• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 8
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩做代理: 一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法.pdf

    关 键 词:
    一种 基于 微孔 纤维素酶 测定 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201110080567.0

    申请日:

    2011.03.31

    公开号:

    CN102230887A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 21/31申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/31申请日:20110331|||公开
    IPC分类号: G01N21/31 主分类号: G01N21/31
    申请人: 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
    发明人: 梁剑平; 李兆周; 王学红; 尚若峰; 郭文柱; 郭志廷; 郝宝成; 王曙阳; 陶蕾
    地址: 730070 甘肃省兰州市城关区西北新村3号501
    优先权:
    专利代理机构: 北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249 代理人: 夏晏平
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110080567.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2013.10.23|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,涉及生物化学领域,具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通量测定的方法。步骤为:1)葡萄糖标准曲线的建立,2)样品酶活力测定,3)根据样品酶的吸光度,从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算酶活值,适用于滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶等的活力测定,具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。

    权利要求书

    1.一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤如下:1)葡萄糖标准曲线的建立:取PCR微孔板,每孔内加缓冲液及不同浓度的葡萄糖标准溶液,然后在每孔中加入DNS溶液,90?℃-100?℃孵育5?min-15?min;而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中,用酶标仪测定吸光度;以此得标准曲线;2)样品酶活力测定:于PCR微孔板中,每孔内加缓冲液、酶液及底物,45?℃-55?℃孵育30?min-60?min,然后在每孔中加入DNS溶液,90?℃-100?℃孵育5?min-15?min;而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中,用酶标仪测定吸光度;3)根据样品酶的吸光度,从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算酶活值。2.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤1)所述的每孔内加缓冲液的量为40???l。3.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤1)所述的葡萄糖溶液的浓度依次为0、2.0?mg/ml、3.3?mg/ml、5.0?mg/ml、6.7?mg/ml和10?mg/ml。4.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤1)所述的DNS溶液的加入量为120???l。5.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤1)和2)所述的每孔中转移出溶液量为40???l,置于含160???l水的96孔平底酶标板。6.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤2)所述的缓冲液为50?mmol/l醋酸钠缓冲液,pH值为4.8。7.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤2)所述的底物分别为:滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。8.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其特征是,步骤1)和2)所述的酶标仪测定波长为540nm。

    说明书

    一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法

    技术领域

    本发明涉及生物化学领域,具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通
    量测定的方法。

    背景技术

    纤维素是光合作用的初级产物,也是生物圈中最为丰富的可再生资源。随着
    生活水平的提高,以纤维素类物质为主的有机废弃物日益增多。合理开发和科学
    利用这一丰厚天然资源对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义,采用先
    进的技术手段将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料是世界各国研究开发
    的重点领域。纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水
    解作用。利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖的关键就是纤维素酶的生产。纤维
    素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,纤维素的完全降解由内切葡聚酶
    (Endo-1,4-β-D-gulcanase,EC3.2.1.4)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶(Exo-1,
    4-β-D-gulcanase,EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-β-D-gulcanase,EC3.2.1.21)
    协同作用而完成的。

    纤维素酶的活性测定对于纤维素酶的定量分析和筛选具有十分重要的意义。
    经过对现有文献检索发现,国际理论与应用化学联合会于1987年在Pure?and?
    Applied?Chemistry(理论与应用化学)59卷,第2期,257-268页发表了由Ghose?
    TK撰写的“Measurement?of?cellulase?activities”(纤维素酶活的测定方法)。该
    方法作为纤维素酶活力测定的标准方法,至今仍被广泛使用,但该方法的测定过
    程较为繁琐,而且难以实现高通量测定。随着自动化技术的发展,机械手也被用
    于纤维素酶活力的测定过程中,Decker?SR等在Applied?Biochemistry?and?
    Biotechnology(应用生化和生物科技),2003年,105-108期,689-703页发表
    了“Automated?filter?paper?assay?for?determination?of?cellulase?activity”(自动化滤
    纸片分析法测定纤维素酶活性)。虽然这种自动化方法能够实现快速高通量的测
    定酶活,但需要较为昂贵的器械设备,难以在实际生产中大范围推广。因此,开
    发一种操作简便、结果可靠的高通量酶活测定方法对于纤维素酶的科研和生产具
    有非常重要的实际意义。

    发明内容

    本发明的目的在于克服现有方法的不足,提出一种高通量快速测定纤维素酶
    活力的方法,使其能够用于纤维素酶活的分析和纤维素酶的高通量筛选。

    本发明通过以下技术方案实现:。

    一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法,其对滤纸酶、纤维素内切酶、纤维
    素外切酶和β-葡萄糖苷酶活力测定步骤如下:

    1)葡萄糖标准曲线的建立:取PCR微孔板,每孔内加缓冲液及不同浓度的
    葡萄糖标准溶液,然后在每孔中加入DNS溶液,90℃-100℃孵育5min-15min;
    而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中,用酶标仪测定吸光
    度;以此得标准曲线;

    2)样品酶活力测定:于PCR微孔板中,每孔内加缓冲液、酶液及底物,45
    ℃-55℃于孵育30min-60min,然后在每孔中加入DNS溶液,90℃-100℃孵育
    5min-15min;而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中,用酶
    标仪测定吸光度;

    3)根据样品酶的吸光度,从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据
    生成的葡萄糖克数计算酶活值。

    所述的DNS溶液,其配制方法为:3,5-二硝基水杨酸2.65g,氢氧化钠4.95
    g,四水酒石酸钾钠102.70g,重蒸酚1.9ml,焦亚硫酸钠2.08g,加水354ml
    溶解,置棕色瓶中保存,放置一周后使用。

    所述的缓冲液为50mmol/l醋酸钠缓冲液,其配制方法为:无水醋酸钠2.05g,
    定溶至1000ml,调pH至4.8。

    所述的底物分别为:滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。

    本发明所建立的微孔板法高通量测定纤维素酶活力的方法,稳定性、精密度
    高,重现性好,具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。

    具体实施方式

    以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例
    仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。

    实施例1

    1)标准曲线的建立

    取96孔PCR板,每孔内加40μl缓冲液及20μl浓度分别为0mg/ml、2.0
    mg/ml、3.3mg/ml、5.0mg/ml、6.7mg/ml和10mg/ml的葡萄糖溶液,随后每孔
    加入120μl?DNS溶液,95℃于基因扩增仪中孵育5min。最后从每孔中转移出
    40μl置于含160μl水的酶标板中,用酶标仪于540nm处测定吸光度。

    以葡萄糖浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,得回归方程Y=0.208X+0.0006,
    标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好,线性相关系数为
    r=0.99975。

    2)样品中滤纸酶活力的测定

    于96孔PCR板中,每孔内加40μl?pH4.8的醋酸钠缓冲液、20μl稀释2倍
    的酶液及4mm×6mm滤纸片。50℃于孵育60min,随后每孔加入120μl?DNS
    溶液,95℃孵育5min,上述孵育分别在基因扩增仪和烘箱中进行。而后从每孔
    中转移出40μl置于含160μl蒸馏水的酶标板中,用酶标仪于540nm处测定吸
    光度。

    从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算出
    酶活值。滤纸酶活按下面公式(1)计算。


    公式(1)

    其中FPU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力;A540样品是样品用微孔板DNS
    测定法测得的酶活力值;A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中,1mg的葡萄糖
    的吸光值;5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数,60min为测定中的
    孵育时间,X为稀释后酶液的体积(20μl)。

    3)稳定性、精密度和重现性实验

    样品显色后,分别在不同的时间测定三份样品的吸光度,每隔20min测定3
    次并记录数据,以表征测定方法的稳定性。在测定过程中,每个浓度平行测定3
    个复孔,每个样品同时用三块板子进行孵育和测定,计算测定方法的精密度。对
    同一份样品分别吸取3份等量酶液进行测定,以验证其重现性。

    为验证微孔板法酶活测定方法的精密度及重复性,将所得酶液进行稀释,在
    不同时间进行精密度和重复性试验(见表1)。结果表明,孔间和板间酶活力值的
    变异系数均在5%以下,也就是说酶活力测定方法的精密度及重复性均较好。

    表1微孔板法测定滤纸酶活力的精密度


    微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表2,通过测定表明其重现性较好,RSD
    为2.30%。

    表2微孔板法测定滤纸酶活力的重现性


    微孔板法测定滤纸酶活的稳定性实验结果见表3,通过不同时间对酶活力的
    测定表明其稳定性性较好,RSD为4.38%。但测定的结果随着时间的延长,酶活
    力的测定值逐渐下降,提示样品的测定应尽早尽快进行,这主要与DNS法的显
    色随着时间的延长会逐渐变淡有关。

    表3微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性


    4)比对实验

    在用微孔板法进行测定的同时,与国际通用的国际理论与应用化学联合会的
    标准方法进行比对,并验证该方法的可靠性。结果显示二者无显著差异(P>0.05),
    其对30份样品测定的RSD为4.5%,稍大于国际标准方法RSD为2.3%,但其较
    国际标准测定方法具有快速、简便和样品测定的高通量等明显优势。

    实施例2

    1)标准曲线的建立

    基本过程同实施例1,加入DNS溶液后在90℃孵育15min,回归方程为
    Y=0.203X+0.0008,标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好,线
    性相关系数为r=0.99935。

    2)样品中纤维素内切酶活力的测定

    基本过程同实施例1,酶液及底物在55℃孵育30min,然后加入DNS溶液,
    在100℃孵育5min,所用底物为2%羧甲基纤维素水溶液,纤维素内切酶活按下
    面公式(2)计算。


    公式(2)

    其中IU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力;A540样品是样品用微孔板DNS
    测定法测得的酶活力值;A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中,1mg的葡萄糖
    的吸光值;5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数,30min:为测定中的
    孵育时间,X为稀释后酶液的体积(20μl)。

    3)稳定性、精密度和重现性实验

    基本过程同实施例1,为验证微孔板法酶活测定方法的精密度及重复性,将
    所得酶液进行稀释,在不同时间进行精密度和重复性试验(见表4)。结果表明,
    精密度及重复性均较好,孔间和板间酶活力值的变异系数均在5%以下。

    表4微孔板法测定滤纸酶活力的精密度



    微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表5,通过测定表明其重现性较好,RSD
    为4.00%。

    表5微孔板法测定滤纸酶活力的重现性


    微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表6,通过不同时间对
    酶活力的测定表明其稳定性性较好,RSD为4.62%。

    表6微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性


    4)比对实验

    与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二
    者无显著差异(P>0.05),其对30份样品测定的RSD为3.7%,稍大于国际标
    准方法RSD为2.9%。

    实施例3

    1)标准曲线的建立

    基本过程同实施例1,加入DNS溶液后在100℃孵育5min,回归方程为
    Y=0.189X+0.0003,标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好,线
    性相关系数为r=0.99968。

    2)样品中β-葡萄糖苷酶活力的测定

    基本过程同实施例1,酶液及底物在45℃孵育60min,然后加入DNS溶液,
    在90℃孵育15min,所用底物为0.5%水杨酸苷的水溶液,纤维素内切酶活按公
    式(2)计算。

    3)稳定性、精密度和重现性实验

    基本过程同实施例1,结果表明见表7,精密度及重复性均较好,孔间和板间
    酶活力值的变异系数均在5%以下。

    表7微孔板法测定滤纸酶活力的精密度


    微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表8,通过测定表明其重现性较好,RSD
    为1.03%。

    表8微孔板法测定滤纸酶活力的重现性


    微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表9,通过不同时间对
    酶活力的测定表明其稳定性较好,RSD为1.82%。

    表9微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性


    4)比对实验

    与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二
    者无显著差异(P>0.05),其对30份样品测定的RSD为2.8%,稍大于国际标
    准方法RSD为1.6%。

    实施例4

    1)标准曲线的建立

    基本过程同实施例1,加入DNS溶液后在93℃孵育12min,回归方程为
    Y=0.183X+0.0005,标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好,线
    性相关系数为r=0.99908。

    2)样品中纤维素外切酶活力的测定

    基本过程同实施例1,酶液及底物在47℃孵育45min,然后加入DNS溶液,
    在97℃孵育10min,所用底物为2%微晶纤维素水溶液,孵育时间为120min,
    纤维素外切酶活按公式(3)计算。


    公式(3)

    其中IU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力;A540样品是样品用微孔板DNS
    测定法测得的酶活力值;A540/mg标准品是在葡萄糖标准曲线中,1mg的葡萄糖
    的吸光值;5.55μmol/mg为1mg溶液中葡萄糖的毫摩尔数,120min:为测定中的
    孵育时间,X为稀释后酶液的体积(20μl)。

    3)稳定性、精密度和重现性实验

    基本过程同实施例1,结果表明见表10,精密度及重复性均较好,孔间和板
    间酶活力值的变异系数均在5%以下。

    表10微孔板法测定滤纸酶活力的精密度


    微孔板法测定滤纸酶活的重现性见表11,通过测定表明其重现性较好,RSD
    为4.00%。

    表11微孔板法测定滤纸酶活力的重现性


    微孔板法测定纤维素内切酶酶活的稳定性实验结果见表12,通过不同时间
    对酶活力的测定表明其稳定性较好,RSD为4.62%。

    表12微孔板法测定滤纸酶活力的稳定性


    4)比对实验

    与国际通用的国际理论与应用化学联合会的标准方法进行比对结果显示二
    者无显著差异(P>0.05),其对30份样品测定的RSD为3.2%,稍大于国际标
    准方法RSD为2.3%。

    最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本
    发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员
    来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分
    技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同
    替换、改进等,均应包含在本发明的?;し段е?。

    关于本文
    本文标题:一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-5870878.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
  • 买13458和02679技巧 分分6合精准计划软件 重庆时时开奖官方 网上信誉搏彩平台 pk10软件破解 北京塞车pk拾 分分彩时时彩 pk10免费计划软件怎么样 内蒙古时时计划软件 pk10挂机软件手机软件 时彩做号稳赚 七星彩规律排除法 时时彩平刷稳赚方案 3分赛车计划彩票稳赚技巧 时时彩怎么玩可以稳赚 nba投注量网站