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    重庆时时彩四星软件: 激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法及检测器.pdf

    关 键 词:
    激光 镊子 微流控 肿瘤 微粒体 检测 检测器
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110078245.2

    申请日:

    2011.03.30

    公开号:

    CN102230934A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/574申请公布日:20111102|||专利申请权的转移IPC(主分类):G01N 33/574变更事项:申请人变更前权利人:杭州锐光生物技术有限公司变更后权利人:嘉兴文斌生物技术有限公司变更事项:地址变更前权利人:310023 浙江省杭州市滨江区江南大道3672-22变更后权利人:314000 浙江省嘉兴市南湖区凌公塘路3339号(嘉兴科技城)1号楼311室变更事项:申请人变更后权利人:浙江普康生物技术股份有限公司登记生效日:20121120|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/574变更事项:发明人变更前:茅涵斌 茅涵文 金锋变更后:茅涵斌 毛子安 忻亚娟 茅涵文 陈刚 贺义惠 金锋|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/574申请日:20110330|||公开
    IPC分类号: G01N33/574; G01N33/544 主分类号: G01N33/574
    申请人: 杭州锐光生物技术有限公司
    发明人: 茅涵斌; 茅涵文; 金锋
    地址: 310023 浙江省杭州市滨江区江南大道3672-22
    优先权:
    专利代理机构: 浙江永鼎律师事务所 33233 代理人: 王梨华;陈丽霞
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110078245.2

    授权公告号:

    ||||||||||||

    法律状态公告日:

    2014.04.23|||2012.12.19|||2012.12.19|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||专利申请权、专利权的转移|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及肿瘤微粒体的检测方法及检测设备,尤其涉及并公开了激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法及检测器。检测法,包括产生不同偏振态的激光镊子;用双光束双激光镊子聚焦并捕获微流控芯片管腔内结合肿瘤微粒体抗体颗粒物;将待测样品与结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合;用检测器检测结合肿瘤微粒体抗体颗粒物与待测样品混合前后物理参数的改变并根据此改变对待测样品进行定性及准确定量。检测器,包括激光器系统、纳米定位系统、摄像系统、光学部件、机械部件、数据采集和传输系统、自动控制和图像处理应用软件。本发明可以检测到单个肿瘤微粒体颗粒,具有高特异性、操作简单、检测时间短、灵敏度高、重复性好、血样可再检测等特点。

    权利要求书

    1.激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,其特征在于:包括下列步骤:步骤a:通过半导体泵浦固态激光发射器发射的400nm~1200nm的近红外激光束形成不同偏振态的激光镊子;???步骤b:用双光束双激光镊子聚焦并捕获微流控芯片管腔(6)内的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物;步骤c:将过滤后的待测样品注入微流控芯片管腔(6)内与被激光镊子捕获的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合;步骤d:用检测器检测微流控芯片管腔(6)中与待测样品混合而引起的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的物理参数的改变;步骤e:根据物理参数的改变对待测样品中的肿瘤微粒体进行定性及准确定量。2.根据权利要求1所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,其特征在于:所述的步骤b中的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物制备方法包括下列步骤:步骤f:用EZ-Link?NHS-PEG12-Biotin试剂盒对预先准备的肿瘤微粒体抗体进行生物素标记;步骤g:将经过步骤f标记的肿瘤微粒体抗体联接到有链霉亲和素聚合物颗粒上,形成结合肿瘤微粒体抗体颗粒物。3.根据权利要求1所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,其特征在于:所述的步骤b中的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的大小为80nm-20um。4.根据权利要求1所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,其特征在于:所述的步骤b中的微流控芯片的制备方法包括下列步骤:步骤i:利用绘图软件绘制微流控芯片掩膜版图,并使用分辨率为12000dpi的激光打印机打印,在透明胶片上制得光刻掩膜板;步骤j:将玻璃基片置分别置于丙酮、酒精中进行超声处理,然后置于浓H2SO4中煮沸,用去离子水冲洗干净,氮气吹干,热烘去除水汽;步骤k:在清洗完毕的玻璃基片表面甩涂光刻胶、软烘、曝光、显影,获得所需刻蚀掩膜层的图形,置于130摄氏度的烘箱中进硬烘;?步骤l:将硬烘后的玻璃基片置于摩尔比为HF?:?NH4F?:?H2O为3?:?6?:?9的腐蚀液中进行刻蚀;步骤m:将刻蚀后的玻璃基片打孔,并与另一表面甩涂紫外光学胶的玻璃基片贴合,形成封闭的微管道和腔体结构,置于强紫外光源下照射,完成固化键合。5.根据权利要求1所述的用激光镊子及微流控技术对肿瘤微粒体的检测法,其特征在于:所述的步骤d中结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的物理参数包括以下参数:颗粒物形状及大小、颗粒物密度、颗粒物折射率、颗粒物散射率、颗粒物介电常数、颗粒物阻尼系数。6.激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,其特征在于:它包括激光器系统(1)、纳米定位系统(2)、摄像系统(3)、光学部件(4)、机械部件、数据采集和传输系统、自动控制和图像处理应用软件。7.根据权利要求6所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,其特征在于:所述的激光器系统(1)为二极管泵浦固态激光发射器或光纤激光发射器。8.根据权利要求6所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,其特征在于:所述的摄像系统(3)为IXON电子倍增电荷耦合器或CCD摄像系统,纳米定位系统(2)为纳米级或微米级可操控反光镜。9.根据权利要求6所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,其特征在于:所述的光学部件(4)包括法拉第隔离器(41)、半波板(42、43)、透镜(44)、偏振分束器(45、46、47、48)、位置敏感光探测器(49、50)、微流控芯片管腔(6)。10.根据权利要求6所述的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,其特征在于:所述的机械部件包括快门、目镜控制台及样本自动控制台。

    说明书

    激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法及检测器

    技术领域

    ????本发明涉及对肿瘤微粒体的检测方法及检测设备,尤其涉及一种激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法及检测器。

    背景技术

    近几十年以来,肿瘤发病率逐年升高,且死亡率居高不下,?已成为生命的头号杀手。肺癌和乳癌的发病率和病死率在中国和世界上分居首位。

    目前对肿瘤最棘手问题是如何及早发现并及时进行规范治疗。仪器检查如核兹共振、CT及病理切片检查只能针对比较晚期的患者而且对机体带来创伤。生化方法如?ELISA法等由于其不稳定,?敏感性不够高的原因,这些方法并不适用于肿瘤的早期诊断。

    肿瘤细胞能产生特异肿瘤微粒体。由细胞内的多胞体与细胞膜融合分泌出来,因此带有双脂层和很多膜蛋白。它能帮助肿瘤细胞与周围组织进行交流,从而有利肿瘤细胞的生长和扩散。与肿瘤侵袭性密切相关。肿瘤微粒体常常含有肿瘤生物标志蛋白,因此能成为激光微流控技术的特异靶物。

    本发明结合激光镊子与微流控技术,可以检测到单个肿瘤微粒体颗粒,与现有检测技术相比较,具有高特异性、操作简单、检测时间短、灵敏度高、重复性好、血样可再检测等特点,是肿瘤检测的革命性突破,它可快速、灵敏地检测早期肿瘤。同时有助于肿瘤致病机理的研究了解,及时跟踪病情,了解治疗进程。

    发明内容

    本发明针对现有技术中不能反映肿瘤早期病变的状况,提供了一种检测快速、简便,操作容易,高特异性、高灵敏度,低成本的激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法及检测器。

    为了解决上述技术问题,本发明通过下述技术方案得以解决:

    激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,包括下列步骤:

    步骤a:通过半导体泵浦固态激光发射器发射的400nm~1200nm的近红外激光束形成不同偏振态的激光镊子;

    步骤b:用双光束双激光镊子聚焦并捕获微流控芯片管腔(6)内的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物;

    步骤c:将经过滤后的待测样品(血清和其它体液)注入微流控芯片管腔(6)内与被激光镊子捕获的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合。

    步骤d:位置敏感光探测器或其它检测相关物理参数的检测器检测微流控芯片管腔(6)中与样品混合后的结合肿瘤抗体颗粒物的物理参数(包括但不局限于以下参数:颗粒物形状及大小、颗粒物密度、颗粒物折射率、颗粒物散射率、颗粒物介电常数、颗粒物阻尼系数)的改变;

    步骤e:根据物理参数的改变对待测样品中的肿瘤微粒体进行定性及准确定量。

    作为优选,所述的步骤b中的肿瘤微粒体抗体的制备方法包括下列步骤:

    步骤f:用EZ-Link?NHS-PEG12-Biotin试剂盒将预先购买的肿瘤微粒体抗体进行生物素标记;所述的EZ-Link?NHS-PEG12-Biotin试剂是指可用于对普通蛋白质包括抗体进行快速有效的生物素标记的试剂,?由美国Pierce公司(现为美国Thermo?Scientific?公司)生产。

    步骤g:将生物素标记的肿瘤微粒体抗体联接到有链霉亲和素聚合物颗粒上,形成结合肿瘤微粒体抗体颗粒物。

    作为优选,所述的步骤b中的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的大小为80nm-20um。

    作为优选,所述的步骤b中的微流控芯片的制备方法包括下列步骤:

    步骤i:利用绘图软件绘制微流控芯片掩膜版图,并使用分辨率为12000dpi的激光打印机打印,在透明胶片上制得光刻掩膜板。

    步骤j:将玻璃基片置分别置于丙酮、酒精中进行超声处理,然后置于浓H2SO4中煮沸,用去离子水冲洗干净,氮气吹干,热烘去除水汽;

    步骤k:在清洗完毕的玻璃基片表面甩涂光刻胶,软烘、曝光、显影,获得所需刻蚀掩膜层的图形,置于130摄氏度的烘箱中进行硬烘;

    步骤l:将硬烘后的玻璃基片置于摩尔比为HF?:?NH4F?:?H2O为3?:?6?:?9的腐蚀液中进行刻蚀;

    步骤m:将刻蚀后的玻璃基片打孔,并与另一表面甩涂紫外光学胶的玻璃基片贴合,形成封闭的微管道和腔体结构,置于强紫外光源下照射,完成固化键合。

    作为优选,所述的步骤d中结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的物理参数为颗粒物形状及大小、颗粒物密度、颗粒物折射率、颗粒物散射率、颗粒物介电常数、颗粒物阻尼系数中的任何一种。

    激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,包括激光器系统、纳米定位系统、摄像系统、光学部件、机械部件、数据采集和传输系统、自动控制和图像处理应用软件。

    作为优选,所述的激光器系统为二极管泵浦固态激光发射器或光纤激光发射器(功率1至5瓦)。

    作为优选,所述的摄像系统为IXON电子倍增电荷耦合器,纳米定位系统为纳米级可操控反光镜。

    作为优选,所述的光学部件包括法拉第隔离器、半波板、透镜、偏振分束器及位置敏感光探测器。

    作为优选,所述的机械部件包括快门、目镜控制台及样本自动控制台。

    本发明由于采用了以上技术方案,具有明显的技术效果:本发明检测快速、简便、特异,整个检测过程在几分钟内便可完成,容易操作;检测的灵敏度及准确度非常高,最低检出限在0.1皮克/毫升以下;低成本,所需的样品仅仅几微升,整个检测过程几乎不对环境造成污染,具有广阔的市场前景。

    附图说明

    图1为本发明实施例的结构示意图。

    具体实施方式

    下面结合图1与具体实施方式对本发明做进一步的说明。

    激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测法,包括下列步骤:

    步骤a:通过半导体泵浦固态激光发射器发射的400nm~1200nm的近红外激光束形成不同偏振态的激光镊子;

    步骤b:用双光束双激光镊子聚焦并捕获微流控芯片管腔(6)内的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物;

    步骤c:将过滤后的待测血清注入微流控芯片管腔(6)内与被激光镊子捕获的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合;

    步骤d:位置敏感光探测器检测微流控芯片管腔(6)中与样品混合后的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的物理参数,这些物理参数包括但不局限于以下参数:颗粒物形状及大小、颗粒物密度、颗粒物折射率、颗粒物散射率、颗粒物介电常数、颗粒物阻尼系数;这些参数可引起激光镊子发生能量的改变,而被两个位置敏感光探测器所反映。

    步骤e:根据这些物理参数的变化不同或强弱引起的激光镊子能量的改变,经计算机处理可定性和准确定量血清肿瘤微粒体浓度。

    其中,结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的制备方法包括下列步骤:

    步骤f:用EZ-Link?NHS-PEG12-Biotin试剂盒对预先购买的肿瘤微粒体抗体进行生物素标记;

    步骤g:将生物素标记的肿瘤微粒体抗体联接到有链霉亲和素聚合物颗粒上,形成结合肿瘤微粒体抗体颗粒物。

    微流控芯片的制备方法包括下列步骤:

    步骤i:利用绘图软件绘制微流控芯片掩膜版图,并使用分辨率为12000dpi的激光打印机打印,在透明胶片上制得光刻掩膜板。

    步骤j:将玻璃基片置分别置于丙酮、酒精中进行超声处理,然后置于浓H2SO4中煮沸,用去离子水冲洗干净,氮气吹干,热烘去除水汽;

    步骤k:在清洗完毕的玻璃基片表面甩涂光刻胶,软烘、曝光、显影,获得所需刻蚀掩膜层的图形,置于130摄氏度的烘箱中进行硬烘;

    步骤l:将硬烘后的玻璃基片置于摩尔比为HF?:?NH4F?:?H2O为3?:?6?:?9的腐蚀液中进行刻蚀;

    步骤m:将刻蚀后的玻璃基片打孔,并与另一表面甩涂紫外光学胶的玻璃基片贴合,形成封闭的微管道和腔体结构,置于强紫外光源下照射,完成固化键合。

    取5微升血清注入微流控芯片,以层流状态分别在芯片上两通路流动。其中一路与纳米级大小的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合;而另一路作为对照,与非特异性的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物混合,用摄像头观察混合状况。双光束双激光镊子分别检测两通路的混合溶液。血清中肿瘤微粒体与结合肿瘤微粒体抗体颗粒物发生聚合,使后者的形状及大小、颗粒物密度、颗粒物折射率、颗粒物散射率、颗粒物介电常数、颗粒物阻尼系数等参数发生改变;而对照通路上的非特异性的结合肿瘤微粒体抗体颗粒物的参数不会发生任何改变。这些参数可引起激光镊子发生能量的改变,而被两个位置敏感光探测器所反映,根据这些参数的变化不同或强弱引起的激光镊子能量的改变(本实验能量的变化范围在18*10-13~30*10-13伏特^2/赫兹之间,而最低能量响应值在6*10-13伏特^2/赫兹),经计算机处理可定性和准确定量血清肿瘤微粒体浓度。本方法对肿瘤微粒体检测的线性范围在0.5皮克/毫升~10皮克/毫升?,添加回收率在92%~110%之间,最低检出限在0.1皮克/毫升以下。而目前ELISA法对肿瘤标志物的检测水平处于1纳克/毫升级别。

    因此,本发明具有检测快速、简便,容易操作,高特异性,高灵敏度,低成本,样本可重复使用等优点。

    实施例2

    激光镊子及微流控对肿瘤微粒体的检测器,如图1所示,包括激光器系统1、纳米定位系统2、摄像系统3、光学部件4、机械部件、数据采集和传输系统、自动控制和图像处理应用软件。激光器系统1为二极管泵浦固态激光发射器或光纤激光发射器(功率1至5瓦),摄像系统3为IXON电子倍增电荷耦合器,纳米定位系统2为纳米级可操控反光镜,光学部件4包括法拉第隔离器41、半波板42、43、透镜44、偏振分束器45、46、47、48、位置敏感光探测器49、50、微流控芯片管腔6,机械部件包括快门、目镜控制台及样本自动控制台。

    用半导体泵浦激光器(diode?pumped?solid?state,?DPSS,1064纳米、4W、连续波模式产生的激光)做为捕获激光。此近红外激光束首先穿过法拉第隔离器41(Faraday?isolator)以消除正光路引起的背景反射。激光束通过一块半波板42(half?wave?plate)转变自身的偏振后,接着进入第一块偏振分束器45(polarized?beam?splitter,?PBS1)。产生的S偏振光被反射去除,同时剩余的P偏振光则通过第二块半波板43的传导重新调整光偏振。调整后的偏振光束经透镜44后放大,到达最终12毫米平行光束(1/e2)。经过两级放大和聚焦,激光束被第二块偏振分束器46(PBS2)分别分束成P和S偏振光。用一对置于目镜5(OBJ1)后聚焦共轭平面上可操纵的反射镜控制S偏振光,产生的两束光线用偏振分束器47(PBS3)合并、传到目镜5(OBJ1)后聚焦在微流控芯片管腔6内。聚焦后的P和S偏振光分别由一相同目镜7收集,而后根据它们各自的偏振状况再次由偏振分束器48(PBS4)分裂。分裂后的光束分别由位置灵敏光探测器49(position?sensitive?photodector,?PSPD1)和位置灵敏光探测器50(PSPD2)实时检测。

    总之,以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰,皆应属本发明专利的涵盖范围。

    关于本文
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