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    重庆时时彩趋势分析: 一种用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物和其应用.pdf

    关 键 词:
    一种 用于 诊断 胸腔 积液 分子 标记 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110086713.0

    申请日:

    2011.04.02

    公开号:

    CN102230903A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 24/08申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 24/08申请日:20110402|||公开
    IPC分类号: G01N24/08 主分类号: G01N24/08
    申请人: 江苏省中医院
    发明人: 周贤梅; 何翠翠; 赵阳; 李建新
    地址: 210029 江苏省南京市汉中路155号
    优先权:
    专利代理机构: 江苏圣典律师事务所 32237 代理人: 贺翔
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110086713.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.12.17|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物及其应用,该小分子标记物由缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、乙酰乙酸盐、肌氨酸酐、氧化三甲胺、甜菜碱、α-和β-葡萄糖、亮氨酸和异亮氨酸11个化合物组成。本发明针对癌性患者胸腔积液的成分及其含量的变化,结合核磁共振技术和逐步判别函数分析法筛选出特意性强、灵敏度高、鉴定结果准确率高的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,尤其是乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖可以灵敏、准确、高效的鉴定出良性和癌性胸腔积液,为早期准确诊断肺癌等癌性胸腔积液,给患者争取更多的治疗时间,提高临床治疗效果具有重要意义。

    权利要求书

    1.一种用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,其特征在于,它由下列化合物组成:缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、乙酰乙酸盐、肌氨酸酐、氧化三甲胺、甜菜碱、α-和β-葡萄糖、亮氨酸和异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,其特征在于,它由下列化合物组成:缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱、α-和β-葡萄糖。3.根据权利要求2所述的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,其特征在于,它由下列化合物组成:乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖。4.根据权利要求1至3任一项所述的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,其特征在于,所述的乳酸盐、醋酸盐和乙酰乙酸盐为钾盐或钠盐。5.权利要求1至3任一项所述的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物在诊断癌性胸腔积液中的应用。

    说明书

    一种用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物和其应用

    ??技术领域

    本发明涉及一种疾病的诊断标记物,具体设计一种用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物及其应用。

    背景技术

    胸腔积液是正常情况下胸腔两层胸膜之间存在很少量(约1~30毫升)的液体,起润滑作用,减少在呼吸活动过程中两层胸膜之间的摩擦。这种液体从壁层胸膜产生,由脏层胸膜吸收,不断循环之处于动态平衡,液体量保持恒定,通常难以检测。但是如果某种情况影响到胸膜,无论是壁层胸膜产生胸腔积液或是脏层胸膜吸收胸腔积液的速率发生改变,均可导致胸腔内液体增多,形成胸腔积液,即胸腔积液。胸腔积液从性质上可分为渗出性及漏出性。尤其是渗出性胸腔积液,可以是由肿瘤引起,如肺癌、乳房癌、胃癌等(也称为癌性或癌性胸腔积液);也有炎症性病变所致,如由细菌、病毒或真菌等感染胸膜引起感染性炎症,导致胸腔积液,或由于肺栓塞、胰腺炎、结缔组织疾病等非感染性炎症引起胸腔积液。漏出性胸腔积液的病因,可以是全身性疾病,如低蛋白血症、过敏性疾病,也可以是某器官的病变,如充血性心力衰竭、肝硬化、胸导管破裂等。

    胸腔积液是呼吸科的常见病、多发病,据报道在美国临床癌性胸腔积液每年有150,000~175,000?例,英国有40,000例。由于胸腔积液的良癌性的鉴别诊断直接关系着患者的治疗和预后,尤其对于癌性胸腔积液的早期诊断可以作为最早的癌症信号,因此癌性胸腔积液的快速、早期诊断在临床治疗中显得及其重要。?但肺癌早期诊断较为困难,其临床症状不显著,肺癌的确认多属于中晚期,其临床诊断主要通过胸腔镜检查、胸膜针刺活检、胸腔积液脱落细胞学检查,胸腔积液脱落细胞学检查是最简单、特异的检测方法,但其灵敏度低(<?50%),且耗时,需要重复检查来确定结果,而近几年来流行的评估癌症标记物的水平来诊断癌性胸腔积液,主要的癌症标记物有癌胚抗原(CEA),癌抗原CA153,CA?199?和CA?125,但其灵敏度不高,对于CEA、CA125、CA199、CA153分别为52.8%、16.7%、52.7%和50.0%。其特异性也不尽人意,CEA、CA?15-3、CA?19-9、CA?125分别为85.3%、75.2%、71.5%和40.5%。且由于癌症标记物的种类较多,特异性不强,费用昂贵,也限制了其应用。

    发明内容

    发明目的:本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种灵敏度高、特异性强、能用于准确诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,本发明另一个目的是提供小分子标记物在辅助诊断癌性胸腔积液的应用。

    ?技术方案:为了实现以上目的,本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,

    它由下列化合物组成:缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、乙酰乙酸盐、肌氨酸酐、氧化三甲胺、甜菜碱、α-和β-葡萄糖、亮氨酸和异亮氨酸。

    作为优选方案,本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,它由下列化合物组成:缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱、α-和β-葡萄糖。

    作为优选方案,本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,它由下列化合物组成:乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖。

    作为优选方案,本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,所述的乳酸盐为乳酸钾盐或钠盐、醋酸盐为醋酸钾盐或钠盐,乙酰乙酸盐为乙酰乙酸钾盐或钠盐。

    本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物在诊断癌性胸腔积液中的应用。

    本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物在诊断肺癌胸腔积液中的应用。

    有益效果:本发明提供的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物和现有技术相比具有以下优点:

    本发明针对癌性患者胸腔积液的成分及其含量的变化,通过大量实验研究,结合核磁共振技术和逐步判别函数分析法筛选出特意性强、灵敏度高、鉴定结果准确率高的用于诊断癌性胸腔积液的11个小分子标记物,尤其是乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖;本发明采用核磁共振技术对小分子标记物的氢化学位移及信号强度进行分析,并建立区分胸腔积液类别的判别函数,可以灵敏、准确、高效的诊断出良性和癌性胸腔积液,为早期准确诊断肺癌等癌性胸腔积液,给患者争取更多的治疗时间,提高临床治疗效果具有重要意义。

    附图说明

    ??图1为本发明提供的癌性和良性胸腔积液中小分子标记物的氢谱信号图。

    图2为实施例2所述的良性和癌性胸腔积液中小分子的判别函数分析结果。

    图3为实施例3所述的良性和癌性胸腔积液中小分子的判别函数分析结果。

    具体实施方式:

    根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

    实施例1??胸腔积液中小分子标记物的核磁共振分析

    1、实验对象:分别取26个良性胸腔积液和26个癌性胸腔积液作为核磁共振分析样本。

    2、实验方法:分别取上述22个良性胸腔积液和26个癌性胸腔积液1毫升与20毫升丙酮混合,涡旋30秒,放置5分钟沉淀蛋白,4000?转/分钟离心10分钟,小分子化合物保留在上层清液中,将上层清液挥干,残留物用500?微升重水复溶,其中重水内含TSP(氘代三甲基甲硅烷基丙酸钠)?作为化学位移内标(δ?=?0)?,然后将样品液4000转/分钟离心10?分钟,取上层清液移入核磁共振样品管。样品测试在Bruker?DPX-300?核磁共振仪上进行,使用修改了的脉冲序列(zgpr):水峰饱和(pl9?=?60?dB,d1=?2秒),脉冲间隔为15.0秒,每个样品空扫4次,采样64次。所有实验都在5?毫米的探头中进行,测试温度维持在27℃。

    3、实验结果:具体实验结果如图1和表1所示:由图1的实验结果表明,本发明通过核磁共振分析癌性和良性胸腔积液,共筛选出12个相关的小分子,其中11个可作为鉴定癌性和良性胸腔积液的相关的小分子标记物,图中A为癌性胸腔积液小分子标记物的氢核磁共振分析图,B为良性胸腔积液小分子标记物的氢核磁共振分析图,图中12个相关的小分子的归属分别为:1为亮氨酸和异亮氨酸、2为缬氨酸、3为乳酸盐、4为丙氨酸盐、5为醋酸盐、6为乙酰乙酸盐、7为肌氨酸酐、8为氧化三甲胺和甜菜碱、9为β-葡萄糖、10为α-葡萄糖。从图1所示的癌性和良性胸腔积液的核磁共振氢谱看出,本发明通过大量实验筛选确定最佳的核磁共振分析方法,以上12个相关的小分子标记物能够呈现出较好的氢谱图,可作为12个相关的小分子标记物定性、定量分析的依据。

    ?

    表1??癌性和良性胸腔积液中的小分子标记物的氢化学位移及其位移值比较

    小分子标记物化学位移ppm氢信号强度变化(癌性和良性相比)P值亮氨酸/异亮氨酸0.86~0.940.0518缬氨酸0.98~1.10↑*0.0249乳酸盐1.20~1.38↑**1.3925E-05丙胺酸1.46~1.57↑**0.0025醋酸盐1.89~1.930.9901乙酰乙酸盐2.17~2.21↓*0.0241肌氨酸酐3.04~3.080.0534氧化三甲胺/甜菜碱3.24~3.28↓**5.0870E-07β-葡萄糖4.63~4.71↓**3.3363E-06α-葡萄糖5.21~5.32↓**2.3943E-04

    *?P?<?0.05;?**?P?<?0.01,与良性胸腔积液中相应的小分子相比较。

    由表1的12个分子的氢谱信号强度定量分析,癌性和良性胸腔积液相比,癌性胸腔积液中的缬氨酸,乳酸盐和丙氨酸盐氢谱信号水平明显高于良性胸腔积液中的缬氨酸,乳酸盐和丙氨酸盐氢谱信号,但是癌性胸腔积液中的乙酰乙酸盐,氧化三甲胺/甜菜碱,α-和β-葡萄糖氢谱信号水平明显低于良性胸腔积液,差异有统计学意义(P?<?0.05),良性和癌性胸腔积液中的亮氨酸、异亮氨酸和肌氨酸酐氢谱信号水平差异较明显,但是二者中的醋酸盐氢谱信号水平差异不够显著。由以上表1的实验结果表明,本发明通过大量实验筛选确定最佳的核磁共振分析方法,各个氢信号的化学位移和信号强度,对26个癌性胸腔积液和26个良性胸腔积液中的各成分进行的表征和归属,筛选确定11个可作为鉴定癌性和良性胸腔积液的小分子标记物,癌性和良性胸腔积液中的这11个小分子标记物的氢信号强度(以积分表示)呈现出较大的差异,因此可以作为诊断癌性和良性胸腔积液的分子标记。为了进一步归属以上所述的11个小分子标记物,本发明对以上所述的11个小分子标记物分别和相应的标准品进行液质联用分析,经过液质联用结果表明,以上所述的11个化合物分别为为亮氨酸和异亮氨酸、缬氨酸、乳酸盐、丙氨酸盐、醋酸盐、乙酰乙酸盐、肌氨酸酐、氧化三甲胺和甜菜碱、β-葡萄糖和α-葡萄糖,所述的乳酸盐、醋酸盐和乙酰乙酸盐为钾盐或钠盐。

    实施例2?良性和癌性胸腔积液中小分子标记物的判别函数分析

    为了进一步优选出鉴定良性和癌性胸腔积液的小分子标记物,本发明采用判别函数分析法(DFA)对良性和癌性胸腔积液中小分子标记物做进一步的统计分析。判别函数分析法分成两个过程:(1)判别:找出潜在的有影响的小分子标记物;?(2)分类:使用分类标准,最大化的正确分类并强调各组之间的差异性,得到判别函数方程后对癌性胸腔积液组进行交叉验证。

    在单变量分析中,癌性胸腔积液患者的缬氨酸,乳酸盐和丙氨酸盐水平明显高于良性胸腔积液的患者,而乙酰乙酸盐,氧化三甲胺/甜菜碱以及葡萄糖的水平明显低于良性胸腔积液的患者,差异具有统计学意义(P?<?0.05,见表1)。

    本发明在此基础上再经过多变量分析,采用逐步判别法,利用SPSS11.0?计算机统计软件,选择对表1的所有小分子的种类和积分值数据进行统计处理。具体步骤为:将小分子数据导入SPSS?11.5,?点击分析→分类→判别,将各种未知分组变量(通过核磁鉴定定的各个小分子变量)选至右边独立变量的框中,选择逐步分析法。在统计的子对话框里,将平均值,Fisher??s,非标准法勾??;在方法的子对话框中,选择Wilks??lambda,?准则里选择概率F,设定纳入值为0.05,?剔除值为0.1。再通过一系列分析,得到分析结果。根据标准的判别方程系数表格中的未标化典型判别函数系数,得到判别方程。判别函数分析所得的判别得分计算方程:=?-0.2688?+?[0.1058?×?Int.?(乳酸盐)]?–?[?0.4263?×Int.?(乙酰乙酸盐)]?–?[2.6758?×Int.?(氧化三甲胺/甜菜碱)]?+?[3.5347?×Int.?(α-葡萄糖)],Int.为各个化合物氢信号的积分数值,典则相关系数为0.845;在函数中,良性胸腔积液组和癌性胸腔积液组的重心为分别为-1.679和1.421,截点-0.129。

    根据判别函数方程和图2所示的判别函数分析结果,其中乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖5种小分子标记物联合检测具有最大的鉴别度(P?<?0.001)以及高的诊断符合率(95%以上)。

    本发明以乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺/甜菜碱和α-葡萄糖5个化合物作为鉴定良性和癌性胸腔积液的小分子标记物,以22例良性胸腔积液和26例癌性胸腔积液作为分析对象,按实施例1所述的核磁共振方法检测良性胸腔积液和癌性胸腔积液中的乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖5个化合物氢谱信号,鉴定结果具有95.83%的诊断符合率,其中22例良性胸腔积液检测结果均为良性,检测准确率为100%,26例癌性胸腔积液检测结果均有24例检测为癌性胸腔积液,检测准确率为92.3%。?

    实施例3?小分子标记物鉴定良性和癌性胸腔积液的验证实验

    为了验证上述实施例2所述的判别函数的可靠性及小分子标记物的鉴定的准确率,本发明建立验证组,验证组(包括15个良性胸腔积液和18癌性胸腔积液样本)中的样本类别在判别函数分析之前是未知的。按实施例1所述的核磁共振方法检测良性胸腔积液和癌性胸腔积液中的乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖5个化合物氢谱信号,并按实施例2所述的判别函数分析的计算方程:=?-0.2688?+?[0.1058?×Int.?(乳酸盐)]?–?[?0.4263?×Int.?(乙酰乙酸盐)]?–?[2.6758?×Int.?(氧化三甲胺/甜菜碱)]?+?[3.5347?×Int.?(α-葡萄糖)]进行计算,Int.为各化合物氢信号的积分数值,典则相关系数为0.845;在函数中,良性胸腔积液组和癌性胸腔积液组的重心为分别为-1.679和1.421,截点-0.129。

    实验结果如图3所示,判别结果与临床结果相比,具有96.97%的诊断符合率,其中15例良性胸腔积液检测结果有14例检测为良性,检测准确率为93.3%,18例癌性胸腔积液检测结果有18例检测为癌性胸腔积液,检测准确率为100%。?

    本发明通过对癌性患者胸腔积液的成分及其含量的变化研究,结合核磁共振技术和逐步判别函数分析法筛选出特意性强、灵敏度高、鉴定结果准确率高的用于诊断癌性胸腔积液的小分子标记物,尤其是乳酸盐、乙酰乙酸盐、氧化三甲胺、甜菜碱和α-葡萄糖可做为早期准确诊断肺癌等癌性胸腔积液的小分子标记物,可实施性强、易在各医院推广,具有重要的临床意义。

    以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施,并不能以此限制本发明的?;し段?,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的?;し段?。

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