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    重庆时时彩交流吧: 用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法.pdf

    关 键 词:
    指示 免疫 层析 定量 诊断 早期 前列腺癌 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110148740.6

    申请日:

    2011.06.03

    公开号:

    CN102221617A

    公开日:

    2011.10.19

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/68申请公布日:20111019|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20110603|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 正元盛邦(天津)生物科技有限公司
    发明人: 霍五奎; 岳晓燕; 马雪明; 刘寅; 王晶; 罗云萍; 张有青
    地址: 300457 天津市经济技术开发区洞庭路220号S901
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110148740.6

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.04.20|||2014.04.23|||2011.10.19

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法,具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法。前列腺癌是中老年男性的常见多发病,据统计,在男性癌症患者中,前列腺癌发病率最高,是除肺癌和大肠癌外的第三位死因。目前,临床上常用的PSA检测的方法为ELISA,CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。免疫胶体金技术近年来发展迅速,得到了广泛应用,如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法,建立快速检测PSA的方法。并且能够半定量检测4ng/mL~10ng/mL这一PSA灰区范围,并结合年龄指导前列腺活检。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法,其特征在于,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗PSA单克隆抗体1并均匀涂布于胶体金垫上,作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上,两个不同浓度的PSA单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线),羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装,剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色,根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

    2.  根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法,其特征在于,抗体划线浓度为:
    T1线用浓度为0.4mg/mL的PSA单克隆抗体2划线,用于检出4ng/mL的PSA;
    T2线用浓度为0.19mg/mL的PSA单克隆抗体2划线,用于检出10ng/mL的PSA;
    C线用3.5mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线;
    将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

    3.  根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法,其特征在于,运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线,以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。

    说明书

    说明书用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法
    技术领域
    本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法,具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断早期前列腺癌的方法。
    背景技术
    前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中老年男性的常见多发病,在男性所有类型癌中占10%~20%,是男性最常见的癌种。据统计,在男性癌症患者中,前列腺癌发病率最高,是除肺癌和大肠癌外的第三位死因。该病进展缓慢,是威胁50岁以上男性生命的主要癌症,在西方国家占男性癌死亡率的第二位,在北欧各国发病率占男性癌瘤的第一位,在美国发病率为14.3%,仅次于肺癌,占男性恶性肿瘤的10%,居男性癌瘤的第二位。
    我国PCa发病率虽较低,但近年随着人口老龄化及生活条件的改善,发病率有明显增加的趋势,在我国男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位。预计今后5~10年内前列腺癌将成为我国老年常见的恶性肿瘤。但遗憾的是,许多病人就诊时已达晚期,从而失去了治疗机会。为此,专家呼吁,50岁以上的男性应高度警惕前列腺癌的发生,并每年常规检查一次血中的前列腺特异性抗原(PSA)。我国前列腺癌发病率虽低于西方国家,但随着PSA及其他检测方法的广泛应用,前列腺癌的发病率和检出率逐渐增高。这表明,未来我国对于高质量的前列腺癌诊断产品,尤其是PSA诊断产品的需求将越来越大。
    前列腺肿瘤由于腺体生理位置的限制生长非?;郝梢猿中ば矶嗄?。在其生长期间几乎没有任何症状和体征。当肿瘤恶性进展可以突破前列腺包膜侵犯周围组织,也可以转移到其他器官例如骨、肺以及肝。症状和体征多出现于恶性进展的肿瘤。由于前列腺癌多发生于后叶,早期并无症状,即使有不适,也不足以引起病人的重视,因此给早期诊断带来了困难。一旦临床上出现了明显症状,往往已属于病变的晚期。因此,早期发现并及时就诊成为提高前列腺癌治愈率的焦点问题,而目前,对于前列腺癌的早期检测集中于前列腺特异抗原PSA这一特异性蛋白。较高的PSA水平意味着癌症也许会存在,这时就需要进行活检来确认诊断。经直肠超声引导前列腺穿刺活检术是目前诊断前列腺癌的主要方法之一,但是这种穿刺活检术会引发并发症,同时其费用也较高。目前,临床上常用的PSA检测的方法为ELISA,CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵??⒓虻?、快速的前列腺癌早期诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。
    免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创,最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂,于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术,现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合,形成特定的免疫检测方式,如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向,是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速,已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用,如传染病、早孕、癌症等的检测。
    利用胶体金的检测方法测定血清中PSA作为前列腺癌的早期诊断,在国外已被开发,其检测下限为10ng/mL,其灵敏度可达100%,特异性可达92.5%。但是对于临床上不同年龄PSA正常值的差异,单独使用10ng/mL这一标准会造成漏诊,使很多患者错失早期治疗的机会,所以开发能够检测PSA4~10ng/mL这一PSA诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。
    发明内容
    本发明的目的:开发简单、快速的前列腺癌早期诊断方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法,建立快速检测PSA的方法。并且能够半定量检测4ng/mL~10ng/mL这一PSA灰区范围,并结合年龄指导前列腺活检。
    本发明是通过以下技术方案实现的:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗PSA单克隆抗体1并均匀涂布于胶金垫上,作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上,两个不同浓度的PSA单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线),羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装,剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色,根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。
    本发明方法包括如下步骤:
    一、胶体金溶液配制
    1.配制1%氯金酸溶液;
    2.配制2%柠檬酸三钠溶液;
    3.将0.02%的氯金酸溶液加热至沸腾,迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL;
    4.溶液由浅蓝色,深蓝,再加热出现酒红色,继续煮沸10min;
    停止加热,继续搅拌至室温。
    二、胶体金标记物的制备
    1.取两个1.5mL试管,分别加入1mL胶体金溶液;
    2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.8;
    3.加入20μg/mLPSA单克隆抗体1,使其达到最小蛋白浓度,混匀,振荡30min;
    4.加入20μL的10%BSA,混匀,振荡30min;
    5.12000rpm离心5min,轻轻吸除上清;
    6.用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀;
    7.重复5.步操作;
    8.重复6.步操作;
    9.重复5.步操作;
    10.用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5~1.0的胶体金免疫复合物;
    11.玻璃纤维素膜点样,形成胶金垫,真空冻干3小时。
    三、在硝酸纤维素膜上划线
    1.T1线用浓度为0.4mg/mL的PSA单克隆抗体2划线,用于检出4ng/mL的PSA;
    2.T2线用浓度为0.19mg/mL的PSA单克隆抗体2划线,用于检出10ng/mL的PSA;
    3.C线用3.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线;
    4.将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。
    四、胶体金试纸条的组装
    1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1);
    2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。
    五、检测
    试纸平放,将样品加到检测条的样本垫上,由于毛细效应,液体的层析方向向前,与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后,根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中PSA水平大于4ng/mL(见附图2),C线与两条检测带都出现红色为样本中PSA水平大于10ng/mL(见附图3),只有C线出现红色的为阴性(见附图4),T线和C线均不显色则试纸条无效。
    本发明检测对象单一且针对性强,准确率高。检测速度快,所需时间短,只需5min,不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测,满足医院、门诊等部门快速、准确地诊断前列腺癌的要求,并且便于基层推广和运用。
    附图说明
    图1为本发明实施例试纸条的图示
    图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(PSA水平大于4ng/mL)
    图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(PSA水平大于10ng/mL)
    图4为本发明实施例试纸条的阴性结果
    具体实施方式
    下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的?;し段Р幌抻谙率龅氖凳├?。
    下面实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
    本实例先用2%的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水,并标记PSA单克隆抗体1,按金标单克隆抗体、PSA单克隆抗体2、羊抗鼠多克隆抗体喷金标垫、检测线(T线)、质控线(C线),然后组装成试纸条,置37℃烘箱烘干并裁成4mm/条,室温干燥保存备用。
    实施例
    1.准备PSA单克隆抗体1和2。并清洗实验所需的玻璃器皿。
    2.胶体金的制备
    先将0.02%氯金酸溶液溶液加热煮沸,迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL;
    溶液颜色由浅蓝色变为深蓝,继续加热出现酒红色,继续煮沸10min;出现透明的酒红色,停止加热,继续搅拌至室温。这样就制备了20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检,确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均匀,颗粒直径在20nm左右,否则重新制作。
    3.胶体金标记物的制备
    取两个1.5mL试管,分别加入1mL胶体金溶液;向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为8.8;加入20μg/mLPSA单克隆抗体1,使其达到最小蛋白浓度,混匀,于振荡仪上快速振荡30min;加入20μL的10%BSA,混匀,振荡30min;于离心机中12000rpm,离心5min,轻轻吸除上清;用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀;于离心机中12000rpm,离心5min,轻轻吸除上清;用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀;于离心机中12000rpm,离心5min,轻轻吸除上清;用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5~1.0的胶体金免疫复合物;在玻璃纤维素膜上点样,形成胶金垫,真空冻干3小时。
    4.胶体金试纸条的组装
    分别将0.4mg/mL和0.19mg/mL的PSA单克隆抗体2划在硝酸纤维素膜的检测线(T线)上,将3.5mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40℃干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。
    5.胶体金试纸条的使用及结果判读
    检测前,先提取被检者的血清样本。
    然后把试纸条试纸平放,将样品加到检测条的样本垫上,由于毛细效应,液体的层析方向向前,与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后,根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与靠近C线的检测带出现红色为样本中PSA水平大于4ng/mL(见附图2),C线与两条检测带都出现红色为样本中PSA水平大于10ng/mL(见附图3),只有C线出现红色的为阴性(见附图4),T线和C线均不显色则试纸条无效。
    实施例可直接检测样品中的PSA,使用方法不需要专业培训,操作方便、快速,5min即可获得结果,可达到快速、简便、及时地检测PSA的目的。

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