下约1,080bp的DNA条带,并使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(WIZARD?SVGel?And?PCR?Clean-Up?System)(Promega?Co.,麦迪逊,WI)提取。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中,从而获得DNA片段(2)的溶液。

    (d)pET-MBPp-His10的制备

    将0.5μl含有已经去除了DNA片段(1)的pET-MBPp-His6的溶液和5μl?DNA片段(2)的溶液混合。随后,将5.5μl?DNA?LIGATION?HIGH?Ver2溶液(商品名,由日本,大阪,TOYOBO?CO.,LTD.制造)加入至该混合物中,然后在16℃下进行DNA连接反应30分钟。此后,约50μl大肠杆菌XL?10-Gold化学感受态细胞用约1μl反应混合物转化。将转化体在LBAG琼脂培养基上在37℃下培养过夜。将单个菌落的转化体在50ml?LBAG中进一步培养过夜,然后使用WIZARD?PLUS?MINIPREPS?DNA纯化试剂盒(商品名,由Promega?Co.制造)提取质粒DNA,从而获得pET-MBPp-His10。根据Beckman?Coulter,Inc.的方案确认编码His10的DNA序列。

    (e)pET-MBPp-His?10的限制性酶处理

    向含有约7μgpET-MBPp-His10的46μl水溶液中加入2μl?SfiI(RocheApplied?Science,10U),6μl?10×BSA溶液和6μl?10×M缓冲液(RocheApplied?Science),然后将该混合物在50℃下静置约3小时。使用WIZARDSV凝胶和PCR提纯系统(WIZARD?SV?Gel?And?PCR?Clean-Up?System)纯化DNA,然后溶解在50μl水溶液中。向该DNA溶液中加入2μl?NotI(Roche?Applied?Science,10U),7μl?10×BSA溶液,7μl?10×H缓冲液(RocheApplied?Science)和4μl?milliQ水,然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,将该混合物在1%琼脂糖凝胶(在TAE缓冲液中)上进行电泳,然后切下约4,800bp的DNA条带,并使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(WIZARD?SV?Gel?And?PCR?Clean-Up?System)提取。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中。

    (f)?VH(HEL)基因片段的制备

    使用pIT2-LxEl6作为模板以及引物(3)和引物(4)进行VH(HEL)基因片段的PCR扩增。引物(3)是具有SfiI位点的反向引物;并且引物(3)的退火位点位于VH(HEL)基因片段的5′侧。引物(4)是具有NotI位点的正向引物;并且引物(4)的退火位点位于VH(HEL)基因片段的3′侧。

    PCR条件如下:

    反应混合物组成

    pIT2-LxEl6(约100μg/ml)???????????0.5μl

    引物(3)(50μM)????????????????????0.5μl

    引物(4)(50μM)????????????????????0.5μl

    10×Pfu缓冲液(20mM?Mg2+)(Agilent?Technologies,Inc.)

    5μl

    dNTP混合物(每种2.5mM)?????????????4μl

    2.5U/μl?Pfu?DNA聚合酶(Agilent?Technologies,Inc.)

    0.5μl

    milliQ水??????????????????????????39μl

    反应循环

    1.94℃,1min

    2.94℃,30sec

    3.58℃,30sec

    4.72℃,30sec

    (25个循环的步骤2-4)

    5.72℃,10min

    6.16℃∞

    将PCR产物用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统纯化并溶解在50μlmilliQ水中。向该溶液中加入2μl?SfiI(Roche?Applied?Science,10U/μl),7μl10×BSA溶液,7μl10×M缓冲液(Roche?Applied?Science)和4μl?milliQ水,然后将该混合物在50℃下静置约3小时。得到的DNA用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统纯化并溶解在50μl水溶液中。向该DNA溶液中加入2μl?NotI(Roche?Applied?Science,10U),7μl10×BSA溶液,7μl10×H缓冲液(Roche?Applied?Science)和4μl?milliQ水,然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,将得到的DNA用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统纯化。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中,从而获得VH(LxE16)基因片段的溶液。

    (g)VL(HEL)基因片段的制备

    使用pIT2-LxE16作为模板以及引物(5)和引物(6)进行VL(HEL)基因片段的PCR扩增。引物(5)是具有SfiI位点的反向引物;并且引物(5)的退火位点位于VL(HEL)基因片段的5′侧。引物(6)是具有NotI位点的正向引物;并且引物(6)的退火位点位于VL(HEL)基因片段的3′侧。DNA的PCR、限制性酶处理和纯化以与VH(LxE16)基因片段的制备相同的方式进行,从而获得VL(LxE16)基因片段的溶液。

    (h)pET-MBPp-VH(HEL)-His?10和pET-MBPp-VL(HEL)-His?10的制备

    将0.5μl含限制性酶处理的pET-MBPp-His10的溶液与5μlVH(LxE16)或VL(LxE16)的溶液混合。随后,向该混合物中加入5.5μlDNALIGATIONHIGH?Ver2溶液(TOYOBO?CO.),然后在16℃下进行DNA连接反应30分钟。此后,将约50μl大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞用约1μl反应混合物转化。将转化体在LBAG琼脂培养基上在37℃下培养过夜。将单个菌落的转化体在50ml?LBAG中进一步培养过夜,然后使用WIZARD?PLUS?MINIPREPS?DNA纯化试剂盒(Promega?Co.)提取质粒DNA。根据Beckman?Coulter,Inc.的方案确认pET-MBPp-VH(HEL)-His10和pET-MBPp-VL(HEL)-His?10的DNA序列。

    (B)MBP-VH(HEL)-His10蛋白和MBP-VL(HEL)-His10蛋白的制备

    将pET-MBPp-VH(HEL)-His?10和pET-MBPp-VL(HEL)-His?10质粒通过热休克法分别转化至大肠杆菌OverExpress?C41(DE3)中以表达这些基因。将1μl所述质粒(约100ng)和100μl?OverExpress?C41(DE3)感受态细胞混合,然后将该混合物在冰上静置30分钟。随后,在42℃下进行热休克45秒。热休克后立即将混合物在冰上静置2分钟。此后,通过向其加入200μlSOC培养基使细胞恢复30分钟。然后将混合物铺在LBA平板上并在37℃下温育过夜。

    将生长的菌落接种在4ml?LBAG中并在30℃下在摇动的条件下培养过夜。然后将4ml小规模培养物加入至800ml?LBA,并在30℃下在摇动的条件下大规模培养。当培养物的O.D.600达到0.5-0.6时,向其加入400μl1000mM?IPTG,并且在30℃下在摇动的条件下进一步培养过夜。然后通过离心将细菌培养物分离成上清液和大肠杆菌沉淀物。通过下面所述的方法,分别通过硫酸铵沉淀从上清液中和通过对细菌细胞进行超声波处理从沉淀中收集MBP-VH(HEL)-His10蛋白(SEQ?ID?NO:12,表5)。此外,通过下面所述的方法,分别通过硫酸铵沉淀从上清液中和通过对细菌细胞进行超声波处理从沉淀物中收集MBP-VL(HEL)-His10蛋白(SEQ?ID?NO:13,表6)。

    表5

    -:蛋白酶切割位点

    表6

    -:蛋白酶切割位点

    在使用上清液的情况下,将344g硫酸铵加入至约800ml培养上清液中,并且将混合物在4℃下搅拌过夜。随后,通过离心收集含MBP-VH(HEL)-His10或MBP-VL(HEL)-His10的不溶物质,并且将沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中。在使用大肠杆菌的沉淀物的情况下,将沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中,然后进行超声波处理,接着离心,收集含MBP-VH(HEL)-His10或MBP-VL(HEL)-His10的上清液。将上清液针对TALON缓冲液进行透析。将收集在TALON缓冲液中的每种蛋白加样至填充以TALON亲和树脂(TALON?Affinity?Resin)(商品名,由ClontechLaboratories,Inc.,芒廷维尤,CA制造)的柱(直径16mm×高度约15mm)。随后,其上吸附有蛋白的TALON亲和树脂用TALON缓冲液洗涤,然后加入TALON洗脱缓冲液以洗脱MBP-VH(HEL)-His10或MBP-VL(HEL)-His10。通过SDS-PAGE确认纯化的蛋白。将洗脱物的缓冲液改变为HBS-N,然后向其加入终浓度为16%的甘油。将获得的溶液在-80℃下保存。

    (C)VL(HEL)-His10的制备

    向1ml纯化的MBP-VL(HEL)-His10溶液(在HBS-N中,约1000μg/ml)中加入20μl?GENENASE溶液(New?England?Biolabs,Inc.,伊普斯威奇,MA)。使该混合物在室温下反应约5小时。反应后,以与上述相同的方式,使用TALON亲和树脂纯化VL(HEL)-His10并将洗脱物的缓冲液改变为HBS-N。

    (2)制造提供有羧基的基底

    将其中在传感器芯片上仅已形成金薄膜的SENSORCHIP?AU(商品名,由GE?Healthcare制造)进行UV/臭氧处理12分钟。随后,将9.5ml溶解了9.5μmol羧基-ED6-十一烷硫醇(由Dojindo?Laboratories制造)的乙醇溶液与9ml溶解了9μmol羟基-ED3-十一烷硫醇(由Dojindo?Laboratories制造)的乙醇溶液以1∶9的比率混合。使金薄膜与该混合溶液在40℃下反应12小时,从而在该金薄膜上形成聚合物。生成物用乙醇洗涤两次,从而获得基底样品。

    (3)复合物的形成

    将均如上制备的MBP-VH(HEL)-His10和VL(HEL)-His10,和溶菌酶以1∶1∶1的数量比混合,以制备在HEPES缓冲液中的每种3.18μM的溶液。然后使该混合溶液在室温下静置3小时,从而获得复合物样品溶液。

    (4)复合物的固定

    将上面制备的基底样品放置在表面等离子共振分析仪(商品名:BIACORE?3000,由Biacore制造)中。将基底表面利用用于SPR的HEPES缓冲液溶液(20mM?HEPES-HCl,150mM?NaCl,pH7.4)以10μl/min的流速稳定化,然后向其上注射70μl?0.2mM?1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.04mM?N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合水溶液。此后,将50μl用乙酸盐缓冲液(pH?4.5)稀释的上述复合物样品溶液的两倍稀释液注射至该基底样品上,然后使用乙醇胺溶液进行封闭处理。

    (5)抗原的洗涤

    在复合物固定后,将基底交替地使用甘氨酸缓冲液(pH?1.5)和10mMNaOH进行5次洗涤,每次1分钟,以去除抗原,从而获得实施例1的固定化基底A?;谙吹雍笱返恼凵渎屎透春衔锕潭ㄇ把返恼凵渎世醇扑憧固迤蔚墓潭?。

    (6)与抗原的结合反应的评价

    在10分钟内将100nM溶菌酶注射至上面获得的固定化基底A上,并且评价溶菌酶的结合量。

    实施例2

    以与实施例1中相同的方式制备固定化基底B,不同之处在于使用可商购的SENSORCHIP?CM5(商品名,由GE?Healthcare制造;羧甲基葡聚糖偶联型)代替SENSORCHIP?AU。固定化基底B中溶菌酶的结合量以与实施例1中相同的方式评价。

    实施例3

    以与实施例1中相同的方式制备固定化基底C,不同之处在于在形成实施例2的复合物时MBP-VH(HEL)-His?10、VL(HEL)-His?10和溶菌酶之间的混合比改变为10∶10∶1。固定化基底C中溶菌酶的结合量以与实施例1中相同的方式评价。

    比较例1

    向实施例1的方法(2)中获得的基底样品,以与实施例1的方法(4)中相同的方式将MBP-VH(HEL)-His10和VL(HEL)-His10以这种次序固定,然后将所得的固定化基底以与实施例1的方法(5)中相同的方式洗涤,从而获得比较例1的固定化基底D。此后,以与实施例1的方法(6)中相同的方式,评价固定化基底D中溶菌酶的结合量。

    比较例2

    向可商购的SENSORCHIP?CM5(商品名,由GE?Healthcare制造),以与实施例1的方法(4)中相同的方式将MBP-VH(HEL)-His10和VL(HEL)-His10以这种次序固定,并且将所得的固定化基底以与实施例1的方法(5)中相同的方式洗涤,从而获得比较例2的固定化基底E。此后,以与实施例1的方法(6)中相同的方式,评价固定化基底E中溶菌酶的结合量。

    比较例3

    以与比较例2中相同的方式获得比较例3的固定化基底F,不同之处在于在固定复合物时,混合MBP-VH(HEL)-His10,VL(HEL)-His10和溶菌酶以进行固定,并且将所得的固定化基底以与实施例1的方法(5)中相同的方式洗涤。此后,以与实施例1的方法(6)中相同的方式,评价固定化基底F中溶菌酶的结合量。

    评价

    溶菌酶的结合比的测量

    基于实施例1-3和比较例1-3中获得的结果,计算和比较溶菌酶的结合比。使用BIACORE?3000,测量从开始加入溶菌酶起10分钟的期间内结合的时间依赖性变化。通过将10分钟时间期间溶菌酶的结合量除以抗体片段的固定量,获得溶菌酶的结合比。计算溶菌酶的结合量并且表示为相对值,假设比较例2中的溶菌酶结合量为1。

    结果显示在表7中。

    相对于理想的抗原结合量的抗原结合比

    分别向实施例3和比较例3中获得的固定化基底C和F中的每一个中加入100nM溶菌酶达10分钟,并且测量溶菌酶的结合量?;谒鼋岷狭?,获得抗原结合比,其中假设MBP-VH(HEL)-His10和VL(HEL)-His10的固定量为0.025pmol/mm2,则理想的抗原结合量为286RU。

    结果显示在表7中。

    表7

    从表7中明显可以看出,在每一个在抗体片段和抗原之间未形成复合物并且不控制基底上抗体片段的位置的条件下制备的固定化基底(比较例1、2和3)中,溶菌酶的结合比,即与溶菌酶的结合能力,是低的。另一方面,实施例1、2和3的固定化基底的每一个均显示较高的溶菌酶结合比。因此,根据本发明,可以有效地检测到由三种或更多种物质构成的复合物的反应,并且可以改善检测灵敏度和准确度。

    另外,在其中抗溶菌酶VH-区多肽、抗溶菌酶VL-区多肽和溶菌酶之间的混合比为10∶10∶1的实施例3中,获得了高结合量,这显示即使当它们的混合比不相等时也可以获得较高的结合比。

    实施例4

    (1)VH(HEL)-His6蛋白的制备

    将pIT2-LxE16质粒通过热休克法转化至大肠杆菌HB2151中用于表达?;旌?μl质粒(约100ng)和100μl?HB2151感受态细胞,并将该混合物在冰上静置30分钟。随后,在42℃C下进行热休克45秒。热休克后立即将混合物在冰上静置2分钟。此后,通过向其加入200μl?SOC培养基使细胞恢复30分钟。然后将混合物铺在LBA平板上并在37℃下温育过夜。

    将生长的菌落接种在4ml?LBAG中并在30℃下在摇动的条件下培养过夜。然后将4ml小规模培养物加入至800ml?LBA,并在30℃下在摇动的条件下大规模培养。当O.D.600达到0.5-0.6时,向其加入400μl1000mMIPTG,并且在16℃下在摇动的条件下进一步培养过夜。通过离心将细菌培养物分离成上清液和大肠杆菌的沉淀物。通过下面所述的方法,分别通过硫酸铵沉淀从上清液中和通过对细菌细胞进行超声波处理从沉淀物中收集VH(HEL)-His6蛋白(SEQ?ID?NO:14,表8)。

    在使用上清液的情况下,将344g硫酸铵加入至约800ml培养上清液中,并且将混合物在4℃下搅拌过夜。随后,通过离心收集含VH(HEL)-His6的不溶物质,并且沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中。在使用大肠杆菌的沉淀物的情况下,将沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中,然后进行超声波处理,接着离心,收集含VH(HEL)-His6的上清液。将上清液针对TALON缓冲液进行透析。将收集在TALON缓冲液中的每种蛋白加样至填充以TALON亲和树脂(商品名,由Clontech?Laboratories,Inc.,芒廷维尤,CA制造)的柱(直径16mm×高度约15mm)。随后,将其上吸附有蛋白的TALON亲和树脂用TALON缓冲液洗涤。此后,加入TALON洗脱缓冲液以洗脱VH(HEL)-His6。通过SDS-PAGE确认纯化的蛋白。将洗脱物的缓冲液改变为HBS-N,然后向其加入终浓度为16%的甘油。将获得的溶液在-80℃下保存。

    表8

    (2)复合物的形成和结合的评价

    以与实施例1中相同的方式获得固定化基底G,不同之处在于将在形成复合物时上面获得的VH(HEL)-His6、VL(HEL)-His10和溶菌酶之间的混合比改变为10∶10∶3。以与实施例1中相同的方式评价在固定化基底G中溶菌酶的结合量。

    比较例4

    以与实施例4中相同的方式获得固定化基底H,不同之处在于在固定复合物时,将上面获得的VH(HEL)-His6和VL(HEL)-His10以这种次序固定。以与实施例1中相同的方式评价固定化基底H中溶菌酶的结合量。

    评价

    溶菌酶的结合比的测量

    基于实施例4和比较例4中获得的结果,计算和比较溶菌酶的结合比。使用BIACORE?3000测量,从开始加入溶菌酶起10分钟的时间内溶菌酶结合的时间依赖性变化。通过将10分钟时间期间溶菌酶的结合量除以抗体片段的固定量,获得溶菌酶的结合比。

    计算溶菌酶的结合量并且表示为假设比较例2中的溶菌酶结合量为1时的相对值。

    表9

    从表9中明显的是,即使当抗体片段不是MBP融合产物的形式时,也可以有效地检测到由三种或更多种物质构成的复合物的反应,并且可以改善检测灵敏度和准确度。

    另外,基于每单位时间的结合量,实施例4中溶菌酶的结合率与实施例3(其中单链肽之一是MBP融合产物)中溶菌酶的结合率的比较揭示:实施例4中的结合率高于实施例3的结合率。因此,认为实施例4的VH-区和VL-区多肽(每一种均具有较低的分子量)可以将其位置改变至最佳位置从而当协作地与溶菌酶结合时以更短的时间结合溶菌酶。因此,认为抗体片段之间的距离未必总是为0(换句话说,其中抗体片段彼此结合的状态)。

    由于上述的原因,认为根据本发明的固定化基底可以应用于催化反应、序列反应等,在这些反应中物质的柔性至关重要。认为在许多情况下对于在催化反应、序列反应等中的此类应用,与使用具有较高亲和力的VH-区和VL-区多肽相比,使用具有较弱亲和力的VH-区和VL-区多肽更为有利。

    实施例5

    抗骨钙蛋白(BGP)VH-区多肽(VH(BGP)),和VH(BGP)与MBP的融合蛋白(MBP-VH(BGP)),和抗BGP?VL-区多肽与MBP的融合蛋白(MBP-VL(BGP))的制备

    下面实施例中使用的缩写如下:

    LB:与实施例1中使用的相同

    LBA:与实施例1中使用的相同

    LBAG:与实施例1中使用的相同

    LBA平板:与实施例1中使用的相同

    SOC:与实施例1中使用的相同

    PBS:含137mM?NaCl和2.7mM?KCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH?7.2)

    5%IBPBS:含5%(v/v)IMMONOBLOCK(商品名,由大阪,DainipponSumitomo?Pharma?Co.,Ltd.制造)的PBS

    20%IBPBS:含20%(v/v)IMMONOBLOCK的PBS

    PBST:含0.1%ofTriton-X?100的PBS

    TAE缓冲液:与实施例1中使用的相同

    TALON缓冲液:与实施例1中使用的相同

    TALON洗脱缓冲液:与实施例1中使用的相同

    IPTG:与实施例1中使用的相同

    HBS-N缓冲液:与实施例1中使用的相同

    类似于实施例1,在所有试验中使用用MILLI-Q(商品名,由MilliporeCo.,比尔里卡,MA制造)纯化的水。此后纯化水称为milliQ水。除非另外指明,使用的一般试剂获自Sigma-Aldrich?Co.(圣路易斯,MO,USA),Nacalai?Tesque(京都,日本),Wako?Pure?Chemical?Industries,Ltd.(大阪,日本),或Kanto?Chemical?Co.Inc.(东京,日本)。低聚DNA由Texas?GenomicsJapan(东京,日本)或Invitrogen(东京,日本)合成。

    大肠杆菌XL10-Gold,OverExpress?C41,和HB2151的基因型显示在表10中。

    表10

    (A)MBP-VH(BGP)表达质粒的构建

    (a)试验中使用的载体

    ·pET-MBPp-His6:pET15b载体(由Merck?Chemicals?Ltd.,达姆施塔特,德国提供),其中插入了编码用含6个组氨酸残基(His6)的His-标签标记的麦芽糖结合蛋白(MBP)的基因(上述,SEQ?ID?NO:7)。

    ·pIT2-VH(BGP):pIT2载体,其中插入了编码抗BGP抗体的VH-区多肽(VH(BGP))的基因(SEQ?ID?NO:15,表11,氨基酸:SEQ?ID?NO:16)。

    ·pMAL-VL(BGP):用于抗-BGP抗体KTM219的VL-区多肽和MBP的融合蛋白(MBP-VL(BGP))的表达载体(记载在Lim等,Anal.Chem.(分析化学)79,6193(2007)中)。

    表11

    (b)pET-MBPp-His6的限制性酶处理

    向77μl含有约10μg?pET-MBPp-His6的水溶液中加入3μl?NotI(RocheApplied?Science,巴塞尔,瑞士,10U),10μl10×BSA溶液和10μl10×H缓冲液(Roche?Applied?Science),然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(商品名,由Promega?Co.,Madison,WI制造)纯化DNA,并溶解在50μl?milliQ水中。向该溶液中加入3μl?SfiI(Roche?Applied?Science,10U),7μl10×BSA溶液,7μl10×M缓冲液(Roche?Applied?Science),然后将该混合物在50℃下静置约3小时。随后,将该混合物在1%琼脂糖凝胶(在TAE缓冲液中)上进行电泳,然后切下约4,100bp的DNA条带,并使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(Promega?Co.)提取。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中。

    (c)从pIT2-VH(BGP)中分离VH(BGP)基因片段

    向77μl含有约10μgpIT2-VH(BGP)的水溶液中加入3μl?NotI(RocheApplied?Science,巴塞尔,瑞士,10U),10μl10×BSA溶液和10μl10×H缓冲液(Roche?Applied?Science),然后将该混合物在37℃下静置约3小时。随后,使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(Promega?Co.)纯化DNA,并将纯化的DNA溶解在50μl?milliQ水中。向该DNA溶液中加入3μl?SfiI(Roche?Applied?Science,10U),7μl10×BSA溶液,7μl10×M缓冲液(RocheApplied?Science),然后将该混合物在50℃下静置约3小时。随后,将该混合物在1%琼脂糖凝胶(在TAE缓冲液中)上进行电泳,然后切下约450bp的DNA条带,并使用WIZARD?SV凝胶和PCR提纯系统(Promega?Co.)提取。将提取的DNA溶解在50μl?milliQ水中。

    (d)将VH(BGP)结合至pET-MBPp-His6中

    将含有如上所述用限制性酶处理并纯化的pET-MBPp-His6的0.5μ1溶液与5μl如上所述用限制性酶处理并纯化的VH(BGP)的溶液混合。随后,将5.5μl?DNA?LIGATION?HIGH?Ver2溶液(TOYOBO?CO.,LTD.,大阪)加入至该混合物中,然后在16℃下进行DNA连接反应30分钟。此后,将约50μl大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞用约1μl该连接反应混合物转化。转化体在LBAG琼脂培养基上在37℃下培养过夜。将单个菌落的转化体在50ml?LBAG中进一步培养过夜,然后使用WIZARD?PLUSMINIPREPS?DNA纯化试剂盒(Promega?Co.)提取质粒DNA,从而获得pET-MBPp-VH(BGP)。pET-MBPp-VH(BGP)的DNA序列根据BeckmanCoulter,Inc.的方案确认。

    (B)MBP-VH(BGP)蛋白和MBP-VL(BGP)蛋白的制备

    将pET-MBPp-VH(BGP)质粒和pMAL-VL(BGP)质粒通过热休克法分别转化至大肠杆菌OverExpress?C41(DE3)中以进行表达。将1μl质粒(约100ng)和100μl?OverExpress?C41(DE3)感受态细胞混合,然后将该混合物在冰上静置30分钟。随后,在42℃下进行热休克45秒。热休克后立即将生成物在冰上静置2分钟。此后,通过向其加入200μl?SOC培养基使细胞恢复30分钟。然后将混合物铺在LBA平板上并在37℃下温育过夜。

    将生长的菌落接种在4ml?LBAG中并在30℃下在摇动的条件下培养过夜。然后将4ml小规模培养物加入至800ml?LBA,并在30℃下在摇动的条件下大规模培养。当培养物的O.D.600达到0.5-0.6时,向其加入400μl1000mM?IPTG,并且在20℃下在摇动的条件下进一步培养过夜。然后通过离心将细菌培养物分离成上清液和大肠杆菌的沉淀物。通过下面所述的方法,通过硫酸铵沉淀从上清液中和通过对细菌细胞进行超声波处理从沉淀中独立地收集MBP-VH(BGP)蛋白(SEQ?ID?NO:17,表12)。此外,通过下面所述的方法,通过硫酸铵沉淀从上清液中和通过对细菌细胞进行超声波处理从沉淀物中独立地收集MBP-VL(BGP)蛋白(SEQ?ID?NO:18,表13)。

    表12

    表13

    在使用上清液的情况下,将344g硫酸铵加入至约800ml培养上清液中,并且将混合物在4℃下搅拌过夜。随后,通过离心收集含MBP-VH(BGP)或MBP-VL(BGP)的不溶物质,并且将沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中。在使用大肠杆菌的沉淀物的情况下,将沉淀物悬浮在30ml?TALON缓冲液中,然后进行超声波处理,接着离心,收集含MBP-VH(BGP)或MBP-VL(BGP)的上清液。将上清液针对TALON缓冲液进行透析。将收集在TALON缓冲液中的每种蛋白加样至填充以TALON亲和树脂(ClontechLaboratories,Inc.,芒廷维尤,CA)的柱(直径16mm×高度约15mm)。随后,将其上吸附有蛋白的TALON亲和树脂用TALON缓冲液洗涤,然后加入TALON洗脱缓冲液以洗脱MBP-VH(BGP)或MBP-VL(BGP)。通过SDS-PAGE确认纯化的蛋白。将洗脱物的缓冲液改变为HBS-N,然后向其加入终浓度为16%的甘油。将获得的溶液在-80℃下保存。

    (C)复合物的形成

    将均在上面制备的MBP-VH(BGP)和MBP-VL(BGP)与BGP的C-末端七肽片段(RRFYGPY:SEQ?ID?NO:19)以1∶1∶1的数量比混合,以制备在HEPES缓冲液中的每种1.1μM的溶液。然后使该混合溶液在室温下静置3小时,从而获得复合物样品溶液。

    (D)复合物的固定

    将可商购的SENSORCHIP?CM5(商品名,由GE?Healthcare制造)放置在表面等离子共振分析仪(商品名:BIACORE?3000,由Biacore制造)中。将基底表面利用用于SPR的HEPES缓冲液溶液(20mM?HEPES-HCl,150mMNaCl,pH7.4)以10μl/min的流速稳定化,然后向其上注射70μl?0.2mMEDC和0.04mM?NHS的混合水溶液。此后,将50μl用乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释的上述复合物样品溶液的两倍稀释液注射至该基底样品上,然后使用乙醇胺溶液进行封闭处理。

    (E)抗原的洗涤

    在复合物固定后,将基底交替地使用甘氨酸缓冲液(pH?1.5)和10mMNaOH进行5次洗涤,每次1分钟,以去除抗原,从而获得实施例5的固定化基底I?;谙吹雍笱返恼凵渎屎透春衔锕潭ㄇ把返恼凵渎世醇扑憧固迤蔚墓潭?。

    (F)与抗原的结合反应的评价

    在10分钟内将1000nM?BGP的C-末端七肽片段(RRFYGPY:SEQ?IDNO:19)注射至上面获得的固定化基底I上,并且评价BGP的C-末端七肽片段的结合量。

    比较例5

    以与实施例5中相同的方式获得固定化基底J,不同之处在于在固定复合物时,以MBP-VH(BGP)和MBP-VL(BGP)这种次序固定。以与实施例5中相同的方式,评价固定化基底J中BGP七肽的结合量。

    评价

    BGP七肽的结合比的测量

    基于实施例5和比较例5中获得的结果,计算和比较BGP七肽的结合比。使用BIACORE?3000,测量从开始加入BGP七肽起10分钟的时间内结合的时间依赖性变化。通过将10分钟时间内BGP七肽的结合量除以抗体片段的固定量,获得BGP七肽的结合比。计算BGP七肽的结合量并且表示为相对值,假设比较例5中的BGP七肽的结合量为1。

    结果显示在表14中。

    表14

    如从表14明显看出,即使当抗原是诸如具有7个残基的肽的低分子量分子时,也可以有效地检测由三种或更多种物质构成的复合物的反应,并且可以改善检测灵敏度和准确度。因此,根据本发明,提供了一种具有更高通用性的固定化基底,其可以固定抗体,而不依赖于蛋白的类型,即使是使用低分子量抗原时也是如此。

    因此,本发明提供了一种具有更高通用性的固定化基底,其可以以稳定的结合性质精确地检测在一种类型的测试物质和两种或更多种类型的物质之间的相互作用,例如在一种类型的抗原和两种或更多种类型的抗体片段之间的相互作用。

    本说明书中提及的所有出版物、专利申请和技术标准通过引用而结合于本文中,其程度如同每个单独的出版物、专利申请或技术标准具体地和单独地被指明通过引用而结合。

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