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    重庆时时彩奖金列表: 比色检测含巯基氨基酸的分析方法.pdf

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    比色 检测 巯基 氨基酸 分析 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010148972.7

    申请日:

    2010.03.23

    公开号:

    CN102200514A

    公开日:

    2011.09.28

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 21/78申请公布日:20110928|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/78申请日:20100323|||公开
    IPC分类号: G01N21/78 主分类号: G01N21/78
    申请人: 中国科学院兰州化学物理研究所
    发明人: 邵士俊; 魏薇; 郭勇
    地址: 730000 甘肃省兰州市城关区天水中路18号
    优先权:
    专利代理机构: 兰州中科华西专利代理有限公司 62002 代理人: 方晓佳
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010148972.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2013.06.05|||2011.11.23|||2011.09.28

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种比色检测含巯基氨基酸的分析方法。本发明应用三吲哚烯化合物作为氨基酸检测受体,通过裸眼可视的颜色变化高选择性地检测含巯基的氨基酸分子,而对其他氨基酸无此比色现象,这种识别性能还可用紫外-可见分光光度仪进行对比测定。本发明与常规方法相比,具有检测液配制过程简单,检测方法简便等优点。

    权利要求书

    1.一种比色检测含巯基氨基酸的分析方法,其特征在于该方法步骤为:A、以三吲哚烯化合物作为溶质,以色谱纯乙腈作为溶剂,制成蓝色的检测液,其浓度范围为1.0×10-4M-1×10-3M;B、用2-羟乙基-1-哌嗪基乙磺酸配制浓度为0.005-0.015M的中性缓冲水溶液,以此缓冲溶液作为溶剂,分别配制成谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺的待检测液,其浓度为1.0×10-4M-1×10-2M;C、将三吲哚烯化合物1的检测液与半胱氨酸或同型半胱氨酸待检测液混合,混合液均变为无色;将三吲哚烯化合物1的检测液与青霉胺待检测液混合,混合液变为黄色;将三吲哚烯化合物1的检测液分别与其它氨基酸待检测液混合,混合液不发生颜色变化;其中三吲哚烯化合物的结构式为:其中R=H,为三吲哚烯类化合物1;R=OCH3,为三吲哚烯类化合物2;R=X(F,Cl,Br,I),为三吲哚烯类化合物3,4,5,6。

    说明书

    比色检测含巯基氨基酸的分析方法

    技术领域

    本发明涉及一种比色检测含巯基氨基酸的分析方法。

    背景技术

    氨基酸是蛋白质的最基本的组成单位,是构成生物体内各器官最基本的物质之一。氨基酸可以合成人体中酶、激素和其它重要组成物质,能广泛参与人体各项生理活动和新陈代谢,在生命活动中发挥着特殊的重要作用,是生物体内必不可少的营养成分之一。各种必需的氨基酸具有维持生物体正常发育的保健营养作用。

    迄今为止,自然界中已发现180多种氨基酸,其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种,它们为生物体合成蛋白质所必需,在生命科学、医学和食品科学等众多领域具有重要意义。例如组氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和含硫氨基酸等对肝病有一定疗效。有些氨基酸混合液可部分地代替血浆,直接注射到人体血液中以补充营养,对创伤、烧伤和手术后的病人具有促进身体康复的作用。青霉胺由于对铜、汞、铅等重金属离子有很强的络合作用,可解人体由重金属离子引起的中毒。青霉胺还具有明显的免疫抑制作用和抗炎作用,对类风湿性关节炎及慢性活动肝炎等免疫性疾病都具有良好的疗效。而且青霉胺能阻止可溶性胶原的成熟,可用于治疗结缔组织增生性疾病。因此,对青霉胺的分析检测具有重要的实际意义。另外,当体液中某种氨基酸含量异常也可能引起众多疾病。同型半胱氨酸Hcy是体内蛋氨酸代谢过程的产物,它来源于每日食物中的蛋氨酸转化为半胱氨酸Cys的过程。血浆中Hcy水平升高是动脉粥样硬化、脑动脉闭塞性疾病、周围动脉闭塞性疾病、深静脉栓塞等血管疾病的一种独立危险因素。同时,Cys的升高可导致妊娠并发症,流产以及低体重儿。因此准确、方便、快捷地检测体液中Hcy和Cys的含量已成为控制心血管疾病和血管闭塞性疾病的重要因素之一。

    目前,国内外测定半胱氨酸、同型半胱氨酸和青霉胺的分析方法主要有荧光检测法(如Sem?D.S.等人的专利US2007054410-A1和US20070054410A1、Shiue?C.C.等人的专利US2005019937-A1和US20050019937A1、Xu?M.等人的专利US6066467-A)、紫外检测法(如Sem?D.S.等人的专利US20070054410A1)、化学发光法(如李富友等人的专利200810204420.6、200810204421.0和200910046661.7)、生物酶法(如Xu?M.X.等人的专利US006066467A、袁崇生等人的专利200480026009.4)、高效液相色谱法、电化学法、毛细管电泳法等,这些方法或多或少均存在操作复杂、灵敏度低、选择性差等缺陷。郭勇等人利用二吡咯甲烷与醌的配合物比色检测半胱氨酸,但原料成本高,二吡咯甲烷合成纯化后处理复杂(200410092788.X)。

    发明内容

    本发明的目的是提供一种利用三吲哚烯化合物比色检测含巯基氨基酸的分析方法。

    本发明的比色检测含巯基氨基酸如半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺的分析方法,通过以下措施来实现:

    一种比色检测含巯基氨基酸的分析方法,其特征在于该方法步骤为:

    A、以三吲哚烯化合物作为溶质,以色谱纯乙腈作为溶剂,制成蓝色的检测液,其浓度范围为1.0×10-4M-1×10-3M;

    B、用2-羟乙基-1-哌嗪基乙磺酸(HEPES)配制浓度为0.005-0.015M的中性缓冲水溶液(pH=7.0),以此缓冲溶液作为溶剂,分别配制成谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺的待检测液,其浓度为1.0×10-4?M-1×10-2M;

    C、将三吲哚烯化合物1的检测液与半胱氨酸或同型半胱氨酸待检测液混合,混合液均变为无色;将三吲哚烯化合物1的检测液与青霉胺待检测液混合,混合液变为黄色;将三吲哚烯化合物1的检测液分别与其它氨基酸待检测液混合,混合液不发生颜色变化。

    本发明利用了具有大共轭特殊结构的三吲哚烯化合物作为氨基酸的检测受体。三吲哚烯化合物能够稳定地存在于体积比为1∶1的乙腈-水(HEPES中性缓冲水溶液,pH=7.0)的混合溶液中,为测定水溶性氨基酸生物分子提供了便利。应用三吲哚烯化合物作为氨基酸检测受体,通过裸眼可视的颜色变化高选择性地检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和青霉胺这类含巯基的氨基酸分子,而对其他氨基酸无此比色现象,这种识别性能还可用紫外-可见分光光度仪进行对比测定。

    本发明所述的三吲哚烯化合物,其结构式为:

    其中R=H,为三吲哚烯类化合物1;R=OCH3,为三吲哚烯类化合物2;R=X(F,Cl,Br,I),为三吲哚烯类化合物3,4,5,6。

    本发明的三吲哚烯化合物的制备方法是将3-甲基吲哚、4,6-二甲氧基-3-甲基吲哚或4,6-二卤素基-3-甲基吲哚分别与原甲酸三乙酯以3∶1的摩尔比加入含有20mL无水甲醇的圆底烧瓶中,在浓硫酸存在条件下,于60℃磁力搅拌反应3-5小时,得到三吲哚烷类化合物,抽滤,用无水甲醇洗涤;再将100mg三吲哚烷类化合物用50mL丙酮和5mL蒸馏水的混合溶液溶解,在浓盐酸存在条件下,缓慢加入18.8mg亚硝酸钠与10mL蒸馏水的混合溶液,加入时间不少于15分钟,继续搅拌反应5分钟后,加入0.2mL?60%的高氯酸水溶液,室温搅拌反应1小时,旋转蒸发除去丙酮,抽滤,用热无水乙醇淋洗,再用蒸馏水淋洗,干燥即得白色或淡黄色的固体。(此合成方法参考文献French?W.N.,Journal?ofpharmaceutical?Science,1965年,54卷,12期,1726-1730页)其合成路线如下:

    其中R=H,为三吲哚烯化合物1;

    R=OCH3,为三吲哚烯化合物2;

    R=X(F,Cl,Br,I),为三吲哚烯化合物3,4,5,6。

    本发明分析方法操作简便,选择性高,不需要对样品进行特殊处理,能在较短时间内不借助任何仪器通过裸眼可见的颜色变化完成被测样品的定性分析,而对其他氨基酸无此比色检测现象。

    本发明三吲哚烯化合物高选择性比色检测含巯基氨基酸如半胱氨酸、同型半胱氨酸和青霉胺的性能还可用紫外-可见分光光度仪进行对比测定:在同样的条件下,以相应浓度的氨基酸乙腈-水(HEPES中性缓冲水溶液,pH=7.0)的混合溶液作参比,在检测液中加入半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺待检测液,三吲哚烯化合物1在500-600nm处的紫外吸收峰均几乎消失,并且在检测液中加入青霉胺待检测液,三吲哚烯化合物1不仅在500-600nm处的紫外吸收峰均几乎消失,而且在400nm处出现新的紫外吸收峰。

    本发明与常规方法相比,具有检测液配制过程简单,检测方法简便等优点。检测液能与水以任意比例相混合而无沉淀等不稳定现象产生,此方法无需对氨基酸进行衍生化处理,不借助任何仪器就能在较短时间内通过裸眼可见的颜色变化检测含巯基氨基酸如半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺,而对其他氨基酸无此比色检测现象。

    附图说明

    图1为利用三吲哚烯化合物1检测液检测含巯基氨基酸如半胱氨酸、同型半胱氨酸和青霉胺的紫外-可见吸收光谱图。图中英文缩写分别为:谷氨酸Glu;丙氨酸Ala;缬氨酸Val;亮氨酸Leu;异亮氨酸Ile;脯氨酸Pro;苯丙氨酸Phe;酪氨酸Tyr;色氨酸Trp;丝氨酸Ser;苏氨酸Thr;蛋氨酸Met;天冬氨酸Asp;甘氨酸Gly;赖氨酸Lys;精氨酸Arg;组氨酸His;谷胱甘肽GSH;半胱氨酸Cys;同型半胱氨酸Hcy;青霉胺Phenicillamine。

    具体实施方式

    实施例1

    检测液的配制:配制三吲哚烯化合物1的蓝色的乙腈溶液作为检测液,其浓度范围为1.0×10-4M-1×10-3M。各种氨基酸待检测液的配制:分别称取下列21种氨基酸(谷氨酸Glu;丙氨酸Ala;缬氨酸Val;亮氨酸Leu;异亮氨酸Ile;脯氨酸Pro;苯丙氨酸Phe;酪氨酸Tyr;色氨酸Trp;丝氨酸Ser;苏氨酸Thr;蛋氨酸Met;天冬氨酸Asp;甘氨酸Gly;赖氨酸Lys;精氨酸Arg;组氨酸His;谷胱甘肽GSH;半胱氨酸Cys;同型半胱氨酸Hcy;青霉胺Phenicillamine)于不同的试管中,将浓度为0.005-0.015M的HEPES中性缓冲水溶液作为溶剂,分别配制成1.0×10-4M-1×10-2M的待检测液。

    实施例2

    以三吲哚烯化合物1为受体检测氨基酸:将上述各种氨基酸的待检测液分别与同体积的三吲哚烯化合物1检测液混合,用体积比为1∶1的乙腈-水(HEPES中性缓冲水溶液,pH=7.0)的混合溶液稀释,使三吲哚烯化合物1的浓度为5×10-5M,并且上述各种氨基酸的浓度均为三吲哚烯化合物1浓度的100倍,混合均匀后观察各种混合溶液的颜色变化。若溶液颜色变为无色,则为半胱氨酸或同型半胱氨酸的溶液;若溶液颜色变为黄色,则为青霉胺的溶液。在同样的条件下,以相应浓度的氨基酸乙腈-水(HEPES中性缓冲水溶液,pH=7.0)的混合溶液为参比,用紫外-可见分光光度仪测定三吲哚烯化合物1的吸收峰变化,所测结果如图1所示。若发现溶液在500-600nm处的吸收峰几乎消失,则为半胱氨酸或同型半胱氨酸的溶液;若发现溶液在500-600nm处的吸收峰几乎消失,并且在400nm处出现新的吸收峰,则为青霉胺的溶液。

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