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    重庆时时彩合作平台: 参与昆虫电压门控钾通道活性的调节害虫的生理状况的试剂.pdf

    关 键 词:
    参与 昆虫 电压 门控 通道 活性 调节 害虫 生理 状况 试剂
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980146555.4

    申请日:

    2009.09.24

    公开号:

    CN102224166A

    公开日:

    2011.10.19

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07K 14/435申请公布日:20111019|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/435申请日:20090924|||公开
    IPC分类号: C07K14/435; G01N33/94 主分类号: C07K14/435
    申请人: 住友化学株式会社
    发明人: 大槻纯子; 马克·洛吉; 泰特斯·卡莱塔; 温迪·马德雷恩
    地址: 日本国东京都
    优先权: 2008.09.24 JP 2008-243846
    专利代理机构: 中科专利商标代理有限责任公司 11021 代理人: 吴小明
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980146555.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.04.01|||2011.11.30|||2011.10.19

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种调节害虫的生理状况的试剂,其中所述试剂具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力;一种测定测试物质的杀虫活性的方法,该方法包括测量反应系统中电压-门控钾通道的活性,在该反应系统中电压-门控钾通道与测试物质接触;等等。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:
    (1)在系统中测量线虫的摄食行为活动的第一步骤,所述线虫以起离子通道作用的形式表达选自下面A组的电压-门控钾通道,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的摄食行为活动和在不含测试物质的系统中所述线虫的摄食行为活动而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性,
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增。

    2.  一种测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:
    (1)在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性,
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增。

    3.  一种筛选杀虫物质的方法,包括选择具有由权利要求1或2所述的方法评价的杀虫活性的物质。

    4.  一种杀虫剂,包括通过权利要求3所述的方法选择的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分。

    5.  一种调节害虫的生理状况的试剂,其中所述试剂具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力。

    6.  根据权利要求5所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道。

    7.  根据权利要求6所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是昆虫ERG-型电压-门控钾通道。

    8.  根据权利要求7所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道。

    9.  根据权利要求5所述的试剂,其中所述试剂是杀虫剂。

    10.  根据权利要求5所述的试剂,其中所述调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力是调节以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,或调节在以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞中的昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力。

    11.  一种杀虫剂,包括一种物质或所述物质的农业上可接受的盐作为活性成分,所述物质具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力。

    12.  根据权利要求11所述的杀虫剂,其中所述物质具有调节以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力。

    13.  根据权利要求12所述的杀虫剂,其中所述物质具有抑制以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中在存在30μM以上的所述物质的条件下,所述摄食行为活动少于在不存在所述物质的条件下的摄食行为活动。

    14.  根据权利要求12所述的杀虫剂,其中所述物质具有抑制以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中摄食行为活动降低50%时的所述物质的有效浓度是100μM以下。

    15.  根据权利要求12所述的杀虫剂,其中所述物质具有激活以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中在存在30μM以上的所述物质的条件下,所述摄食行为活动多于在不存在所述物质的条件下的摄食行为活动。

    16.  根据权利要求12所述的杀虫剂,其中所述物质具有激活以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中摄食行为活动增加50%时的所述物质的有效浓度是100μM以下。

    17.  根据权利要求11所述的杀虫剂,其中所述物质具有调节在以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞中的昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力。

    18.  一种控制害虫的方法,包括向所述害虫、所述害虫的栖息地或要?;っ馐芩龊Τ嫔撕Φ闹参锸┯糜行Я康娜ɡ?或11-17中任一项所述的杀虫剂。

    19.  一种控制害虫的方法,包括:
    鉴定具有由权利要求1或2所述的方法评价的杀虫活性的物质,以及
    将所鉴定的杀虫物质与所述害虫接触。

    20.  一种电压-门控钾通道,其包括选自下面B组中的氨基酸序列:
    <B组>
    (a)SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并具有SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列中一个或多个氨基酸缺失、添加或置换的氨基酸序列,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上序列同一性的氨基酸序列,
    (d)由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并由与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并由多核苷酸编码的氨基酸序列,其中所述多核苷酸在严谨的条件下与包括与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交,
    (g)昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    (h)棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增。

    21.  以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用。

    22.  以起离子通道作用的形式表达权利要求20所述的电压-门控钾通道的线虫作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用。

    23.  以起离子通道作用的形式表达权利要求20所述的电压-门控钾通道的细胞作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用。

    24.  一种多核苷酸,包括编码权利要求20所述的电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列。

    25.  根据权利要求24所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列。

    26.  一种多核苷酸,包括与权利要求24或25所述的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

    27.  一种多核苷酸,包括:权利要求24或25所述的多核苷酸的部分核苷酸序列;或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

    28.  根据权利要求27所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:11-15中的任一核苷酸序列。

    29.  一种获得包括编码电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法,所述方法包括:使用权利要求27或28所述的多核苷酸作为引物,通过聚合酶链式反应扩增所需多核苷酸的步骤;鉴定扩增的所需多核苷酸的步骤;以及回收所鉴定的多核苷酸的步骤。

    30.  一种获得包括编码电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法,包括:
    使用权利要求26,27或28所述的多核苷酸作为探针,通过杂交检测所需多核苷酸的步骤;鉴定检测到的所需多核苷酸的步骤;以及回收所鉴定的多核苷酸的步骤。

    31.  一种环状多核苷酸,其包括:可操作地连接于在宿主生物体或宿主细胞中可表达的启动子的权利要求24或25所述的多核苷酸。

    32.  一种环状多核苷酸,其包括:可操作地连接于来自线虫的启动子的权利要求24或25所述的多核苷酸。

    33.  根据权利要求32所述的环状多核苷酸,其中所述来自线虫的启动子是myo-2基因的启动子。

    34.  根据权利要求31,32或33所述的环状多核苷酸,其中所述环状多核苷酸具有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点。

    35.  一种产生环状多核苷酸的方法,包括将权利要求24或25所述的多核苷酸连接于载体。

    36.  一种转化体,其中已经导入了权利要求24或25所述的多核苷酸。

    37.  瞬间表达昆虫电压-门控钾通道的细胞,其中已经在其中导入了权利要求24或25所述的多核苷酸的转录产物。

    38.  根据权利要求36所述的转化体,其中所述转化体是转化的大肠杆菌(Escherichia coli)。

    39.  根据权利要求36所述的转化体,其中所述转化体是转化的线虫。

    40.  根据权利要求39所述的转化体,其中所述线虫是秀丽隐杆线虫(Caenorhabdtis elegans)。

    41.  一种产生转化体的方法,包括将权利要求24或25所述的多核苷酸导入至宿主细胞中。

    42.  一种产生电压-门控钾通道的方法,包括培养权利要求36,38,39或40所述的转化体以及回收所产生的电压-门控钾通道的步骤。

    43.  权利要求20所述的电压-门控钾通道或权利要求24-28中任意一项所述的多核苷酸作为研究工具的应用。

    44.  根据权利要求43所述的应用,其中所述研究工具是用于筛选杀虫剂的研究工具。

    45.  一种测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的方法,包括:
    (1)在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白;
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白;
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性;
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性;
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增。

    46.  根据权利要求45的方法,其中所述细胞是来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞。

    47.  一种测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的方法,包括:
    (1)在系统中测量线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述线虫以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中的线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质的调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白;
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白;
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性;
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性;
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增。

    48.  根据权利要求47的方法,其中所述线虫是秀丽隐杆线虫。

    49.  一种关于测试物质的系统,包括:输入/累积/管理数据信息的装置,所述数据信息涉及改变来自具有测试物质的昆虫的电压-门控钾通道的活性的能力,基于所需条件查询/检索所述数据信息的装置,和显示/输出查询/检索的结果的装置。

    说明书

    说明书参与昆虫电压-门控钾通道活性的调节害虫的生理状况的试剂
    技术领域
    本发明涉及调节害虫的生理状况、参与昆虫电压-门控钾通道活性的试剂等。
    背景技术
    电压-门控钾通道是对膜电位应答从而选择性渗透钾离子并普遍存在于动物、植物、和微生物中的膜蛋白,并包括多种分子种类。根据结构和生理学功能特征,将电压-门控钾通道分类为许多家族,即Shaker型,EAG(ether-a-go-go)型,KvLQT等等(Gutman等,Pharmacol.Reviews(药理学综述),55(4):583-586,2003)。
    Seizure是人ERG(hERG)的昆虫同源物并是电压-门控钾通道EAG家族的成员。EAG家族由三个亚家族EAG(ether-a-go-go),ERG(EAG相关基因)和ELK(EAG样基因)组成。根据国际基础和临床药理学协会(IUPHAR)的命名法:EAG是Kv10.x,ERG是Kv11.x且ELK是Kv12.x。人EAG家族也称为KCNH家族。
    seizure基因产物是来自电压-门控离子通道的6-跨膜结构域超家族的电压-门控钾通道亚基(VGKC)。概括地,钾通道功能的降低导致细胞的兴奋性过高且钾通道功能的激活导致细胞的兴奋性过低。
    黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)seizure无效突变体表现出活动过度表型。由Wang等(J.Neurosci.(神经系统科学杂志),17(3):882-890,1997)所述的全部无效突变体在高温条件下显示另外的表型,即瘫痪。
    秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的seizure直向同源unc-103的失功能突变体不表现出明显的缺陷,但是获功能(通道激活)突变导致严重的运动和产卵缺陷(WormBase,www.wormbase.org/)。这些数据说明seizure-样钾通道的过度激活也导致严重的神经肌肉缺陷。
    农业化学品的发现传统上是基于随机筛选过程,经常直接测试特定化学品对整个生物体(害虫),诸如昆虫、真菌和植物的影响并测定生物学活性。一旦发现具有合适生物学活性的化合物,则需要进行更深入的研究,以具体确定这些化合物在分子水平上的作用模式或作用位点,从而预测这些化合物的安全性和环境负担。
    发明内容
    本发明描述一种更加基于目标的筛选农业化学品的方法,其中针对特定的目标筛选化合物,所述目标已经鉴定为在生物学和/或生理学上,与化学干扰目标位点以控制昆虫或其他害虫生物体的目的相关。
    具体地,本发明描述了使用一种调节害虫的生理状况并具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的试剂有效用于控制害虫。
    即,本发明提供:
    1.一种调节害虫的生理状况的试剂,其中所述试剂具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力。
    2.根据第1项所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道;
    3.根据第2项所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是昆虫ERG-型电压-门控钾通道;
    4.根据第3项所述的试剂,其中所述电压-门控钾通道是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道;
    5.根据第1项所述的试剂,其中所述试剂是杀虫剂;
    6.根据第1项所述的试剂,其中所述调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力是调节以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,或调节在以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞中的昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力;
    7.一种杀虫剂,包括具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的物质或所述物质的农业上可接受的盐作为活性成分;
    8.根据第7项所述的杀虫剂,其中所述物质具有调节以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力;
    9.根据第8项所述的杀虫剂,其中所述物质具有抑制以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中在存在30μM以上的所述物质的条件下,所述摄食行为活动少于在不存在所述物质的条件下的摄食行为活动;
    10.根据第8项所述的杀虫剂,其中所述物质具有抑制以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中摄食行为活动降低50%时所述物质的有效浓度是100μM以下;
    11.根据第8项所述的杀虫剂,其中所述物质具有激活以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中在存在30μM以上的所述物质的条件下,所述摄食行为活动多于不存在所述物质条件下的摄食行为活动;
    12.根据第8项所述的杀虫剂,其中所述物质具有激活以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的能力,其中摄食行为活动增加50%时所述物质的有效浓度是100μM以下;
    13.根据第7项所述的杀虫剂,其中所述物质具有调节在以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞中的昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力;
    14.一种测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:
    (1)在系统中测量线虫的摄食行为活动的第一步骤,所述线虫以起离子通道作用的形式表达选自下面A组的电压-门控钾通道,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的摄食行为活动和在不含测试物质的系统中所述线虫的摄食行为活动而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性,
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列;
    15.一种测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:
    (1)在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性,
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列;
    16.一种筛选杀虫物质的方法,包括选择具有由第14或15项所述的方法评价的杀虫活性的物质;
    17.一种杀虫剂,包括通过第16项所述的方法选择的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分;
    18.一种控制害虫的方法,包括向所述害虫、所述害虫的栖息地或要?;っ馐芩龊Τ嫔撕Φ闹参锸┯糜行Я康牡?-13或17项中任一项所述的杀虫剂;
    19.一种控制害虫的方法,包括:
    鉴定具有由第14或15项所述的方法评价的杀虫活性的物质,以及
    将所鉴定的杀虫物质与所述害虫接触;
    20.一种电压-门控钾通道,其包括选自下面B组中的氨基酸序列:
    <B组>
    (a)SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并具有SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列中一个或多个氨基酸缺失、添加或置换的氨基酸序列,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上序列同一性的氨基酸序列,
    (d)由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并由与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并由多核苷酸编码的氨基酸序列,其中所述多核苷酸在严谨的条件下和包括与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交,
    (g)昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    (h)棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列;
    21.以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用;
    22.以起离子通道作用的形式表达第20项所述的电压-门控钾通道的线虫作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用;
    23.以起离子通道作用的形式表达第20项所述的电压-门控钾通道的细胞作为提供评价杀虫活性的指示物的研究工具的应用;
    24.一种多核苷酸,包括编码第20项所述的电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列;
    25.根据第24项所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列;
    26.一种多核苷酸,包括与第24或25项所述的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列;
    27.一种多核苷酸,包括:第24或25项所述的多核苷酸的部分核苷酸序列;或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列;
    28.根据第27项所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:11-15中的任一核苷酸序列;
    29.一种获得包括编码电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法,包括:使用第27或28项所述的多核苷酸作为引物,通过聚合酶链式反应扩增所需多核苷酸的步骤;鉴定扩增的所需多核苷酸的步骤;以及回收所鉴定的多核苷酸的步骤;
    30.一种获得包括编码电压-门控钾通道的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法,包括:
    使用第26,27或28项所述的多核苷酸作为探针,通过杂交检测所需多核苷酸的步骤;鉴定检测到的所需多核苷酸的步骤;以及回收所鉴定的多核苷酸的步骤;
    31.一种环状多核苷酸,其包括第24或25项所述的多核苷酸,所述第24或25项所述的多核苷酸可操作地连接于在宿主生物体或宿主细胞中可表达的启动子;
    32.一种环状多核苷酸,其包括第24或25项所述的多核苷酸,所述第24或25项所述的多核苷酸可操作地连接于来自线虫的启动子;
    33.根据第32项所述的环状多核苷酸,其中所述来自线虫的启动子是myo-2基因的启动子;
    34.根据第31,32或33项所述的环状多核苷酸,其中所述环状多核苷酸具有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点;
    35.一种产生环状多核苷酸的方法,包括将第24或25项所述的多核苷酸连接于载体;
    36.一种转化体,其中已经导入了第24或25项所述的多核苷酸;
    37.瞬间表达昆虫电压-门控钾通道的细胞,其中已经在所述细胞中导入了第24或25项所述的多核苷酸的转录产物;
    38.根据第36项所述的转化体,其中所述转化体是转化的大肠杆菌;
    39.根据第36项所述的转化体,其中所述转化体是转化的线虫;
    40.根据第39项所述的转化体,其中所述线虫是秀丽隐杆线虫;
    41.一种产生转化体的方法,包括将第24或25项所述的多核苷酸导入至宿主细胞中;
    42.一种产生电压-门控钾通道的方法,包括培养第36,38,39或40项所述的转化体以及回收产生的电压-门控钾通道的步骤;
    43.如第20项定义的电压-门控钾通道或第24-28项中任意一项所述的多核苷酸作为研究工具的应用;
    44.根据第43项所述的应用,其中所述研究工具是用于筛选杀虫剂的研究工具;
    45.一种测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的方法,包括:
    (1)在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白;
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白;
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性;
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性;
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列;
    46.根据第45项的方法,其中所述细胞是来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞;
    47.一种测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的方法,包括:
    (1)在系统中测量线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述线虫以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及
    (2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中的线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质的调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的第二步骤;
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白;
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白;
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性;
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性;
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列;
    48.根据第47项的方法,其中所述线虫是秀丽隐杆线虫;和
    49.一种关于测试物质的系统,包括:输入/累积/管理数据信息的装置,所述数据信息涉及改变来自具有测试物质的昆虫的电压-门控钾通道的活性的能力;基于所需条件查询/检索所述数据信息的装置;和显示/输出查询/检索的结果的装置。

    附图简述
    图1显示实施例2的结果。
    图2显示实施例6的结果。
    图3显示实施例6的结果。
    图4显示实施例6的结果。
    图5显示实施例6的结果。
    图6显示实施例6的结果。
    图7显示实施例6的结果。
    图8显示实施例6的结果。
    图9显示实施例7的结果。
    图10显示实施例10的结果。
    图11显示实施例10的结果。
    具体实施方式
    下面将详细地解释本发明。
    在本发明中,“害虫”指通过直接伤害人和动物或通过损害庄稼使人类生活受伤害或不适的小动物。其实例包括节肢动物诸如昆虫、螨类和虱类和线虫动物门(Nematoda)诸如线虫类,并且其典型的实例如下:半翅目(Hemiptera):
    飞虱科(Delphacidae)如灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)和白背稻飞虱(Sogatella furcifera),角顶叶蝉科(Deltocephalidae)如黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和茶绿叶蝉(Empoasca onukii),蚜科(Aphididae)如棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae),蝽科(Pentatomidae),粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)和Bemisia argentifolli,蚧科(Coccidae),网蝽科(Tingidae),木虱科(Psyllidae),等;
    鳞翅目(Lepidoptera):
    螟蛾科(Pyralidae)如二化螟(Chilo suppressalis)、稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocis medinalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nuhilalis)和Parapediasia teterrella,夜蛾科(Noctuidae)如斜蚊贪夜蛾(Spodoptera litura)、贪夜蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Pseudaletia separata)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、实夜蛾属(Heliothis spp.)、Helicoverpa spp.和山卷蛾(Earias spp.),粉蝶科(Pieridae)如菜粉蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora),卷蛾科(Tortricidae)如棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholita molesta)和苹果皮小卷蛾(Cydia pomonella),蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposina niponensis),Bucculatricidae如桃潜夜蛾(Lyonetia clerkella),细蛾科(Gracillariidae)如金纹小潜细蛾(Phyllonorycter ringoniella),夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾(Phyllocnistis citrella),巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutella xylostella),麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella),灯蛾科(Arctiidae),谷蛾科(Tineidae),等;
    双翅目(Diptera):
    库蚊属(Culex)如淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、三带喙库蚊(Cules tritaeniorhynchus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus),伊蚊属(Aedes)如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus),按蚊属(Anopheles)如中华按蚊(Anophelinae sinensis),摇蚊科(Chironomidae),蝇科(Muscidae)如家蝇(Musca domestica)和厩腐蝇(Muscina stabulans),丽蝇科(Calliphoridae),麻蝇科(Sarcophagidae),夏厕蝇(Fannia canicularis),花蝇科(Anthomyiidae)如灰地种蝇(Delia Platura)和葱地种蝇(Delia antigua),实蝇科(Trypetidae),果蝇科(Drosophilidae),毛蠓科(Psychodidae),蚋科(Simuliidae),虻科(Tabanidae),螫蝇科(Stomoxyidae),潜蝇科(Agromyzidae),等;
    翘翅目(Coleoptera):
    谷物食虫(Diabrotica)如西方谷物食虫(Diabrotica virgifera virgifera)和南方谷物食虫(Diabrotica undecimpunctata howardi),金龟科(Scarabaeidae)如古铜异丽金龟(Anomala cuprea)和多色异丽金龟(Anomala rufocuprea),象虫科(Curculionidae)如玉米象(Sitophilus zeamais)、稻水象(Lissorphoptrus oryzophilus)和绿豆象(Calosobruchys chinensis),拟步甲科(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio molitor)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum),叶甲科(Chrysomelidae)如水稻负泥虫(Oulema oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoralis)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata),窃蠹科(Anobiidae),瓢虫(Epilachna spp.)如二十八斑瓢虫(Epilachna vigintioctopunctata),粉蠹科(Lyctidae),长蠹科(Bostrychidae),天???Cerambycidae),毒隐翅虫(Paederus fuiscipes),等;
    缨翅目(Thysanoptera):
    蓟马科(Thripidae),如包括棕榈蓟马(Thrips palmi)的蓟马属(Thrips spp.),包括西方花蓟马(Flankliniella occidentalis)的花蓟马属(Frankliniella spp.),和包括Sciltothrips dorsalis的Sciltothrips,管蓟马科(Phlaeothripidae),等;
    膜翅目(Hymenoptera):
    叶蜂科(Tenthredinidae),蚁科(Formicidae),胡蜂科(Vespidae),等;
    网翅目(Dictyoptera):
    蜚蠊科(Blattidae),姬蠊科(Blattellidae),等;
    直翅目(Orthoptera):
    剑角蝗科(Acrididae),蝼蛄科(Gryllotalpidae),等;
    蚤目(Siphonaptera):
    人蚤(Pulex irritans),等;
    虱目(Anoplura):
    体虱(Pediculus humanus capitis),等;
    等翅目(Isoptera):
    白蚁科(Termitidae),等;
    蜱螨目(Acarina):
    叶螨科(Tetranychidae)如二斑叶螨(Tetranychus urticae)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)和小爪螨属(Oligonychus spp.),瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(Aculops pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculus schlechtendali),跗线螨科(Tarsonemidae)如侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus),细须螨科(Tenuipalpidae),杜克螨科(Tuckerellidae),硬蜱科(Ixodidae)如长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)、台湾革蜱(Dermacentor taiwanicus)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和微小牛蜱(Boophilus microplus),粉螨科(Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae),皮刺螨科(Dermanyssidae),肉食螨科(Cheyletidae)如粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoides ptrenyssnus),诸如普通肉食螨(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食螨(Cheyletus malaccensis)和Cheyletus moorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.),等;
    线虫类(Nematodes):
    咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae),伪短体线虫(Pratylenchus fallax),大豆异皮线虫(Heterodera glycines),马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis),北方根结线虫(Meloidogyne hapla),南方根结线虫(Meloidogyne incognita),等。
    在本发明中,“调节害虫的生理状况”是指将诸如活体内各种现象或其机制的状况改变成不同于通常状况的状况,所述现象是用于维持害虫生存的现象,例如,诸如呼吸、消化、分泌、体液循环、新陈代谢、神经传递等。实例包括通过停止呼吸以致不提供用于害虫体内新陈代谢所必需的氧气而改变状况,和通过停止害虫的神经传递功能以致害虫的各种运动停止而改变状况。
    在本发明中,“调节害虫的生理状况的试剂”是当施用于害虫时可以调节害虫的生理状况的试剂。
    在本发明中,“来自昆虫的电压-门控钾通道”指昆虫中存在的电压-门控钾通道,其是各种生物体中存在的电压-门控钾通道之一。作为电压-门控钾通道,优选地,来自昆虫的电压-门控钾通道是来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道,更优选地,来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道是昆虫ERG-型电压-门控钾通道(seizure),且进一步优选地,昆虫ERG-型电压-门控钾通道是来自棉蚜的ERG-型电压-门控钾通道(seizure)。
    昆虫是在动物界(Animalia),节肢动物门(Arthropod),昆虫纲(Insecta)下分类的动物,并且它的实例包括下列各目的节肢动物:原尾目(Protura),弹尾目(Collembola),双尾目(Diplura),缨尾目(Thysanura),蜉蝣目(Ephemeroptera),蜻蜓目(Odonata),织翼夜蛾目(Plecoptera),蛩蠊目(Grylloblattodea),直翅目(Orthoptera),竹节虫目(Phasmatodea),革翅目(Dermaptera),螳螂目(Mantodea),蜚蠊目(Blattaria),等翅目(Isoptera),纺足目(Embioptera),啮虫目(Psocoptera),食毛目(Mallophaga),虱目(Anoplura),缨翅目(Thysanoptera),半翅目(Hemiptera),脉翅目(Neuroptera),长翅目(Mecoptera),毛翅目(Trichoptera),鳞翅目(Lepidoptera),鞘翅目(Coleoptera),双翅目(Diptera),膜翅目(Hymenoptera),蚤目(Siphonaptera),捻翅目(Strepsiptera),等。
    离子通道是细胞的生物膜中存在的一种跨膜蛋白,并使离子经由在其中心处形成的称为孔的亲水性路径渗透。离子通道参与维持膜电位或细胞内和细胞外各种离子的浓度,在可电兴奋的细胞诸如神经细胞中产生动作电位,和信号转导。
    离子通道的活性一般可以通过电生理学方法来测量。电压-门控钾通道的活性可以例如通过双电极电压钳方法(TEVC法)、利用表达目标离子通道的非洲爪蟾卵母细胞来测量,如Bruggemann等的报告所述(Nature(自然)365(6445),445-448,1993),或通过膜片钳方法、利用表达目标离子通道的培养的细胞来测量,如Schonherr等的报告所述(European Journal of Neuroscinece(欧洲神经科学杂志)11(3),753-760,1999)。在这些方法中,使用电极直接读取离子流,并测量离子通道活性。在已知作为模式生物体的秀丽隐杆线虫(以下在一些情形中称为线虫)中,伴随有咽部收缩运动(抽吸(pumping))的电位变化可以利用称为咽电图(electropharyngeogram)的电生理学方法来测量,如Raizena和Avery的报告所述(Neuron(神经元)12(3),483-495,1994)。咽电图的波形反映在与咽部诸如咽部肌肉收缩相关的位点处表达的离子通道和转运蛋白的活性。因此,通过记录在咽部表达目标离子通道的转基因线虫的咽电图,可以间接测量目标离子通道的活性,如稍后所述。
    测量昆虫电压-门控钾通道的活性的方法可以通过与电生理学程序类似的方法来执行。
    在本发明中,“以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道”意指在这样的状态下表达电压-门控钾通道,其中所述通道具有使得钾离子渗透的活性,并且所述活性可以通过前述各种电生理学方法来测量。
    在本发明中,“EAG家族”由EAG(ether-a-go-go),ERG(EAG-相关基因),和ELK(EAG-样基因)组成,其属于电压-门控钾通道。根据国际基础和临床药理学协会(IUPHAR)的分类名称:EAG是Kv10.x,ERG是Kv11.x且ELK是Kv12.x。人EAG家族也称为KCNH家族。
    在本发明中,“ERG-型电压-门控钾通道”指与作为EAG家族成员的ERG(EAG-相关基因)同源的基因的产物。作为人ERG(hERG)的昆虫同源物,seizure存在于黑腹果蝇中。线虫(秀丽隐杆线虫)的seizure直向同源物是unc-103。
    在来自昆虫的电压-门控钾通道中,作为ERG-型电压-门控钾通道或seizure的氨基酸序列,以下各项的氨基酸序列已经公开在公共数据库中:
    黑腹果蝇(登记号NP_476713),
    赤拟谷盗(Tribolium castaneum)(登记号XP_973853),
    意大利蜜蜂(Apis mellifera)(登记号XP_393977),
    冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)(登记号XP_308166),等等。
    在来自昆虫的电压-门控钾通道中,作为编码ERG-型电压-门控钾通道或seizure的核苷酸序列,以下各项的核苷酸序列已经公开在公共数据库中:
    黑腹果蝇(登记号NM_057365),
    赤拟谷盗(登记号XM_968760),
    意大利蜜蜂(登记号XM_393977),
    冈比亚按蚊(登记号XM_308166),等等。
    通过稍后所述的方法,揭示尚未知的棉蚜seizure的氨基酸序列及其基因的核苷酸序列成为可能,并且通过这些方法获得的氨基酸序列和基因的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:1,3,5,7,和SEQ ID NO:2,4,6,8中公开。
    以SEQ ID NO:3所示的棉蚜seizure的氨基酸序列与已知序列的的同一性显示在表1中。
    表1


    在本发明中,“调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力”指增加或减小昆虫电压-门控钾通道的活性的能力,即激活电压-门控钾通道的活性的能力或抑制电压-门控钾通道的活性的能力。通过将测试物质加入至反应系统,以利用电生理学方法测量电压-门控钾通道的活性,可以检验测试物质对以下的影响:电压-门控钾通道的开启和关闭,和离子的渗透。
    关于调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力,可以如下利用以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞测量电压-门控钾通道的电生理学活性。
    例如,通过经由实施例6中所述的方法将昆虫电压-门控钾通道的基因引入至非洲爪蟾卵母细胞中从而在卵母细胞中瞬间表达,可以制备以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞。利用表达昆虫电压-门控钾通道的卵母细胞,可以通过双电极电压钳方法测量电压-门控钾通道的电生理学活性。
    通过将昆虫电压-门控钾通道的基因引入至培养的动物细胞中以在培养的细胞中瞬间表达该基因,可以制备以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞。备选地,通过将昆虫电压-门控钾通道的基因引入至培养的动物细胞,和从转化的培养细胞群选择稳定表达电压-门控钾通道的培养的细胞,可以制备以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞。在本文中,作为培养的动物细胞,可以使用来自作为哺乳动物的仓鼠的CHO细胞,和来自人的HEK293细胞,来自作为昆虫的果蝇的S2细胞,来自作为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞的Sf9细胞,等等。利用表达昆虫电压-门控钾通道的培养的动物细胞,可以例如,通过实施例7中所述的全细胞膜片钳方法来测量电压-门控钾通道的电生理学活性。
    调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力也可以如下利用以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的转基因线虫来测量。
    已知作为模式生物体的秀丽隐杆线虫通过咽部的收缩运动(抽吸)将细菌作为生物传输到肠中。秀丽隐杆线虫的咽部由诸如肌肉和神经元这样的组织组成,并是用于验证神经元信号传导和膜兴奋性的模式系统。例如,如Davis等的报告中所述(Science(科学)286(5449),2501-2504,1999),秀丽隐杆线虫中的电压-门控钾通道EXP-2影响咽部肌肉细胞的动作电位的形状和持续时间。在EXP-2的失功能突变体中,咽部动作电位的复极化延迟,且动作电位的持续时间延长。在另一方面,在EXP-2的获功能突变体中,复极化加速,并动作电位的持续时间缩短。
    由于控制动作电位去极化和复极化的阳离子通道在整个动物界是保守的,所以可能再改造秀丽隐杆线虫咽部中的离子通道组成,并开发关于目标离子通道的功能模型。例如,当昆虫电压-门控钾通道,棉蚜seizure以起离子通道作用的形式表达在秀丽隐杆线虫咽部中时,咽部中电压-门控钾通道的存在增加并且因此增加向细胞外的总钾流出。结果,如稍后的实施例10中所述,咽部动作电位复极化加速,并且动作电位持续时间缩短。这与EXP-2获功能突变体的表型相同,并与EXP-2失功能突变体的表型相反。该结果显示基因改造的咽部受棉蚜seizure的控制。
    有可能在药理学上调节昆虫电压-门控钾通道的活性,所述昆虫电压-门控钾通道控制基因改造的咽部的动作。例如,如稍后所述的实施例6和实施例7中所示,已知为人ERG或人EAG的阻断剂的氯非铵(clofilium)抑制棉蚜seizure的活性??梢栽诖嬖诼确秋У奶跫?,通过常规电生理学方法来测量棉蚜seizure的活性。在另一方面,当将在咽部功能性表达棉蚜seizure的秀丽隐杆线虫暴露于氯非铵时,如实施例10中所示,缩短的动作电位持续时间再次延长并且基因改造诱导的表型逆转为正常动作电位持续时间,与电生理学实验中棉蚜seizure的抑制相一致。
    控制基因改造的咽部的昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的变化影响咽部的活动和由此影响食物摄取。因此,调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力可以作为调节转基因线虫的食物摄取的能力来测量。
    在本发明中,“线虫的摄食行为”意指通过咽部的收缩运动(抽吸)摄取食物从而将细菌作为食物传输至肠中的行为。测量“线虫的摄食行为”,即“食物摄取”的方法的实例包括以下使用荧光染料的方法。当将前荧光(pre-fluorescent)化合物加入至含有线虫的培养基中时,由线虫经口摄取的前荧光化合物由此在肠中通过酶转化为荧光染料,并且由线虫发射的荧光信号增加。因此,线虫的食物摄取可以作为由线虫发射的荧光信号来测量。该原理测定也称为饮用测定(Drinking Assay),如WO 00/63425中所述,并且已经使用商购化合物验证。例如,如WO 01/88532中所述,驱虫药伊维菌素(ivermectin)抑制线虫的食物摄取。在该饮用测定中,这意味着前荧光染料的摄入受到强烈抑制且因此荧光信号非常低。另一个实例是抗抑郁剂氯米帕明(clomipramine),其增加线虫的食物摄取。在该饮用测定中,这意味着前荧光染料的摄入受到强烈增强且因此荧光信号非常高。将该技术应用于功能性表达昆虫电压-门控钾通道的转基因线虫提供了检验测试物质对离子通道活性的影响的手段。
    另外,用于选择潜在具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的物质的方法的实例包括:利用RI-标记的配体的结合测定和利用膜电位-敏感染料的荧光染料法。
    在前述测量调节电压-门控钾通道的活性的能力的方法中,利用转基因的线虫的测定优选用于机械地并有效地测量大量样品中的电压-门控钾通道的活性。其实例包括将测试物质对摄食行为活动的影响作为对离子通道活性的影响来进行评估的方法。具体地,使测试物质存在于含有功能性表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的液体培养基中,并将前荧光染料加入至该培养基。由线虫口服摄取的前荧光染料的摄入作为由线虫发射的荧光信号来检测。当前荧光染料的摄入被定义为摄食行为活动时,将测试物质对摄食行为活动的影响作为对离子通道活性的影响来评估。
    功能性表达昆虫电压-门控钾通道的线虫的实例优选包括功能性表达棉蚜seizure的线虫,且前荧光染料的实例优选包括钙荧光素AM。
    在各种电压-门控钾通道阻断剂中,氯非铵(Gessner和Heinemann,Br.J.Pharmaco.(英国药理学杂志),138:161-171,2003)已经被认为是人ERG和人EAG的阻断剂,并是用于治疗心律不齐的模式试剂(Greene等,Am.Heart J.(美国心脏杂志),106:492-501,1983)。尽管尚未报道氯非铵对来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道起作用,但是氯非铵抑制棉蚜seizure的活性,如实施例6和实施例7中所述。
    所述饮用测定中测试物质的EC50值意指当将线虫的前荧光染料摄入定义为摄食行为活动时,摄食行为活动减少或增加50%时的测试物质浓度。测试物质的EC50值可以通过以下步骤确定:将不同浓度的测试物质加入至饮用测定系统,计算在各种浓度的加入的测试物质(剂量)下的线虫摄食行为活动(应答),生成剂量-应答曲线,和计算摄食行为活动减少或增加50%时所加入的测试物质的浓度。更具体地,使用4参数对数模型(4Parameter Logistic Model)或S形剂量-应答模型(Sigmoidal Dose-Response Model):
    fx=(A+(B-A)/(1+((C/x)^D))),
    f(x)=A+B-A1+(C/x)D]]>
    生成剂量-应答曲线,由此可以计算EC50。实际上,EC50可以利用市售计算软件XLfit(由IDBS制造)来计算。
    电生理学方法中的测试物质的EC50值也可以通过类似的方法来计算,并意指电生理学活性减小或增加50%时的测试物质的浓度。测试物质的EC50值可以通过以下步骤来确定:将不同浓度的测试物质加入至电生理学实验系统中,计算在各种加入的测试物质浓度(剂量)下的电生理学活性(应答),生成剂量-应答曲线,和计算生理学活性减小或增加50%时所加入的测试物质的浓度。
    在本发明中,“具有调节昆虫电压-门控钾通道活性的能力的试剂”是含有具有调节昆虫电压-门控钾通道活性的能力的物质作为活性成分的试剂。
    在本发明中,“调节害虫的生理状况的试剂,其中所述试剂具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力”意指一种具有可以通过所述测量方法鉴定的调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力,并且可以调节害虫的生理状况的试剂。
    所述试剂的实例包括优选地具有调节来自EAG家族的昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的试剂,更优选地,具有调节昆虫ERG-型电压-门控钾通道的活性的能力的试剂和,进一步优选地,具有调节棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的活性的能力的试剂。
    另外,试剂的实例优选包括杀虫剂。
    另外,试剂的实例优选包括具有调节昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力的试剂,所述电生理学活性如通过上述电生理学方法所测量。
    备选地,试剂的实例优选包括在使用上述转基因线虫的饮用测定中具有调节该线虫摄食行为活动的能力的试剂。
    在本发明中,“杀虫剂”是指具有控制害虫的能力的试剂。
    除本发明中公开的方法之外,用于测量控制害虫的能力的方法的实例还包括,测定对害虫的杀虫活性的方法。具体地,例如,可以按照下述方法检测杀虫活性。
    按照昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版社(Elsevier Science Publisers)1985)第35-36页所述的方法,除了制备具有以下组成(表2)的无菌人工饲料,并且按人工饲料体积的0.5%加入处于DMSO中的测试试剂溶液,并且混合之外,饲养棉蚜,在6天后研究存活的棉蚜的数目,并且按照下述方程获得控制值。
    表2


    控制值(%)={1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}x100
    在所述方程中的字母代表下述含义:
    Cb:在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目
    Cai:在未处理部分中在观察时存活的蠕虫数目
    Tb:在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目
    Tai:在处理部分中在观察时存活的蠕虫数目
    可以这样说,表现出显著高的控制值的测试试剂具有杀虫活性。更优选地,可以确定,具有30%或更大的控制值的测试试剂具有实质杀虫活性,并且可以确定,具有小于30%的控制值的测试试剂没有实质杀虫活性。
    本发明的杀虫剂包含具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的化学物质或其农业上可接受的盐作为活性成分。
    在本发明中,农业上可接受的盐是指以这样的形式存在的盐,即,控制试剂的制备及所述制剂的应用是可能的,并且可以是任何形式的盐。具体地,所述盐的实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸,有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、和乙磺酸,或酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸的酸式加成盐;与无机碱如钠、钾、镁和铝的盐,与有机碱如甲胺、乙胺和乙醇胺,或碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸的盐;以及铵盐。
    在本发明中,“包含具有调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂”意指以下试剂,其可以通过包含具有可以通过所述测量方法鉴定的调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分而控制害虫。
    所述试剂的实例优选包括这样的试剂,其包含具有调节昆虫电压-门控钾通道的电生理学活性的能力的物质,所述电生理学活性如通过所述电生理学方法测量。
    备选地,所述试剂的实例优选包括这样的试剂,所述试剂包含在使用上述转基因线虫的饮用测定中具有调节该线虫摄食行为活动的能力的物质。
    所述试剂的实例包括这样的试剂,其包含:具有抑制上述转基因线虫的摄食行为活动的能力的化学物质,其中更优选地,在使用所述转基因线虫的饮用测定中,在存在30μM或更多所述物质的条件下的摄食行为活动少于在不存在所述物质的条件下的摄食行为活动;或具有活化上述转基因线虫的摄食行为活动的能力的化学物质,其中更优选地,在使用所述转基因线虫的饮用测定中,在存在30μM或更多所述物质的条件下的摄食行为活动多于在不存在所述物质的条件下的摄食行为活动。
    另外,所述试剂的实例还优选包括这样的试剂,其包含:具有抑制上述转基因线虫的摄食行为活动的能力的化学物质,其中在使用所述转基因线虫的饮用测定中,摄食行为活动减少50%时所述物质的有效浓度是100μM或更低;或具有活化上述转基因线虫的摄食行为活动的能力的化学物质,其中在使用所述转基因线虫的饮用测定中,摄食行为活动增加50%时所述物质的有效浓度是100μM或更低。
    在本发明中,“测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:在系统中测量线虫的摄食行为活动的第一步骤,所述线虫以起离子通道作用的形式表达选自下面A组的电压-门控钾通道,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及基于通过比较在所述第一步骤中测量的摄食行为活动和在不含测试物质的系统中所述线虫的摄食行为活动而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤”是指特征在于在用于测定测试物质的杀虫能力的各种方法中包括所述第一步骤和所述第二步骤的方法。
    另外,在本发明中,“测定测试物质的杀虫活性的方法,包括:在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自下面A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤”是指特征在于在用于测定测试物质的杀虫能力的各种方法中包括所述第一步骤和所述第二步骤的方法。
    在本文中,A组表示:
    <A组>
    (a)包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列的起离子通道作用的蛋白,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并包括SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列或其一部分序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的起离子通道作用的蛋白,
    (c)具有电压-门控钾通道活性并包括这样的氨基酸序列的蛋白,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性,
    (d)包括由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性,
    (f)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸在严谨的条件下和与包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸互补的多核苷酸杂交,
    (g)包括昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,
    (h)包括棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列的蛋白,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并包括由这样的多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白,所述多核苷酸可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列。
    第一步是“将测试物质加入至用于测量以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的反应系统,从而使所述线虫与所述测试物质相接触,并测量所述线虫的摄食行为活动的步骤”,或“将测试物质加入至用于测量以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞的电生理学活性的反应系统,从而使所述细胞与所述测试物质相接触,并测量所述细胞的电生理学活性的步骤”。
    另外,第二步是比较测量测试物质时的活性和对照的活性并且基于该差别评估杀虫能力的步骤。
    在本文中,对照意指,例如,在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中时,其中只加入与用来溶解所述测试物质的溶剂相同的溶剂的检测部分。
    在包括所述第一步骤和第二步骤的用于测定测试物质杀虫活性的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫是以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的线虫。
    另外,在包括所述第一步骤和第二步骤的用于测定测试物质杀虫活性的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞是以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的细胞。
    在A组的蛋白中,在由(a)表示的蛋白的氨基酸序列和由(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i)表示的蛋白的氨基酸序列之间可以认识到的差异是部分氨基酸的缺失、置换、添加等。这些包括,例如,由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在细胞中经受的加工所引起的缺失。另外,实例包括由以下所产生的氨基酸的缺失、置换、添加等:由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变,或通过定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
    经受所述缺失、置换、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现“以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动”或“以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞的电生理学活性”的范围内的数目。
    氨基酸置换的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行置换。所述置换的具体实例包括在下列各组中的置换:(1)甘氨酸,丙氨酸;(2)缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸;(3)天冬氨酸,谷氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,(4)丝氨酸,苏氨酸;(5)赖氨酸,精氨酸;(6)苯丙氨酸,酪氨酸等。
    人工引入氨基酸的缺失、添加或置换(下文,在一些情形中总称为氨基酸的改变)的程序的实例包括将定向突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中,并且然后通过常规方法表达这一DNA的程序。
    在此处,定点诱变的实例包括应用琥珀突变的方法(缺口双链方法(gapped duplex method),核酸研究(Nucleic Acids Res.),12,9441-9456(1984))、通过使用用于引入突变的引物的PCR的方法等。
    人工改变氨基酸的程序的实例包括将突变随机引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的程序。在此处,随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增各全长DNA的引物对,在下列反应条件下进行PCR的方法,在所述反应条件下,用作底物的各种dATP,dTTP,dGTP和dCTP的添加量由常规浓度开始变化,或促进聚合酶反应的Mg2+的浓度由常规浓度开始升高。PCR程序的实例包括,例如,在分子生物学方法(Method in Molecular Biology),(31),1994,97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
    在本文中,“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸之间的同一性?!靶蛄型恍浴蓖ü冉洗冉系男蛄械乃星蛑幸宰钍首刺榷缘牧礁鲂蛄卸范?。在此处,在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中,可以允许添加或缺失(例如,缺口等)??梢酝ü褂萌鏔ASTA[Pearson和Lipman,美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),4,2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等,分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology),215,403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson,Higgins和Gibson,核酸研究(Nucleic Acid Research),22,4673-4680(1994a)]等的程序进行同源性分析以生成比对来计算序列同一性。所述程序通??纱尤毡綝NA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心(Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan),国家遗传学学院(National Institute of Genetics)中管理的国际DNA数据库;CIB/DDBJ】的网站(//www.ddbj.nig.ac.jp)上获得。备选地,序列同一性还可以使用市售的序列分析软件来分析。具体地,例如,可以使用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公司(Software Development Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman,D.J.和Pearson,W.R.,科学(Science),227,1435-1441,(1985)】进行同源性分析和生成比对来计算序列同一性。
    当如上所述的两个最优比对的氨基酸序列由于保守氨基酸置换而具有序列差异时,使用“序列相似性”来表述置换的氨基酸的保守性??梢哉庋?,在具有由保守氨基酸置换引起的序列差异的序列对之间存在序列相似性。此种类型的序列相似性可使用诸如上面FASTA的程序来分析。氨基酸可分为四组:疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。氨基酸被同一组的另一氨基酸置换称为保守氨基酸置换。
    疏水氨基酸组包括丙氨酸(A),缬氨酸(V),亮氨酸(L),异亮氨酸(I),蛋氨酸(M),色氨酸(W),苯丙氨酸(F)和脯氨酸(P)。
    中性氨基酸组包括甘氨酸(G),丝氨酸(S),苏氨酸(T),半胱氨酸(C),酪氨酸(Y),天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。
    酸性氨基酸组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
    碱性氨基酸组包括赖氨酸(K),组氨酸(H)和精氨酸(R)。
    在(f)中所述的“严谨的条件”的实例包括以下条件:在该条件下,在根据例如,Sambrook J.,Frisch E.F.,Maniatis T.,分子克隆第二版,冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory press)中所述的常规方法进行的杂交中,在45℃下在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成杂交物,并且然后将该杂交物用2×SSC在50℃下洗涤(分子生物学(Molecular Biology),John Wiley和Sons,纽约(1989),6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤中的盐浓度可选自从2×SSC(低严谨度条件)至0.2×SSC(高严谨度条件)的条件。洗涤步骤中的温度可选自,例如,从室温(低严谨度条件)至65℃(高严谨度条件)的条件??裳〉?,盐浓度和温度两者都可改变。
    (h)中所述的蛋白表示存在于棉蚜中的ERG-型电压-门控钾通道(seisure),是昆虫电压-门控钾通道中的一种,并且包括包含(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。
    尽管A组的蛋白包括(c)中所述的蛋白,(c)中所述的蛋白包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有60%或更高的序列同一性的氨基酸序列,并具有电压-门控钾通道活性,但可优选地使用具有电压-门控钾通道活性并包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有65,70或75%或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白,并且可高度优选具有电压-门控钾通道活性并包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80,85,90或95%或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白。
    具有杀虫能力的物质可以通过使用测量对上文提及的害虫的杀虫能力或控制作用来测定杀虫能力的方法进行筛选。
    备选地,具有杀虫能力的物质还可以通过使用电压-门控钾通道测定杀虫能力的方法进行筛选。具体地,当通过使用电压-门控钾通道测定杀虫能力的方法鉴定测试物质的杀虫能力是特定的值以上,或者特定的值以下时,可以通过选择所述物质而筛选具有杀虫能力的物质。
    由于通过所述筛选方法选择的物质具有杀虫能力,所以它可以用作包含所述物质或其农业上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂。
    害虫的控制通??梢酝ü行Я康纳背婕潦┯糜诮槐;さ呐┳魑?、害虫或害虫的栖息地而进行。
    当将杀虫剂用于农业和林业时,其使用量通常是0.1-1000g杀虫剂量/1000m2。当将杀虫剂配制成乳剂、水可分散的粉剂、易流动的制剂、微胶囊制剂等时,所述试剂通常通过用水稀释至活性成分浓度1-10,000ppm,并且将其喷雾而施用,并且当杀虫剂配制成颗粒剂、粉剂等时,所述试剂通常按照原样进行施用。
    杀虫剂可以通过叶面-处理诸如农作物等应该?;っ馐芎Τ嫔撕Φ闹参锒褂?,并且还可以通过在移栽农作物的幼苗之前处理苗床,或者处理栽植时的栽植穴或品系基部(strain base)而使用。此外,为了控制害虫在耕地的土壤中栖息的目的,可以通过处理所述土壤而使用所述试剂。备选地,所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制剂缠绕在农作物上,将所述制剂在农作物附近铺开和/或散布在品系基部的土壤表面而使用。
    当将杀虫剂用作害虫控制剂用于防止流行病时,乳剂、水可分散的粉剂、流动剂等通常通过用水稀释以致活性成分浓度变为0.01到10,000ppm而施用,并且油性试剂、气溶胶、薰剂、毒饵等按照原样进行施用。
    杀虫剂的一种用途的实例包括控制家畜如牛、绵羊、山羊和鸡或小动物如狗、猫、大鼠和小鼠的体外寄生虫,在这种情形中,所述试剂可以通过兽医学已知的方法施用给动物。作为一种具体的施用方法,当意欲全身控制时,例如,所述试剂通过片剂、混合在饲料中、栓剂、注射剂(肌内、皮下、静脉内、腹膜内等)等而施用,当意欲非全身控制时,所述试剂通过喷雾油性试剂或水性液体试剂、在处理时进行倾倒或打点、用洗发精制剂清洗动物或给动物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而使用。当施用给动物体时杀虫剂的量通常在0.1到1,000mg范围内,其表示为每1kg动物的化合物A和化合物B的总量。
    它们的施用量和施用浓度都取决于这样的情形而不同,所述情形诸如制剂种类、施用时间、施用位置、施用方法、害虫种类、损害程度等,可以增加或减少,而不管前文提及的范围,并且可以适当地进行选择。
    前文提及的杀虫剂可以用于如上所述的控制害虫的方法中。
    另外,害虫还可以通过以下步骤来控制:鉴定具有杀虫能力的物质,所述杀虫能力通过前文提及的测定测试物质的杀虫能力的方法来评价,所述测定测试物质的杀虫能力的方法包括:“使用以起离子通道作用的形式表达选自A组的电压-门控钾通道的线虫的第一步骤和第二步骤”或“使用以起离子通道作用的形式表达选自A组的电压-门控钾通道的细胞的第一步骤和第二步骤”;和将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫相接触。在此处,作为将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫相接触的方法,可以使用前文提及的制备方法、施用方法等。
    B组中所示的氨基酸序列是昆虫电压-门控钾通道的氨基酸序列,其包含下述(a)到(i)的任一种氨基酸序列。
    (a)SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列,
    (b)具有电压-门控钾通道活性并具有SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换的氨基酸序列;
    (c)具有电压-门控钾通道活性并与SEQ ID NO:1,3,5或7的氨基酸序列具有60%以上的序列同一性的氨基酸序列;
    (d)由SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列编码的氨基酸序列,
    (e)具有电压-门控钾通道活性并由与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列具有75%以上的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列;
    (f)具有电压-门控钾通道活性并由多核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述多核苷酸序列在严谨的条件下和包括与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交,
    (g)昆虫ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    (h)棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,和
    (i)具有电压-门控钾通道活性并由多核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述多核苷酸序列可使用棉蚜的cDNA作为模板并利用包括SEQ ID NO:11,13或15的核苷酸序列的多核苷酸和包括SEQ ID NO:12或14的核苷酸序列的多核苷酸作为引物,通过PCR来扩增;
    其中:
    SEQ ID NO:1,3,5或7是棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的氨基酸序列,
    SEQ ID NO:2,4,6或8是编码棉蚜ERG-型电压-门控钾通道的核苷酸序列,
    SEQ ID NO:11,13或15是PCR 5’引物的核苷酸序列,和
    SEQ ID NO:12或14是PCR 3’引物的核苷酸序列。
    在B组的氨基酸序列中,在由(a)表示的氨基酸序列和由(b),(c),(d),(e),(f),(g),(h)和(i)表示的氨基酸序列之间可以识别的差异是部分氨基酸的缺失、置换、添加等。这些包括,例如,由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在细胞中经受的加工引起的缺失。另外,实例包括由下面各项所产生的氨基酸的缺失、置换、添加等:由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变,或通过定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
    经受所述缺失、置换、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现“以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动”或“以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞的电生理学活性”的范围内的数目。
    氨基酸置换的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行置换。所述置换的具体实例包括在下列各组中的置换:(1)甘氨酸,丙氨酸;(2)缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸;(3)天冬氨酸,谷氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,(4)丝氨酸,苏氨酸;(5)赖氨酸,精氨酸;(6)苯丙氨酸,酪氨酸等。
    人工引入氨基酸的缺失、添加或置换(下文,在一些情形中总称为氨基酸的改变)的程序的实例包括将定向突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中,并且然后通过常规方法表达这一DNA的程序。
    在此处,定点诱变的实例包括应用琥珀突变的方法(缺口双链方法(gapped duplex method),核酸研究(Nucleic Acids Res.),12,9441-9456(1984))、通过使用用于引入突变的引物的PCR的方法等。
    人工改变氨基酸的程序的实例包括将突变随机引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的程序。在此处,随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增各全长DNA的引物对,在下列反应条件下进行PCR的方法,在所述反应条件下,用作底物的各种dATP,dTTP,dGTP和dCTP的添加量由常规浓度开始变化,或促进聚合酶反应的Mg2+的浓度由常规浓度开始升高。PCR程序的实例包括,例如,在分子生物学方法(Method in Molecular Biology),(31),1994,97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
    在本文中,“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸之间的同一性?!靶蛄型恍浴蓖ü冉洗冉系男蛄械乃星蛑幸宰钍首刺榷缘牧礁鲂蛄卸范?。在此处,在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中,可以允许添加或缺失(例如,缺口等)??梢酝ü褂萌鏔ASTA[Pearson和Lipman,美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),4,2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等,分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology),215,403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson,Higgins和Gibson,核酸研究(Nucleic Acid Research),22,4673-4680(1994a)]等的程序进行同源性分析以生成比对来计算序列同一性。所述程序通??纱尤毡綝NA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心(Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan),国家遗传学学院(National Institute of Genetics)中管理的国际DNA数据库;CIB/DDBJ】的网站(//www.ddbj.nig.ac.jp)上获得。备选地,序列同一性还可以使用市售的序列分析软件来分析。具体地,例如,可以使用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公司(Software Development Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman,D.J.和Pearson,W.R.,科学(Science),227,1435-1441,(1985)】进行同源性分析和生成比对来计算序列同一性。
    当如上所述的两个最优比对的氨基酸序列由于保守氨基酸置换而具有序列差异时,使用“序列相似性”来表述置换的氨基酸的保守性??梢哉庋?,在具有由保守氨基酸置换引起的序列差异的序列对之间存在序列相似性。此种类型的序列相似性可使用诸如上面FASTA的程序来分析。氨基酸可分为四组:疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。氨基酸被同一组的另一氨基酸置换称为保守氨基酸置换。
    疏水氨基酸组包括丙氨酸(A),缬氨酸(V),亮氨酸(L),异亮氨酸(I),蛋氨酸(M),色氨酸(W),苯丙氨酸(F)和脯氨酸(P)。
    中性氨基酸组包括甘氨酸(G),丝氨酸(S),苏氨酸(T),半胱氨酸(C),酪氨酸(Y),天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。
    酸性氨基酸组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
    碱性氨基酸组包括赖氨酸(K),组氨酸(H)和精氨酸(R)。
    在(f)中所述的“严谨的条件”的实例包括以下条件:在该条件下,在根据例如,Sambrook J.,Frisch E.F.,Maniatis T.,分子克隆第二版,冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory press)中所述的常规方法进行的杂交中,在45℃下在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成杂交物,并且然后将该杂交物用2×SSC在50℃下洗涤(分子生物学(Molecular Biology),John Wiley和Sons,纽约(1989),6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤中的盐浓度可选自从2×SSC(低严谨度条件)至0.2×SSC(高严谨度条件)的条件。洗涤步骤中的温度可选自,例如,从室温(低严谨度条件)至65℃(高严谨度条件)的条件??裳〉?,盐浓度和温度两者都可改变。
    (h)中所述的氨基酸序列表示存在于棉蚜中的作为昆虫电压-门控钾通道的一种的ERG-型电压-门控钾通道(seisure)的氨基酸序列,并且包括(a)中所述的氨基酸序列。
    尽管包含B组的氨基酸序列的蛋白包括(c)中所述的蛋白,(c)中所述的蛋白包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有60%或更高的序列同一性的氨基酸序列,并具有电压-门控钾通道活性,但可优选地使用具有电压-门控钾通道活性并包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有65,70或75%或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白,并且可高度优选具有电压-门控钾通道活性并包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80,85,90或95%或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白。
    具有在B组中所示的氨基酸序列的蛋白可以例如按照下文所述的方法、使用编码在B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸进行制备。
    以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫可以用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具。具体地,例如,以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫可以用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具,其通过被用作在使用以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的测定杀虫活性的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫来实现。另外,更具体的方法可以根据测量以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的摄食行为活动的方法而进行。
    当以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的线虫用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具时,优选的是,昆虫电压-门控钾通道是包括B组中所示的氨基酸序列的电压-门控钾通道。
    以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的细胞可以用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具。特别地,例如,以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的细胞可以用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具,其通过被用作在利用以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞测定杀虫活性的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞来实现。另外,更特别的方法可以根据利用以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞通过电生理学方法进行的活性测量方法来执行。
    当以起离子通道作用的形式表达昆虫电压-门控钾通道的细胞用作提供评价杀虫活性的指示剂的研究工具时,优选的是,昆虫电压-门控钾通道是包括B组中所示的氨基酸序列的电压-门控钾通道。
    包含编码B组中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(在下文中,在一些情形中称为多核苷酸B组)具有这样的核苷酸序列,在生物体的细胞或体外翻译系统中,由所述核苷酸序列可以生成包含B组中所示的氨基酸序列的蛋白。多核苷酸B组可以是由天然克隆的DNA,其中例如,通过定点诱变或随机诱变将核苷酸的缺失、置换或添加引入至由天然克隆的DNA中的DNA,或人工合成的DNA。具体地,实例包括包含SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸。
    <第一种获得方法>
    例如,将在下文中显示获得包含SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列并包括在多核苷酸B组中的多核苷酸的方法。作为一步,从棉蚜获得总RNA,合成cDNA文库,并且进行PCR扩增,由此可以获得目的多核苷酸。
    将在盆栽黄瓜的叶片上养殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷子从叶片表面刮下,并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)按下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中后,将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后,将流体样品用移液管转移到15ml试管中,并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)制造)。立即将混合物用力振荡15秒,然后在室温静置3分钟。然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且将每个5ml水层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到各管中后,将混合物立即用力振荡15秒,并且然后在室温静置3分钟。然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且将各个10ml水层分别转移到新的50ml管中。随后,将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中,并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后,向剩余物中加入20ml 70%乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后,将总RNA的沉淀稍微干燥,并且然后溶解在1ml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司)中。在260nm测量制备的总RNA的吸光度,以根据常规方法计算浓度。
    应用通过上述方法获得的棉蚜总RNA作为模板,并且根据试剂附带的手册使用随机引物(由Invitrogen制造)和superscript III(由Invitrogen制造)进行RT-PCR,以合成第一链cDNA。
    应用通过上述方法获得的棉蚜cDNA作为模板,并且根据试剂附带的手册使用包括SEQ ID NO:11的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列的寡核苷酸引物以及延伸长模板PCR系统(Expand Long Template PCR System)(由Roche(罗氏)制造)进行PCR。PCR的条件是用于递降PCR的那些,如下所示:在94℃起始变性2分钟;然后是10个递降PCR循环,一个循环为94℃30秒,70℃30秒(每个循环降低1℃),和68℃4分钟;接着是25个PCR循环,一个循环为94℃30秒,60℃30秒,和68℃30秒(每个循环升高1℃);和随后68℃7分钟。
    如上文所述,可以获得包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸。
    <第二种获得方法>
    备选地,在多核苷酸B组中所示的多核苷酸还可以通过制备具有由利用琥珀突变的方法引入其中的突变的多核苷酸而获得,所述方法为上文提及的定点诱变,为一种使用包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸作为模板、使用用于引入突变等的引物的PCR方法。
    <第三种获得方法>
    备选地,多核苷酸B组中所示的多核苷酸还可以通过使用包括SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列的多核苷酸作为探针的杂交方法来获得。更具体地,第三种获得方法可以根据在前文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.,Frisch E.F.,Maniatis T.,分子克隆第二版中所述的常规杂交而进行。
    <第四种获得方法>
    备选地,多核苷酸B组中所示的多核苷酸还可以通过基于已知的昆虫电压-门控钾通道的氨基酸序列制备引物并且进行PCR而获得。为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离电压-门控钾通道基因的同源物,应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心内运行的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网站//blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html上可公共地获得),并且参考前文提及的棉蚜ERG-型电压-门控钾通道(seizure)基因的序列和先前已知的来自诸如人(NCBI登记号Q12809和Q9H252),秀丽隐杆线虫(NP_49782),黑腹果蝇(AAM68296),冈比亚按蚊(XP_308166)等的同源物的氨基酸序列,设计简并引物。
    选择的昆虫物种的电压-门控钾通道基因的同源物的部分序列通过一系列PCR扩增,所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处,所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一组简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造)根据所述试剂附带的生产厂商的方法而进行。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在94℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为94℃30秒,60℃1分钟(每个循环降低1℃),和72℃1分30秒;接着是25个PCR循环,一个循环为94℃30秒,50℃30秒和72℃1分30秒;并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    然后,设计对所得到的电压-门控钾通道基因的昆虫同源物的部分序列特异的引物,并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR,以获得所述基因的全长序列。
    在5’RACE反应中,对目的序列特异的反向引物与5’/3’RACE试剂盒中包含的作为正向引物的寡-d(T)-锚定引物1(Oligo-d(T)-anchor primer1)(第二代)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃40秒;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃40秒(每个循环延长20秒);并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时,使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。作为引物,被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性反向引物与5’/3’RACE试剂盒中包含的作为正向引物的PCR锚定引物(第二代)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃40秒;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃40秒(每个循环延伸20秒);并且接着是72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    在3’RACE反应中,对目的序列特异的正向引物与SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的作为反向引物的通用引物混合物(UPM)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃1分钟;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃1分钟;并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时,使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。作为引物,被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性正向引物与SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的作为反向引物的NUP引物组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃1分钟;然后是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃1分钟;接着是72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    上述测序结果揭示5’-端序列和3’-端序列,其各自分别编码昆虫电压-门控钾通道的N-端区域和C-端区域。
    因此,多核苷酸B组中所示的多核苷酸可以通过基于已知的昆虫电压-门控钾通道的氨基酸序列制备引物、通过PCR而获得。
    包括与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来利用杂交方法获得多核苷酸B组中所示的多核苷酸。
    本发明中的获得方法包括通过杂交检测所需多核苷酸的步骤,鉴定检测到的所需多核苷酸的步骤,和回收所鉴定的多核苷酸的步骤。各步骤将在下文中具体地解释。
    通过杂交检测所需多核苷酸的步骤,和鉴定检测到的所需多核苷酸的步骤可以这样进行,即,通过使用具有与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为探针,根据例如记述在“分子克?。菏笛槭沂植岬诙?Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition)”(1989),冷泉港实验室出版社,“当代分子生物学方法(Current Protocols In Molecular Biology)”(1987),John Wiley & Sons公司ISBN0-471-50338-X等中所述的方法进行。
    具体地,例如,将包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA用放射性同位素或荧光标记,通过使用随机引发的DNA标记试剂盒(Random Primed DNA Labelling Kit,由Boehringer制造)、随机引物DNA标记试剂盒第2版(由TAKARA SHUZO有限公司制造)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System,由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造),或Megaprime DNA-标记系统(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造)的已知方法进行标记,并且这可以用作探针。
    用于杂交的条件的实例包括严谨的条件,并且具体地,实例包括这样的条件,即,在所述条件下,在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl,0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s溶液(0.1%(w/v)菲克(Ficoll)400,0.1%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮,0.1%BSA)、0.5%(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下,或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution,Boehringer Mamnnheim)中进行孵育,然后,在室温下在存在1×SSC(0.15m NaCl,0.015m柠檬酸钠)和0.5%SDS的条件下进行孵育两次,持续15分钟,并且此外,在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl,0.0015m柠檬酸钠)和0.5%SDS的条件下进行孵育持续30分钟。
    更具体地,例如,可以通过应用包括与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为模板,使用Megaprime DNA-标记系统(由安玛西亚法玛西亚生物技术(Amersham Pharmacia Biotech)制造)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液,而制备用32P标记的探针。使用这一探针根据照常规方法进行菌落杂交,在65℃下在存在6×SSC(0.9M NaCl,0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s溶液(0.1%(w/v)菲克400,0.1%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮,0.1%BSA)、0.5%(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下,或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution,Boehringer Mamnnheim)中进行温育,然后,在室温下在存在1×SSC(0.15m NaCl,0.015m柠檬酸钠)和0.5%SDS的条件下进行孵育两次持续15分钟,并且此外,在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl,0.0015m柠檬酸钠)和0.5%SDS的条件下进行孵育持续30分钟,由此可以检测(包含)杂交的多核苷酸(的菌落)。因此,可以通过杂交检测所需的多核苷酸,并且可以鉴定检测到的所需多核苷酸。
    为了回收所鉴定的所需多核苷酸,可以从含有通过前文提及的方法,例如,根据如在冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)中所述的碱法的方法检测并且鉴定的多核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的所需多核苷酸(质粒DNA)的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如,在Maxam,A.M和W.Gilbert,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74,560,1977等中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如,在Sanger,F.和A.R.Coulson,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),94,441,1975,Sanger,F.和Nicklen和A.R.Coulson.,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74,5463,1977等中所述)进行验证。因此,例如,可以使用市售的Termo测序酶II染料终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造)、染料终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造)等。
    包括多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或包括与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来使用PCR获得在多核苷酸B组中所示的多核苷酸。更具体地,实例包括包含SEQ ID NOs:11-15中任一项的核苷酸序列的多核苷酸。本发明中的获得方法包括通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤,鉴定所扩增的所需的多核苷酸的步骤,和回收所鉴定的所需的多核苷酸的步骤。各步骤将在下文中具体解释。
    在通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤中,具体地,基于约20bp-约40bp的核苷酸序列,例如,选自SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列和与SEQ ID NO:2,4,6或8的核苷酸序列互补的序列的核苷酸序列,从多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列设计并且合成的DNA,可以用作引物组。引物组的实例包括一组包含由SEQ ID NO:13表示的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列的多核苷酸。例如,通过将市售的PCR试剂盒指定的反应溶液添加到通过前文提及的方法制备的cDNA文库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化,这取决于要用的引物组,并且例如,可使用这样的条件,即在所述条件下,在94℃孵育10秒后,重复大约40个循环,1个循环为94℃15秒,60℃15秒,和72℃3分钟,并且继续在72℃进行孵育3分钟;可使用这样的条件,即,在所述条件下,在94℃进行孵育2分钟,然后在约8℃进行孵育3分钟,并且然后重复大约40个循环,1个循环为94℃30秒,55℃30秒,和72℃4分钟;或者这样的条件,即在所述条件下,进行5-10个循环,1个循环为94℃孵育5秒,然后72℃4分钟,并且继续进行约20-40个循环,1个循环为在94℃孵育5秒,然后在70℃4分钟。在PCR中,例如,可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制造),Amplitaq Gold(由应用生物系统制造),Takara Heraculase(商标)(由TAKARA SHUZO有限公司制造),包含在优势cDNA PCR试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的DNA聚合酶(由Clonetech制造),TaKaRa Ex Taq(由TAKARA SHUZO有限公司制备),PLATINUMTM PCR超级混合物(PLATINUMTM PCR SUPER Mix,由东方生命技术(Lifetech Oriental)制造)。
    通过PCR扩增的所需的多核苷酸的鉴定可以通过琼脂糖凝胶电泳,根据冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)中所述的方法测量分子量而进行。另外,关于所扩增的所需的多核苷酸,使用市售的DNA测序反应试剂盒,例如,染料终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统制造),根据试剂盒附带的手册进行测序反应,并且使用DNA测序仪3100(由应用生物系统制造)分析核苷酸,由此,可以读取扩增片段的核苷酸序列。
    回收所鉴定的所需的多核苷酸的方法的实例包括根据冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)中所述的方法从琼脂糖凝胶纯化并且回收通过琼脂糖凝胶电泳鉴定的前文提及的多核苷酸的方法。另外,这样回收的多核苷酸或通过PCR扩增的所需的多核苷酸可以根据冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)和“当代分子生物学方法”(1987),John Wiley和Sons公司ISBN0-471-50338-X中所述的常规方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARA SHUZO有限公司制造),pTVA118N(由TAKARA SHUZO有限公司制造),pBluescriptII(由Toyobo有限公司制造),pCR2.1-TOPO(由Invitrogen制造)等。另外,克隆的多核苷酸的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如,在Maxam,A.M和W.Gilbert,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74,560,1977中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如,在Sanger,F.和A.R.Coulson,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),94,441,1975,Sanger,F.& Nicklen和A.R.Coulson.,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74,5463,1977中所述)进行验证。因此,例如,可以使用市售的Termo测序酶II染料终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造)、染料终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造)等。
    另外,具有多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来获得多核苷酸B组中所示的多核苷酸,其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地,实例包括包含由SEQ ID NOs:11-15中任一项的核苷酸序列的多核苷酸。
    制备包括B组中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的实例包括培养其中引入选自多核苷酸B组的多核苷酸的转化体并且回收所生产的蛋白的方法。另外,为了制备本文所用的转化体,其是这样的工作,诸如制备包含这样的多核苷酸的环状多核苷酸,在所述这样的多核苷酸中,选自多核苷酸B组的多核苷酸与可在宿主生物体中或在宿主细胞中表达的启动子可操作地连接。该方法将在下文详细阐述。
    另外,在使用电压-门控钾通道测定杀虫活性的方法中使用的A组中显示的电压-门控钾通道可通过类似的方法,使用包括编码所用电压-门控钾通道的核苷酸序列的多核苷酸来制备和获得。
    可在宿主生物体或宿主细胞中表达的启动子意指具有转录目标基因从而在宿主生物体或宿主细胞的转录系统中表达基因产物能力的启动子,在所述宿主生物体或宿主细胞中已经引入了含有所述目标基因的多核苷酸。例如,当宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)时,所述启动子的实例包括T7 RNA聚合酶基因、T3 RNA聚合酶基因、和SP6 RNA聚合酶基因的启动子,其是来自噬菌体的启动子。当宿主是哺乳动物细胞时,所述启动子的实例包括CMV启动子,其是源自巨细胞病毒的IE(即时早期)基因的启动子。当宿主是线虫,所述启动子的实例包括源自线虫的肌球蛋白基因(myo-2或myo-3)的启动子。在线虫中,myo-2基因启动子表现出咽部-特异性表达,且myo-3基因的启动子表现出体壁-特异性表达。
    在本发明中,“可操作地连接”意指将包含目的基因的多核苷酸连接到包含启动子序列的多核苷酸的下游,以便目的基因可以在所用的转录系统中进行转录。具体地,例如,当使用CMV启动子时,包含目的基因的多核苷酸可以连接到CMV启动子的下游。另外,例如,当使用除CMV启动子之外的启动子时,还可能将包含目的基因的多核苷酸连接到包含除CMV启动子以外的启动子序列的多核苷酸的下游。更具体地,例如,当使用利用CMV启动子的质粒pcDNA3.1(+)(由Invitrogen制造)载体时,可以通过将目的基因连接到位于CMV启动子下游的限制酶位点如NheI,PmeI,AflII,HindIII,Asp718I,KpnI,BamHI,BstXI,EcoRI,EcoRV,NotI,XhoI,XbaI,DraII,或ApaI而可操作地连接多核苷酸。
    在本发明中,“环状多核苷酸”是通过将多核苷酸链的末端结合而成环状的多核苷酸,并且实例包括除了质粒DNA、杆粒DNA等以外的许多细菌的染色体DNA。
    质粒DNA是相对低分子量的环状多核苷酸,并且实例包括pET(由Novagen制造)和pBluescriptII(由Stratagene制造),其用于在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达。它的其它实例包括pcDNA(由Invitrogen制造),其用于哺乳动物中的基因表达。
    在其中将包含编码在B组中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸可操作地连接到可在宿主生物体或宿主细胞中表达的启动子上的环状多核苷酸具体地为,例如,含有包括与噬菌体T7 RNA聚合酶启动子、巨细胞病毒CMV启动子或棉蚜myo-2基因启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA的环状多核苷酸,并且可以例如,根据下述方法制备并且获得。
    使用包含根据前文提及的方法克隆的棉蚜seizure基因的质粒DNA作为模板,使用对棉蚜seizure基因特异的添加了Eco RV限制性位点的引物和对棉蚜seizure基因特异的添加了XhoI限制性位点的引物,通过PCR扩增包含棉蚜seizure基因的DNA片段。将得到的PCR产物用Eco RV和XhoI切割,并且将得到的包含棉蚜seizure基因的DNA片段与预先用Eco RV和XhoI消化的质粒载体pcDNA3+)(由Invitrogen制造)连接。以这种方式获得的质粒是含有包括与CMV启动子可操作性连接的棉蚜seizure基因的DNA片段的环状多核苷酸的一个实例。
    类似地,可以通过将编码B组所示的氨基酸序列的核苷酸连接到载体中而制备环状多核苷酸。
    在本发明中,“复制起点”是对于自身在宿主细胞中复制所必需的特异性DNA序列。复制起点的实例包括用于细菌质粒的colE1,f1和pUC。
    转化体是真核细胞(eukaryote)(真核细胞(eukaryotic cell))或原核细胞(prokaryote)(原核细胞(prokaryotic cell)),所述细胞已经通过向细胞中引入外源多核苷酸而被遗传改变。转化体的实例包括通过在大肠杆菌中引入用于基因克隆或基因表达的质粒如pET(由Novagen制造)或pBluescript II(由Stratagene制造)而转化的大肠杆菌细胞。它的其他实例包括哺乳动物培养的细胞诸如通过在哺乳动物细胞中引入用于基因表达的质粒诸如pcDNA(由Invitrogen制造)而转化的CHO细胞或HEK293细胞。备选地,其实例包括培养的昆虫细胞,诸如源自果蝇的S2细胞或源自鳞翅目昆虫草地贪夜蛾卵巢细胞的Sf9细胞,其通过在昆虫细胞中引入用于基因表达的质粒诸如pMT(由Invitrogen制造)或pAC(由Invitrogen制造)来转化。在模式生物体线虫中,其实例包括通过引入这样的质粒而转化的线虫,在所述质粒中,目标基因与源自线虫的启动子连接。
    其中已经引入了编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的转化体的实例包括:这样的转化的大肠杆菌,其中已经引入了包含与噬菌体T7 RNA聚合酶基因的启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段;转化的哺乳动物细胞,其中已经引入了包含与巨细胞病毒的CMV启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段;转化的线虫,其中已经引入了包含与线虫的myo-2基因的启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段,等。
    将DNA引入至宿主生物体或宿主细胞中的技术的实例包括转化、转染、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、显微注射、和粒子枪等。在线虫中,转化体主要通过显微注射引入外源基因来产生,如Mello等的报告(EMBO J.10(12),3959-3970,1991)和Mello和Fire的文献(Methods in Cell Biology(细胞生物学方法)48,451-482)中所述,并且也开发了如Praitis等的报告(Genetics 157,1217-1226,2001)和WO 99/49066中所述的通过粒子枪的转化方法。
    线虫的转化体以与目标基因同时显微注射的标记物基因的表型来区分。所述标记物基因分为两类。一类赋予容易区分的表型变化,诸如线虫的运动或形态学。例如,存在赋予线虫新表型的突变基因,诸如赋予顺时针方向滚动(Rol)表型的rol-6,和拯救宿主中突变表型的野生型基因,诸如dpy-20,lin-15,unc-76,unc-4,pha-1,和unc-119。另一类是荧光报道基因,其中荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)的基因在来自线虫的启动子的下游连接。
    通过使用pha-1作为选择标记物拯救突变体而选择转化体的实例包括利用Granato等的报告(Nucleic Acids Res.(核酸研究)22,1762-1763,1994)中所述的pBX载体的方法。尽管pha-1突变体不能在20℃以上生长,但是其中已经引入了用作标记物的野生型基因的突变体的转化体也可以在20℃以上生长,这归因于表型的拯救。
    通过使用unc-119作为选择标记物拯救突变体而选择转化体的实例包括利用Praitis等的报告(Genetics(遗传学)157,1217-1226,2001)中所述的pDPMM#016b载体的方法。线虫,当在L1幼虫期中个体密度高并缺乏食物时,变为具有抗性的幼虫并且可以在无食物的条件下存活约6个月。由于unc-119突变体不能变为具有抗性的幼虫,所以它不能在禁食状态下存活。其中已经引入了用作标记物的野生型基因的突变体的转化体甚至可以在禁食状态下存活,这归因于表型的拯救。
    其中已经引入了编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的转化体可以具体地根据以下方法来生成。
    转化体可以这样制备,即通过根据在冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)中所述的方法,将在BamHI位点和Xho I位点之间插入包含棉蚜电压-门控钾通道基因的DNA的质粒载体pET41a(+)(Novagen)引入到大肠杆菌细胞中而制备。备选地,还可以通过根据大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)附带的手册所述的方法,通过用前文提及的质粒DNA转化大肠杆菌而制备转化体,在所述质粒DNA中插入了包含噬菌体T7RNA聚合酶启动子和棉蚜电压-门控钾通道基因的片段。
    转化的大肠杆菌可以这样制备,即通过根据在冷泉港实验室出版社的“分子克?。菏笛槭沂植岬诙妗?1989)中所述的方法,将质粒载体pET(由Novagen制造)或pBluescript II(由Stratagene制造)引入到大肠杆菌细胞中而制备,在所述质粒载体中已经插入了包含棉蚜seizure基因的DNA片段。备选地,可以通过根据大肠杆菌DH5α或BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen制造)附带的手册所述的方法,通过用质粒DNA转化大肠杆菌而制备转化的大肠杆菌,在所述质粒DNA中插入了包含与噬菌体T7 RNA聚合酶基因启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段。
    转化的细胞可以这样获得,即通过根据脂转染胺(lipofectamine)(由Invitrogen制造),lipofectin(由Invitrogen制造),cellfectin(由Invitrogen制造)等附带的说明书所述的方法,使用其中已经插入包含与巨细胞病毒CMV启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段的质粒DNA引入哺乳动物细胞诸如CHO细胞或HEK293细胞来获得。
    另外,转化的线虫可以通过使用其中已经插入包含与线虫myo-2基因启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的DNA片段的质粒DNA,通过显微注射或粒子枪引入外源基因来生成。
    作为以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫或以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞,其用于测定杀虫活性的方法中,表达A组中所示的蛋白的线虫或细胞可以使用包含编码所用的电压-门控钾通道的核苷酸序列的多核苷酸,通过类似的方法生成和获得。
    电压-门控钾通道可以通过培养由上述方法制备的转化体和回收生成的昆虫电压-门控钾通道来制备。
    其中已经引入编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的转录产物的瞬间表达细胞的实例包括已经向其中引入了棉蚜seizure基因的cRNA的非洲爪蟾的卵母细胞。
    将RNA引入至宿主细胞中的技术的实例主要包括显微注射。其中已经引入了编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的转录产物的瞬间表达细胞可以具体地根据以下方法生成。
    麻醉雌性非洲爪蟾,在保持冰冻条件下将下腹部切割成小块,并取出包含卵母细胞的卵巢。切出一部分卵泡,用不含钙离子的OR2溶液(82.5mM NaCl,2mM KCl,1mM MgCl2,5mM HEPES,pH 7.4)洗涤,并在16℃进行2mg/ml胶原酶处理,并且从卵母细胞表面取出卵泡细胞。将包含与噬菌体T7 RNA聚合酶基因启动子可操作地连接的棉蚜seizure基因的质粒用限制酶消化,以线性化获得DNA片段,利用该DNA片段作为模板并使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra(由Ambion制造),根据后附的说明书合成cRNA。制备的cRNA以10ng/卵母细胞,利用由Drummond Scientific(布鲁莫尔,PA,USA)制造的纳升注射器来注射。这在注射cRNA后瞬间表达。
    包含B组中所示的氨基酸序列的昆虫电压-门控钾通道可以用作研究工具。例如,所述通道可以用作执行诸如测定杀虫活性的研究和筛选具有杀虫活性的化学物质的研究工具。另外,例如,还在分析对电压-门控钾通道起作用的试剂的作用机制的研究中,电压-门控钾通道可以作为研究工具使用。
    另外,编码在B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸和具有与它们有互补性的核苷酸序列的多核苷酸,以及编码在B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的部分核苷酸序列,或具有与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列的多核苷酸,和符合由SEQ ID NO:4或5表示的核苷酸序列的多核苷酸,可以用作研究工具。例如,它们中的一部分的作用是用于如上所述的制备电压-门控钾通道的方法中的多核苷酸。
    另外,编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸或包含与其互补的核苷酸序列的多核苷酸,或编码B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的部分核苷酸序列,或包含与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸,和包含SEQ ID NO:11-15中任一项所示的核苷酸序列的多核苷酸可以用作研究工具。例如,它们中的一部分的作用是用于如上所述的制备电压-门控钾通道的方法中的多核苷酸。备选地,所述部分可以用作用于使用PCR获得多核苷酸B组中所示的多核苷酸,或者使用杂交获得多核苷酸B组中所示的多核苷酸的重要研究工具,如上文所述。
    在本发明中,“测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的方法,包括:在系统中测量细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,所述细胞以起离子通道作用的形式表达选自A组中的电压-门控钾通道,在所述系统中所述细胞与测试物质接触;以及基于通过比较在所述第一步骤中测量的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中所述细胞的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力的第二步骤”表示在各种测定测试物质调节电压-门控钾通道活性的能力的方法中的特征为包括所述第一步骤和所述第二步骤的方法。
    在本文中,A组是包含前述氨基酸序列的蛋白。
    所述第一步骤是“将测试物质加入至用于测定以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞的电生理学活性的反应系统,从而使该细胞与所述测试物质相接触,并测定所述细胞的电生理学活性的步骤”。
    另外,所述第二步骤是比较测定测试物质时的活性和对照的活性,并基于该差别评估调节电压-门控钾通道的活性的能力的步骤。
    在本文中,对照意指,例如,在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中时,其中只加入与用来溶解所述测试物质的溶剂相同的溶剂的检测部分。
    在包括所述第一步骤和所述第二步骤的测定测试物质调节电压-门控钾通道活性的能力的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的细胞是以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的细胞。
    以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的细胞的实例具体包括以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的非洲爪蟾的卵母细胞。
    在本发明中,“测量测试物质调节昆虫电压-门控钾通道活性的能力的方法包括:在系统中测量以起离子通道作用的形式表达选自A组中的电压-门控钾通道的线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性的第一步骤,在所述系统中所述线虫与测试物质接触;以及基于通过比较在所述第一步骤中测定的电压-门控钾通道的电生理学活性和在不含测试物质的系统中的线虫的电压-门控钾通道的电生理学活性而获得的差别,评价所述测试物质调节昆虫电压-门控钾通道活性的能力的第二步骤”表示各种测定测试物质调节电压-门控钾通道活性的能力的方法中的特征为包括所述第一步骤和所述第二步骤的方法。
    在本文中,A组是包含前述氨基酸序列的蛋白。
    所述第一步骤是“将测试物质加入至用于测定以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫的电生理学活性的反应系统,从而使该线虫与所述测试物质相接触,并测量所述线虫的电生理学活性的步骤”。
    另外,所述第二步骤是比较测量测试物质时的活性和对照的活性,并基于该差别评估调节电压-门控钾通道的活性的能力的步骤。
    在本文中,对照意指,例如,在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中时,其中只加入与用来溶解所述测试物质的溶剂相同的溶剂的检测部分。
    在包括所述第一步骤和所述第二步骤的测量测试物质调节电压-门控钾通道活性的能力的方法中使用的以起离子通道作用的形式表达电压-门控钾通道的线虫是以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的线虫。
    以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的线虫的实例具体包括以起离子通道作用的形式表达A组中所示的蛋白的秀丽隐杆线虫。
    具体地,在执行筛选杀虫剂时,它们可以用作用于为了筛选而进行的实验的实验工具。具体地,它们可以用作用于在执行测定杀虫能力,筛选具有杀虫能力的化学物质等时进行的实验的实验工具。
    此外,本发明还包括这样的系统,所述系统包括输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的设备,其中所述能力是调节昆虫电压-门控钾通道的活性的能力(以下,在一些情形中,称为设备a),基于所需的标准查询并且检索所述数据信息的设备(以下,在一些情形中,称为设备b),和显示并且输出查询和检索的结果的设备(以下,在一些情形中,称为设备c)(以下,在一些情形中称为本发明的系统)。
    首先,将解释设备a。设备a是意指,在输入关于测试物质具有的调节昆虫电压-门控钾通道活性的能力的数据信息之后,存储并且管理所输入的信息的设备,如上文所述。信息通过输入设备1输入,并且通常在存储设备2中存储。输入设备的实例包括可以输入信息的设备诸如键盘和鼠标。当完成信息的输入和存储、管理时,步骤前进至下一设备b。为了存储、管理所述信息,大量的数据可以通过以下步骤来有效地存储和管理:使用硬件如计算机、和软件如OS和数据库管理而输入具有数据结构的信息,并且将所述信息存储到适当的存储装置中,例如计算机可读记录介质如软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘。
    将解释设备b。设备b是通过基于获得需要的结果的标准的手段查询并且检索所存储和管理的数据信息的设备,如上文所述。对于所述信息,当将用于查询和检索的标准通过输入设备1输入,并且在通常存储在存储设备2中的信息中选择符合所述标准的信息时,步骤前进至下一设备c。选择的结果通常存储在存储设备2中,并且可以进一步通过显示输出设备3显示。
    将解释设备c。设备c是显示并且输出查询和检索的结果的设备,如上文所述。显示输出设备3的实例包括显示器、打印机等,并且所述结果可以在计算机的显示装置上显示,或者可以通过打印在纸上输出。
    实施例
    下面将通过实施例的方式更详细地解释本发明,但是本发明不限于这些具体的实施例。
    实施例1(从棉蚜和德国蟑螂提取总RNA)
    (1)从棉蚜提取总RNA
    将在盆栽黄瓜的叶片上养殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷子从叶片表面刮下,并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根据下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中后,将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后,将流体样品用移液管转移到15ml试管中,并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)制造)。立即将混合物用力振荡15秒,然后在室温静置3分钟,然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且向两个新管中各转入5ml水层。在向每一管中加入5ml ISOGEN后,将混合物立即用力振荡15秒,并且然后在室温静置3分钟。然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且向新的50ml管中分别各转入10ml水层。随后,将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中,并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后,向剩余物中加入20ml70%乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后,将总RNA的沉淀稍微干燥,并且然后溶解在1ml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)为6.9mg/ml。
    (2)从德国蟑螂提取总RNA
    提供人工培养的德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))的成虫、若虫和卵囊(oothecae)作为样品。10只雄性成虫和10只雌性成虫(卵囊已经从每一只个体去除)用作1.1g的成虫样品,将10只雄性若虫和10只雌性若虫用作1.0g的若虫样品,并且将26只卵囊用作1.0g的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒分别地在液氮中压成粉末。从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根据下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中后,将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后,将流体样品用移液管转移到15ml试管中,并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)供应)。立即将混合物用力振荡15秒,然后在室温静置3分钟。然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且向两个新管中各转入5ml水层。在向每一管中加入5ml ISOGEN后,将混合物立即用力振荡15秒,并且然后在室温静置3分钟。然后,将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟,并且向新的50ml管中分别各转入10ml水层。随后,将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中,并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后,向剩余物中加入20ml 70%乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后,将总RNA的沉淀稍微干燥,并且然后溶解在1ml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)在来源于成虫的总RNA的情况下为1.1mg/ml,在来源于若虫的总RNA的情况下为2.5mg/ml,并且在来源于卵囊的总RNA的情况下为1.4mg/ml。
    实施例2(分离棉蚜seizure基因)
    使用来自棉蚜的总RNA,用于RT-PCR的随机引物(Invitrogen)和Superscript III(Invitrogen),根据Superscript III的生产厂商的方法而制备第一链cDNA。
    通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO:11的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO:12的寡核苷酸(它们为对所述基因特异的引物),和延伸长模板PCR系统(由罗氏(Roche)制造)根据生产厂商的方法进行PCR而扩增棉蚜seizure的全长cDNA。将实施例1中所述的cDNA用作模板。使用的PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:起始变性在94℃2分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为94℃30秒,70℃30秒(每个循环降低1℃),和68℃4分钟;然后是25个PCR循环,一个循环为94℃30秒,60℃30秒,和68℃30秒(每个循环延长10秒);接着在68℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化以获得目的DNA片段。此外,将由此获得的DNA片段克隆到TOPO XL载体(由Invitrogen制造)中,确定核苷酸序列,并且存在4种剪接变体D1,D2,E1和E2(D1:SEQ ID NO:2,D2:SEQ ID NO:4,E1:SEQ ID NO:6,E2:SEQ ID NO:8)。这4种核苷酸序列示意性地显示在图1中。D和E变体在它们的5’区中不同,且E变体的5’区比D同种型的5’区长约270bp。D1和E1变体与D2和E2变体相比,具有另外的96个碱基对的序列,其位于聚3’区1kb的位置。该附加序列在本文中表示为SEQ ID NO 9。由核苷酸序列SEQ ID NO:2,4,6和8推导出的氨基酸序列分别是氨基酸序列SEQ ID NO:1,3,5和7。5’末端和3’末端的非翻译区是普通的,且含有该非翻译区的D1的核苷酸序列以SEQ ID NO:10显示。
    实施例3(分离德国蟑螂seizure基因)
    为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离seizure基因的同源物,应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心内运行的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网站//blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html上可公共地获得),并且参考前文提及的棉蚜seizure的氨基酸序列和先前已知的来自诸如人(NCBI登记号Q12809和Q9H252),秀丽隐杆线虫(NP_49782),黑腹果蝇(AAM68296),冈比亚按蚊(XP_308166)的同源物的氨基酸序列,设计简并引物。
    选择的昆虫物种的seizure基因的同源物的部分序列通过一系列PCR扩增,所述PCR使用来源于该昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处,所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一组简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造)根据所述试剂附带的生产厂商的方法而进行。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在94℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为94℃30秒,60℃1分钟(每个循环降低1℃),和72℃1分30秒;接着是25个PCR循环,一个循环为94℃30秒,50℃30秒,和72℃1分30秒;并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    因此,获得德国小蠊seizure基因的部分序列。
    然后,设计对所得到的seizure基因的昆虫同源物的部分序列特异的引物,并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR,以获得所述基因的全长序列。3’RACE PCR这样进行,即,应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板,并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。5’RACE PCR这样进行,即,应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板,并且使用第二代5’/3’RACE试剂盒(由罗氏(Roche)制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。
    在5’RACE反应中,对目的序列特异的反向引物与作为正向引物的第二代5’/3’RACE试剂盒中包含的寡-d(T)-锚定引物1(Oligo-d(T)-anchor primer1)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃40秒;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃40秒(每个循环延长20秒);并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时,使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性反向引物与作为正向引物的第二代5’/3’RACE试剂盒中包含的PCR锚定引物组合用作引物。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃40秒;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃40秒(每个循环延长20秒);并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    在3’RACE反应中,对目的序列特异的正向引物与SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的作为反向引物的通用引物混合物(UPM)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃1分钟;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃1分钟;并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时,使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性正向引物与作为反向引物的SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物组合用作引物。PCR条件为进行递降PCR的那些条件,如下:在95℃起始变性5分钟;然后是10个递降-PCR循环,一个循环为95℃30秒,60℃30秒(每个循环降低1℃),和72℃1分钟;接着是25个PCR循环,一个循环为95℃30秒,50℃30秒,和72℃1分钟;并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化,以获得目的DNA。此外,将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen制造)中,并且测序。
    上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列,各自分别编码昆虫seizure的N-端区域和C-端区域。
    实施例4(构建用于生成转基因线虫的质粒)
    通过分别使用实施例2中所示的克隆至TOPO XL载体(由Invitrogen制造)中的棉蚜seizure的剪接变体D1,D2,E1和E2作为模板,并使用对各基因序列特异的引物,通过PCR来扩增待克隆至用于生成重组线虫的载体中的来自棉蚜的seizure基因片段。
    在D1的情形中,所述片段使用由核苷酸序列SEQ ID NO:13组成的寡核苷酸和由核苷酸序列SEQ ID NO:14组成的寡核苷酸(它们是与基因序列特异的引物),通过PerfectShot ExTaq(由Takara Bio Inc.制造),根据所述试剂附带的说明书通过PCR来扩增。PCR条件为稍后所述的递降PCR。即,首先,94℃5分钟,随后进行10个循环:94℃30秒,由80℃30秒开始伴随着每个循环降低1℃,和72℃4分钟,其后,进一步进行25个循环:94℃30秒,70℃30秒,和72℃4分钟,最后,72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析,并且将目标DNA片段克隆至TOPO XL载体(由Invitrogen制造)中以获得TOPO-XL-D1。
    由于引物SEQ ID NO:13包含NheI限制酶位点,且引物SEQ ID NO:14包含NcoI限制酶位点,所以用NheI和NcoI来切用于生成重组线虫的载体pDW2700(由Devgen制备,如WO 2003097682中所述),所述重组线虫包含TOPO-XL-D1和源自线虫的myo-2启动子。棉蚜的ERG-型电压-门控钾通道D1的NheI/NcoI DNA片段,和用NheI/NcoI消化的用于生成重组线虫的载体pDW2700,通过琼脂糖凝胶电泳来分析,并通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(Quiaquick Gel Extraction Kit)(由Qiagen制造)来纯化。这两个纯化的DNA片段利用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)来连接,以获得pGBB010。
    在D2的情形中,所述片段使用由核苷酸序列SEQ ID NO:13组成的寡核苷酸和由核苷酸序列SEQ ID NO:14组成的寡核苷酸(它们是与基因序列特异的引物),使用PerfectShot ExTaq(由Takara Bio Inc.制造),根据所述试剂附带的说明书通过PCR来扩增。PCR条件为稍后所述的递降PCR。即,首先,94℃5分钟,随后进行10个循环:94℃30秒,由80℃30秒开始伴随着每个循环降低1℃,和72℃4分钟,其后,进一步进行25个循环:94℃30秒,70℃30秒,和72℃4分钟,最后,72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析,并且将目标DNA片段克隆至TOPO XL载体(由Invitrogen制造)中以获得TOPO-XL-D2。
    由于引物SEQ ID NO:13包含NheI限制酶位点,且引物SEQ ID NO:14包含NcoI限制酶位点,所以用NheI和NcoI来切用于生成重组线虫的载体pDW2700(由Devgen制备),所述重组线虫包含TOPO-XL-D2和myo-2启动子。棉蚜seizure D2的NheI/NcoI DNA片段,和用NheI/NcoI消化的用于生成重组线虫的载体pDW2700,通过琼脂糖凝胶电泳来分析,并通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)来纯化。这两个纯化的DNA片段利用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)来连接,以获得pGBB014。
    在E1和E2的情形中,所述片段使用由核苷酸序列SEQ ID NO:15组成的寡核苷酸和由核苷酸序列SEQ ID NO:14组成的寡核苷酸(它们是与基因序列特异的引物),使用Takara LATaq(由Takara Bio Inc.制造),根据所述试剂附带的说明书通过PCR来扩增。PCR条件为稍后所述的递降PCR。即,首先,94℃5分钟,随后进行10个循环:94℃30秒,由70℃30秒开始伴随着每个循环降低1℃,和72℃4分钟,其后,进一步进行25个循环:94℃30秒,60℃30秒,和72℃30秒(伴随着每个循环增加10秒),最后,72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析,并且将目标DNA片段克隆至TOPO XL载体(由Invitrogen制造)中以获得TOPO-XL-E1-MUT和TOPO-XL-E2-MUT。然而,作为序列分析的结果,没有获得与模板的E1和E2的核苷酸序列完全一致的克隆。然后,使用D1和E1,以及D2和E2(它们在除5’末端以外的区域具有相同核苷酸序列)的组合,利用TOPO-LX-D1和TOPO-LX-D2,通过以下操作改变TOPO-XL-E1-MUT和TOPO-XL-E2-MUT。
    由于TOPO-XL-D1和TOPO-XL-E1-MUT在TOPO XL载体(由Invitrogen制造)上包含HindIII限制酶位点,并且在D1和E1基因的5’上游区域上包含BsgI限制酶位点,所以侧邻HindIII和BsgI限制酶位点的5’上游区域片段互换。首先,使用HindIII和BsgI来消化TOPO-XL-D1,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化,并除去包含D1的5’上游区域的HindIII/BsgI片段。随后,使用HindIII和BsgI消化TOPO-XL-E1-MUT,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化,并且获得包含E1的5’上游区域的HindIII/BsgI片段。由于BsgI限制酶位点的区域下游为D1和E1所共有,所以由此产生的包含E1的5’上游区域的HindIII/BsgI片段和已经从中除去了D1的5’上游区域的TOPO-XL-D1进行连接,以获得具有正确的E1核苷酸序列的TOPO-XL-E1。
    由于TOPO-XL-D2和TOPO-XL-E2-MUT在TOPO XL载体(由Invitrogen制造)上包含HindIII限制酶位点,并且在D2和E2基因的5’上游区域上包含BsgI限制酶位点,所以侧邻HindIII和BsgI限制酶位点的5’上游区域片段互换。首先,使用HindIII和BsgI来消化TOPO-XL-D2,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化,并除去包含D2的5’上游区域的HindIII/BsgI片段。随后,使用HindIII和BsgI消化TOPO-XL-E2-MUT,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化,并且获得包含E2的5’上游区域的HindIII/BsgI片段。由于BsgI限制酶位点的下游区域为D2和E2所共有,所以由此产生的包含E2的5’上游区域的HindIII/BsgI片段和已经从中除去了D2的5’上游区域的TOPO-XL-D2使用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)进行连接,以获得具有正确的E2核苷酸序列的TOPO-XL-E2。
    由于TOPO-XL-E1和TOPO-XL-E2中包含的E1和E2基因侧邻NheI限制酶位点和NcoI限制酶位点,所以使用NheI和NcoI来切TOPO-XL-E1和TOPO-XL-E2。使用NheI和NcoI,类似地酶切用于生成重组线虫的载体pDW2700(由Devgen制造)。E1和E2的NheI/NcoI DNA片段和用NheI/NcoI消化的pDW2700通过琼脂糖凝胶电泳分析,并通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)纯化。E 1和pDW2700的NheI/NcoI DNA片段,或E2和pDW2700的NheI/NcoI DNA片段利用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)来分别连接。
    实施例5(构建用于电生理学实验的质粒)
    实施例4中所示的TOPO-XL-D1,TOPO-XL-D2,TOPO-XL-E1,和TOPO-XL-E2使用限制酶NheI来处理,并使用Klenow酶来钝化粘性末端。在使用限制酶EcoRI进一步消化后,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化,获得四种棉蚜seizure剪接变体(D1,D2,E1,E2)的各自DNA片段。用于电生理学实验的载体pcDNA3.1(+)-X(由IonGate制造,其中将源自非洲爪蟾的a-blobin基因的5’和3’非翻译区插入由Invitrogen制造的载体pcDNA3.1(+)中的载体)使用限制酶BamHI来处理,并使用Klenow酶来钝化粘性末端。这进一步使用限制酶EcoRI来消化,并进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化。D1,D2,E1和E2的各自DNA片段,和pcDNA3.1(+)-X利用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)来分别连接,以获得pcDNA3.1X-D1,pcDNA3.1X-D2,pcDNA3.1X-E1,和pcDNA3.1X-E2。这四种质粒用于使用非洲爪蟾卵母细胞,通过双电极电压钳方法(TEVC方法)进行的电生理学实验。
    实施例4中所示的包含棉蚜seizure D2的pGBB014使用限制酶NheI来处理,并使用绿豆核酸酶(由新英格兰生物实验室(New England Biolabs)制造)来钝化粘性末端。在使用限制酶XhoI进一步消化后,进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化。在另一方面,由Invitrogen制造的载体pcDNA3(+)使用限制酶EcoRV和XhoI来处理,并进行通过琼脂糖凝胶电泳的分析,和通过Quiaquick凝胶提取试剂盒(由Qiagen制造)的纯化。D2的DNA片段和pcDNA3(+)利用Takara连接酶I(由Takara Bio Inc.制造)来连接,以获得pGBB036。该质粒用于利用CHO细胞通过膜片钳方法进行的电生理学实验中。
    实施例6(利用非洲爪蟾卵母细胞通过TEVC方法进行的电生理学分析)
    关于四种棉蚜seizure剪接变体(D1,D2,E1,E2),通过使用非洲爪蟾卵母细胞通过双电极电压钳方法(TEVC方法)进行的电生理学分析来选择最佳用于生成基因重组线虫的基因。
    为了持续保持水的循环和清洁,将雌性非洲爪蟾养殖在装配以空气泵和过滤装置的水浴中。关于非洲爪蟾,实验室养殖线购自NASCO(Fort Atkinson,WI,美国),并使其适合于干燥样品,并用于实验中。非洲爪蟾养殖在水温保持在18℃的自来水中,并人工提供各12小时的光/暗周期。非洲爪蟾利用2g/l托利卡因(tolycaine)水溶液来麻醉,并随后使用冰来冷却。将下腹部切割成小块,并取出包含卵母细胞的卵巢。切出一部分卵泡,用不含钙离子的OR2溶液(82.5mM NaCl,2mM KCl,1mM MgCl2,5mM HEPES,pH 7.4)洗涤,并在16℃进行2mg/ml胶原酶处理,以从卵母细胞表面取出卵泡细胞。在胶原酶处理后,使用OR2溶液洗涤卵母细胞,并将其保存在OR2溶液中,向所述OR2溶液中加入了终浓度50mg/l的庆大霉素(Gentamycin)。
    在实施例5中生成的用于电生理学实验的四种质粒(pcDNA3.1X-D1,pcDNA3.1X-D2,pcDNA3.1X-E1,pcDNA3.1X-E2)使用限制酶XbaI来消化,从而线性化获得DNA片段,使用该DNA片段作为模板并使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra(由Ambion制造),根据附带的说明书合成cRNA。制备的cRNA利用由Drummond科学(Drummond Scientific)(布鲁莫尔,PA,美国)制造的纳升注射器,以10ng/卵母细胞来注射。cRNA注射后的卵母细胞在具有向其中加入的庆大霉素的OR2溶液中,以16℃温育1-6天,以表达目标基因。
    所有电生理学实验在ND96标准溶液(96mM NaCl,2mM KCl,1mM MgCl2,1.8mM CaCl2,5mM HEPES,pH 7.4)中进行。将测试化合物以浓度100mM溶解在DMSO中,并在即将使用前,使用ND96标准溶液稀释至目标浓度。处于最大测试浓度(100μM)的测试系统中的DMSO浓度是0.1%。该DMSO浓度不影响电流的测量。
    使用由npi电子学(npi electronics)(Tamm,德国)制造的放大器TEC-03X,和软件Cellworks,通过双电极电压钳方法进行电生理学测量。在室温下(20-25℃)记录实验数据。对微电极填充3M KCl,并将电阻值设置为0.2-1.5MΩ。在整个记录过程中,使卵母细胞进入使用ND96对其进行灌注的状态。当提供电压脉冲时,卵母细胞在停留电压(retention potential)-80mV下固定。测试方案显示在图2-4中。作为标准方案,使用方案IV来记录离子通道的电流电压关系。使用方案活化和方案hERG尾电流来验证通道是否表现出与人ERG类似的性能。
    化合物的活性使用方案IV通过以下程序来测量。首先,将方案IV的连续脉冲重复提供给灌注ND96的卵母细胞3次。然后,在存在溶解在ND96中的化合物的条件下,将该连续脉冲重复提供给卵母细胞6次。当实验条件充足时,随后进行洗出测试化合物的实验。在洗出实验中,再次使用ND96灌注卵母细胞,并且将该连续脉冲重复提供3-6次。
    在各自测试浓度下,对最后3次连续脉冲的电流波形的振幅进行平均,并使用计算的电流值来计算抑制程度。利用在仅使用ND96测量时的电流值作为标准,校正数据。关于数据分析,使用由微软(Microsoft)(雷蒙德,WA,美国)制造的软件Excel和由OriginLac(北安普敦,MA,美国)制造的软件Origin。利用Hill方程式获得IC50值。
    利用方案IV,验证四种剪接变体是否表达为功能性钾通道。如表3中所示,D1,D2和E2表达为功能性钾通道,但E1在该测试系统中不表现出活性。由于D2表现出最大电流应答,所以其被确定为最适合用于生成在选择化合物中使用的重组线虫。
    表3
      剪接变体  电流大小(10ng cRNA)  D1  0.8±0.1μA  D2  23±5μA  E1  0  E2  2.5±0.6μA
    然后,当利用方案活化来验证存在或不存在失活时,D1,D2和E2几乎不表现出失活。此外,当所述性能利用方案hERG尾电流与人ERG的性能进行比较时,图5的人ERG的电生理学应答中识别出的ERG-型通道中特有的尾电流在图6的棉蚜seizure D2的电生理学应答中没有发现。该结果普遍适用于D1和E2。尽管与果蝇seizure和人ERG的同源性很高,但是棉蚜seizure表现出与EAG通道的性能在电生理学方面类似的性能。
    然后,比较与通道的功能相关的氨基酸序列。如表4中所示,人ERG的Ser620在棉蚜seizure中是保守的,但相反地,Ala位于人EAG中。然而,人ERG的Ser631在棉蚜seizure中被Ala置换,并且该Ala也在人EAG中证实。由尾电流的存在或不存在和氨基酸序列的比较,棉蚜seizure具有ERG和EAG的混合特征。
    表4
      hERG  hEAG  蚜虫seizure  尾电流  无尾电流  无尾电流  620 Ser  Ala  Ser  631 Ser  Ala  Ala
    最后,对棉蚜seizure D2进行药理学分析。将多非利特(Dofetilide)(图7),其是hERG的选择性阻断剂,和氯非铵(图8),其作为阻断剂作用于ERG/EAG二者,用作对照试剂。多非利特以中等程度(IC50~23μM)影响棉蚜seizure D2,而作为阻断剂作用于ERG/EAG二者的氯非铵强烈作用于D2(IC50~1μM)。这与D2具有ERG/EAG混合特征相一致。由前述,显示D2起作为电压-门控钾通道的功能,且ERG/EAG调节剂影响D2的活性。
    实施例7(通过全细胞膜片钳方法进行的电生理学分析)
    使用表达棉蚜seizure D2的CHO细胞,通过全细胞膜片钳方法测量电压-门控钾通道的活性。
    根据一般的组织培养程序,将在实施例5中生成的pGBB036瞬间引入至CHO细胞中。为了验证基因引入成功,将荧光标记物GFP基因同时引入至CHO细胞中。pGBB036与标记物基因的比率为10∶1??赡苁褂萌肷涔庥庀晕⒕道醇虻サ丶ɑ蛞氤晒Φ南赴?。在培养24小时后,将引入基因的细胞分装,冷冻,并立即冷藏保存在-150℃。在执行电生理学实验的前一天,再将冷藏保存的细胞悬浮在新鲜培养基中,并将细胞接种在直径为12mm的盖玻片上,所述盖玻片在皮氏培养皿中展开。将皮氏培养皿保持在温度37℃,5%CO2的条件下。24小时后,交换培养基,并将盖玻片转移入膜片钳装置的室中。
    对CHO细胞执行通过全细胞膜片钳方法的记录。一般膜片钳的微电极由硼硅玻璃毛细管制备,且电阻值设置为5-7MΩ。用于全细胞记录的电极中的溶液是130mM葡萄糖酸钾,2mM Na-G-葡萄糖酸盐,20mM HEPES,4mM MgCl2,4mM Na2ATP,0.4mM NaGTP,5mM EDTA,pH 7.3。记录的信号均使用由Warner器具(Warner Instruments)(哈姆登,CT,美国)制造的放大器PC-501A来放大并且,随后,以10kHz数字化。为了存储和分析数据,使用WINWCP软件(版本3.5.2,J.Dempster博士,University of Strathclyde Electrophysiology Software(斯特拉思克莱德区大学电生理学软件)),WINWDR软件(版本2.7.0,J.Dempster博士,University of Strathclyde Electrophysiology Software(斯特拉思克莱德区大学电生理学软件)),和Microsoft Office Excel 2003。
    当使用30μM氯非铵处理表达D2的CHO细胞时,如图9中所示,通道的活性在氯非铵处理中与未处理相比受到86%的抑制。
    实施例8(通过显微注射生成重组线虫)
    其中已经引入了棉蚜seizure D2的基因改造线虫通过显微注射,根据以下程序来生成,从而获得UG2242(基因型:pha-1(e2123ts)III;bgEx1259[pha-1;myo-2::蚜虫seizure(D2);myo-3::gfp])。UG2242保持其中棉蚜seizure与myo-2启动子下游连接的基因,作为染色体外DNA阵列。
    为了显微注射,使用通过以下程序制备的琼脂糖垫作为试样固定器。将电泳级琼脂糖(由GIBCO BRL制造)制成浓度为2%,并在载玻片上逐滴加入20μl该电泳级琼脂糖。将另一块载玻片叠盖在加入的琼脂糖上并且,在10秒后,除去上面的盖玻片。将琼脂糖已经在其上以薄垫形式展开的载玻片在65℃干燥过夜。利用拔针器PC-10(由Narishige制造),用于显微注射的针由硼硅玻璃毛细管GC120F-10(由SDR制造)制成。用0.5μl DNA混合物填充该针。待注射的DNA混合物通过在1μl M9缓冲液中混合全部以下各项来制备:5ng包含待引入的D2基因的载体pGBB014,5ng包含pha-1基因作为选择标记物的载体pBX(记述在Granato等,Nucleic Acids Res.(核酸研究)22,1762-1763,1994中),10ng包含GFP基因作为另一种标记物基因的载体pDW2821(其中GFP基因与源自线虫的myo-3启动子的下游连接),和80ng线虫基因组DNA作为载体DNA。
    将一滴矿物油(由西格玛(Sigma)制造,400-5)倒在琼脂糖垫上,并将年幼的双性pha-1突变体线虫置于该油中。将用于显微注射的针连接到显微操纵器(由Leitz制造)。对焦在性腺和针尖上,同时使用倒置显微镜(由Zeiss,Axiovert制造)观察所述油。针刺入性腺,并使用Transjector 5246(由Eppendorf制造)注射DNA混合物。完成显微注射后,逐滴加入50μl M9缓冲液,以回收线虫。最后,将线虫转移至包被有大肠杆菌(Escherichia coli)OP50菌株的3cm NGM(线虫生长培养基)琼脂培养基,所述大肠杆菌OP50菌株是线虫的饲料。
    为了使用pha-1选择系统,在15℃养殖显微注射后的线虫(P0代),以获得后代(F1代)。然后,收集F1代,并将其转移至20-25℃,并获得存活的下一代作为转化体。将该存活的下一代由15℃转移至20℃,再次获得存活率,并验证pha-1选择系统的存在。另外,通过使用GFP荧光显示体壁肌肉,验证myo-3::gfp标记物基因的存在。通过PCR,验证引入的棉蚜seizure基因的存在。
    通过类似的方法,可能制备D1,E1或E2的转化体。
    作为对照品系的UG2234(基因型:pha-1(e2123ts)III;bgEx1253[pha-1;myo-3::gfp])也通过类似的方法制备。由于该品系具有pha-1选择标记物基因和myo-3::gfp标记物基因,所以将其用于验证这些标记物系统对实施例10中所示的线虫的咽电图没有影响。
    实施例9(通过粒子枪生成重组线虫)
    根据以下程序,使用粒子枪制备适合于高通量筛选的基因重组线虫,并且将其称为UG2346(基因型:+/+;bgls1289[myo-2::蚜虫seizure(D2);unc-119-unc-119])。UG2346是这样的品系,其中将小拷贝数的myo-2::蚜虫seizure(D2)基因结合至基因组中。
    UG2346通过粒子枪方法来制备。为了制备其中利用该技术将引入基因结合到基因组中的品系,发射通过使用DNA包被unc-119突变体DP38(基因型:unc-119(ed3)III)获得的金颗粒。作为用于包被的DNA,使用包含pGBB014(myo-2::蚜虫seizure(D2))和作为选择系统的UNC-119片段的质粒pDPMM#016b(记述在Praitis等,Genetics(遗传学)157,1217-1226,2001中),所述pGBB014(myo-2::蚜虫seizure(D2))包含待引入的棉蚜seizure D2基因。
    UNC-119突变体在液体培养基中培养。在培养溶液中大部分线虫是晚期幼虫(L4幼虫)或年幼成虫的时刻,回收线虫,并用500ml M9缓冲液洗涤至少5次。在各洗涤程序之间,容许线虫静止10-15分钟以沉积。其后,将线虫转移至50ml管中,并再次沉积。将沉积的线虫(0.5ml)用于转化。向1.5ml硅处理的管(由Scientific Plastics制造)中置入15mg 1.5-3.0微米金颗粒(由Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)制造)。向其中加入1ml 70%乙醇,并使用涡旋混合器将其搅拌至少5分钟。容许混合物静止15分钟,以沉积金颗粒。在使用离心机快速离心该混合物后,去除上清。随后,加入1ml去离子水,使用涡旋混合器搅拌混合物1分钟并容许其静止1分钟以沉积金颗粒,并去除上清。该操作重复三次。最后,加入250μl 50%甘油,随后使用涡旋混合器搅拌1分钟。
    制备各2.5μg两种质粒pDPMM#016b和pGBB014并且,在线性化后,使用Qiuaquick离心柱(Qiuaquick Spin Column)(由Qiagen制造)对其进行纯化。加入1/10量的7.5M乙酸钠和2倍量的100%乙醇,并使用离心机离心DNA 30分钟。去除上清,并使用200μl 70%乙醇洗涤沉淀的DNA。使用离心机,离心DNA 10分钟。去除上清,并干燥沉淀的DNA。将DNA溶解在去离子水中,达到终浓度1μg/μl。
    向10μl金颗粒中混合1μDNA溶液,10μl 12.5M CaCl2,和0.1M亚精胺,并使用涡旋混合器搅拌该混合物3分钟。在使用离心机快速离心该混合物后,去除上清。将金颗粒沉淀物重新悬浮在30μl 70%乙醇中,再次使用离心机对其进行快速离心,并去除上清。将金颗粒沉淀物重新悬浮在10μl 100%乙醇中。
    将沉淀的unc-119突变体(0.5ml)重新悬浮在3ml M9缓冲液中。使用移液管取出300μl混悬液,并展开在4.5cm琼脂培养基。
    使用移液管和涡旋混合器重新悬浮用DNA包被的金颗粒。向不锈钢Sweeney过滤器固定器13mm(由Millipore制造)中填充10μl金颗?;煨?,并将其连接于利用氦气压力的基因发射装置。利用该装置,金颗粒用气压(8巴,10毫秒)加速,并发射到线虫中。容许其静止1小时直至回收线虫,并且线虫使用M9缓冲液来回收,并转移至9cm琼脂培养基。
    培养在琼脂培养基上,以20℃进行12天。培养12天后,饲料耗尽,并使线虫开始进入禁食状态。转化体可以通过抗性幼虫在该禁食状态期间存活,但是非转化体不能存活。
    通过该选择,筛选可存活的转化体。证实选择的线虫表现与野生型相同的运动。分离转化体,并将其逐一转移至分开的皮氏培养皿中。从使用金颗粒发射的P0代看,这些线虫处于F2代。为了鉴定其中将引入基因插入基因组中的品系,繁殖F2代的下一代。使F2代作为亲本,当下一代(F3)中转化体的比率为75%(杂合体型)或100%(纯合体型)时,这被认为是其中引入基因结合至基因组中的品系。选择UG2295(基因型:unc-119;bgls1289[myo-2::蚜虫seizure(D2);unc-119-unc-119]),并通过PCR验证pGBB014(myo-2::蚜虫seizure(D2))的存在。
    如此,在引入基因随机结合至基因组的程序中,由于存在这样的可能性,即可能出现其中插入许多质粒的品系或其中引入基因ga插入至产生不必要的表现型的基因中的品系,所以UG2295与野生型线虫后部-交配(back-mated)。最后,通过两次后部交配(back mating),获得UG2346(基因型:+/+;bgls1289[myo-2::蚜虫seizure(D2);unc-119-unc-119])。
    通过相同的方法,可能还关于D1,E1和E2生成其中引入基因结合至基因组中的转化体。
    实施例10(重组线虫的咽电图)
    通过使用作为瞬间转化品系的UG2242和作为稳定转化品系的UG2346来记录咽电图,证实引入的棉蚜seizure基因以功能性形式表达。
    制备在20℃养殖的线虫的成虫。使用含有促进抽吸的20mM 5-羟色胺的Dent’s盐水(以mM为单位的组成;D-葡萄糖10mM,HEPES 10mM,NaCl 140mM,KCl 6mM,CaCl2 3mM,MgCl2 1mM,pH 7.4)作为室内溶液,将线虫置于室内。进行抽吸直至作为室内溶液的Dent’s盐水与微量移液管中的电极相接触。在适度抽吸后,将线虫的头部插入移液管尖端,以进行记录。使用放大器(Multiclamp 700-A,Axon仪器(Axon instruments))和A/D转换器(Digidata 1322A,Axon仪器(Axon instruments))获得数据。
    作为对照品系的UG2234(基因型:pha-1(e2123ts)III;bgEx1253[pha-1;myo-3::gfp])的咽电图显示在图10A中。在另一方面,其中引入有棉蚜seizure D2的重组线虫UG2242(基因型:pha-1(e2123ts)III;bgEx1259[pha-1;myo-2::蚜虫seizure(D2);myo-3::gfp])的咽电图显示在图10B中。如与作为对照品系的UG2234相比,在其中引入有棉蚜seizure D2的UG2242中,导致特有的变化,即在咽电图中,动作电位持续时间缩短,且电压波形长度减小。动作电位持续时间在作为对照品系的UG2234中为200±50ms,而在其中引入有棉蚜seizure D2的UG2242中缩短至50ms。而且,在作为稳定转化品系的UG2346中,获得类似的结果。
    为了证明引入的棉蚜seizure的活性可以在表达棉蚜seizure的重组线虫中通过药理学调节,和验证重组线虫担当筛选化合物中所使用的工具的作用,使用氯非铵处理其中引入有棉蚜seizure D2的UG2242,所述氯非铵作为阻断剂作用于ERG/EAG二者。当记录咽电图时,在氯非铵处理前(图11A),电压波形的长度显著减小,但是当进行5μM氯非铵处理5分钟时(图11B),电压波形的长度显著增加,并且在15分钟后变为与野生型相同的电压波形(图11C)。这显示氯非铵可以阻断重组线虫中表达的棉蚜seizure,并且通过药理学证明了重组线虫的适宜性。
    通过类似的方法,可能验证D1,E1和E2在重组线虫中以功能性形式表达。
    实施例11(选择抑制重组线虫摄食行为活动的化合物)
    在基因改变的线虫的咽部,棉蚜seizure电活性的改变影响咽部的运动,即食物的摄入。因此,关于基因重组线虫,改变棉蚜seizure活性的能力可以作为改变食物摄入的能力来测量。
    线虫的食物摄入可以通过向培养基添加荧光染料前体来测量。特别地,由于由线虫口服的荧光染料前体在肠中通过酶转变为荧光染料,并且由基因重组线虫发射的荧光信号增加,所以线虫的食物摄入可以作为由线虫发射的荧光信号来测量。
    为了测量改变以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫的摄食行为活动的能力,将荧光染料前体加入至包含以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫的液体培养基中,并且将由线虫口服摄取的荧光染料前体的摄入作为由线虫发射的荧光信号来检测。当将荧光染料前体的摄入定义为摄食行为活动时,将测试物质对摄食行为活动的影响作为对棉蚜seizure活性的影响来评估。
    作为以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫,使用实施例9中生成的重组线虫UG2346并且,作为荧光染料前体,添加钙荧光素AM(由Molecular Probes(分子探针)制造)。由钙荧光素AM转变的荧光物质钙荧光素以485nm的激发和535nm的发射来测量,并且计算线虫的摄食行为活动。
    为了测量活性,在包含溶解于DMSO中至终浓度为30μM的氯非铵时,测量以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫的摄食行为活动。另外,在替代氯非铵包含DMSO时,测量以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫的摄食行为活动。然后,计算在包含溶解于DMSO中的氯非铵时的线虫摄食行为活动测量值相对于在替代氯非铵包含DMSO时的线虫摄食行为活动测量值的比率(%),并且用作抑制程度(%)。
    另外,在包含溶解于DMSO中至终浓度分别为100μM,30μM,10μM,3μM,1μM,0.3μM,0.1μM,和0.03μM的氯非铵时,测量以功能性形式表达棉蚜seizure的线虫的摄食行为活动。由测试化合物中各种浓度时的结果,利用浓度依赖性测试分析软件XL拟合(由IDBS制造)来计算IC50(μM)。结果与实施例12的结果一起显示在实施例11中的表6中。
    通过类似的方法,可能在许多化合物中选择具有抑制棉蚜seizure活性的能力的化合物。
    实施例12(杀虫活性检测)
    制备具有下述组成(表5)的灭菌人工饲料。然后,根据与在昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版社1985)第35-36页中所述的方法相同的方法,不同之处在于将溶解在DMSO中至终浓度50ppm的测试化合物以该人工饲料的0.5%体积加入,并且混和各成分,饲养棉蚜。饲养后6天,研究存活的棉蚜数目,并且通过用下述方程获得控制值而将表现出显著控制值(例如,30%或更大的控制值)的实体确定为具有杀虫活性。
    控制值(%)={1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
    在所述方程中的字母表示下述含义:
    Cb:在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目
    Cai:在未处理部分中在观察时存活的蠕虫数目
    Tb:在处理的部分中在处理之前存活的蠕虫数目
    Tai:在处理的部分中在观察时存活的蠕虫数目
    结果与实施例11的结果一起显示在实施例12中的表6中。
    表5


    表4

    工业应用性
    根据本发明,能够提供靶向性更强的筛选农业化学品的方法,由此针对特定目标筛选化合物,目的在于化学性地干扰目标位点以控制昆虫或其它害虫生物体。




























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    本文标题:参与昆虫电压门控钾通道活性的调节害虫的生理状况的试剂.pdf
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