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    果糖 氧化酶
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980148386.8

    申请日:

    2009.10.08

    公开号:

    CN102232111A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/00申请日:20091008|||公开
    IPC分类号: C12N15/00; C12N9/04; C12N15/09; C12Q1/26; G01N33/72; C12N5/10; C12N1/15; C12N1/19; C12N1/21 主分类号: C12N15/00
    申请人: 协和梅迪克斯株式会社
    发明人: 相阪和夫; 铃木惠子
    地址: 日本东京都
    优先权: 2008.10.09 JP 2008-262601
    专利代理机构: 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 代理人: 张颖;樊卫民
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980148386.8

    授权公告号:

    102232111B||||||

    法律状态公告日:

    2014.12.03|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了选自下面[1]到[4]的蛋白:[1]具有SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白;[2]具有在SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列中缺失、取代或添加至少一个氨基酸残基所产生的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;[3]具有与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;以及[4]通过使用大肠埃希氏杆菌(Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株(在保藏号FERM?BP-11026下保藏)所携带的表达质粒产生的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。

    权利要求书

    1.下列[1]到[4]任一项中的蛋白:
    [1]包含SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白;
    [2]包含在SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列中具有一个或多个
    氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性
    的蛋白;
    [3]包含与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%以上同源
    性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;以及
    [4]由在保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌
    (Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株所携带的表达质粒编码的具有
    果糖基肽氧化酶活性的蛋白。
    2.权利要求1的蛋白,其包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基酸序列。
    3.下列[1]到[3]任一项的DNA:
    [1]编码权利要求1的蛋白的DNA;
    [2]包含SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的DNA;以及
    [3]在严紧条件下与包含SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的互
    补核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中所述DNA编码具有果糖基肽
    氧化酶活性的蛋白。
    4.权利要求3的DNA,其编码包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基
    酸序列的蛋白。
    5.权利要求3的DNA,其包含SEQ?ID?NO:4所显示的核苷酸序
    列。
    6.一种重组DNA,其包含权利要求3到5任一项的DNA。
    7.一种转化体,其包含权利要求6的重组DNA。
    8.一种用于生产权利要求1或2的蛋白的方法,其中将权利要求
    7的转化体在培养基中进行培养,蛋白产生并积累在培养物中,并从培
    养物收集蛋白。
    9.一种用于测量样品中的糖化蛋白的方法,其中方法包含将样品
    与蛋白酶反应以形成糖化肽,然后将形成的糖化肽与权利要求1或2
    的蛋白反应,并测量由糖化肽与蛋白之间的反应所形成的物质或在糖
    化肽与蛋白之间的反应中所消耗的物质。
    10.权利要求9的测量方法,其中糖化蛋白是糖化血红蛋白。
    11.权利要求10的测量方法,其中糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。
    12.一种用于测量糖化蛋白的试剂,其包含蛋白酶和权利要求1
    或2的蛋白。
    13.权利要求12的试剂,其还包含用于测量由权利要求1或2的
    蛋白与从糖化蛋白形成的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。
    14.权利要求13的试剂,其中产物是过氧化氢。
    15.权利要求12到14任一项的试剂,其中糖化蛋白是糖化血红
    蛋白。
    16.权利要求15的试剂,其中糖化血红蛋白是血红蛋白A1c。
    17.在保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌
    (Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株。

    说明书

    新的果糖基肽氧化酶

    技术领域

    本发明涉及具有果糖基肽氧化酶活性的新蛋白、编码所述蛋白的DNA、用于生产所述蛋白的方法、使用所述蛋白测量糖化蛋白的方法以及包含所述蛋白的用于测量糖化蛋白的试剂。?

    背景技术

    糖化蛋白包含在生物样品例如体液和毛发中,体液包括血液等。血液中存在的糖化蛋白的浓度取决于溶解在血清中的糖、例如葡萄糖的浓度,并且最近,在临床诊断领域中,测量血液中的糖化蛋白——血红蛋白A1c的浓度(非专利文献1),被用于诊断和监测糖尿病。作为测量这种血红蛋白A1c的方法,已经知道的有使用高效液相色谱(HPLC)的仪器分析方法(非专利文献2)、使用抗原-抗体反应的免疫分析法(例如非专利文献3)等,但是在近年中,已经开发了酶分析法,例如,已经开发了使用蛋白酶和果糖基肽氧化酶的方法(专利文献1)。酶分析法能够适用于通用自动化分析仪,并且因为操作也简单,它们的开发越来越多。?

    在酶分析法中使用的果糖基肽氧化酶,是一种催化在分子氧的存在下通过氧化切开酮糖衍生物中的C-N键而产生邻酮醛糖(α-酮基醛)、肽和过氧化氢的反应的酶,所述酮糖衍生物由葡萄糖的半缩醛与肽的N-端氨基之间的反应产生的葡萄糖胺的Amadori重排所产生。?

    在如图1中所示的酶分析法的情形中,一种方法是已知的,其中首先用蛋白酶降解血红蛋白A1c,并从血红蛋白的β-链的N-端产生α-果糖基缬氨酰组氨酸(在后文中称为α-FVH);接下来,使果糖基肽氧化酶作用于所产生的α-FVH,将产生的过氧化氢在过氧化物酶存在?下应用于氧化缩合以产生醌色素,并且使用分光光度计通过比色法测定产生的量(专利文献1)。?

    然而,作为蛋白酶处理的副产物,形成了ε-果糖基赖氨酸和含有它的糖化肽,并且已经指出,当果糖基肽氧化酶作用于它们时,存在着血红蛋白A1c的测量值可能高于真实值的风险(专利文献2)。?

    已经从细菌、真菌和植物发现果糖基肽氧化酶。例如源自于Achaetomiella属、毛壳属(Chaetomium)(专利文献3)、弯孢霉属(Curvularia)(专利文献2)、蔷薇科(Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)、伞形科(Apiaceae)(专利文献4)、姜科(Zingiberaceae)(专利文献5)等的果糖基肽氧化酶是已知的。?

    然而,到目前为止报道的果糖基肽氧化酶具有缺点,例如:?

    (1)针对α-糖化二肽(α-果糖基缬氨酰组氨酸)的活性与针对α-糖化氨基酸(例如α-果糖基缬氨酸)的活性相比不一定高;?

    (2)如上所述,除了N-端α-糖化二肽之外,它也作用于其中糖连接到赖氨酸的ε-氨基上的ε-糖化氨基酸(ε-果糖基赖氨酸),并增加血红蛋白A1c测量中的测量值;以及?

    (3)在使用酶的测量方法的情形中,酶在测量或储存过程中变得不稳定。?

    为了克服这些缺点,已经报道了由于在果糖基肽氧化酶中人工导入突变而对ε-果糖基赖氨酸的反应性降低的酶(专利文献4)、也是由于导入突变而耐热性增加的酶(非专利文献4)等。然而,以高水平同时克服上面提到的(1)至(3)的缺点的酶的存在,仍是未知的。?

    非专利文献1:Clinical?Chemistry?and?Laboratory?Medicine第36卷,p.299-308(1998).?

    非专利文献2:Chromatogr.Sci.,第10卷,p.659(1979).?

    非专利文献3:日本临床检查自动化学会杂志,第18卷,第4号,p.620(1993).?

    非专利文献4:Appl.Microbiol.Biotechnol.,第78卷,第5号,p.775-781(2008).?

    专利文献1:特开2001-95598号公报。?

    专利文献2:国际公布WO?2004/104203号单行本。?

    专利文献3:特开2003-235585号公报.?

    专利文献4:国际公布WO?2004/038033号单行本。?

    专利文献5:国际公布WO?2004/038034号单行本。?

    发明内容

    [本发明待解决的问题]?

    有鉴于上面提到的问题,完成了本发明。本发明的目的是提供对α-糖化二肽(α-果糖基缬氨酰组氨酸)具有高特异性并具有非常稳定的果糖基肽氧化酶活性的蛋白。此外,本发明的另一个目的是提供编码该蛋白的DNA、含有该DNA的重组DNA、用该重组DNA转化的转化体、使用该转化体等生产具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的方法,以及使用该蛋白测量糖化蛋白的方法和包含该蛋白的用于测量糖化蛋白的试剂。?

    [解决问题的手段]?

    本发明涉及下列(1)到(17):?

    (1)下列[1]到[4]任一项中的蛋白:?

    [1]包含SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白;?

    [2]包含在SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;?

    [3]包含与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%或更高同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;以及?

    [4]由在保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌?(Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株所携带的表达质粒编码的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;?

    (2)(1)的蛋白,其包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基酸序列;?

    (3)下列[1]到[3]任一项的DNA:?

    [1]编码(1)的蛋白的DNA;?

    [2]包含SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的DNA;以及?

    [3]在严紧条件下与包含与SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的互补核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中DNA编码具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;?

    (4)(3)的DNA,其编码包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基酸序列的蛋白;?

    (5)(3)的DNA,其包含SEQ?ID?NO:4所显示的核苷酸序列;?

    (6)一种重组DNA,其包含(3)到(5)任一项的DNA;?

    (7)一种转化体,其包含(6)的重组DNA;?

    (8)一种用于生产(1)或(2)的蛋白的方法,其中将(7)的转化体在培养基中进行培养,蛋白产生并积累在培养物中,并从培养物收集蛋白;?

    (9)一种用于测量样品中的糖化蛋白的方法,其中方法包含将样品与蛋白酶反应以形成糖化肽,然后将形成的糖化肽与(1)或(2)的蛋白反应,并测量由糖化肽与蛋白之间的反应所形成的物质或在糖化肽与蛋白之间的反应中所消耗的物质;?

    (10)(9)的测量方法,其中糖化蛋白是糖化血红蛋白;?

    (11)(10)的测量方法,其中糖化血红蛋白是血红蛋白A1c;?

    (12)一种用于测量糖化蛋白的试剂,其包含蛋白酶和(1)或(2)的蛋白;?

    (13)(12)的试剂,其还包含用于测量由(1)或(2)的蛋白与从糖化蛋白形成的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;?

    (14)(13)的试剂,其中产物是过氧化氢;?

    (15)(12)到(14)任一项的试剂,其中糖化蛋白是糖化血红蛋白;?

    (16)(15)的试剂,其中糖化血红蛋白是血红蛋白A1c;以及?

    (17)在保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌(Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株。?

    [本发明的效果]?

    本发明提供了对α-糖化二肽(α-果糖基缬氨酰组氨酸)具有高特异性并具有非常稳定的果糖基肽氧化酶活性的蛋白、编码该蛋白的DNA、用于生产该蛋白的方法,以及使用该蛋白测量糖化蛋白的方法和包含该蛋白的用于测量糖化蛋白的试剂。?

    附图简述

    图1显示了血红蛋白A1c的酶法测量的方案图。?

    图2显示了FPOX-9的氨基酸序列。上面有圆圈标记的氨基酸显示了相对于产果糖基肽氧化酶真菌(遗传来源)的氨基酸序列来说突变的位点。?

    图3显示了FPOX-9的DNA序列。上面有圆圈标记的核苷酸显示了相对于产果糖基肽氧化酶细菌(遗传来源)的DNA序列来说突变的位点。?

    图4显示了FPOX-15的氨基酸序列。上面有圆圈标记的氨基酸显示了相对于产果糖基肽氧化酶细菌(遗传来源)的氨基酸序列来说突变的位点,下划线的氨基酸显示了相对于FPOX-9的氨基酸序列来说突变的位点。?

    图5显示了FPOX-15的DNA序列。上面有圆圈标记的核苷酸显示了相对于产果糖基肽氧化酶细菌(遗传来源)的DNA序列来说突变的位点,下划线的核苷酸显示了相对于FPOX-9的DNA序列来说突变的位点。?

    执行本发明的方式

    1.本发明的蛋白?

    本发明的蛋白的实例包括?

    [1]包含SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白;?

    [2]包含在SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;?

    [3]包含与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白;以及?

    [4]由在保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌(Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株所携带的表达质粒编码的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。?

    在上述中,包含具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白,可以例如使用位点特异性诱变方法通过将位点特异性突变导入包含SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白的编码DNA来获得,所述位点特异性诱变方法描述在:《分子克隆实验指南》第二版(Molecular?Cloning,A?Laboratory?Manual,Second?Edition),Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press(1989)(在后文中简称《分子克隆》第二版);《分子生物学现代方法》(Current?Protocols?in?Molecular?Biology),John?Wiley?&?Sons(1987-1997)(在后文中简称《分子生物学现代方法》);Nucleic?Acids?Research,10,6487(1982);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982);Gene,34,315(1985);Nucleic?Acids?Research,13,4431(1985);和Proc.Natl.Acad.Sci.USA,?82,488(1985)等。?

    尽管对缺失、取代或添加的氨基酸的数量没有特别限制,但它是通过已知方法例如上面提到的位点特异性诱变方法能够缺失、取代或添加的氨基酸的数量,并且该数量是一到几十,优选为1到20、更优选为1到10、更加优选为1到5。?

    当一个或多个氨基酸被缺失、取代或添加到SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列时,一个或多个氨基酸可以在同一序列的任何位置处缺失、取代或添加。?

    能够发生氨基酸缺失或添加的氨基酸位置包括例如位于SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的N-端侧和C-端侧的一个到几个氨基酸。?

    缺失、取代或添加可以同时发生,并且被取代或添加的氨基酸可以是天然存在类型或非天然存在类型的氨基酸。天然存在类型的氨基酸的实例包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸。?

    下面,显示了可互相取代的氨基酸的实例。包含在同一个组中的氨基酸可互相取代。?

    A组:亮氨酸,异亮氨酸,正亮氨酸,缬氨酸,正缬氨酸,丙氨酸,2-氨基丁酸,甲硫氨酸,O-甲基丝氨酸,叔丁基甘氨酸,叔丁基丙氨酸,环己基丙氨酸?

    B组:天冬氨酸,谷氨酸,异天冬氨酸,异谷氨酸,2-氨基己二酸,2-氨基辛二酸?

    C组:天冬酰胺,谷氨酰胺?

    D组:赖氨酸,精氨酸,鸟氨酸,2,4-二氨基丁酸,2,3-二氨基丙酸?

    E组:脯氨酸,3-羟基脯氨酸,4-羟基脯氨酸?

    F组:丝氨酸,苏氨酸,高丝氨酸?

    G组:苯丙氨酸,酪氨酸?

    此外,为了使本发明的蛋白具有果糖基肽氧化酶活性,期望蛋白与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选94%以上、更优选98%以上、特别优选99%以上的同源性。?

    氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可以使用Karlin和Altshul的?BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[Methods?Enzymol.,183,63(1990)]来确定?;诟肂LAST算法,已经开发了被称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。当通过基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列时,参数被设置成例如得分(score)=100和字长(wordlength)=12。当通过基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列时,参数被设置成例如得分(score)=50和字长(wordlength)=3。当使用BLAST和Gapped?BLAST程序时,使用每个程序的缺省参数。?

    包含与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选94%以上、更加优选98%以上或特别优选99%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白,也是本发明的蛋白。?

    本发明的蛋白是,例如,包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基酸序列的蛋白。?

    作为证实本发明的蛋白具有果糖基肽氧化酶活性的手段,人们可以通过DNA重组方法生产表达本发明的蛋白的转化体,使用该转化体生产本发明的蛋白,然后使用α-FVH作为底物,测量通过与底物的反应所形成的过氧化氢。?

    本发明的蛋白具有下列性质:?

    (a)作用:使用分子氧氧化糖化肽,以生成邻酮醛糖(α-酮基醛)、肽和过氧化氢。?

    (b)底物特异性:对α-FVH的高反应性和对ε-果糖基赖氨酸(在后文中简称为ε-FK)的低反应性。?

    可以通过例如使用α-FVH和ε-FK作为底物并测量对α-FVH的活性与对ε-FK的活性的比率(α-FVH/ε-FK),来证实本发明的蛋白对?α-FVH的高反应性和对ε-FK的低反应性。?

    对于本发明蛋白的果糖基肽氧化酶活性的最适pH和稳定的pH范围没有特别限制,最适pH优选为约6.0至7.0,并且对于在40℃处理10分钟的稳定pH优选为pH6.0至9.0。?

    对于作用的最适温度范围没有特别限制,并且优选为约30℃至50℃。蛋白的热稳定性越高,蛋白越优选,并且优选使用例如在50℃处理15分钟后残余活性为25%以上的蛋白。?

    果糖基肽氧化酶活性的测量通过下述方法进行,并且将在1分钟内从α-FVH产生1μmol过氧化氢的酶量定义为1个单位(U)。?

    用于测量活性的试剂的制备

    溶液A:着色溶液?

    溶液A-1:4-氨基安替比林在离子交换水中的溶液,浓度为2.4mmol/L。?

    溶液A-2:N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)在离子交换水中的溶液,浓度为32mmol/L。?

    溶液B:过氧化物酶溶液?

    过氧化物酶(110U/mg,由东洋纺织社制造)在0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的溶液,浓度为2mg/mL。?

    溶液C:底物溶液?

    α-FVH或ε-FK(由PEPTIDE研究所制造)在0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的溶液,浓度为10mmol/mL。?

    测量程序

    将50μL溶液A-1、50μL溶液A-2、2μL溶液B和20μL溶液C?混合,并加水到200μL,然后将其在30℃预温育5分钟,然后加入1μL酶溶液,使混合物在30℃反应30分钟,在读板器(infinite?F200,由Tecan制造)上测量550nm处的吸光度??瞻字翟谑褂美胱咏换凰娴孜锶芤?C溶液)制备的溶液上进行测量。?

    然后,向上述测量体系加入各种不同量的过氧化氢,测量550nm处的吸光度,产生显示出过氧化氢量与吸光度之间的关系的校正曲线,并从该校正曲线确定酶的单位数(酶效价)。?

    携带有包含SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白的表达质粒(表达质粒)的大肠埃希氏杆菌(Escherichia?coli)XL1-Blue?MRF’菌株(大肠埃希氏杆菌XL1-Blue?MRF’/pTrcFPOX-9),保藏于独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏中心。保藏物的特定说明内容如下所述。?

    (a)保藏机构的名称和地址?

    名称:独立行政法人产业技术综合研究所?国际专利生物保藏中心?

    地址:日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码:305-8566)?

    (b)接收日期(保藏日期):2008年9月19日?

    (c)接收号(保藏号):FERM?BP-11026?

    在上述保藏号FERM?BP-11026下保藏的大肠埃希氏杆菌XL1-Blue?MRF’菌株、该细菌菌株所携带的表达质粒以及由该质粒编码的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白,也包含在本发明中。?

    2.本发明的DNA?

    本发明的DNA的实例包括:?

    [1]编码前面1下的[1]到[3]的本发明蛋白的DNA;?

    [2]包含SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的DNA;以及?

    [3]在严紧条件下与所包含的核苷酸序列与SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列互补的DNA杂交、并且编码具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的DNA。?

    在本文中,“杂交”是指目标DNA与具有特定核苷酸序列的DNA或该DNA的一部分杂交。因此,具有特定核苷酸序列的DNA核苷酸序列或该DNA的一部分,可以是其长度可用作Northern或Southern印迹分析的探针、或可用作PCR分析的寡核苷酸引物的DNA。用作探针的DNA包括至少100个核苷酸以上、优选200个核苷酸以上或更优选500个核苷酸以上的DNA;并且它们也可以是至少10个核苷酸以上或优选15个核苷酸以上的DNA。?

    DNA杂交实验的方法是公知的??梢岳绨凑障铝形南字械拿枋鋈范ㄔ咏惶跫⒔惺笛椋骸斗肿涌寺 ?Molecular?Cloning)第二版、第三版(2001),《通用和分子细菌学方法》(Methods?for?General?and?Molecular?Bacteriology,ASM?Press)(1994),《免疫学方法手册》(Immunology?methods?manual,Academic?press)(Molecular),以及许多其他标准教科书。?

    上面提到的严紧条件的实例包括下列条件:将其上固定化有DNA的滤膜与探针DNA在含有50%甲酰胺、5xSSC(750mmol/L氯化钠和75mmol/L柠檬酸钠)、50mmol/L磷酸钠(pH?7.6)、5xDenhardt′s溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/L变性鲑鱼精子DNA的溶液中,在42℃下温育过夜,以及在温育后,将滤膜在例如0.2xSSC溶液中、在约65℃下清洗;并且,也可以使用严紧性较低的条件??梢酝ü髡柞0返呐ǘ?随着甲酰胺浓度的降低,条件的严紧性变低)或通过改变盐浓度和温度条件,来修改严紧条件。低严紧条件的实例包括下列条件:在含有6xSSCE(20xSSCE:3mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸二?氢钠和0.02mol/L?EDTA,pH?7.4)、0.5%SDS、30%甲酰胺和100μg/L变性鲑鱼精子DNA的溶液中,在37℃下进行过夜温育,然后使用1xSSC、0.1%SDS溶液在50℃下进行清洗。严紧性更低的条件的实例包括下述条件:杂交在上面提到的低严紧条件下使用高盐浓度的溶液(例如,5xSSC)进行,然后进行清洗。?

    也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的阻断试剂,来设置上面描述的各种条件。在添加上面提到的阻断试剂后,可以改变杂交条件以使条件相容。?

    上面提到的能够在严紧条件下杂交的DNA,包括当例如使用程序例如上面描述的BLAST和FASTA、根据上面提到的参数进行计算时,所包含的核苷酸序列与SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列具有至少80%以上、优选90%以上、更优选94%以上、更加优选98%以上或特别优选99%以上的同源性的DNA。?

    可以如下验证在严紧条件下与上述DNA杂交的DNA是编码具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的DNA:制备表达该DNA的重组DNA,将该重组DNA导入宿主细胞,培养所获得的微生物,纯化从培养物获得的蛋白,并通过使用纯化的蛋白作为酶源和α-FVH作为底物测量与底物的反应所产生的过氧化氢。?

    本发明的DNA的实例包括包含SEQ?ID?NO:3所显示的氨基酸序列的蛋白的编码DNA,以及包含SEQ?ID?NO:4所显示的核苷酸序列的DNA。?

    3.本发明的转化体?

    本发明的转化体的实例包括使用含有前面2的DNA的重组DNA通过已知方法转化宿主细胞所获得的转化体。宿主细胞的实例包括细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞,优选为细菌,更优选为?原核细胞,更加优选为属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物。?

    4.本发明的DNA的制备?

    本发明的DNA可以从例如微生物例如丝状真菌、优选从属于曲霉属(Aspergillus)或裸胞壳属(Emericella)的微生物、或特别优选从属于构巢裸胞壳(Emericella?nidulans)等的微生物,使用可以根据SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列设计的探针来获得。?

    或者,根据各种遗传序列数据库,可以搜索与SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的编码DNA的核苷酸序列具有85%以上、优选90%以上、更优选95%以上、更加优选98%以上以及特别优选99%以上的同源性的序列,并且也可以根据通过搜索获得的核苷酸序列,按照上面描述的方法从具有核苷酸序列的生物体的染色体DNA、cDNA文库等获得本发明的DNA或在本发明的生产方法中使用的DNA。?

    DNA的核苷酸序列可以如下测定:原样使用所获得的DNA,或通过将它用适合的限制性酶切开,通过常规方法插入到载体中,将得到的重组DNA导入宿主细胞,然后使用惯常使用的核苷酸序列分析方法例如双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463(1977)]或核苷酸序列分析仪例如373A?DNA测序仪(由Perkin?Elmer制造)进行分析。?

    用于插入本发明的DNA的载体的实例包括pBluescript?II?KS(+)(由Stratagene制造)、pDIRECT[Nucleic?Acids?Res.,18,6069(1990)]、pCR-Script?Amp?SK(+)(由Stratagene制造)、pT7Blue(由Novagen,Inc.制造)、pCR?II(由Invitrogen?Corp.制造)和pCR-TRAP(由GenHunter?Corp.制造)。?

    作为宿主细胞,可以使用属于埃希氏杆菌属等的微生物。属于埃希氏杆菌属的微生物的实例包括大肠埃希氏杆菌XL1-Blue、大肠埃希氏杆菌XL2-Blue、大肠埃希氏杆菌DH1、大肠埃希氏杆菌MC1000、?大肠埃希氏杆菌ATCC?12435、大肠埃希氏杆菌W1485、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌HB101、大肠埃希氏杆菌No.49、大肠埃希氏杆菌W3110、大肠埃希氏杆菌NY49、大肠埃希氏杆菌MP347、大肠埃希氏杆菌NM522、大肠埃希氏杆菌BL21和大肠埃希氏杆菌ME8415。?

    作为导入重组DNA的方法,可以使用任何用于将DNA导入上述宿主细胞的方法,其实例包括使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法(特开昭63-248394)和电穿孔[Nucleic?Acids?Res.,16,6127(1988)]。?

    在所获得的DNA作为核苷酸序列测定的结果是部分DNA的情况下,可以使用该部分DNA作为探针,通过在染色体DNA文库上进行Southern杂交等,来获得全长DNA。?

    此外,也可以根据所测定的该DNA的核苷酸序列,使用由PerSeptive?Biosystems制造的8905型DNA合成仪等通过化学合成来制备所需DNA。?

    如上所述获得的DNA的实例是具有SEQ?ID?NO:2所显示的核苷酸序列的DNA。?

    5.用于产生在本发明的生产方法中使用的转化体的方法?

    在本发明DNA的基础上,根据需要制备含有本发明蛋白的编码区的适合长度的DNA片段。通过取代蛋白编码部分的核苷酸序列中的核苷酸以获得在宿主中表达的最适密码子,可以获得具有提高的蛋白生产率的转化体。?

    通过将DNA片段插入到适合的表达载体中启动子的下游,产生重组DNA。?

    可以通过将重组DNA导入适合于表达载体的宿主细胞,来获得生产本发明蛋白的重组体。?

    作为宿主细胞,可以使用任何宿主细胞例如细菌细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞,只要其能够表达目标基因即可。?

    所使用的表达载体是在上面提到的宿主细胞中能够自主复制或整合到染色体中,并在能够转录本发明的DNA的位置处含有启动子的表达载体。?

    在使用原核生物例如细菌作为宿主细胞的情况下,含有本发明的DNA的重组DNA优选为能够在原核生物中自主复制,并在同时由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA和转录终止序列构成的重组DNA?;箍梢园骺仄舳拥幕?。?

    表达载体的实例是pCold?I(由TAKARA?BIO?Inc.制造)、pCDF-1b和pRSF-1b(都由Novagen?Inc.制造)、pMAL-c2x(由New?England?Biolabs?Inc.制造)、pGEX-4T-1(由GE?Healthcare?Biosciences制造)、pTrcHis(由Invitrogen?Corp.制造)、pSE280(由Invitrogen?Corp.制造)、pGEMEX-1(由Promega?Corp.制造)、pQE-30(由Qiagen?Inc.制造)、pET-3(由Novagen?Inc.制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,?53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript?II?SK(+)、pBluescript?II?KS(-)(由Stratagene制造)、pTrS30[从大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS30(FERM?BP-5407)制备]、pTrS32[从大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS32(FERM?BP-5408)制备]、pPAC31(WO?98/12343)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(由TAKARA?BIO?Inc.制造)、pUC118(由TAKARA?BIO?Inc.制造)和pPA1(特开昭63-233798)。?

    可以使用任何启动子,只要它能够在宿主细胞例如大肠埃希氏杆菌中起作用即可。其实例包括源自于大肠埃希氏杆菌、噬菌体等的启动子,例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子和PSE启动子,以及SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子。也可以使用具有人工设计的变化的启动子,例如其中将两个Ptrp串联排列的启动子、tac启动子、lacT7启动子和let?I启动子。?

    此外,也可以使用用于在属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,35,594-599(1991)]、用于在属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)]等。?

    优选使用其中Shine-Dalgarno序列、即核糖体结合序列与起始密码子之间的距离经过适当调整(例如6到18个核苷酸)的质粒。?

    在其中本发明的DNA已被连接到表达载体的重组DNA中,转录终止序列不总是必需的;然而,转录终止序列优选置于结构基因的直接下游。?

    这种重组DNA的实例是pET21-plu1440。?

    原核生物的实例包括属于下列属的微生物:埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、着色菌属(Chromatium)、欧文氏菌属(Erwinia)、甲基杆菌属(methylobacterium)、席藻属(Phormidium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红?螺菌属(Rhodospirillum)、栅藻属(Scenedesmus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻属(Synechoccus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。例如,它们是大肠埃希氏杆菌XL1-Blue、大肠埃希氏杆菌XL2-Blue、大肠埃希氏杆菌DH1、大肠埃希氏杆菌DH5α、大肠埃希氏杆菌MC1000、大肠埃希氏杆菌KY3276、大肠埃希氏杆菌W1485、大肠埃希氏杆菌JM109、大肠埃希氏杆菌HB101、大肠埃希氏杆菌No.49、大肠埃希氏杆菌W3110、大肠埃希氏杆菌NY49、大肠埃希氏杆菌MP347、大肠埃希氏杆菌NM522、大肠埃希氏杆菌BL21、枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)ATCC?33712、巨大芽孢杆菌(Bacillus?megaterium)、产氨短杆菌(Brevibacterium?ammoniagenes)、Brevibacterium?immariophilum?ATCC?14068、解糖短杆菌(Brevibacterium?saccharolyticum)ATCC?14066、黄色短杆菌(Brevibacterium?flavum)ATCC?14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium?lactofermentum)ATCC?13869、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium?glutamicum)ATCC?13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC?14297、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium?acetoacidophilum)ATCC?13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium?ammoniaphilum)ATCC?15354、无花果沙雷氏菌(Serratia?ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia?fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia?liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia?marcescens)、假单胞菌(Pseudomonas)sp.D-0110、放射形土壤杆菌(Agrobacterium?radiobacter)、毛根土壤杆菌(Agrobacterium?rhizogenes)、覆盆子土壤杆菌(Agrobacterium?rubi)、柱胞鱼腥藻(Anabaena?cylindrica)、桶形鱼腥藻(Anabaena?doliolum)、水华鱼腥藻(Anabaena?flos-aquae)、金黄色节杆菌(Arthrobacter?aurescens)、柠檬色节杆菌(Arthrobacter?citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter?globiformis)、裂烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter?hydrocarboglutamicus)、迈索节杆菌(Arthrobacter?mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter?nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter?paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter?protophormiae)、Arthrobacter?roseoparaffinus、硫磺节杆菌(Arthrobacter?sulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacter?ureafaciens)、?布氏着色菌(Chromatium?buderi)、微温着色菌(Chromatium?tepidum)、酒色着色菌(Chromatium?vinosum)、沃氏着色菌(Chromatium?warmingii)、Chromatium?fluviatile、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia?uredovora)、胡萝卜欧文氏菌(Erwinia?carotovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia?ananas)、草生欧文氏菌(Erwinia?herbicola)、Erwinia?punctata、地生欧文氏菌(Erwinia?terreus)、罗得西亚甲基杆菌(methylobacterium?rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium?extorquens)、席藻(Phormidium)sp.ATCC?29409、荚膜红细菌(Rhodobacter?capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter?sphaeroides)、胚素红假单胞菌(Rhodopseudomonas?blastica)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas?marina)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas?palustris)、深红红螺菌(Rhodospirillum?rubrum)、需盐红螺菌(Rhodospirillum?salexigens)、嗜盐红螺菌(Rhodospirillum?salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces?ambofaciens)、金霉素链霉菌(Streptomyces?aureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces?aureus)、杀真菌素链霉菌(Streptomyces?fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomyces?griseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces?griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces?lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces?olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces?rameus)、田无链霉菌(Streptomyces?tanashiensis)、葡萄色链霉菌(Streptomyces?vinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonas?mobilis)。?

    作为将重组DNA导入原核生物的方法,可以使用任何方法,只要它能够将DNA导入上面提到的宿主细胞中即可,其实例包括使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体方法(特开昭63-248394)和电穿孔方法[Nucleic?Acids?Res.,16,6127(1988)]。?

    在使用酵母菌株作为宿主细胞的情况下,可以使用YEp13(ATCC?37115)、YEp24(ATCC?37051)、YCp50(ATCC?37419)、pHS19和pHS15作为表达载体。?

    作为启动子,可以使用任何启动子,只要它能够在酵母菌株中起作用即可,其实例包括启动子例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal?1启动子、gal?10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子和CUP?1启动子。?

    宿主细胞的实例包括属于酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)的酵母菌株,具体实例包括酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces?pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces?lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon?pullulans)、Schwanniomyces?alluvius、巴斯德毕赤酵母(Pichia?pastoris)和产朊假丝酵母(Candida?utilis)。?

    作为将重组DNA导入酵母的方法,可以使用任何方法,只要它能够将DNA导入酵母中即可,其实例包括电穿孔方法[Methods?Enzymol.,?194,182(1990)]、原生质球方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4889(1984)]和乙酸锂方法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]。?

    在使用动物细胞作为宿主细胞的情况下,可以使用pcDNAI、pcDM8(可以从Funakoshi?Co.,Ltd.商购)、pAGE107(特开平03-22979)、pAS3-3(特开平02-227075)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(由Invitrogen?Corp.制造)、pREP4(由Invitrogen?Corp.制造)、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA等作为表达载体。?

    作为启动子,可以使用任何启动子,只要它在动物细胞中起作用即可,其实例包括巨细胞病毒(CMV)的立即早期(IE)基因启动子、SV40早期启动子或金属硫蛋白启动子、反转录病毒的启动子、热休克?启动子、SRα启动子等。此外,人类CMV的IE基因的增强子可以与启动子组合使用。?

    宿主细胞的实例包括小鼠骨髓瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠杂交瘤细胞、人类细胞的Namalwa细胞和Namalwa?KJM-1细胞、人类胚胎肾细胞、人类白血病细胞、非洲绿猴肾细胞、源自中华仓鼠的CHO细胞、和HBT5637(特开昭63-299)。?

    小鼠骨髓瘤细胞包括SP2/0和NSO;大鼠骨髓瘤细胞包括YB2/0;人类胚胎肾细胞包括HEK293(ATCC?CRL-1573);人类白血病细胞包括BALL-1;非洲绿猴肾细胞包括COS-1和COS-7。?

    作为将重组DNA导入动物细胞的方法,可以使用任何方法,只要它能够将DNA导入动物细胞中即可,其实例包括电穿孔方法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙方法(特开平02-227075)、脂转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]以及在Virology,?52,456(1973)中描述的方法。?

    在使用昆虫细胞作为宿主的情况下,可以例如使用在下述文献中描述的方法来生产蛋白:《杆状病毒表达载体,实验室手册》(Baculovirus?Expression?Vectors,A?Laboratory?Manual),W.H.Freeman?and?Company,New?York(1992);《分子生物学现代方法》(Current?Protocols?in?Molecular?Biology);《分子生物学实验室手册》(Molecular?Biology,A?Laboratory?Manual);Bio/Technology,6,47(1988)等。?

    具体来说,可以通过将重组基因转移载体和杆状病毒共同导入昆虫细胞以在昆虫细胞的培养上清液中获得重组病毒,然后使用重组病毒感染昆虫细胞,来生产蛋白。?

    在该方法中使用的基因转移载体的实例包括pVL1392、pVL1393?和pBlueBacIII(都由Invitrogen?Corp.制造)。?

    作为杆状病毒,可以使用感染夜蛾科盗夜蛾亚科(Noctuidae?Hadeninae)昆虫的病毒——苜蓿银纹夜蛾(Autographa?californica)核型多角体病毒。?

    作为昆虫细胞,可以使用草地贪夜蛾(Spodoptera?frugiperda)的卵巢细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia?ni)的卵巢细胞、源自于蚕卵巢的培养细胞等。?

    草地贪夜蛾(Spodoptera?frugiperda)的卵巢细胞包括Sf9和Sf21(《杆状病毒表达载体,实验室手册》(Baculovirus?Expression?Vectors,A?Laboratory?Manual));粉纹夜蛾(Trichoplusia?ni)的卵巢细胞包括High?5和BTI-TN-5Bl-4(Invitrogen?Corp.);源自于蚕卵巢的培养细胞包括家蚕(Bombyx?mori)N4。?

    用于将上面提到的重组基因转移载体和上面提到的杆状病毒共同导入昆虫细胞中以制备重组病毒的方法的实例,包括磷酸钙方法(特开平02-227075)和脂转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]。?

    在使用植物细胞作为宿主细胞的情况下,可以使用Ti质?;蜓滩莼ㄒ恫《驹靥遄魑泶镌靥?。?

    作为启动子,可以使用任何启动子,只要它能够在植物细胞中起作用即可,其实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和水稻肌动蛋白1启动子。?

    宿主细胞的实例包括烟草、土豆、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦、大麦等的植物细胞。?

    作为将重组载体导入植物细胞的方法,可以使用任何方法,只要它能够将DNA导入植物细胞即可,其实例包括使用土壤杆菌的方法(特开昭59-140885,特开昭60-70080,WO?94/00977)、电穿孔方法(特开昭60-251887)和使用粒子枪(基因枪)的方法(特许第2606856号和特许第No.2517813号)。?

    6.生产本发明蛋白的方法?

    可以通过将使用上述5的方法获得的转化体在培养基中进行培养,使本发明的蛋白在培养物中形成和积累,并从培养物收集蛋白,来生产本发明的蛋白。?

    上面提到的用于生产本发明的蛋白的转化体的宿主可以是任何宿主,例如细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞或织物细胞,并且其优选为细菌、更优选为属于埃希氏杆菌属的微生物,更加优选为属于大肠埃希氏杆菌的微生物。?

    在使用酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞进行表达的情况下,可以获得附有糖或糖链的蛋白。?

    在培养基中培养上面提到的转化体的方法,可以按照培养宿主的通用方法来进行。

    作为培养使用原核生物例如大肠埃希氏杆菌或真核生物例如酵母作为宿主获得的转化体的培养基,可以使用天然培养基和合成培养基中的任一种,只要它是含有能够被生物体同化的碳源、氮源、无机盐等、并且转化体能够在其中有效培养的培养基即可。?

    作为碳源,可以使用能够被生物体同化的任何碳源,并且可以使用糖类例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解?物,有机酸例如乙酸和丙酸,以及醇类例如乙醇和丙醇。?

    作为氮源,可以使用氨、有机或无机酸的铵盐例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵、和其他含氮化合物,以及蛋白胨、肉类抽提物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼、大豆饼水解物和各种发酵性微生物细胞,及其消化产物。?

    作为无机盐,可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。?

    培养通常在有氧条件下进行,例如通过振摇培养或深部通气搅拌培养。培养温度优选为15至40℃,培养时间通常为5小时至7天。在培养过程中pH维持在3.0至9.0。pH的调节通过使用有机或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来进行。?

    当需要时,在培养过程中可以向培养基添加抗生素例如氨苄青霉素和四环素。?

    当对使用诱导型启动子作为启动子的表达载体所转化的微生物进行培养时,在需要时可以向培养基添加诱导物。例如,当对使用lac启动子的表达载体所转化的微生物进行培养时,可以向培养基添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷等;并且当对使用trp启动子的表达载体所转化的微生物进行培养时,可以向培养基添加吲哚丙烯酸等。?

    作为培养使用动物细胞作为宿主获得的转化体的培养基,可以使用一般使用的培养基,例如RPMI1640培养基[J.Am.Med.Assoc.,199,519(1967)]、Eagle’s?MEM培养基[Science,122,501(1952)]、DMEM培养基[Virology,8,396(1959)]和199培养基[Proc.Soc.Biol.Med.,73,1(1950)],或已经向这些培养基添加过胎牛血清等的培养基。?

    培养通常在pH6至8、25℃至40℃、存在5%CO2等的条件下进行1至7天。?

    在需要时,可以在培养过程中向培养基添加抗生素例如卡那霉素、青霉素和链霉素。?

    作为培养使用昆虫细胞作为宿主获得的转化体的培养基,可以使用一般使用的培养基,例如TNM-FH培养基(由Pharmingen,Inc.制造)、Sf-900?II?SFM培养基(由Life?Technologies,Inc.制造)、ExCell?400和ExCell?405(二者均由JRH?Biosciences,Inc.制造)和Grace′s昆虫培养基[Nature,195,788(1962)]。?

    培养通常在pH6至7、25℃至30℃等的条件下进行1至5天。?

    在需要时,可以在培养过程中向培养基添加抗生素例如庆大霉素。?

    使用植物细胞作为宿主获得的转化体,可以作为细胞或在分化成植物细胞或植物器官后进行培养。作为培养转化体的培养基,可以使用一般使用的培养基,例如Murashige和Skoog(MS)培养基、White培养基以及已经向这些培养基中添加了植物激素例如植物生长素和细胞分裂素的培养基。?

    培养通常在pH5至9、25℃至40℃的条件下进行3至60天。?

    在需要时,可以在培养过程中向培养基添加抗生素例如卡那霉素和潮霉素。?

    用于生产本发明的蛋白的方法,包括在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法以及在宿主细胞外膜上生产的方法。待生产的蛋白的结构可以根据所选的方法而变。?

    当本发明的蛋白在宿主细胞中或宿主细胞外膜上产生时,可以通过使用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989);Genes?Develop.,4,1288(1990)]或在特开平05-336963、WO?94/23021中描述的方法等,将蛋白主动分泌到宿主细胞外。?

    具体来说,可以使用遗传工程技术,将信号肽添加到含有本发明蛋白的活性位点的蛋白的上游,通过产生这种形式的蛋白将本发明的蛋白主动分泌到宿主细胞外。?

    也可以按照特开平02-227075中描述的方法,利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统,来增加生产水平。?

    此外,通过将已导入基因的动物或植物细胞重新分化,可以构建已导入基因的动物(非人类转基因动物)或植物(转基因植物),并且这可用于生产本发明的蛋白。?

    当生产本发明蛋白的转化体是动物或植物时,可以通过按照通用方法饲养或培养动物或植物,使蛋白形成并积累,并且从动物或植物收集蛋白,来生产蛋白。?

    使用动物生产本发明的蛋白的方法,包括例如在按照已知方法通过基因导入而构建的动物中生产本发明蛋白的方法[Am.J.Clin.Nutr.,?63,639S(1996);Am.J.Clin.Nutr.,63,627S(1996);Bio/Technology,9,830(1991)]。?

    在动物的情况下,可以通过例如饲养已经导入本发明的DNA或在本发明的生产方法中使用的DNA的非人类转基因动物,使蛋白在动物形成并积累,以及从动物回收蛋白,来生产本发明的蛋白。蛋白在动?物中形成和积累的场所包括动物的乳汁(特开昭63-309192)、蛋等。作为在该方法中使用的启动子,可以使用任何启动子,只要它能在动物中起作用即可,例如可以适合地使用乳腺细胞特异性启动子如α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。?

    使用植物生产本发明蛋白的方法,包括例如按照已知方法对已导入编码本发明蛋白的DNA的转基因植物进行培养[组织培养,20(1994);组织培养,21(1995);Trends?Biotechnol.,15,45(1997)],使蛋白在植物中形成和积累,并从植物收集蛋白,从而生产蛋白的方法。?

    作为用于分离/纯化通过使用产生本发明蛋白的转化体所生产的本发明蛋白的方法,可以使用分离和纯化酶的通用方法。?

    例如,当本发明的蛋白在细胞中以可溶状态生产时,在培养完成后通过离心收集细胞,将其悬浮在水性缓冲液中,然后使用超声波破碎机、French压力器、Manton?Gaulin均浆机、Dynomill等进行破碎,以获得无细胞提取物。?

    从无细胞提取物离心所获得的上清液中,可以单独或组合使用用于分离和纯化酶的通用方法来获得纯化的制备物。通用方法包括溶剂萃取、使用硫酸铵等盐析、脱盐、使用有机溶剂沉淀、使用树脂例如二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖或DIAION?HPA-75(由三菱化成社制造)进行阴离子交换层析、使用树脂例如S-琼脂糖FF(由GE?Healthcare?Biosciences制造)进行阳离子交换层析、使用树脂例如丁基琼脂糖和苯基琼脂糖进行疏水层析、使用分子筛进行凝胶过滤、亲和层析、层析聚焦以及电泳例如等电聚焦。?

    当蛋白在细胞中以不溶体形式生产时,同样地收集和破碎细胞,离心以获得沉淀级份,在通过常用方法从沉淀级份中回收蛋白后,使?用蛋白变性剂将蛋白的不溶体溶解。?

    通过用不含蛋白变性剂的溶液或所含蛋白变性剂的浓度低至不使蛋白变性的溶液对溶解的溶液进行稀释或透析,将蛋白构造成具有正常的三维结构,然后使用与上述相同的方法分离和纯化蛋白,可以获得纯化的制备物。?

    当本发明的蛋白或其衍生物例如糖修饰的形式被分泌到细胞外时,可以从培养上清液中回收蛋白或其衍生物例如糖附加体的形式。?

    具体来说,将培养物用与上述相似的方式例如离心进行处理,以获得可溶级份,并且可以通过使用与上述相似的分离和纯化方法,从可溶级份中获得纯化的制备物。?

    以上述方式获得的蛋白的实例包括含有SEQ?ID?NO:1所显示的氨基酸序列的蛋白。?

    此外,本发明的蛋白可以作为与另一种蛋白的融合蛋白来生产,并使用对融合蛋白具有亲和性的物质,利用亲和层析来纯化。例如,本发明的蛋白可以按照Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989);Genes?Develop.,4,1288(1990)]或在特开平05-336963和WO?94/23021中描述的方法,作为与蛋白A的融合蛋白来生产,并使用免疫球蛋白G通过亲和层析来纯化。?

    本发明的蛋白也可以作为与Flag肽的融合蛋白来生产,并使用抗Flag抗体通过亲和层析来纯化[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989);Genes?Develop.,4,1288(1990)],或者它可以作为与聚组氨酸的融合蛋白来生产,并使用对聚组氨酸具有高亲和性的金属配位的树脂,通过亲和层析来纯化。此外,可以使用针对蛋白自身的抗体,通过亲和层析来纯化蛋白。?

    本发明的蛋白可以基于上面获得的蛋白的氨基酸序列信息,通过化学合成方法例如Fmoc方法(芴基甲氧羰基方法)和tBoc方法(叔丁氧羰基方法)来生产。此外,蛋白可以使用来自Advanced?ChemTech、Perkin-Elmer、Pharmacia、Protein?Technology?Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、Shimadzu?Corporation等公司的肽合成仪进行化学合成。?

    7.使用本发明的蛋白测量糖化蛋白的方法?

    本发明的蛋白通过作用于糖化蛋白被蛋白酶作用后从糖化蛋白所产生的糖化肽而具有产生过氧化氢的特点;因此,它们可用于测量各种类型样品中的糖化蛋白。具体来说,可以通过将样品与蛋白酶反应以产生糖化肽,将产生的糖化肽与本发明的蛋白反应,并测量由糖化肽与本发明的蛋白之间的反应所产生的物质或在糖化肽与本发明的蛋白之间的反应中所消耗的物质,来测量样品中的糖化蛋白。与样品中糖化蛋白的测量相关的反应可以如下所述在水性介质中进行。本发明的糖化蛋白是例如糖化血红蛋白例如血红蛋白A1c或糖化白蛋白;它优选为糖化血红蛋白,特别优选为血红蛋白A1c。?

    本发明的测量方法描述如下。?

    待测量的样品和对象

    对于在本发明的测量方法中使用的样品没有具体限制,只要它们含有糖化蛋白即可,其实例包括生物样品例如全血、血浆、血清、血细胞、细胞样品、尿液、脑脊液、汗液、泪液、唾液、皮肤、黏膜和毛发以及食物。作为样品,全血、血浆、血清、血细胞等是优选的,全血、血细胞等是特别优选的。全血包括来自于全血的血细胞级份与血浆混合的样品。对于这些样品来说,可以使用进行过预处理例如溶血、分离、稀释、浓缩和纯化的样品。?

    血红蛋白是由α-链和β-链的两个多肽构成的四聚体,分子量为64,500。血红蛋白α-链的N-端三个氨基酸的序列是缬氨酸-亮氨酸-丝氨酸,β-链的N-端三个氨基酸的序列是缬氨酸-组氨酸-亮氨酸。血红蛋白A1c被定义为其中β-链的N-端缬氨酸被糖化的血红蛋白。此外,已知血红蛋白在分子中具有多个糖化位点(The?Journal?of?Biological?Chemistry(1980),256,3120-3127)。?

    通过使蛋白酶作用于含糖化血红蛋白的样品,产生了糖化氨基酸和/或糖化寡肽,例如源自于其中β-链N-端缬氨酸残基被糖化的糖化血红蛋白的α-果糖基缬氨酸(在后文中简称为α-FV)和α-FVH,源自于其中α-链N-端缬氨酸残基被糖化的糖化血红蛋白的α-FV和α-果糖基缬氨酰亮氨酸(在后文中简称为α-FVL),以及源自于α-链和/或β-链内的赖氨酸残基的ε-氨基的糖化的ε-FK。?

    此外,当样品是全血时,也从全血中糖化血红蛋白之外的糖化蛋白、例如糖化白蛋白产生糖化氨基酸,例如ε-FK。?

    因此,当使蛋白酶作用于含纯化血红蛋白的样品或含全血的样品时,产生了例如α-FVH、α-FV、ε-FK和α-FVL,其中α-FVH和α-FVL源自于糖化血红蛋白,α-FVH特异性源自于血红蛋白A1c。?

    因此,当测量血红蛋白A1c时,人们可以特异性测量α-FVH。本发明的蛋白对α-FVH具有高度反应性,并对ε-FK具有低反应性;因此,能够有效测量血红蛋白A1c。?

    蛋白酶

    作为可以在本发明中使用的蛋白酶,可以使用任何蛋白酶,只要它能作用于样品中包含的待测糖化蛋白即可,其实例包括源自于动物、植物和微生物的蛋白酶、金属蛋白酶、内切蛋白酶、外切蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和巯基蛋白?酶。?

    源自于动物的蛋白酶的实例包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、牛胰蛋白酶、源自于猪肝的亮氨酸氨肽酶、组织蛋白酶、需钙蛋白酶、I型蛋白酶、XX型蛋白酶(以上由Sigma制造)、氨肽酶M、羧肽酶A(以上由Boehringer?Mannheim制造)和胰液素(由Wako?Pure?Chemical?Industries?Ltd.和Sigma制造)。?

    源自于植物的蛋白酶的实例包括激肽释放酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶W(以上由Sigma制造)、木瓜蛋白酶W-40和菠萝蛋白酶F(以上由Amano?Enzyme?Inc.制造)。?

    源自于微生物的蛋白酶的实例包括下列(1至(14)。?

    (1)源自于芽孢杆菌的蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶、VIII型蛋白酶、IX型蛋白酶、X型蛋白酶、XV型蛋白酶、XXIV型蛋白酶、XXVII型蛋白酶、XXXI型蛋白酶、VII型蛋白酶、源自于地衣芽胞杆菌(Bacillus?licheniformis)的蛋白酶(以上由Sigma制造)、嗜热菌蛋白酶(由和光纯药工业社制造)、Orientase-90N、Orientase-10NL、Orientase-22BF、Orientase?Y、Orientase-5BL、Nucleisin(以上由HBI?Enzymes?Inc.制造)、Proleather?FG-F、蛋白酶NL“Amano”、蛋白酶S“Amano”G、蛋白酶N“Amano”G(以上由Amano?Enzyme?Inc.制造)、GODO-BNP、GODO-BAP、GODO高纯度蛋白酶(以上由合同酒精社制造)、Protin-AC10F、Protin-NL10、Protin-NC25、Protin-NY10、Protin-PC10F、Protin-PS10、Deskin、Depirays、Biosoke、Thermoase-PC10F、嗜热菌蛋白酶(以上由大和化成社制造)、Toyozyme?NEP、中性蛋白酶(以上由东洋纺织社制造)、Neutrase、Esperase、Savinase、Dyrazym、Bio-Feed?Pro、Alcalase、NUE、Pyrase、Clear?Lens-Pro、Evelase、Novozyme-FM、volan(以上由Novo?Nordisk?Bioindustry制造)、Enzylon-NBS、Enzylon-SA(以上由洛东化成工业社制造)、Nagarse、Biopullase??APL-30、Biopullase?SP-4FG、Biopullase?XL-416F、Biopullase?AL-15FG、果胶酶XP-534(以上由Nagase?ChemteX?Corp.制造)、Aroase?AP-10、蛋白酶YB(以上由Yakult药品工业社制造)、Colorase-N、Colorase-7089、Belon?W(以上由樋口商会社制造)、Chirazyme?P-1、分散酶(以上由Roche制造)、Satilysin(以上由Boehringer?Mannheim制造)、蛋白酶N、蛋白酶细菌枯草杆菌蛋白酶(以上由Fluka制造)、链霉蛋白酶E(由科研制药社制造)等。?

    (2)源自于曲霉的蛋白酶:XIII型、XIX型、XXIII型蛋白酶(以上由Sigma制造)、Sumizyme-MP、Sumizyme-AP、Sumizyme-LP?L、Sumizyme-LP20、Sumizyme-FP、Enzyme?P-3(以上由新日本化学工业株式会社制造)、Orientase-20A、Orientase-ONS、Orientase-ON5、Tetrase?S(以上由HBI?Enzymes?Inc.制造)、Umamizyme?G、Neurase?A、Neurase?F3G、蛋白酶-A“Amano”G、蛋白酶K“Amano”、蛋白酶M“Amano”G、蛋白酶P“Amano”3G(以上由天野酶制品工业会社制造)、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、Morsin、AO蛋白酶、肽酶(以上由Kikkoman制造)、Protin-F、Protin-FN、Protin-FA(以上由大和化成社制造)、Denapsin?2P、Denazyme-SA-7、Denazyme-AP、Denazyme?AP(以上由Nagase?ChemteX?Corp.制造)、蛋白酶YP-SS、Pantidase-NP-2、Pantidase-P(以上由Yakult药品工业社制造)、Sakanase(由科研制药社制造)、Flavorzyme(由Novo?Nordisk?Bioindustry制造)、Belon?PS(由樋口商会社制造)、蛋白酶6(由Fluka制造)、蛋白酶A5(由协和化成社制造)等。?

    (3)源自于根霉(Rhizopus)的蛋白酶:XVIII型蛋白酶(由Sigma制造)、肽酶R、Neurase?F(以上由天野酶制品工业会社制造)、XP-415(由Nagase?ChemteX?Corp.制造)等。?

    (4)源自于青霉(Penicillium)的蛋白酶:PD酶(由Kikkoman?Corp.制造)、蛋白酶B“Amano”(由天野酶制品工业会社制造)、Deoxin?l(由Nagase?ChemteX?Corp.制造)等。?

    (5)源自于链霉菌的蛋白酶:XIV型蛋白酶(也称为链霉蛋白酶)、XXI型蛋白酶(以上由Sigma制造)、Actinase-AS、Actinase-AF、Actinase-E(以上由科研制药社制造)、嗜碱性蛋白酶(由东洋纺织社制造)、链霉蛋白酶E(由Roche、Calbiochem-Novabiochem和Sigma制造)、链霉蛋白酶(由Boehringer?Mannheim制造)等。?

    (6)源自于葡萄球菌(Staphylococcus)的蛋白酶:XVII型蛋白酶(由Sigma制造)、内切蛋白酶Glu-C(由Boehringer?Mannheim制造)、V8蛋白酶(由TAKARA和和光纯药社制造)等。?

    (7)源自于梭菌(Clostridium)的蛋白酶:梭菌蛋白酶、非特异性中性蛋白酶、1A型胶原酶(以上由Sigma制造)等。?

    (8)源自于溶杆菌(Lysobacter)的蛋白酶:内切蛋白酶Lys-C(由Sigma制造)等。?

    (9)源自于奇果菌(Grifola)的蛋白酶:金属内肽酶(由Sigma制造)。?

    (10)源自于酵母菌的蛋白酶:蛋白酶A(由Sigma制造)、羧肽酶Y(由Boehringer?Mannheim制造)等。?

    (11)源自于麦轴梗霉(Tritirachium)的蛋白酶:蛋白酶K(由Sigma、Roche和和光纯药社制造)等。?

    (12)源自于栖热菌(Thermus)的蛋白酶:氨肽酶T(由Boehringer?Mannheim制造)等。?

    (13)源自于假单胞菌的蛋白酶:内切蛋白酶Asp-N(由和光纯药工业社制造)等。?

    (14)源自于无色菌(Achromobacter)的蛋白酶:赖氨酰内肽酶、无色肽酶(以上由和光纯药社制造)、AP-1(由TAKARA制造)等。?

    在本发明的测量方法中,源自于芽孢杆菌、曲霉、链霉菌和麦轴梗霉的蛋白酶是优选的,因为它们对人类血红蛋白的效应大,并且源自于芽孢杆菌的蛋白酶是特别优选的。?

    金属蛋白酶的实例包括嗜热菌蛋白酶和蛋白酶N。内切蛋白酶的实例包括嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。外切蛋白酶的实例包括氨肽酶和羧肽酶。丝氨酸蛋白酶的实例包括耐热蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、纤溶酶和弹性蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的实例包括木瓜蛋白酶和胱天蛋白酶。酸性蛋白酶的实例包括胃蛋白酶和组织蛋白酶D。碱性蛋白酶的实例包括Orientase?22BF。巯基蛋白酶的实例包括木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶。?

    反应溶液中的蛋白酶浓度优选为0.01U/mL至100,000U/mL,更优选为0.1U/mL至10,000U/mL。此外,在本发明中可以组合使用两种以上类型的酶。?

    在本发明中使用的蛋白酶优选是无色的,例如蛋白酶的1,000U/mL水性溶液在300nm至800nm波长处的吸光度优选为100mAbs以下、更优选为0至10mAbs。作为蛋白酶,优选的是通过各种类型的层析、盐析、透析、活性炭处理等纯化、并且其上述吸光度被降低的蛋白酶。?

    在本发明的测量方法中,反应溶液中酶、即本发明蛋白的浓度优?选为0.01U/mL至1,000U/mL,更优选为0.1U/mL至100U/mL。?

    测量方法

    本发明的样品中的待测糖化蛋白可以通过连续执行下列步骤(i)到(iii)来测量:?

    (i)通过将样品与蛋白酶进行反应来产生糖化肽;?

    (ii)将形成的糖化肽与本发明的蛋白进行反应;以及?

    (iii)测量步骤(ii)中形成或消耗的物质。?

    上面提到的步骤(i)到(iii)可以在水性介质中进行。水性介质的实例包括去离子水、蒸馏水和缓冲溶液;并且缓冲溶液是优选的。在缓冲溶液中使用的缓冲剂的实例包括三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂(Tris缓冲剂)、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂和Good’s缓冲剂。?

    Good’s缓冲剂的实例包括2-吗啉乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟基甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟基甲基)甲基]-甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)和N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。?

    对缓冲剂的浓度没有具体限制,只要它适合于测量即可,但是浓?度优选为0.001mol/L至2.0mol/L、更优选为0.005mol/L至1.0mol/L。?

    对于每个步骤中的反应来说,反应温度是例如10℃至50℃、优选为20℃至40℃,并且反应时间是1秒至60分钟,优选为1至10分钟。?

    如果蛋白酶不影响步骤(ii)的反应,它不必在执行步骤(i)的反应后特意失活;但是,可以进行加热、冷却、离心、膜过滤、添加抑制剂等,以使酶在步骤(ii)中不起作用。?

    在步骤(ii)中,由于糖化肽与本发明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白之间的反应而在反应溶液中形成的产物包括过氧化氢、邻酮醛糖(α-酮基醛)和肽。此外,在步骤(ii)中,被糖化肽与本发明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白之间的反应所消耗的物质是例如氧分子。在步骤(ii)中消耗的氧分子通过例如使用氧电极的电化学测量方法来测量。?

    在本发明的步骤(ii)中产生的过氧化氢可以使用例如光学技术或电化学技术来测量。光学技术的实例包括吸光度法和发光法。具体实例包括使用测量过氧化氢的试剂的光学测定和使用过氧化氢电极的电化学测定。?

    用于测量过氧化氢的试剂是用于将所产生的过氧化氢转变成可检测物质的试剂??杉觳馕镏实氖道ㄉ睾凸?;并且色素是优选的。?

    当可检测物质是色素时,用于测量过氧化氢的试剂包括过氧化活性物质例如过氧化物酶和氧化发色型色原体。氧化发色型色原体的实例包括氧化偶联型色原体和无色型色原体,其在后面描述。?

    当可检测物质是光时,用于测量过氧化氢的试剂包括化学发光物质。生物发光物质包括在化学发光物质中,其实例包括鲁米诺、异鲁?米诺、光泽精、吖啶酯和草酸酯。?

    当使用含有过氧化活性物质例如过氧化物酶和氧化发色型色原体的试剂作为测量过氧化氢的试剂时,可以通过将过氧化氢与氧化发色型色原体在过氧化活性物质存在下进行反应以形成色素,然后测量形成的色素,来测量过氧化氢。此外,当使用含有化学发光物质的试剂测量过氧化氢时,可以通过将过氧化氢与化学发光物质进行反应以形成光子,然后测量形成的光子,来测量过氧化氢。?

    氧化偶联型色原体是在过氧化活性物质例如过氧化物酶存在下与过氧化氢反应、通过氧化偶联反应产生色素的色原体。氧化偶联型色原体的具体实例包括偶联剂例如4-氨基安替比林和酚类或苯胺类氢供体。偶联剂和酚类或苯胺类氢供体化合物在过氧化氢和过氧化活性物质存在下经历氧化偶联,以产生色素。?

    偶联剂的实例包括4-氨基安替比林(4-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。?

    酚类氢供体的实例包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚和3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)。?

    苯胺类氢供体的实例包括N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙?基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙?;叶?、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)、N-[2-(琥珀酰氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(MASE)和N-乙基-N-[2-(琥珀酰氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(Et-MASE)。?

    无色型色原体是在过氧化活性物质例如过氧化物酶存在下通过与过氧化氢反应自身产生色素的色原体。具体实例包括10-N-羧甲基氨甲?;?3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲?;?3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)N,N,N’,N’,N”,N”-六-3-磺丙基-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)、二氨基联苯胺、羟基苯基丙酸、四甲基联苯胺和邻苯二胺。?

    在过氧化氢的测量中,对于过氧化活性物质的浓度没有具体限制,只要它适合于测量即可;并且,当过氧化物酶用作过氧化活性物质时,浓度优选为1U/mL至100U/mL,更优选为2U/mL至50U/mL。对于氧化发色型色原体的浓度没有具体限制,只要它适合于测量即可;并且它优选为0.01g/L至10g/L,更优选为0.02g/L至5g/L。?

    当使用过氧化氢电极测量过氧化氢时,对于所使用的电极没有具体限制,只要它是允许使用过氧化氢传递电子的材料即可,其实例包括铂、金和银。作为测量方法,可以使用已知方法例如电流测定法、电势测定法和电量测定法。通过在电极与氧化酶或底物之间的反应中介入电子传递物质,也可以测量得到的氧化或还原电流或其电量。?

    任何具有传递电子功能的物质都可以用作电子传递物质,其实例包括物质例如二茂铁衍生物和醌衍生物。此外,通过在电极与氧化酶?反应所产生的过氧化氢之间介入电子传递物质,可以测量得到的氧化或还原电流或其电量。?

    在步骤(ii)中,邻酮醛糖(α-酮基醛)与过氧化氢一起产生;因此,也可以通过测量产生的邻酮醛糖(α-酮基醛)来测量样品中的血红蛋白A1c。通过使葡萄糖氧化酶作用于α-酮基醛,并通过也测量产生的过氧化氢,可以获得高灵敏性测量(特开2000-333696)。?

    制备样品的方法

    在需要时,可以从生物样品分离待测量的含有糖化蛋白的样品。分离方法包括离心、过滤和使用血细胞分离膜的方法。例如,通过离心进行的分离方法可以将全血分离成血细胞和血浆或血清。在需要时,可以用等渗溶液例如生理盐水溶液洗涤血细胞,以获得已从其中除去源自血浆的组分的洗过的血细胞。?

    当使用血细胞作为样品时,可以通过用低渗溶液稀释含有血细胞的样品例如全血、血细胞或洗过的血细胞,来进行溶血??梢允褂萌魏蔚蜕芤?,只要它能引起血细胞溶血即可;其实例包括水和缓冲液,并且低渗溶液优选含有添加剂例如表面活性剂。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性表面活性剂。?

    用于制备洗过的血细胞的方法包括下述方法。?

    从健康人和糖尿病患者收集血液,通过倒转进行混合,然后在25℃离心(3,000rpm)5分钟。在离心后,除去上清血浆。对于一份下层部分的血细胞层,加入四份生理盐水溶液,通过倒转将其混合,并在25℃离心(3,000rpm)5分钟。离心后,除去上清生理盐水溶液。在重复该清洗操作三次后,向一份洗过的血细胞层加入九份蒸馏水,这将产生洗过的血细胞。?

    用于测量糖化蛋白的试剂和试剂盒

    本发明的用于测量糖化蛋白的试剂和用于测量糖化蛋白的试剂盒,可用于本发明的测量糖化蛋白的方法中。本发明的用于测量糖化蛋白的试剂可以采取试剂盒的形式作为适合于储存、运输和配送的形式。试剂盒形式的实例包括双试剂系统和三试剂系统。?

    本发明的用于测量糖化蛋白的试剂包括蛋白酶以及本发明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。此外,本发明的用于测量糖化蛋白的试剂可以包括用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的实例包括过氧化氢、邻酮醛糖(α-酮基醛)和肽。用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂的实例,包括用于测量过氧化氢的试剂、用于测量邻酮醛糖(α-酮基醛)的试剂和用于测量肽(Val-His)的试剂;并且用于测量过氧化氢的试剂是优选的。?

    本发明的用于测量待测糖化蛋白的试剂盒的实例,包括下述实施方案的试剂盒:?

    -试剂盒1(双试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列两种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂;以及?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂。?

    -试剂盒2(双试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列两种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂;以及?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂,以及用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。?

    -试剂盒3(双试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列两种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;以及?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂。?

    -试剂盒4(双试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列两种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;以及?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂,以及用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。?

    -试剂盒5(三试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列三种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂;?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂;以及?

    (3)用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。?

    -试剂盒6(三试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列三种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂;以及?

    (3)用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。?

    -试剂盒7(三试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列三种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂;?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;以及?

    (3)用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂。?

    -试剂盒8(三试剂系统试剂盒)?

    试剂盒包含下列三种试剂:?

    (1)包含蛋白酶的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;?

    (2)包含本发明的蛋白的试剂和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂;以及?

    (3)包含用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂的试剂。?

    在本发明的用于测量的试剂和试剂盒中使用的每种蛋白酶、本发明的蛋白、糖化蛋白、和用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂的实例,包括上面所提到的。?

    当用于测量由本发明的蛋白与从糖化蛋白产生的糖化肽之间的反应所形成的产物的试剂是用于测量过氧化氢的试剂时,用于测量过氧化氢的试剂的实例包括上面提到的用于测量过氧化氢的试剂。当使用氧化偶联类型色原体作为测量过氧化氢的试剂时,偶联剂和酚类或苯胺类氢供体可以包含在同一试剂中;并且它们优选包含在分开的试剂中。?

    本发明的用于测量的试剂和用于测量的试剂盒还可以包含用于测量的标准品例如标准蛋白。?

    当需要时,本发明的用于测量的试剂和用于测量的试剂盒可以包?含缓冲剂、稳定剂、防腐剂、影响物质除去剂、非特异性反应抑制剂、表面活性剂等?;撼寮恋氖道ㄉ厦嫣岬降幕撼寮?。稳定剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、氨基酸、白蛋白、葡聚糖和盐类例如乙酸钙。防腐剂的实例包括叠氮化钠和抗生素。用于影响物质除去剂的实例包括用于消除抗坏血酸影响的抗坏血酸氧化酶。非特异性反应抑制剂的实例包括聚合化合物例如硫酸葡聚糖。表面活性剂的实例包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性离子表面活性剂。?

    本发明的用于测量的试剂和试剂盒可以是冷冻干燥状态或溶解在反应溶液中的状态。当使用冷冻干燥状态的试剂盒时,试剂盒可以在溶解于上面提到的水性介质或反应溶液中以后使用。当使用冷冻干燥状态的试剂盒时,如果需要,用于溶解冷冻干燥试剂等的试剂可以包含在试剂盒中。?

    本发明的用于测量的试剂盒中蛋白酶的含量,优选为在溶解于水性介质中的状态下提供0.01U/mL至1,000,000U/mL的浓度、更优选为0.1U/mL至100,000U/mL的浓度的含量。?

    本发明的用于测量的试剂盒中本发明蛋白的含量,优选为在溶解于水性介质中的状态下提供0.01U/mL至10,000U/mL的浓度、更优选为0.1U/mL至1,000U/mL的浓度的含量。?

    试剂盒中的过氧化物酶和氧化偶联型色原体的含量,当使用含有过氧化物酶和氧化偶联型色原体的试剂作为测量过氧化氢的试剂时,优选其含量将在溶解于水性介质中的状态下分别提供1U/mL至600U/mL和0.5g/L至40g/L的浓度、更优选分别为2U/mL至150U/mL和1g/L至20g/L的浓度。?

    本文中引用的所有现有技术参考文献在本说明书中引为参考。?

    实施例

    在下文中显示了实施例,但本发明不应被解释为受限于此。?

    [实施例1]用于果糖基肽氧化酶基因的表达系统的构建?

    选择构巢裸胞壳(Emericella?nidulans)KY125菌株作为生产对α-FVH具有相对高活性并对ε-FK具有低活性的酶的真菌。?

    接下来,使用参考构巢曲霉(Aspergillus?nidulans)FGSC?A4菌株的DNA序列(Nature,438,1105(2005))制备的引物(SEQ?ID?NO:5和6),通过PCR方法扩增了全长果糖基肽氧化酶基因,所述构巢曲霉是与构巢裸胞壳有亲缘关系的真菌,其全基因组序列已被解码。当使用DNA测序仪对该DNA序列进行解码时,KY125菌株的果糖基肽氧化酶基因在6个外显子之间含有5个内含子。通过交叠PCR方法扩增了单独的外显子部分(Nucleic?Acids?Res.,16,7351(1988)),并将它们相连,构建了只由外显子构成的成熟形式的果糖基肽氧化酶基因。通过对该DNA序列进行解码,发现成熟形式的果糖基肽氧化酶基因由1317bp和438个氨基酸构成。?

    为了构建用于表达构巢裸胞壳KY125菌株的果糖基肽氧化酶基因的系统,将上面获得的果糖基肽氧化酶基因插入到pTrc99A表达载体(4,176-bp,由GE?Japan制造)的NcoI和BamHI限制性酶位点中。使用该重组DNA(质粒)(pTrcFPOX-1)转化大肠杆菌XL1-Blue(由Funakoshi?Corp.制造)。通过将该转化体在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜,在这些细菌中获得了具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。?

    [实施例2]果糖基氧化物肽酶的构建?

    在实施例1中获得的果糖基肽氧化酶基因中导入随机突变。随机突变的导入使用来自Stratagene的GeneMorph?II随机诱变试剂盒进行。?使用pTrcFPOX-1作为模板DNA和与相应于果糖基肽氧化酶基因的5’-侧上游部分和3’-侧下游部分的区域对应的引物(SEQ?ID?NO:5和6),通过PCR方法同时进行核苷酸取代的导入和全长扩增。?

    使用NcoI和BamHI切开PCR产物,然后使用PureLink?PCR纯化试剂盒(Invitrogen?Corp.)将其纯化,并连接到pTrc99A的NcoI和BamHI位点中,然后将其用于转化大肠杆菌XL1-Blue菌株。?

    挑取当在含有含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基的平板上培养过夜时生长的菌落(转化体)。使用含有含50mg/L氨苄青霉素的2mL?LB培养基的24孔培养板(由住友酚醛塑料株式会社制造),将它们在30℃培养18小时。向培养基添加BugBuster(由Novagen制造),并且在细菌细胞裂解和离心后,使用该上清溶液作为酶源,测量对两种类型的底物(ε-FK和α-FVH)的酶活性。?

    同时,从每个转化体制备质粒,并使用DNA测序仪解码果糖基肽氧化酶基因部分的核苷酸序列。然后,将酶活性、耐热性和底物特异性的变化与核苷酸序列(氨基酸序列)的变化相关联。?

    在这种情况下,作为α-FVH活性或耐热性增加的果糖基肽氧化酶,获得了在实施例1所获得的果糖基肽氧化酶中,71位Ser被Tyr取代、109位Lys被Arg取代、94位Ile被Met取代、269位Phe被Ile取代、104位Glu被Lys取代的果糖基肽氧化酶(在后文中称为FPOX-9)。FPOX-9的氨基酸序列显示在SEQ?ID?NO:1中,编码该氨基酸序列的核苷酸序列显示在SEQ?ID?NO:2中。?

    接下来,获得了通过FPOX-9中59位的Ser被Gly取代所产生的FPOX-10,FPOX-10中58位的Met和105位的Gly分别被Phe和Lys取代所产生的FPOX-11,FPOX-11中183位的Gly被Glu取代所产生的FPOX-13,以及FPOX-13中302位的Pro被Leu取代所产生的?FPOX-14。此外,获得了通过FPOX-14中272位的Asn被Asp取代所产生的FPOX-15。FPOX-15的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列分别显示在SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4中。?

    作为从这些操作积累的取代,如表1中所示,针对α-FVH的活性连续增加。FPOX-15的α-FVH活性增加到FPOX-9的约4倍。相反,FPOX-15对ε-FK的活性降低到FPOX-9的约70%。因此,FPOX-15的α-FVH/ε-FK比率变为约7.3,该值与FPOX-9的值相比增加了约5.6倍。此外,即使在50℃热处理15分钟,FPOX-15仍保留约80%的酶活性,因此热稳定性也极大增加。?

    表1?

    上面的表1显示了各种突变的果糖基肽氧化酶的底物选择性和耐热性。在上面的表1中,α-FVH活性和ε-FK活性表示当FPOX-9的ε-FK活性被取为1.00时的相对值,添加的突变数量表示对FPOX-9作出的取代数量。?

    [实施例3]获得突变型果糖基肽氧化酶?

    将携带有实施例2中获得的FPOX-9的大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到10支装有10mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基的试管中,将它们在30℃振摇培养24小时。将每种培养溶液转移到含有300mL?LB培养基的10个Erlenmeyer培养瓶中,培养基中含有50mg/L氨苄青霉素和20mg/L?IPTG,在30℃振摇培养24小时。?

    收集约3,000mL培养溶液,通过以10,000xg离心15分钟收集细菌细胞。将细菌细胞悬浮在约50mL?10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH?7.0)中,并使用超声匀浆器在冰上冷却下将细菌细胞破碎1分钟。在同样条件下再重复破碎9次。将该细菌细胞裂解液以10,000xg离心15分钟,并将获得的上清液用作粗酶提取液。?

    向粗酶提取液加入固体硫酸铵至获得60%饱和度,将混合物在冰上冷却的同时保持搅拌2小时以充分沉淀目标酶蛋白。然后,通过以10,000xg离心15分钟收集沉淀。将沉淀溶解在约20mL?10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH?7.0)中,并将该溶液在冷处对5,000mL同样的缓冲液透析过夜。?

    将透析后的酶溶液上样到装填有DEAE-Toyopearl(东洋纺织社制造)、事先用10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH?7.0)平衡过的10x100cm柱上,并用同样的缓冲液进一步冲洗。目标酶通过柱而不被吸附。另一方面,大多数污染蛋白吸附在柱上。结果如表2中所示,目标酶被纯化约50倍,收率为31%。同样,对实施例2中获得的携带有FPOX-15的大肠杆菌XL1-Blue菌株进行了一系列纯化步骤,获得了纯化的FPOX-15的溶液。?

    表2?

    上面的表2显示了果糖基肽氧化酶FPOX-9纯化的每个步骤中FPOX-9的状态。?

    [实施例4]果糖基肽氧化酶FPOX-9的Km值?

    使用下面的试剂1到试剂3,测量了实施例2中获得的新的FPOX-9对糖化肽和/或糖化氨基酸的底物特异性。?

    试剂1

    Tris缓冲液(pH7.5)????????100mmol/L?

    试剂2

    在这里,使用的FPOX-9溶液是在实施例3中制备的。?

    试剂3

    Tris缓冲液(pH7.5)????????100mmol/L?

    α-FVH、α-FV或ε-FK?????X?mmol/L?

    (当使用α-FVH或α-FV时,X=0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10)?

    (当使用ε-FK时,X=0、1、2、5、10、20、40、50、80、100)?

    作为底物,使用糖化肽α-FVH以及糖化氨基酸ε-FK和α-FV。?

    α-FVH溶液和α-FV溶液使用Tris缓冲液制备,以获得在试剂3中的下列每种浓度:0、0.05、0.1、0.5、1、2、5和10mmol/L。ε-FK溶液使用Tris缓冲液制备,以获得在试剂3中的下列每种浓度:0、1、2、5、10、20、40、50、80和100mmol/L。?

    向10μL试剂1添加170μL试剂2,并且在37℃反应5分钟后,加入20μL试剂3,并将反应在37℃继续进行5分钟,总共为10分钟。将0mmol/L下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/800nm(副波长)处的吸光度定义为A0’(Abs),每种底物浓度下反应开始5.4分钟后?在546nm(主波长)/800nm(副波长)处的吸光度定义为A0x(Abs),则ΔA0按照方程(I)计算。?

    (数学表达式1)?

    ΔA0=A0x-A0’(Abs)??(I)?

    将0mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/800nm(副波长)处的吸光度定义为As’(Abs),每种底物浓度下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/800nm(副波长)处的吸光度定义为Asx(Abs),则ΔAs按照方程(II)计算。?

    (数学表达式2)?

    ΔAs=Asx-As’(Abs)??(II)?

    通过将获得的ΔA0和ΔAs、反应溶液的总量(0.2mL)、TOOS的摩尔消光系数(39,200)、反应时间(1.2分钟)和反应比色杯的光路长度(0.5cm)带入方程(III),计算了每种底物浓度下的酶活性(U/mL)。?

    (数学表达式3)?

    酶活性(U/mL)={(ΔAs-ΔA0)x反应溶液的总量(mL)}/{摩尔消光系数ε/1000x酶溶液的量(mL)x0.5x反应时间(min)x光路长度(cm)}????(III)?

    对于每种底物α-FVH、ε-FK和α-FV,在水平轴上使用底物浓度(mmol/L),在垂直轴上使用相应的酶活性(U/mL),产生了图,并将对应于最大酶活性的1/2的底物浓度计算为Km值(米氏常数)。结果显示在表3中。?

    表3?

    上面的表3显示了果糖基肽氧化酶FPOX-9对每种类型底物的Km值。表3清楚地显示,本发明的果糖基肽氧化酶是对α-FVH和α-FV具有高底物特异性并难以与ε-FK反应的酶。?

    [实施例5]果糖基肽氧化酶FPOX-9上的突变和突变体的底物特异性?

    通过使用“GeneMorph?II随机诱变试剂盒”的PCR方法,使用pTrcFPOX-9作为模板DNA和与相应于果糖基肽氧化酶基因的5’-侧上游区和3’-侧下游区的区域对应的引物(SEQ?ID?NO:5和6),同时进行核苷酸取代的导入和全长扩增。?

    使用NcoI和BamHI切开PCR产物,然后使用PureLink?PCR纯化试剂盒(Invitrogen?Corp.)将其纯化,并连接到pTrc99A的NcoI和BamHI位点中,然后将其用于转化大肠杆菌XL1-Blue菌株。?

    挑取在含有含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基的平板上培养过夜时生长的菌落(转化体)。使用含有含50mg/L氨苄青霉素的2mL?LB培养基的24孔培养板(由住友酚醛塑料株式会社制造),将它们在30℃培养18小时。向培养基添加BugBuster(由Novagen制造),并且在细菌细胞裂解和离心后,使用该上清溶液作为酶源,测量对两种类型的底物(ε-FK和α-FVH)的酶活性。?

    同时,从每个转化体制备质粒,并使用DNA测序仪解码果糖基肽氧化酶基因部分的核苷酸序列。然后,将底物特异性的变化与核苷酸序列(氨基酸序列)的变化相关联。结果显示在表4中。?

    表4?

    在上面显示的表中,α-FVH活性和ε-FK活性表示当FPOX-9的ε-FK活性被取为1.00时的相对值。表4显示了即使当氨基酸突变被引入FPOX-9时,突变体的α-FVH活性与ε-FK活性的活性比(FVH/FK)与FPOX-9相比不变或增加。?

    [实施例6]果糖基肽氧化酶FPOX-15的Km值?

    使用下面的试剂1到试剂3,测量了实施例2中获得的FPOX-15对糖化肽和/或糖化氨基酸的底物特异性。?

    试剂1

    磷酸二氢钠(pH8.0)????????100mmol/L?

    果糖基肽氧化酶FPOX-15????2μL?

    在这里,对于FPOX-15溶液来说,使用了将实施例3中获得的溶液稀释4倍后所产生的溶液。?

    试剂2

    磷酸二氢钠(pH6.0、pH7.0或pH8.0)??100mmol/L?

    过氧化物酶(源自辣根)?????3U/mL?

    4-氨基安替比林???????????0.5mmol/L?

    EMSE?????????????????????0.4mmol/L?

    试剂3

    α-FVH、α-FV或ε-FK????X?mmol/L?

    (当使用α-FVH或α-FV时,X=0、2、2.5、3、3.66)?

    (当使用ε-FK时,X=0、20、30、40、50)?

    作为底物,使用糖化肽α-FVH以及糖化氨基酸ε-FK和α-FV。?

    α-FVH溶液和α-FV溶液使用蒸馏水制备,以获得在试剂3中的下列浓度:0、2、2.5、3和3.66mmol/L。ε-FK溶液使用蒸馏水制备,以获得在试剂3中的下列浓度:0、20、30、40和50mmol/L。?

    向5μL试剂1添加150μL试剂2,并且在37℃反应5分钟后,加入20μL试剂3,并将反应在37℃继续进行5分钟,总共为10分钟。将0mmol/L下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0’(Abs),每种底物浓度下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0x(Abs),则ΔA0按照方程(I)计算。?

    (数学表达式1)?

    ΔA0=A0x-A0’(Abs)??(I)?

    将0mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为As’(Abs),每种底物浓度下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为Asx(Abs),则ΔAs按照方程(II)计算。?

    (数学表达式2)?

    ΔAs=Asx-As’(Abs)??(II)?

    通过将获得的ΔA0和ΔAs、反应溶液的总量(0.2mL)、EMSE的摩尔消光系数(33,800)、反应时间(1.2分钟)和反应比色杯的光?路长度(0.5cm)带入方程(III),计算出每种底物浓度下的酶活性(U/mL)。?

    (数学表达式3)?

    酶活性(U/mL)={(ΔAs-ΔA0)x反应溶液的总量(mL)}/{摩尔消光系数ε/1000x酶溶液的量(mL)x0.5x反应时间(min)x光路长度(cm)}????(III)?

    对于每种底物α-FVH、ε-FK和α-FV,在水平轴上使用底物浓度(mmol/L),在垂直轴上使用相应的酶活性(U/mL),产生了图,并将对应于最大酶活性的1/2的底物浓度计算为Km值(米氏常数)。结果显示在表5中。?

    表5?

    上面的表5显示了果糖基肽氧化酶FPOX-15对每种类型底物的Km值。表5清楚地显示,本发明的果糖基肽氧化酶是对α-FVH和α-FV具有高底物特异性和对ε-FK具有低底物特异性的酶。?

    [实施例7]果糖基肽氧化酶(FPOX-9和FPOX-15)的等电点pI

    将FPOX-9和FPOX-15的各1mg/mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶液(3μL)施加到Phast系统(全自动电泳系统,GE?Healthcare)的等电聚焦凝胶上,并按照操作步骤进行电泳、染色和脱色操作,以确定?每种果糖基肽氧化酶的pI。结果显示在表6中。?

    表6?

    如表6中所示,发现果糖基肽氧化酶FPOX-9和FPOX-15的pI值略微在碱性一侧。?

    [实施例8]pH对果糖基肽氧化酶FPOX-9和FPOX-15的稳定性的影响?

    使用下列试剂1到试剂3,评估了pH对果糖基肽氧化酶FPOX-9和FPOX-15的稳定性的影响。为了进行评估,将制备后即刻的试剂、制备后在30℃储存24小时(一天)的试剂和制备后在30℃储存5天的试剂,各用作试剂1。?

    试剂1

    Bis-Tris(pH?5.0、pH?6.0、pH?7.0或pH?8.0)??100mmol/L?

    果糖基肽氧化酶FPOX-9或FPOX-15????2μL?

    在这里,作为FPOX-9溶液,使用对实施例3中获得的溶液稀释20倍所产生的溶液,作为FPOX-15溶液,使用对实施例3中获得的溶液稀释20倍所产生的溶液。?

    试剂2

    磷酸二氢钠(pH6.0、pH7.0或pH8.0)??100mmol/L?

    过氧化物酶(源自辣根)?????3U/mL?

    4-氨基安替比林????????????0.5mmol/L?

    EMSE??????????????????????0.4mmol/L?

    试剂3

    α-FG(果糖基甘氨酸)???????0或15mmol/L?

    使用糖化氨基酸α-FG作为底物。?

    向5μL试剂1添加150μL试剂2,并且在37℃反应5分钟后,加入20μL试剂3,并将反应在37℃继续进行5分钟,总共为10分钟。将0mmol/L下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0’(Abs),15mmol/L底物下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0x(Abs),则ΔA0按照方程(I)计算。?

    (数学表达式1)?

    ΔA0=A0x-A0’(Abs)??(I)?

    将0mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为As’(Abs),15mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为Asx(Abs),则ΔAs按照方程(II)计算。?

    (数学表达式2)?

    ΔAs=Asx-As’(Abs)??(II)?

    通过将获得的ΔA0和ΔAs、反应溶液的总量(0.2mL)、EMSE的摩尔消光系数(33,800)、反应时间(1.2分钟)和反应比色杯的光路长度(0.5cm)带入方程(III),计算了15mmol/L底物下的酶活性(U/mL)。?

    (数学表达式3)?

    酶活性(U/mL)={(ΔAs-ΔA0)x反应溶液的总量(mL)}/{摩尔?消光系数ε/1000x酶溶液的量(mL)x0.5x反应时间(min)x光路长度(cm)}????(III)?

    分别对制备后即刻的试剂、在30℃储存24小时(一天)的试剂和在30℃储存5天的试剂执行了该系列操作,并且根据制备后即刻的试剂中的酶活性E0天、在30℃储存24小时的试剂中的酶活性E1天和在30℃储存5天的试剂中的酶活性E5天,按照方程(IV)计算了在30℃储存24小时(一天)的试剂和在30℃储存5天的试剂相对于制备后即刻的试剂的酶活性残存率(%)E’。结果显示在表7和表8中。?

    (数学表达式4)?

    酶活性残存率E’(%)=(E1天或E5天)/E0天x100(IV)?

    表7?

    表8?

    表7显示了pH对果糖基肽氧化酶FPOX-9的稳定性的影响,表8显示了pH对果糖基肽氧化酶FPOX-15的稳定性的影响。正如从表7和8清楚地看到的,发现本发明的果糖基肽氧化酶FAOX-9和FPOX-15在任何下述pH下稳定:pH?5.0、pH?6.0、pH?7.0和pH?8.0。?

    [实施例9]金属对果糖基肽氧化酶FPOX-9和FPOX-15的稳定性的影响?

    使用下列试剂1到试剂3,评估了金属对果糖基肽氧化酶FPOX-9和FPOX-15的稳定性的影响。为了进行评估,将制备后即刻的试剂、制备后在5℃储存24小时(一天)的试剂和制备后在30℃储存24小时(一天)的试剂,各用作试剂1。?

    试剂1

    Bis-Tris(pH?7.0)???????????????100mmol/L?

    果糖基肽氧化酶FPOX-9或FPOX-15??2μL?

    金属离子???????????????????????X?mmol/L?

    (当金属离子是Na+、K+或Li+时,X=100;当金属离子是Mg2+或Ca2+时,X=10;并且当金属离子是Cr3+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Cd2+、Pb2+、Ba2+、Al3+或Sr2+时,X=0.1)?

    在这里,作为FPOX-9溶液,使用对实施例3中获得的溶液稀释20倍后所产生的溶液,作为FPOX-15溶液,使用对实施例3中获得的溶液稀释100倍后所产生的溶液。?

    试剂2

    磷酸二氢钠(pH8.0)???????100mmol/L?

    过氧化物酶(源自辣根)????3U/mL?

    4-氨基安替比林??????????0.5mmol/L?

    EMSE????????????????????0.4mmol/L?

    试剂3

    α-FG(果糖基甘氨酸)????????0或15mmol/L?

    使用糖化氨基酸α-FG作为底物。?

    向5μL试剂1添加150μL试剂2,并且在37℃反应5分钟后,加入20μL试剂3,并将反应在37℃继续进行5分钟,总共为10分钟。将0mmol/L下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0’(Abs),15mmol/L底物下反应开始5.4分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为A0x(Abs),则ΔA0按照方程(I)计算。?

    (数学表达式1)?

    ΔA0=A0x-A0’(Abs)??(I)?

    将0mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为As’(Abs),15mmol/L下反应开始6.6分钟后在546nm(主波长)/700nm(副波长)处的吸光度定义为Asx(Abs),则ΔAs按照方程(II)计算。?

    (数学表达式2)?

    ΔAs=Asx-As’(Abs)??(II)?

    通过将获得的ΔA0和ΔAs、反应溶液的总量(0.2mL)、EMSE的摩尔消光系数(33,800)、反应时间(1.2分钟)和反应比色杯的光路长度(0.5cm)带入方程(III),计算了15mmol/L底物下的酶活性(U/mL)。?

    (数学表达式3)?

    酶活性(U/mL)={(ΔAs-ΔA0)x反应溶液的总量(mL)}/{摩尔消光系数ε/1000x酶溶液的量(mL)x0.5x反应时间(min)x光路长度(cm)}????(III)?

    分别对制备后即刻的试剂、在5℃储存24小时(一天)的试剂和?在30℃储存24小时(一天)的试剂执行了该系列操作,并且根据制备后即刻的试剂中的酶活性E’0天、在5℃或30℃储存24小时(一天)的试剂中的酶活性E’1天,按照方程(V)计算了在5℃或30℃储存24小时(一天)的试剂相对于制备后即刻的试剂的酶活性残存率(%)E”。结果显示在表9和表10中。?

    (数学表达式5)?

    酶活性残存率E”(%)=(E’1天/E’0天)x100????(V)?

    表9?

    表10?

    表9显示了金属对果糖基肽氧化酶FPOX-9的稳定性的影响,表10显示了金属对果糖基肽氧化酶FPOX-15的稳定性的影响。正如从表9和10中清楚地看到的,发现本发明的果糖基肽氧化酶FAOX-9和FPOX-15在与每种金属物质共存时是稳定的。?

    工业实用性

    本发明提供了可用于诊断生活方式疾病例如糖尿病的新蛋白、编码该蛋白的DNA、用于生产该蛋白的方法,以及使用该蛋白测量糖化?蛋白的方法和包含该蛋白的用于测量糖化蛋白的试剂。?

    序列表独立文本

    SEQ?ID?NO:5-描述了人工序列:合成的DNA?

    SEQ?ID?NO:6-描述了人工序列:合成的DNA。?









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