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    一种 构建 中医 脾虚证 艾滋病 模型 方法 用途
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110120395.5

    申请日:

    2011.05.11

    公开号:

    CN102228699A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A61K 49/00申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 49/00申请日:20110511|||公开
    IPC分类号: A61K49/00; A61K35/76; A61K36/708; G01N33/571; G01N21/00; G01N21/64; G01N1/28; G01N1/31; A01K67/027 主分类号: A61K49/00
    申请人: 广州中医药大学
    发明人: 符林春; 李茂清; 胡英杰; 何金洋; 张苗苗; 陈芝喜; 刘政; 胡董仁; 陈津岩; 董伯振; 周红燕; 李志强; 刘抗伦
    地址: 510405 广东省广州市机场路12号大院
    优先权:
    专利代理机构: 广州市南锋专利事务所有限公司 44228 代理人: 刘媖
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110120395.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2013.09.04|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法及用途。在现有艾滋病实验动物中猴子最接近人类,发明人应用两种方法都成功地构建了恒河猴艾滋病病毒感染中医脾虚证复合模型。第一种方法是用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证后经静脉注射感染猴艾滋病病毒。第二种方法是恒河猴经静脉注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证。通过了解艾滋病病毒在脾虚证模型体内感染过程、发病过程、病理变化,以研究包括感染的靶器官、靶组织和靶细胞,对免疫系统的攻击,免疫系统细胞的反应,中医证候的演变规律等。通过所建立的中医脾虚证艾滋病病毒感染猴复合模型,对于研究艾滋病中医发病机理、证候学演变,评价抗艾滋病中药和复方的药效有着不可替代作用。

    权利要求书

    1.一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法,其特征在于选择健康成年雄性恒河猴,经血清学检测猴艾滋病病毒SIV,猴逆转录D型病毒(SRV),猴B病毒和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)抗体阴性,无中医脾虚、气虚症状体征;采用的毒株为SIVmac239病毒株,经健康猴PBMC体外扩增;用生大黄浓缩液灌胃造成脾虚证,生大黄浓缩液为将生大黄粉碎成的粗粉加沸水煎煮,制成1mL=1g生药的浓缩液,灌胃剂量是0.5?g/kg.d?至3.0?g/kg.d;灌胃时间是3至7周;采用静脉注射方式进行病毒接种,接种量为1:(1000-5000)。2.根据权利要求1所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法,其特征在于用放射免疫学方法检测三碘甲状腺原氨酸(T3)、?四碘甲状腺原氨酸?(T4)、?促甲状腺素(TSH)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、皮质醇(Cor)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、环腺苷酸(cAMP)、?环鸟苷酸(cGMP)、?白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等指标,用比色法测定D-木糖;每1-2周收集标本,接种CEMX174细胞,进行病毒分离;用RT-PCR方法测定体液和组织内的SIV病毒载量;每1-2周收集标本,接种CEMX17细胞,进行病毒分离;用RT-PCR方法测定体液和组织内的SIV病毒载量;用流式细胞术测定模型动物的淋巴细胞亚群数据,包括CD4、CD3、CD8计数;用活检方法取模型动物的淋巴结,福尔马林固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,染色,进行病理形态及半定量分析;中医脾虚证艾滋病猴模型指标体系中的主要特异性指标为三碘甲状腺原氨酸(T3)、D-木糖、病毒载量、CD4、CD4?/CD8比值。3.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法,用于脾虚造模后观察中医证候积分。4.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法,用于研究艾滋病的中医病因、病机和证候。5.根据权利要求1或2所述的构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法,用于抗艾滋病中药和复方的药效评价。

    说明书

    一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法及用途

    技术领域

    ?本发明涉及一种构建中医模型的方法及用途,具体涉及一种构建中医脾虚证艾滋病模型的方法及用途。

    背景技术

    目前艾滋病的治疗主要是应用高效抗逆转录病毒疗法(HARRT)治疗、免疫治疗、生物治疗、疫苗、中医药治疗等。其中,中医临床治疗具有辨证论治的特点,可根据患者的自身体质特征和症状表现采用个体化治疗,且中药通过调节机体免疫系统,延长患者带毒生存时间,毒副作用少,依从性好。中医药特别是在感染HIV病毒后的无症状期发挥积极的治疗作用。近几年中医药防治艾滋病的实验取得了可喜的成绩,通过体外抑制HIV病毒细胞培养、药物筛选和动物实验发现了多种具有抑制艾滋病病毒作用的中药,临床试验研究也证实了中药在稳定和提高免疫功能、消除和缓解症状、改善生活质量方面具有较好的效果。中医药通过多环节、多靶点的调节,从多个途径介入,通过影响病毒——宿主网络,改变疾病的病理状态或推迟疾病的进程,在临床治疗中更强调对患者生活质量和生存期的改善,与西医药着重于抑制病毒有着较大的区别,因此,作为病因病机基础研究和评价标准的动物模型应该有别于西医药研究所采纳的动物模型。

    然而,目前尚未建立适合中医药筛选抗艾滋病的动物模型,给中医药的筛选工作带来了困难。艾滋病中医动物模型应能够和艾滋病的病因、病理变化相似;满足中医临床的症状模拟,评价指标特异性强、客观;模型应能够被药物反证。概括而言,应符合中医动物模型的基本要求。另外,该模型应该价操作简单、操作步骤和环节精炼,实验结果的重复性好。中医药艾滋病动物模型必须始终以中医理论为指导,体现中医特色。中医的证候是中医药理论和临床的基础,因此,动物模型应该符合中医的证和病机变化。

    目前,中医艾滋病证候的研究已进行了多年,形成了多种学说,基本认为艾滋病的证候以复合证、虚实夹杂为特点,具有复杂的病机,体现了多样性的特点。我们长期的临床和实验研究认为,AIDS病因病机为:HIV侵入人体,首先损伤脾脏,致脾气亏虚,进而损及其他四脏,终至五脏气血阴阳俱虚,并伴有气滞血瘀,或痰饮水湿,或风寒火热等邪毒为其基本病机的疾病。

    艾滋病复杂的临床症状表现,说明除了HIV病毒之外,其他的因素也参与了证候的形成。利用当前成熟的技术,在动物身上复制能够和临床证候更为相似的动物模型,能够更好地模拟临床表现,提供与临床“证”相似的模型,丰富艾滋病的中医动物模型库,切中中医动物模型中“辨证”的要求。由于临床上艾滋病的发生、发展过程中,症状、证型存在随时空变化而改变的性质,提示某种因素复制的艾滋病动物模型在不同的时期,其所表现的证可能是不同的,这种证的变化尽量拟合临床证的变化。除了客观的症状指标外,应选择科学、准确、量化的指标衡量证候,并应注意这些指标应该有较强的特异性。如艾滋病动物脾虚模型,就应该选小肠木糖吸收试验等指标。药物反证(以下简称反证)?,又称以药测证也是衡量模型是否成功的有效手段。当建立稳定的动物模型后,再用该模型相对应的基本方药进行观察治疗,如果治疗能改善或消除模型的症状和检测指标,则佐证了此模型成立,反之亦然。

    综上所述,中医艾滋病动物模型应在满足模拟艾滋病病因、病理的基础上,应能体现中医证的特色,满足中医学的发病学原理,模型的症状、客观指标和药物反证比较一致,与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质,验证并探讨中医中药的疗效和机理,促进中医药防治艾滋病的理论研究。

    猴艾滋病病毒SIV属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒,?SIV?病毒株于1985年首先从恒河猴中成功地分离。SIV引起的症状和人AIDS明显相似,第一阶段为感染后第1~3周,其间会出现一个病毒复制的高峰,常表现在血浆中的P27核心蛋白大量增值,有明显的病毒血症,表现为发热、皮疹、腹泻和外周浅表淋巴结肿大等,类似于人感染的临床症状。第二阶段为持续无临床症状期。该期时间长短不一,短的仅为2个月,长的可达几年。其表现为P27核心蛋白水平下降而相应的抗体出现。第三阶段为AIDS期,猴外周血中CD4?细胞逐渐下降,血浆病毒水平回升,并伴有体重下降、全身衰竭和机会感染(主要表现为顽固的腹泻和肺炎)?。约有20%~30%的感染猴因缺乏有效的免疫应答而死亡。。SIV和HIV同属逆转录病毒科慢病毒亚科病毒,?SIV与CD4受体和辅助受体CCR5,?CXCR4密切相关,并可使猴子致病,还可以通过母猴喂养小猴传播。SIV猴模型作为AIDS模型,得到了越来越多人认可。国内外艾滋病实验大多数都是应用SIV猴模型,作为AIDS发病机理、药物治疗、疫苗研制的技术平台。

    本发明人克服了诸多技术问题,成功构建了一种艾滋病灵长类中医脾虚证动物模型。在所述动物中复制的重复性、稳定性好;能体现中医证的特色,模型的症状、客观指标和药物反证比较一致,与中医理论较为吻合。该模型的建立将有利于揭示艾滋病“证”的实质,验证并探讨中医中药的疗效和机理,促进中医药防治艾滋病的理论研究为中医药治疗艾滋病疗效评价和药物筛选提供了比较理想的动物模型。

    发明内容

    本发明的目的,是构建一种中医脾虚证艾滋病猴模型。这种中医脾虚证艾滋病猴模型,是由同一造模动物中医脾虚症候模型和SIV感染模型叠加构建而成。具由中医脾虚症候和SIV感染艾滋病症候双重特点。

    本发明的目的是这样实现的:

    本发明通过两种方案构建了中医脾虚证艾滋病猴模型。

    第一种是用生大黄浓缩液灌胃先造成中医脾虚症猴模型,然后静脉注射感染SIV病毒,感染14天后检测并最终确认病毒感染,达到构建复合模型。中医脾虚症候模型根据实验要求和恒河猴自身身体状况,连续使用生大黄浓缩液灌胃对恒河猴进行为期4周左右的造??纱锸笛樯杓埔?。

    第二种是恒河猴经静脉注射感染猴艾滋病病毒后再用生大黄浓缩液灌胃造脾虚证。SIV感染模型采用SIVmac239病毒株进行静脉感染方式,感染14天后抽血检测确认感染情况,然后用生大黄浓缩液灌胃进行中医脾虚症候模型构建,最终构建复合模型。

    恒河猴造模成脾虚后出现明显的腹泻、摄食量减少、进食速度减慢、厌食等典型中医脾虚情况;随着造模时间的延长症状逐渐加重。但如果不加用大黄维持复合模型,则症状会逐渐缓解。

    恒河猴感染艾滋病病毒后,表现和艾滋病人极为相似,猴感染SIV后病情发展有三个阶段:急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期,产生抗艾滋病病毒抗体IgM?和IgG体液分离病毒阳性,检测病毒阳性。

    中医脾虚SIV复合模型病毒构建前后血浆病毒载量与正常状况下SIV感染猴模型的血浆病毒载量相比较无明显差别,但CD4计数较正常状况下SIV感染猴模型的更低。CD4/CD8比值倒置状况也较正常状况下SIV感染猴模型更加严重。整体来说,中医脾虚SIV复合模型病情较自然感染的恒河猴病情严重。

    本发明的特点和突出优势在于:

    成功构建了一种中医脾虚证艾滋病猴模型。在最接近于人类的动物模型上既能体现中医脾虚证候特点及演变规律,并可从中获得稳定的脾虚症状和脾虚证相关客观指标,又能体现最接近人类艾滋病的感染与发病过程和症状,并可从中获得稳定的病毒学、免疫学及病理学相关客观指标。构建的病、证结合的艾滋病猴模型具有重复性和稳定性,有利于揭示艾滋病“证”的实质,验证并探讨中医中药的疗效和机理,促进中医药防治艾滋病的理论研究。?

    以下通过实施例进一步说明本发明的内容,本领域技术人员能够通过实施例了解本发明所说的一种中医脾虚证艾滋病猴模型的建立方法和用途。但是这些实施例不得理解为对本发明权利要求的限制。

    实施例1???第一种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法和用途

    ?1?实验动物:选择健康成年雄性恒河猴,经血清学检测SIV,猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)抗体阴性,无脾虚、气虚症状体征;

    2?造模药物:大黄灌胃溶液

    2.1制备工艺:取生大黄药材,粉碎成粗粉,称取5?kg,加4倍量水,置不锈钢桶中搅拌均匀,浸泡0.5?h,再将此桶置入沸水浴中,继续加热、保温搅拌20?min,用纱布过滤,残渣加沸水8000?mL,搅拌20?min,四层纱布过滤。先将第二次过滤的药液常压下浓缩至小体积,再并入第一次的过滤液,常压浓缩至5000?mL,即得。浓度为1?mL?=?1?g生药。

    给药方式:经鼻插胃管,大黄浓缩液灌胃给药。

    感染模型构建

    3.1?造模感染病毒株:SIVmac239病毒株

    3.2?感染剂量及方式

    感染的剂量为1:3000,使用1640稀释液进行稀释,将稀释后呈粉红色液体1ml进行静脉注射,注射后压按注射口防治血液倒流以确保注射病毒剂量准确,14天后抽血检测确认感染情况。

    造模效果评价

    4.1?中医证候积分变化

    复合模型构建前恒河猴中医症候临床观察无特殊异常,中医症候积分一般在0~6分水平波动。复合模型构建启动后,造模动物出现明显的腹泻、摄食量减少、进食速度减慢、厌食等典型中医脾虚情况;随着造模时间的延长,恒河猴群相继出现腹泻加重出现水样便或粘液血便、摄食和食欲明显下降、对外界刺激反应能力降低和等症状体征;在造模后期主要表现为消化道症状明显加重、毛发开始干涩、疏松、体重进一步下降、摄食明显减少甚至不摄食,中医症候积分超过9分。但如果不加用大黄维持复合模型,则症状会逐渐缓解。

    体重变化

    造模动物在造模后体重迅速下降,个体存在明显差异。造模前体重5.78±0.68?kg,造模四周后体重5.06±0.62?kg;而同期正常健康恒河猴同造模前时间点为5.57±0.67?kg,造模后时间点为5.73±0.74?kg。复合模型构建前体重均数为5.5785±0.58960,造模后给药前均数为5.2030±0.50091;体重下降明显。?

    部分生化指标变化情况

    4.3.1??T3指标变化情况

    动物造模后T3?(nmol/L)指标明显下降,严重脾虚的造模动物下降的幅度超出正常参考范围,并与造模强度和临床症状密切相关??赡芪幸狡⑿橹ぬ匾煨灾副?。

    造模动物中(n=20)T3指标在中医脾虚造模前均数为4.2000±1.06640,造模后均数为1.5200±0.57605;而非造模动物(n=15)在中医脾虚造模前均数为4.4500±1.16594,造模后均数为3.3567±0.67757。这两组在造模前后均有变化,而且统计学检验均差异有意义。

    指标变化情况

    动物造模后T4?(nmol/L)指标出现波动,变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)T4指标在中医脾虚造模前均数为112.5490±30.15634,造模后均数为74.5740±19.84165。

    指标变化情况

    动物造模后T?(nmol/L)指标出现水平波动,整体水平较造模前有所升高。

    造模动物中(n=20)T指标在中医脾虚造模前均数为0.5465±0.31668,造模后均数为0.8705±0.54350。

    指标变化情况

    动物造模后E2?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)E指标在中医脾虚造模前均数为68.6235±28.85705,造模后均数为48.6610±18.67433。

    指标变化情况

    动物造模后Cor?(nmol/L)指标出现水平波动,整体水平较造模前有所升高,但在参考范围内变化,临床意义有待进一步研究。

    造模动物中(n=20)Cor指标在中医脾虚造模前均数为1745.4845±462.67066,造模后均数为2064.7450±461.07680。

    指标变化情况

    动物造模后ACTH?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)ACTH指标在中医脾虚造模前均数为13.6820±7.38403,造模后均数为24.0685±9.53206。

    指标变化情况

    动物造模后cAMP?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)cAMP指标在中医脾虚造模前均数为66.8295±21.09865,造模后均数为59.5250±18.79794。

    指标变化情况

    动物造模后cGMP?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)cGMP指标在中医脾虚造模前均数为9.5770±2.76173,造模后均数为7.9045±2.13597。

    指标变化情况

    动物造模后IL-2?(ng/mL)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)IL-2指标在中医脾虚造模前均数为2.1170±0.88675,造模后均数为1.8100±0.57513。

    指标变化情况

    动物造模后IL-6?(ng/mL)指标出现水平波动,变化未显示特异性。

    造模动物中(n=20)IL-6指标在中医脾虚造模前均数为65.8215±22.08351,造模后均数为109.3970±40.96902。

    木糖指标变化情况

    动物造模后尿D-木糖排泄率指标出现明显下降??赡芪幸狡⑿橹ぬ匾煨灾副曛?。

    造模动物中(n=20)尿D木糖排泄率指标在造模前均数为19.56±8.76,造模后均数为11.99±4.31;

    4.4血浆病毒载量和CD4计数、CD4/CD8比值

    中医脾虚SIV复合模型病毒构建后每2周收集标本,用RT-PCR方法测定病毒载量,证实了本发明使SIV病毒在该动物模型中复制。也证实了中医脾虚SIV复合模型病毒构建前后血浆病毒载量较正常状况下感染自然症候观察组高。复合模型造模后病毒载量变化,为复合模型特异性指标。中医脾虚SIV感染复合模型构建前后血浆病毒载量与正常状况下感染自然症候观察组比较差别不显著,但CD4计数结果比正常感染恒河猴计数低,而且CD4+/CD8+在复合模型动物中倒置严重,具统计学差异,证实脾虚造模后能加重SIV感染病情。CD4计数、CD4+/CD8+比例也都是为复合模型特异性指标。

    血浆病毒载量

    造模动物中(n=20)病毒载量对数指标在造模前为0,造模后均数为3.7887±1.0329。

    动物造模后CD4%出现下降,与造模和临床相关,为中医脾虚SIV感染复合模型特异性指标。造模动物中(n=20),CD4%指标在造模前均数为27.4846±9.51696造模后均数为21.758±6.80809。

    比值

    动物造模后CD4+/CD8+比值出现下降,而且幅度较大,与造模和临床相关,为中医肾虚SIV感染复合模型特异性指标。

    造模动物中(n=20)CD4+/CD8+比值指标均数在造模前为1.83±1.21,在造模后均数为0.93±0.27。

    中药反证实验

    对脾虚复合模型组、同步感染对照治疗组、自然症候观察组三组死亡数据(7/50,1/24,3/18)进行非参数检验(Kruskal-Wallis?Test)统计学分析,P=0.000,按α=0.05水准拒绝H0,接受H1,三组死亡分布不同。(自然感染死亡率16.7%,复合模型死亡率14%,同步感染治疗对照死亡率4.2%,三组死亡率比较差异有统计学意义。)提示:在病毒感染后无中医症候模型情况下采用中药治疗,能大大降低死亡率(具统计学意义),当病毒感染的恒河猴具有中医脾虚症候时,死亡率会较同步感染恒河猴增加(具统计学意义),采用中医药治疗后,死亡率比感染后不治疗的恒河猴低(但无统计学意义)。

    模型具体应用

    5.1造模后观察脾虚证对艾滋病感染急性期病毒高峰的改变,毒血症的病理变化,观察药物或疫苗的预防效果,特别是观察早期应用中药对疾病进程的影响,为临床窗口期的中医药治疗提供依据。

    5.2慢性感染早期模型的应用:观察证候对艾滋病进展的相关性和病理机制,观察治疗性中药或疫苗的效果,较普遍适用。

    5.3慢性感染中、后期模型的应用:观察中医药或中西药联合应用的药代动力学和疗效,特别是中医药对艾滋病患者全身状况的变化,病毒载量的下降,免疫学改善的影响及中药对HAART治疗减毒增效的研究。

    5.4不同时期淋巴结病理学活检:观察中医证候演变与艾滋病病情轻重形态学指标的相关性。通过治疗前后的对比,可以清楚知道抗艾滋病药物的疗效和药效维持时间的长短,还运用免疫组织化学的方法,可以测出幼稚淋巴细胞的再生的情况,这是很有说服力的指标。

    实施例2???第二种构建中医脾虚证艾滋病猴模型的方法和用途

    1?实验动物:选择健康成年雄性恒河猴,经血清学检测SIV,猴逆转录D型病毒(SRV),猴B病毒和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)抗体阴性,无脾虚、气虚症状体征;

    2?造模药物:大黄灌胃溶液

    2.1制备工艺:取生大黄药材,粉碎成粗粉,称取5?kg,加4倍量水,置不锈钢桶中搅拌均匀,浸泡0.5?h,再将此桶置入沸水浴中,继续加热、保温搅拌20?min,用纱布过滤,残渣加沸水8000?mL,搅拌20?min,四层纱布过滤。先将第二次过滤的药液常压下浓缩至小体积,再并入第一次的过滤液,常压浓缩至5000?mL,即得。浓度为1?mL?=?1?g生药。

    给药方式:经鼻插胃管,大黄浓缩液灌胃给药。

    感染模型构建

    3.1?造模感染病毒株:SIVmac239病毒株

    3.2?感染剂量及方式

    感染的剂量为1:3000,使用1640稀释液进行稀释,将稀释后呈粉红色液体1ml进行静脉注射,注射后压按注射口防治血液倒流以确保注射病毒剂量准确,14天后抽血检测确认感染情况。

    造模效果评价

    4.1?中医证候积分

    复合模型构建前恒河猴中医症候临床观察无特殊异常,中医症候积分一般在0~6分水平波动。复合模型构建启动后,造模动物出现明显的腹泻、摄食量减少、进食速度减慢、厌食等典型中医脾虚情况;随着造模时间的延长,恒河猴群相继出现腹泻加重出现水样便或粘液血便、摄食和食欲明显下降、注意力下降、对外界刺激反应能力降低和等症状体征;在造模后期主要表现为消化道症状明显加重、毛发开始干涩、疏松、体重进一步下降、摄食明显减少甚至不摄食,中医症候积分超过9分。但如果不加用大黄维持复合模型,则症状会逐渐缓解。

    体重变化

    造模动物在造模后体重迅速下降,个体存在明显差异。造模前体重5.78±0.68?kg,造模四周后体重5.06±0.62?kg;而同期正常健康恒河猴同造模前时间点为5.57±0.67?kg,造模后时间点为5.73±0.74?kg。复合模型构建前体重均数为5.5785±0.58960,造模后给药前均数为5.2030±0.50091;体重下降明显。?

    部分生化指标变化情况

    4.3.1??T3指标变化情况

    动物造模后T3?(nmol/L)指标明显下降,严重脾虚的造模动物下降的幅度超出正常参考范围,并与造模强度和临床症状密切相关??赡芪幸狡⑿橹ぬ匾煨灾副?。

    造模动物中(n=30)T3指标在中医脾虚造模前均数为3.33±0.81,造模后均数为2.69±0.83。变化规律与第一种造模方法的相一致。

    指标变化情况

    动物造模后T4?(nmol/L)指标出现波动,变化未显示特异性。

    造模动物中中(n=30)T4指标在中医脾虚造模前均数为100.6±35.1,造模后均数为111.3±33.8。

    指标变化情况

    动物造模后T?(nmol/L)指标出现水平波动,整体水平较造模前有所升高。

    造模动物中(n=30)T指标在中医脾虚造模前均数为0.63±0.75,造模后均数为1.16±1.07。与第一种造模方式产生的指标变化一致,整体水平升高。

    指标变化情况

    动物造模后E2?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=30)E指标在中医脾虚造模前均数为81.9±27.2,造模后均数为84.2±28.5。

    指标变化情况

    动物造模后Cor?(nmol/L)指标出现水平波动,整体水平较造模前有所升高,但在参考范围内变化,临床意义有待进一步研究。

    造模动物中(n=30)Cor指标在中医脾虚造模前均数为719.9±211.1,造模后均数为724.3±225.5。与第一种造模方式产生的指标变化一致,整体水平有所升高。

    指标变化情况

    动物造模后ACTH?(pmol/L)指标出现水平波动。变化未显示特异性。

    造模动物中(n=30)ACTH指标在中医脾虚造模前均数为24.9±13.5,造模后均数为24.3±15.7。

    血浆病毒载量和CD4计数、CD4/CD8比值

    中医脾虚SIV复合模型病毒构建后每2周收集标本,用RT-PCR方法测定病毒载量,证实了本发明使SIV病毒在该动物模型中复制。也证实了中医脾虚SIV复合模型病毒构建前后血浆病毒载量较正常状况下感染自然症候观察组高。复合模型造模后病毒载量变化,为复合模型特异性指标。中医脾虚SIV感染复合模型构建前后血浆病毒载量与正常状况下感染自然症候观察组比较差别不显著,但CD4计数结果比正常感染恒河猴计数低,而且CD4+/CD8+在复合模型动物中倒置严重,具统计学差异,证实脾虚造模后能加重SIV感染病情。CD4计数、CD4+/CD8+比例也都是为复合模型特异性指标。

    血浆病毒载量

    造模动物中(n=30)病毒载量的对数指标在造模前均数为5.2995±1.03126,?造模后均数为4.4920±1.24795。

    动物造模后CD4%出现下降,与造模和临床相关,为中医脾虚SIV感染复合模型特异性指标。造模动物中(n=30)CD4%指标在造模前均数为19.57±8.56,?造模后均数为18.16±9.02。

    比值

    动物造模后CD4+/CD8+比值出现下降,而且幅度较大,与造模和临床相关,为中医肾虚SIV感染复合模型特异性指标。

    造模动物中(n=30)CD4+/CD8+比值指标在中医肾虚SIV感染复合造模前均数为0.74±0.31,?造模后均数为0.76±0.39。整体来说,第二种方案构建的复合模型病情较重。

    中药反证实验

    对脾虚复合模型组、同步感染对照治疗组、自然症候观察组三组死亡数据(7/50,1/24,3/18)进行非参数检验(Kruskal-Wallis?Test)统计学分析,P=0.000,按α=0.05水准拒绝H0,接受H1,三组死亡分布不同。(自然感染死亡率16.7%,复合模型死亡率14%,同步感染治疗对照死亡率4.2%,三组死亡率比较差异有统计学意义。)提示:在病毒感染后无中医症候模型情况下采用中药治疗,能大大降低死亡率(具统计学意义),当病毒感染的恒河猴具有中医脾虚症候时,死亡率会较同步感染恒河猴增加(具统计学意义),采用中医药治疗后,死亡率比感染后不治疗的恒河猴低(但无统计学意义)。

    模型具体应用

    5.1造模后观察脾虚证对艾滋病感染急性期病毒高峰的改变,毒血症的病理变化,观察药物或疫苗的预防效果,特别是观察早期应用中药对疾病进程的影响,为临床窗口期的中医药治疗提供依据。

    5.2方案二造模后观察疾病的证候演变规律及其对病毒复制的影响,观察中药预防效果。

    5.3慢性感染早期模型的应用:观察证候对艾滋病进展的相关性和病理机制,观察治疗性中药或疫苗的效果,较普遍适用。

    5.4慢性感染中、后期模型的应用:观察中医药或中西药联合应用的药代动力学和疗效,特别是中医药对艾滋病患者全身状况的变化,病毒载量的下降,免疫学改善的影响及中药对HAART治疗减毒增效的研究。

    5.5不同时期淋巴结病理学活检:观察中医证候演变与艾滋病病情轻重形态学指标的相关性。通过治疗前后的对比,可以清楚知道抗艾滋病药物的疗效和药效维持时间的长短,还运用免疫组织化学的方法,可以测出幼稚淋巴细胞的再生的情况,这是很有说服力的指标。

    在我国现有的实验动物中没有其他动物比实验用猴更接近人类,因而,应用该模型观察艾滋病脾虚证候的病理学指标,在人体内无法取材,而在该模型中可以开展时间动力学任何指标的取材、示踪以及相关条件病原协同致病的研究中,该模型具有无可替代的优越性。

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