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    重庆时时彩个位全天计划: 可直读的固相免疫分析方法.pdf

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    直读 免疫 分析 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010121781.1

    申请日:

    2010.03.10

    公开号:

    CN102192981A

    公开日:

    2011.09.21

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/543申请公布日:20110921|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20100310|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; G01N33/52 主分类号: G01N33/543
    申请人: 苏州浩欧博生物医药有限公司
    发明人: 李纪阳
    地址: 215123 江苏省苏州市工业园区星湖街218号
    优先权:
    专利代理机构: 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 代理人: 孙仿卫
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010121781.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.01.21|||2011.11.23|||2011.09.21

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种可直读的固相免疫分析方法,以内部含有染料或有色物质的封闭膜囊作为标记粒子,在固相支撑物上可观察到形成的斑点。膜囊技术是此发明的主要发明点。该膜囊介导的可直读的固相免疫分析方法灵敏度高,步骤简单,不需要仪器就可直接判读结果。

    权利要求书

    1.一种待测物的检测方法,其特征在于,该方法包括使得被固定在固相载体的测试区的绑定物与待测物和标记物接触的步骤,所述的绑定物至少能够特异性结合待测物,所述的标记物包含了带有显色颗粒物标记的配体;所述配体,通过标记物被固相载体上的至少一个绑定物绑定且待测物也被绑定到该绑定物上,与所述的至少一个绑定物和待测物结合;所述测试区的组成材料具有一个能够固定一定浓度绑定物的表面区域,所述的一定浓度是指所述绑定物具有的浓度能使得被绑定的标记物能够在检测条件下的固相载体上显色;以所述测试区的标记物显色程度来测定样品中待测物。2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述的待测物和标记物依次与固相载体上的绑定物绑定或同时与固相载体上的绑定物绑定。3.如权利要求2所述的检测方法,其特征在于:所述标记物中的所述显色颗粒物标记为一囊状物,该囊状物中含有可显色的染料。4.如权利要求3所述的检测方法,其特征在于:所述的囊状物为脂质体。5.如权利要求4所述的检测方法,其特征在于:被绑定的标记物的显色程度不是通过脂质体的溶解来确定。6.如权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其特征在于:所述的绑定物为抗体。7.如权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其特征在于:所述测试区的组成材料为硝酸纤维素膜,孔径约0.2μm~0.45μm,所述的绑定物在测试区的分布浓度至少是40μg/cm2。8.如权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其特征在于:所述的待测物为绒毛膜促性腺激素。9.如权利要求1-5中任意一项所述的检测方法,其特征在于:所述的固相载体呈薄片状。10.采用权利要求1所述待测物检测方法的试剂盒,其特征在于,其包括固相载体和标记物,所述的固相载体的测试区固定有绑定物;所述的绑定物至少能够特异性结合待测物,所述的标记物包含了带有显色颗粒物标记的配体;检测的过程中,所述的配体被绑定到固相载体上的绑定物,且待测物也被绑定到固相载体上的绑定物;所述测试区的组成材料具有一个能够固定一定浓度绑定物的表面区域,所述的一定浓度是指所述绑定物具有的浓度能使得被绑定的标记物能够在检测条件下的固相载体上显色。

    说明书

    可直读的固相免疫分析方法

    技术领域

    本发明属于诊断免疫分析技术领域。

    背景技术

    免疫分析法的研发有30多年的历史了。已有的免疫分析法大多是利用酶联免疫反应(ELISA),或是放射免疫反应(RIA),或是胶体金类的快速反应。ELISA和RIA都需要专业的仪器,胶体金产品则是要经过复杂的制备步骤且价格昂贵。

    目前,诊断免疫分析领域急需一种制备简单,反应简单,且不需要读数仪就可以操作的免疫分析法。

    发明内容

    本发明的一方面提供了一种待测物的检测方法,该方法包括使得被固定在固相载体的测试区的绑定物与待测物和标记物接触的步骤,所述的绑定物至少能够特异性结合待测物,所述的标记物包含了带有显色颗粒物标记的配体;所述配体,通过标记物被固相载体上的至少一个绑定物绑定且待测物也被绑定到该绑定物上,与所述的至少一个绑定物和待测物结合;所述测试区的组成材料具有一个能够固定一定浓度绑定物的表面区域,所述的一定浓度是指所述绑定物具有的浓度能使得被绑定的标记物能够在检测条件下的固相载体上显色;以所述测试区的标记物显色程度来测定样品中待测物。

    优选的,所述的待测物和标记物依次与固相载体上的绑定物绑定或同时与固相载体上的绑定物绑定。

    优选的,所述标记物中的所述显色颗粒物标记为一囊状物,该囊状物中含有可显色的染料。更优选的,所述的囊状物为脂质体。在本发明的一个具体实施方式中,采用封闭囊体作为标记物,如血影细胞、脂质体、聚合微胶囊等。使染料或其他有色物质包入囊内部,然后用这种封闭囊体对选定的物质进行标记。在检测条件下,标记物和待测物与绑定物结合后,不经过处理,不用破坏囊体,不需要任何仪器,一般来说在测试区可观察到直径3-5mm斑点。

    优选的,被绑定的标记物的显色程度不是通过脂质体的溶解来确定。

    优选的,所述的绑定物为抗体。绑定物的类型根据使用的方法和特殊的检测步骤选择??梢允强固?、抗原、特异性结合蛋白或天然存在的物质。

    优选的,所述测试区的组成材料为硝酸纤维素,孔径约0.2μm~0.45μm,绑定物存在于孔中。采用多孔的膜材料且孔径在0.2μm~0.45μm能得到很好的试验结果。所述的绑定物在测试区的分布浓度至少是40μg/cm2。

    优选的,所述的固相载体呈薄片状。固相支撑物一般为硝酸纤维素膜,孔径约0.2μm~0.45μm,其它具有合适孔隙的材料也可以用于制备这种固相载体。

    另外,样品中的待测物浓度最好不要超过10-9g/ml。

    本发明还提供了采用上述待测物检测方法的试剂盒,其包括固相载体和标记物,所述的固相载体的测试区固定有绑定物;所述的绑定物至少能够特异性结合待测物,所述的标记物包含了带有显色颗粒物标记的配体;检测的过程中,所述的配体被绑定到固相载体上的绑定物,且待测物也被绑定到固相载体上的绑定物;所述测试区的组成材料具有一个能够固定一定浓度绑定物的表面区域,所述的一定浓度是指所述绑定物具有的浓度能使得被绑定的标记物能够在检测条件下的固相载体上显色。

    采用本发明的可直读的固相免疫分析方法,以内部含有染料或有色物质的封闭膜囊作为标记粒子,在固相支撑物上可观察到形成的斑点。膜囊技术是此发明的主要发明点。该膜囊介导的可直读的固相免疫分析方法灵敏度高,步骤简单,不需要仪器就可直接判读结果。

    具体实施方式

    以下结合实施例来进一步阐述本发明的可直读的固相免疫分析方法。

    实施例1

    a)脂质体(显色颗粒物标记)的制备

    i.在100mL圆底可旋转烧瓶中加入48mg胆固醇,104mg二硬脂酰磷脂酰胆碱,3.75mg交联剂,6.0mL异丙醚,1.0mL甲醇;涡旋混合;

    ii.加入5.0mL?0.1M桃红B,桃红B用pH?4.5的乙酸钠-氯化钠缓冲液溶解;涡旋混合;

    iii.通N2;

    iv.室温下在水浴超声容器中粉碎10分钟,乳化;

    v.将旋转蒸发器放置在44℃水浴中,旋转速度每分钟4次,缓慢抽真空,直到泡沫消失,大约需要30-40分钟;

    vi.减压,使脂质体在44℃退火30分钟;

    vii.加入10mL预热至50-52℃的0.1M的桃红B溶液,混合;

    viii.用0.4μm微孔滤膜过滤,再用0.2μm微孔滤膜过滤;

    ix.得到的脂质体用pH?4.5的乙酸缓冲液稀释至80mL,75000Xg离心30分钟;

    x.得到的沉淀物用pH?4.5的乙酸缓冲液重新悬浮至80mL;75000Xg离心30分钟;

    xi.再次将得到的沉淀物用pH?4.5的乙酸缓冲液重新悬浮至80mL;75000Xg离心30分钟;

    xii.用10mLpH?8.0的Tris缓冲液重新悬浮得到的沉淀物;

    xiii.4℃储存;

    b)脂质体与抗hCG抗体连接制备标记物

    i.取8mg由蛋白A纯化的抗hCG抗体(特异性识别hCG),加入0.4mL?1M的二硫苏糖醇,二硫苏糖醇用pH4.5的乙酸缓冲液溶解;

    ii.涡旋混合,室温暗处放置30分钟;

    iii.将上述溶液过G-25柱,柱子用pH8.0的Tris缓冲液平衡;

    iv.得到的组分在280nm测吸光值,收集

    v.将得到的组分与10mL新配制的脂质体混合;

    vi.通N2,加盖密封;

    vii.室温反应,过夜

    viii.用Tris缓冲液洗涤2次,离心;

    ix.得到的沉淀用40mLTris缓冲液重悬??;

    x.4℃储存;

    c)硝酸纤维素盘检测尿样品中的绒毛膜促性腺激素(hCG)

    i.试剂

    吸附缓冲液(BD公司,商品编号614335)、hCG?α链抗体(绑定物)、硝酸纤维素膜、牛血清白蛋白(BSA)、尿对照品、b)部分制备的标记物溶液;

    ii.方法

    1.将硝化纤维素膜切成1cm的盘;

    2.在盘中心加3μL?1∶50稀释的hCG抗体,室温干燥15分钟;

    3.每个盘上加300μL5%BSA的ABS溶液,37℃孵育1小时;

    4.弃去液体;

    5.加200μL尿对照品或尿样品,室温孵育1小时;

    6.弃去对照品或尿;

    7.用1.5mL?ABS溶液洗2次;

    8.每个盘上加300μL的1∶12的标记物稀释液,室温孵育1小时;

    9.弃去标记物;

    10.用1.5mL?ABS溶液洗2次;

    表1尿样定性RIA结果与硝化纤维素盘检测结果

    “+”表示阳性反应;“-”表示阴性反应。RIA采用BD公司的HCGI125试剂盒进行。尿样从临床收集。

    从上述实施例可以看出,本发明中的固相免疫分析方法使用包裹染料的膜囊进行标记,步骤简单,不破坏膜囊,不需要仪器就可直接判读结果,灵敏度高。

    本发明的可直读的固相免疫分析方法并不局限于上述的实施例,凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的?;し段?。

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