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    重庆时时彩二期计划: 一种检测多种蛋白的电化学免疫分析方法.pdf

    关 键 词:
    一种 检测 多种 蛋白 电化学 免疫 分析 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110077420.6

    申请日:

    2011.03.29

    公开号:

    CN102230939A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20110329授权公告日:20130828终止日期:20160329|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20110329|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N27/48; G01N27/30 主分类号: G01N33/68
    申请人: 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
    发明人: 王东; 仲召阳; 李梦侠; 卿毅; 戴楠; 关伟; 杨雪琴
    地址: 400038 重庆市渝中区大坪长江支路10号
    优先权:
    专利代理机构: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 冯琼;李玉秋
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110077420.6

    授权公告号:

    |||102230939B||||||

    法律状态公告日:

    2017.05.17|||2013.08.28|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及免疫学领域,公开了一种同时检测样品中多种蛋白含量的电化学免疫分析方法,包含使包裹不同电化学分子的脂质体与不同待测蛋白的抗体形成共偶合物的步骤,每种待测蛋白对应唯一一种电化学分子;向固载了多种待测蛋白的抗体的微孔板中加入待测蛋白标准溶液或待测样品,充分反应后,洗涤,封闭非特异结合位点;再加入共耦合物,充分反应后,加入表面活性剂使脂质体破乳;线性扫描伏安法检测不同电化学分子的电流信号强度,根据标准溶液浓度及电流信号强度绘制标准曲线,根据标准曲线得到待测样品中不同蛋白的浓度。本发明所述方法可同时检测同一样品中不同蛋白浓度,具有灵敏度高,检测快速的特点。

    权利要求书

    1.一种同时检测样品中多种蛋白含量的电化学免疫分析方法,
    包含以下步骤:
    步骤1:使包裹不同电化学分子的脂质体与不同待测蛋白的抗体形
    成共耦合物,每种待测蛋白对应唯一一种电化学分子;
    步骤2:向固载了多种待测蛋白的抗体的微孔板中加入待测蛋白标
    准溶液或待测样品,充分反应后,洗涤,封闭非特异结合位点;再向
    微孔板中加入步骤1制备的共耦合物,充分反应后,除去非特异性吸
    附的脂质体,加入表面活性剂使脂质体破乳;
    步骤3:线性扫描伏安法检测不同电化学分子的电流信号强度,
    根据标准溶液浓度及电流信号强度绘制标准曲线,根据标准曲线得到
    待测样品中不同蛋白的浓度。
    2.根据权利要求1所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    所述蛋白种类为两种。
    3.根据权利要求2所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    所述蛋白为胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶。
    4.根据权利要求2所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    所述电化学分子种类为两种。
    5.根据权利要求4所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    所述电化学分子为尿酸和抗坏血酸。
    6.根据权利要求1所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    步骤3所述检测具体为:以MWNT修饰玻碳电极为工作电极,铂丝
    电极作为对电极,饱和甘汞电极作为参比电极,检测电化学分子的峰
    电流强度。
    7.权利要求6所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,所述
    MWNT修饰玻碳电极为浓度为1.0mg/mL、充分分散的MWNT的
    5%DMF溶液滴涂的玻碳电极。
    8.根据权利要求1所述的电化学免疫分析方法,其特征在于,
    所述表面活性剂为Triton-100。

    说明书

    一种检测多种蛋白的电化学免疫分析方法

    技术领域

    本发明涉及免疫学领域,具体涉及一种检测多种蛋白的电化学免
    疫分析方法,特别涉及一种可同时检测胃泌素前体释放肽和神经化烯
    醇酶的电化学免疫分析方法。

    背景技术

    肺癌的发病率和死亡率一直位居全球首位,并呈逐年增多的趋
    势。目前用于肺癌辅助诊断的血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、
    易于接受等特点,在肿瘤筛查、诊断、评价治疗疗效等方面具有较大
    的实用价值。

    胃泌素前体释放肽(ProGRP)和神经化烯醇酶(NSE)是提示小细
    胞肺癌(SCLC)的血清肿瘤标志物,ProGRP是烯醇化酶同功酶,烯醇
    化酶同功酶根据α,β,γ三个亚基的不同,可分为αα,ββ,γγ,αβ
    和αγ五种二聚体同功酶。α亚基主要存在于肝,肾等组织;β亚基主
    要存在于骨骼肌和心??;γ亚基主要存在于神经组织。γγ亚基组成的
    同功酶属神经元和神经内分泌细胞特有,故命名为神经元特异性烯醇
    化酶,此酶在正常人脑组织中含量最高,起源于神经内分泌细胞的肿
    瘤组织也有异常表达,NSE分子量为87000,pH4.7,是一种酸性蛋白
    酶,参与糖酵解,主要作用是催化2-磷酸-甘油变成烯醇式磷酸丙酮酸。
    癌组织糖酵解作用加强,细胞增殖周期加快,细胞内的NSE释放进入
    血液增多,导致此酶在血清内含量增高。适用于SCLC的早期诊断,
    以及与NSCLC的鉴别诊断。

    胃泌素前体释放肽(ProGRP)是NSE胃泌素释放肽(GRP)相
    对稳定的前体,是近年来发现的一种新的SCLC肿瘤标志物,它不仅
    可用于SCLC的早期发现,还有助于判断疗效及肿瘤复发。而ProGRP
    位于胃泌素释放肽的前端,由27个氨基酸组成,在血液中较为稳定。
    是测定小细胞肺癌的良好标志物。有助于SCLC的分期和评估化疗效
    果。

    将ProGRP和NSE联合检测,优势互补,能显著提高SCLC的诊
    断敏感度,特异度和准确率,在SCLC诊断和治疗中有重要的临床应
    用价值。

    发明内容

    本发明的目的在于利用电化学的基本原理,提供一种可同时检测
    多种蛋白如检测胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶的电化学免疫方
    法。

    为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:

    一种同时检测样品中多种蛋白含量的电化学免疫分析方法,包含
    以下步骤:

    步骤1:使包裹不同电化学分子的脂质体与不同待测蛋白的抗体
    形成共偶合物,每种待测蛋白对应唯一一种电化学分子;

    步骤2:向固载了多种待测蛋白的抗体的微孔板中加入待测蛋白
    标准溶液或待测样品,充分反应后,洗涤,封闭非特异结合位点;再
    向微孔板中加入步骤1制备的共耦合物,充分反应后,除去非特异性
    吸附的脂质体,加入表面活性剂使脂质体破乳;

    步骤3:线性扫描伏安法检测不同电化学分子的电流信号强度,
    根据标准溶液浓度及电流信号强度绘制标准曲线,根据标准曲线得到
    待测样品中不同蛋白的浓度。

    作为优选,所述蛋白种类为两种。

    作为优选,所述蛋白为胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶。

    作为优选,所述电化学分子种类为两种。

    作为优选,所述电化学分子为尿酸和抗坏血酸。尿酸UA、抗坏
    血酸AA是具有电化学活性的芳香族双质子分子,在一定的电压下能
    够发生氧化还原反应,可以作为电化学免疫传感器的氧化还原探针分
    子。利用脂质体的空腔结构包埋电活性小分子如铁氰化钾,二茂铁、
    光化学活性分子、核酸、酶等,可以用于构建高灵敏免疫传感器。

    在具体实施例中,本发明采用超声降解法,分别制备包裹具有电
    化学分子活性的尿酸和抗坏血酸的脂质体,以此作为信号放大的载体,
    利用免疫反应的高特异性,结合电化学的高灵敏性。

    当固载的抗体与待测蛋白发生特异性结合后,再用表面固定了可
    与待测蛋白特异性结合的检测抗体的内部包埋了不同电化学分子的脂
    质体进行检测,形成“三明治”夹心形式,用表面活性剂破乳,释放出
    电化学分子,借助不同电活性分子在不同电位下具有特征的伏安峰的
    特性,利用修饰电极通过检测不同电化学分子的线性扫描伏安(LSV)
    峰电流信号强度,根据标准曲线来检测样品中对应的待测蛋白的浓度,
    电流响应值与待测蛋白浓度成正比。

    在本发明的具体实施例中,包裹在脂质体内的电化学分子为尿酸
    和抗坏血酸,所检测的蛋白为胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶。所
    述表面活性剂为Triton-100。

    在本发明的具体实施例中,步骤3所述检测具体为:以MWNT
    修饰玻碳电极为工作电极,铂丝电极作为对电极,饱和甘汞电极作为
    参比电极,检测电化学分子的峰电流强度。

    所述MWNT修饰玻碳电极为浓度为1.0mg/mL、充分分散的
    MWNT的5%DMF溶液滴涂的玻碳电极。

    与现有技术相比,本发明所述方法具有如下优点:

    1、可同时对同一样品的不同蛋白含量进行检测;

    2、灵敏度高;

    3、检测快速;

    4、特异性好。

    附图说明

    图1为实施例4检测ProGRP标准品绘制的标准曲线;

    图2为实施例4检测NSE标准品绘制的标准曲线;

    图3为对含有不同浓度的ProGRP和NSE的标准溶液响应的线性

    扫描伏安图;

    图4为本发明所述方法对人体血清中ProGRP含量的检测及
    ELISA验证结果;

    图5为本发明所述方法对人体血清中NSE含量的检测及ELISA
    验证结果。

    具体实施方式

    本发明公开了一种检测多种蛋白的电化学免疫分析方法,本领域
    技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出
    的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,
    它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施
    例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内
    对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用
    本发明技术。

    为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结
    合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

    实施例1:包埋尿酸或抗坏血酸的脂质体的制备

    采用标准的超声降解法制备小单层脂质体颗粒,具体方法如下:
    在一个5mL的圆底烧瓶中加入总质量为1mg,摩尔比为3∶1的DPPC
    与PE的混合物。再加入体积比为6∶1的氯仿、甲醇混合溶液来溶解
    磷脂混合物,短时超声,形成稳定的W/O乳剂。充分溶解混匀后,通
    过减压旋转蒸发除去有机溶媒,圆底烧瓶内壁上形成了一层薄薄的磷
    脂膜。再向其加入2mL含有UA的磷酸缓冲溶液后,把烧瓶放到50
    ℃的水浴中溶胀1小时,溶胀后剧烈混匀得到多层的脂质体囊泡。这
    些多层的脂质体囊泡用探头超声仪超声后得到体积均匀的包含了UA
    的单层脂质体。制得的脂质体溶液离心分离15分钟,除去可能残留的
    多层脂质体或团聚的脂质体。离心沉淀物分散于PBS中在4℃下储存
    备用。

    参照上述方法,制备内部包埋抗坏血酸的脂质体。

    实施例2:脂质体与检测抗体共耦合物的制备

    采用戊二醛共价交联法分别将不同的检测抗体标记到实施例1制
    备的内部包裹了不同电活性分子的脂质体表面。具体操作过程如下:
    首先将0.5mL?2.5%的戊二醛溶液中逐滴加入包裹了UA的脂质体溶液
    中,在室温下搅拌反应1小时,使脂质体表面充分醛基化。将反应后
    的溶液置于透析袋中,置于磷酸缓冲液中在4℃下透析12小时以除去
    过量的戊二醛分子。取100μL的NSE抗体溶液,缓慢加入到200μ
    L表面醛基化的脂质体溶液中,充分混匀后在25℃下持续搅拌反应1.5
    小时。最后加入60μL?0.25%的牛血清白蛋白溶液以封闭脂质体表面
    未反应的醛基,并在25℃下温育反应1.5小时,制得内部包裹了UA
    的脂质体与NSE抗体的共耦合物,所得产物保存于4℃。

    参照上述方法,制备内部包裹了AA的脂质体与ProGRP抗体的
    共耦合物。

    实施例3:测试电极的制备

    玻碳电极(Φ=4mm)依次经1.0,0.3和0.05μm的Al2O3糊抛光后
    用蒸馏水冲洗干净,再分别在蒸馏水、丙酮、蒸馏水中超声洗涤,清
    洗后的电极置于室温下晾干,备用。多壁碳纳米管(MWNT)使用前,
    用浓硝酸∶浓硫酸(1∶1)80℃5h处理,水洗后真空干燥。取5.0mg
    处理后的MWNT分散于5mL?5%的DMF溶液中,超声30min使其充
    分分散。取6μL超声充分分散的MWNT溶液滴加在预处理的玻碳电
    极表面,即制得测试电极,于室温下放置晾干,置于4℃的冰箱中保
    存待用。

    实施例4:本发明所述方法的检测限

    采用本发明所述方法对ProGRP和NSE的标准溶液进行检测,绘制
    标准曲线

    分别配制四份不同的标准溶液,其ProGRP和NSE的含量分别为:

    (1)100pg/mL?ProGRP和5ng/mL?NSE;

    (2)250pg/mL?ProGRP和10ng/mL?NSE;

    (3)500pg/mL?ProGRP和25ng/mL?NSE;

    (4)1000pg/mL?ProGRP和50ng/mL?NSE。

    具体步骤如下:

    向固载了NSE抗体(或ProGRP抗体)的微孔板中加入100μL
    的NSE标准溶液(或ProGRP标准溶液),于37℃反应1小时,再加
    入100μL?0.25%BSA溶液以封闭非特异性异常结合位点。反应完成后
    用PBS冲洗去掉未结合的样品蛋白和BSA。

    向微孔板中加入100μL内部包裹了UA(或AA)的脂质体与NSE
    抗体(或ProGRP抗体)的共耦合溶液,在37℃下反应1小时。用PBS
    溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的脂质体。

    加入100μL,1.2mM的TritonX-100溶液在室温下培育20分钟使
    脂质体破乳。然后,分别从将固载了NSE抗体和ProGRP抗体的两个
    微孔板中各取100μL所得溶液并转移到电化学测试池中。采用线性扫
    描伏安法(扫描范围-0.2~0.8V,扫速为50mV/s),以三电极系统,
    即制备好的MWNT修饰玻碳电极为工作电极,铂丝电极作为对电极,
    饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,检测AA和UA的峰电流强度,平
    行检测三次,绘制标准曲线,见图1和图2。

    ProGRP的线性范围为100-1000pg/mL,回归方程:为ipc(μA)=
    0.118×C[ProGRP](pg/mL)+113.5,检测限为10pg/mL(见图1)。

    NSE的线性范围为5-50ng/mL,回归方程:为ipc(μA)=6.108×
    C[NSE](pg/mL)+85.31,检测限为0.08ng/mL(见图2)。

    实施例5:本发明所述方法的特异性

    我们考察本发明所述免疫检测方法的非特异吸附情况,图3为修
    饰电极对含有不同浓度的ProGRP和NSE的标准溶液响应的线性扫描
    伏安图;其中a-e曲线代表的检测物浓度分别为:

    (a)0pg/mL?ProGRP+0ng/mL?NSE;

    (b)100pg/mL?ProGRP+5ng/mL?NSE;

    (c)250pg/mL?ProGRP+10ng/mL?NSE;

    (d)500pg/mL?ProGRP+25ng/mL?NSE;

    (e)1000pg/mL?ProGRP+50ng/mL?NSE。其中曲线a为控制其他
    反应条件一致的情况下,以10ng/mL牛血清白蛋白溶液作为空白试
    样,得到的线性扫描伏安曲线。由曲线a可见在0V和0.4V附近均未见
    明显的伏安峰,说明本发明所述免疫检测方法可有效降低非特异吸附。

    实施例6:人体血清样品的检测

    使用本发明所述方法对人体血清样品进行了检测,并将其结果和
    标准的ELISA方法检测的结果进行了对照。

    具体步骤如下:

    向固载了NSE抗体(或ProGRP抗体)的微孔板中各加入100μL
    的人体血清样品溶液,于37℃反应1小时,再加入100μL?0.25%BSA
    溶液以封闭非特异性异常结合位点。反应完成后用PBS冲洗去掉未结
    合的样品蛋白和BSA。

    向微孔板中加入100μL内部包裹了UA(或AA)的脂质体与NSE
    抗体(或ProGRP抗体)的共耦合溶液,在37℃下反应1小时。用PBS
    溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的脂质体。

    加入100μL,1.2mM的TritonX-100溶液在室温下培育20分钟使
    脂质体破乳。然后,分别从将固载了NSE抗体和ProGRP抗体的两个
    微孔板中各取100μL所得溶液并转移到电化学测试池中。采用线性扫
    描伏安法(扫描范围-0.2~0.8V,扫速为50mV/s),以三电极系统,
    即制备好的MWNT修饰玻碳电极为工作电极,铂丝电极作为对电极,
    饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,通过检测AA和UA的峰电流强度,
    平行检测三次。计算得到的AA和UA的峰电流强度的平均值,并与
    实施例4绘制的标准曲线比较,得到对应的血清样品中ProGRP和NSE
    的浓度,并与标准的ELISA方法检测的结果比较,见图4和图5,结
    果显示,两者相关性良好,结果表明该方法可较好的应用于人血清中
    ProGRP和NSE的同时检测。

    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领
    域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出
    若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的?;し段?。

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