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    重庆时时彩3d杀号程序: 一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒.pdf

    关 键 词:
    一种 结核 分枝杆菌 氟喹诺酮 耐药 突变 检测 方法 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110137832.4

    申请日:

    2011.05.25

    公开号:

    CN102229990A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110525|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12Q1/02; G01N21/64 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 厦门大学; 厦门致善生物科技有限公司
    发明人: 李庆阁; 刘歆; 张轶; 胡思玉
    地址: 361005 福建省厦门市思明南路422号
    优先权:
    专利代理机构: 厦门南强之路专利事务所 35200 代理人: 马应森;何加友
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110137832.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.07.16|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术,提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。提取结核分枝杆菌样本的DNA;根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区,设计引物和探针;构建单管单色实时PCR体系,进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测,比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线熔点的差异,判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致时判定为野生型,试验菌株对氟喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对照至少2℃时判定为突变型,试验菌株对氟喹诺酮耐药。提高结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测灵敏度、特异性,缩短检测所需时间。

    权利要求书

    1.一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)提取结核分枝杆菌样本的DNA;
    2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区,利用引物设计软件Primer?5设计引物和探针;
    3)构建单管单色实时PCR体系,进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测,比
    较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点的差异,判断样品是否发生突变。样品的熔点
    与阳性对照的熔点一致时判定为野生型,试验菌株对氟喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对
    照2℃或2℃以上时判定为突变型,试验菌株对氟喹诺酮耐药。
    2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法,其特征在于在
    步骤2)中,所述设计引物和探针的具体方法如下:a,引物设计在所检测的突变两端,探针
    覆盖突变位点;b,探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor任意
    一种,淬灭基团可选择BHQ、Dabcyl。
    3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法,其特征在于在
    步骤2)中,所述引物和探针的具体序列为:
    Primer-F:5’-CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3’
    Primer-R:5’-GACCAGGGCTGGGCCATG-3’
    Probe-A:5′-FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3′。
    4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法,其特征在于在
    步骤3)中,所述单管单色实时PCR体系为:
    含有1×PCR?buffer,2.0mM?MgCl2,dATP、dCTP、dGTP?0.2mM,dUTP?0.4mM,2U?Taq,0.01U
    UNG,0.8μM?of?Primer-R,0.08μM?of?Primer-F,0.08μM?of?Probe-A;
    取结核分枝杆菌样本5μl?DNA作为模板,并取浓度为104copies/μl的阳性质粒作为阳性
    对照,双蒸水做为阴性对照。
    5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法,其特征在于在
    步骤3)中,所述PCR的反应程序为:
    第一步:50℃2min,95℃10min;
    第二步:95℃10s,65℃20s(每个循环降低1℃),78℃25s,10个循环;
    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环,65℃20s处收集荧光信号;
    第四步:95℃30s;
    第五步:40℃2min;
    第六步:40~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道。
    6.如权利要求1所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒,其特征在于
    设有盒体、扩增试剂、TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB?DNA提取液;扩增
    试剂、TB酶混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB?DNA提取液放置在盒体内;
    所述扩增试剂为FQ?PCR?Mix,其成分为1×PCR?buffer(10mM?Tris-HCl,pH8.6,50mM?KCl,
    5%甘油),2.0mM?MgCl2,dATP、dCTP、dGTP各0.2mM,dUTP?0.4mM,0.8μM?Primer-R,
    0.08μM?Primer-F,0.08μM?Probe-A;
    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG;
    所述FQ阳性对照为FQ野生型标准质粒,TB阴性对照选自TB?DNA提取液、H2O、Tris
    或生理盐水;
    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。
    7.如权利要求6所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒对标本的检验
    方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)试剂准备——配液区
    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    FQ?PCR?Mix和n×0.4μL?TB酶混合液a加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒,配好的PCR反应液必须贮存在-20℃并在4h内使用;
    ②PCR反应液的分装,将PCR反应液以每管20μL分装于PCR薄壁反应管;
    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕;
    2)样品提取及加样——提取区
    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在250
    μL?TB?DNA提取液中,液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心15min,
    丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌;
    ②封口膜封口,99℃加热20min,14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管,上清即为PCR扩增模板;
    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL,立即盖严管盖;
    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区;
    3)PCR扩增——扩增区
    ①仪器的程序设定如下:
    第一步:50℃2min,95℃10min;
    第二步:95℃10s,65℃20s,每个循环降低1℃,78℃25s,10个循环;
    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环;
    第四步:95℃2min;
    第五步:40℃2min;
    第六步:45~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道;
    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理;
    (3)试剂盒的参考值
    阳性对照,即野生型的Tm值范围:反应体系中FAM通道野生型对照峰的Tm值为
    71℃±1℃;
    其中Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考,当使用其它仪器时,
    Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照所得的Tm值为准;
    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,参考阳性对照和阴性对
    照的峰型选择有效Tm值;当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,通过调整基线或直接人
    工判读的方法获得Tm值;
    (4)结果判读
    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点Tm值的差异判断样品是否发生突
    变,样品的熔点与阳性对照的熔点一致,即误差不超过1℃时判定为野生型,试验菌株对氟
    喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对照至少2℃时,即ΔTm≥2℃,判定为突变型,试验菌株
    对氟喹诺酮耐药。

    说明书

    一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒

    技术领域

    本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术,特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的
    探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变。

    背景技术

    20世纪80年代以来,结核病疫情重新上升,成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的
    传染病。据世界卫生组织统计,目前全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌,每年新增800
    万病人,死亡200~300万人,是目前死亡率最高的传染性疾病。根据世界卫生组织的评估,
    我国是世界上22个结核病高负担国家之一,患者人数仅次于印度,居全球第二位。今年召开
    的第二届全球遏制结核病伙伴论坛大会上,将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的第
    一位。

    喹诺酮类药物是一类人工化学合成抗菌药,由于该类药物均具有4-喹诺酮母核的基本结
    构,故由此命名。氟诺喹酮类在喹诺酮母核的第六6位上引入氟,第7位上引入哌嗪基或吡咯
    啉基的衍生物,为第3代喹诺酮产品。已用于临床抗分枝杆菌的氟喹诺酮类药物有环丙沙星
    (Ciprofloxacin,CIP),氧氟沙星(Ofloxacin,OFL),左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV),斯帕沙
    星(Sparfloxacin,SPX),加替沙星(Gatifloxacin,GAT),莫西沙星(Moxifloxacin,MOX)等。
    随着喹诺酮类抗菌药物在结核分枝杆菌(MTB)感染中使用的增多,结核分枝杆菌对该类抗
    菌药物的耐药率逐渐上升。因此,对氟喹诺酮耐药突变的检测已成为必要。

    目前,临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因检测两类,并以表型检测为主。
    表型检测中的常规药敏试验方法、BACTEC?TB-460液体培养基药敏试验方法以及噬菌体生物
    扩增法已应用于临床,然而这些方法都有明显的局限性。常规药敏试验方法受结核杆菌生长
    缓慢影响,需要6~8周甚至更长时间才能得到结果。BACTEC?TB-460液体培养基药敏试验方
    法虽较灵敏,速度较快,但需昂贵设备,且易受杂菌污染,并有放射性危害。噬菌体生物扩
    增法则受干扰因素多,且操作复杂。由于目前的表型检测难以形成高效准确的检测手段,常
    常造成病情延误,更难以实现追踪治疗。已有的基因型检测方法有DNA测序法(1、Dauendorffer,
    JN,Guillemin?I,Aubry?A?et?al,Identification?of?mycobacterial?species?by?PCR?sequencing?of?
    quinolone?resistance-determining?regions?of?DNA?gyrAse?genes.J?Clin?Microbiol.2003,41:
    1311-1315.),线性杂交法(2、Giannoni?F,Iona?E,Sementilli?F?et?al.Evaluation?of?a?new?line?probe?
    assay?for?rapid?identification?of?gyrA?mutations?in?Mycobacterium?tuberculosis.Antimicrob?Agents?
    Chemother.2005,49:2928-2933.),PCR-SSCP方法(3、Cheng?AF,Yew?WW,Chan?EW?et?al.
    Multiplex?PCR?amplimer?conformation?analysis?for?rapid?detection?of?gyrA?mutations?in?
    fluoroquinolone-resistant?Mycobacterium?tuberculosis?clinical?isolates.Antimicrob?Agents?
    Chemother.2004,48:596-601),DHPLC方法(4、Shi?R,Otomo?K,Yamada?H?et?al.
    Temperature-mediated?heteroduplex?analysis?for?the?detection?of?drug-resistant?gene?mutations?in?
    clinical?isolates?of?Mycobacterium?tuberculosis?by?denaturing?HPLC,SURVEYOR?nuclease.
    Microbes?Infect.2006,8:128-135),生物芯片法(5、Antonova?OV,Gryadunov?DA,Lapa?SA?et?al.
    Detection?of?mutations?in?Mycobacterium?tuberculosis?genome?determining?resistance?to?
    fluoroquinolones?by?hybridization?on?biological?microchips.Bull?Exp?Biol?Med.2008,
    145:108-113),实时PCR方法(6、van?Doorn?H?R,An?DD,de?Jong?MD?et?al.Fluoroquinolone?
    resistance?detection?in?Mycobacterium?tuberculosis?with?locked?nucleic?acid?probe?real-time?PCR.
    Int.J.Tuberc.Lung?Dis.2008,12:736-742)等,德国HAIN公司已有可检测gyrA基因突变的
    GenoType?MTBDRsl试剂盒。

    发明内容

    本发明的目的之一在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的
    检测方法,即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。

    本发明的另一目的在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的
    检测方法的试剂盒。

    所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法包括以下步骤:

    1)提取结核分枝杆菌样本的DNA;

    2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区(QRDR),利用引物设计软件Primer?5设计
    引物和探针;

    在步骤2)中,所述设计引物和探针的具体方法如下:

    a,引物设计在所检测的突变两端,探针覆盖突变位点;

    b,探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor等中的任意一种,
    淬灭基团可选择BHQ或Dabcyl等,探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等。

    所述引物和探针的具体序列为:

    Primer-F:5’-CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3’

    Primer-R:5’-GACCAGGGCTGGGCCATG-3’

    Probe-A:5′-FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3′

    3)构建单管单色实时PCR体系,进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测,比
    较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异,判断样品是否发生突变,样
    品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)时判定为野生型,试验菌株对氟喹诺酮
    敏感;样品的熔点低于阳性对照至少2℃时判定为突变型,试验菌株对氟喹诺酮耐药。

    在步骤3)中,所述单管单色实时PCR体系可为:

    含有1×PCR?buffer(10mM?Tris-HCl,pH8.6,50mM?KCl,5%甘油),2.0mM?MgCl2,dATP、
    dCTP、dGTP各0.2mM,dUTP?0.4mM,2U?Taq,0.01U?UNG,0.8μM?Primer-R,0.08μM?Primer
    -F,0.08μM?Probe-A。

    有经验的人也可选择其它类型的buffer,或者通过优化找到更为合适的buffer类型。

    取结核分枝杆菌样本5μl?DNA作为模板,并取浓度为104copies/μl的阳性质粒作为阳性
    对照,双蒸水做为阴性对照;

    所述PCR的反应程序为:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,65℃20s(每个循环降低1℃),78℃25s,10个循环;

    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环,65℃20s处收集荧光信号;

    第四步:95℃2min;

    第五步:40℃2min;

    第六步:45~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道。

    本发明检测了279个临床样本,包括270份敏感菌株和9份耐药菌株。关于杂合结果的
    判读,分3种情况:①当样本出现双峰时,即为杂合样本;②样本为一个熔合峰,与阳性对
    照的熔点一致,但峰型跟阳性对照的峰型有较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰
    或突起,即为杂合样本;③样本为一个熔合峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或
    突起,即为杂合样本。杂合样本对氟喹诺酮耐药,建议出现杂合样本时将样本重复检测,以
    确定样本耐药性。

    所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂、TB酶
    混合液、FQ阳性对照、TB阴性对照和TB?DNA提取液;扩增试剂、TB酶混合液、FQ阳性
    对照、TB阴性对照和TB?DNA提取液放置在盒体内;

    所述扩增试剂为FQ?PCR?Mix,其成分为1×PCR?buffer(10mM?Tris-HCl,pH8.6,50mM?KCl,
    5%甘油),2.0mM?MgCl2,dATP、dCTP、dGTP各0.2mM,dUTP?0.4mM,0.8μM?Primer-R,
    0.08μM?Primer-F,0.08μM?Probe-A。

    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述FQ阳性对照为FQ野生型标准质粒,TB阴性对照可选自TB?DNA提取液、H2O、
    Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    采用所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒对标本的检验方法包括以
    下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    FQ?PCR?Mix和n×0.4μL?TB酶混合液a加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在-20℃并在4h内使用。

    ②PCR反应液的分装,将PCR反应液以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在250
    μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心15min,
    丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,65℃20s(每个循环降低1℃),78℃25s,10个循环;

    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环;

    第四步:95℃2min;

    第五步:40℃2min;

    第六步:45~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    阳性对照,即野生型的Tm值范围:反应体系中FAM通道野生型对照峰的Tm值为
    71℃±1℃。

    其中Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器时,
    Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)时判定为野生型,试验菌株对
    氟喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突变型,试验菌
    株对氟喹诺酮耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂合样品,分3种情况:
    ①当样品出现双峰时,即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性对照的熔点一致,但峰
    型跟阳性对照的峰型有较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样
    品;③样品为一个融合峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品。
    杂合样品对氟喹诺酮耐药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。

    与现有的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药检测方法相比,本发明具有以下突出的优点:

    1)引物是设计在gyrA基因氟喹诺酮耐药决定区的两端,具有高度的特异性。

    2)探针的设计,充分考虑了主要突变位点的重点检测和其它突变类型的有效覆盖,从而
    达到提高突变检出率的目的。另外,探针可选择多种类型的荧光基团和淬灭基团,并可进行
    各种修饰。

    3)通过对熔点的分析区分野生型和突变类型。野生型完全与探针序列匹配,因此熔点较
    高;突变型不能完全与探针序列匹配,因此熔点较野生型低,单碱基导致的突变会导致熔点
    2~6℃左右的下降。

    本发明大大提高了结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测的灵敏度、特异性,大大缩短了
    检测所需要的时间。

    附图说明

    图1为探针检测结核分枝杆菌单碱基突变的典型结果图。在图1中,横坐标为反应温度,
    纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT)。曲线1,2,3,4,5分别表示:突变94GAC>GCC,
    突变94GAC>GGC,突变90GCG>GTG,野生型,阴性对照。

    图2为本发明所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒实施例结构示意
    图。

    具体实施方式

    以下实施例将结合附图对本发明做进一步说明:

    采用的仪器设备参见表1

    表1

    ??仪器名称(规格)
    ?生产厂商
    ??荧光定量PCR仪(CFX96)
    ?美国Bio-Rad公司
    ??小型台式高速离心机(centrifuge?5415D)
    ?德国Eppendorf公司
    ??普通PCR仪(T3)
    ?德国Biometra公司
    ??超微量分光光度计(Nanodrop?ND-1000)
    ?美国Nanodrop公司

    实施例1结核分枝杆菌DNA的提取

    1)菌株培养

    结核分枝杆菌采用酸性罗氏培养基培养。

    2)DNA提取

    用热裂解法提取结核分枝杆菌基因组DNA,具体过程是:

    A、固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心15min,
    丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    B、封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心管。
    上清即为PCR扩增模板。

    C.样本保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要反复冻融样本。

    实施例2结核分枝杆菌检测引物和探针的设计

    引物和探针的设计:

    根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药相关基因gyrA序列,应用Primer?Premier?5、Tm?Utility
    v1.3和mfold等软件辅助完成。引物和探针序列如下:

    Primer-F:5’-CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3’

    Primer-R:5’-GACCAGGGCTGGGCCATG-3’

    Probe-A:5′-FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3′

    引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。探针定量后避光保存。

    实施例3结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测试剂盒检测氟喹诺酮耐药突变

    用单个反应体系进行单管单色氟喹诺酮耐药突变检测:

    FQ?PCR?MIX每份为19.6μl,每份反应液中含1×PCR?buffer(10mM?Tris-HCl,pH8.6,50mM
    KCl,5%甘油),2.0mM?MgCl2,dATP、dCTP、dGTP各0.2mM,dUTP?0.4mM,0.8μM?Primer-R,
    0.08μM?Primer-F,0.08μM?Probe-A。检测前加入2U酶混合液(0.4μl),待测模板加入量为5μl。

    取浓度为104copies/μl的FQ野生型标准质粒作为阳性对照,TB?DNA提取液做为阴性对
    照。PCR反应程序:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,65℃20s(每个循环降低1℃),78℃25s,10个循环;

    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环,65℃20s处收集荧光信号;

    第四步:95℃2min;

    第五步:40℃2min;

    第六步:45~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道。

    1.探针的分型原理

    分子信标在没有靶序列存在的情况下,保持稳定的发夹状二级结构,荧光基团与淬灭基
    团较为靠近,荧光基团的荧光被淬灭,此时检测不到荧光。当靶序列存在时,探针可与靶序
    列上互补的碱基结合,即发生杂交,荧光基团与淬灭基团由于探针的伸展位置不再靠近,荧
    光基团的荧光无法被淬灭基团淬灭,此时就可以检测到荧光信号。在熔解曲线的检测过程中,
    随着温度的升高,探针与靶序列呈现由完全结合到解离的过程,因此可以通过熔点的差异识
    别探针与靶序列的匹配程度。

    2.结果判读

    反应体系中FAM通道野生型对照峰Tm值为71℃±1℃。

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)时判定为野生型,试验菌株对
    氟喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突变型,试验菌
    株对氟喹诺酮耐药。

    3.采用结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)
    检测279株菌株

    参见图2,所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒实施例设有盒体1、
    扩增试剂2、TB酶混合液3、FQ阳性对照4、TB阴性对照5和TB?DNA提取液6;扩增试
    剂2、TB酶混合液3、FQ阳性对照4、TB阴性对照5和TB?DNA提取液6放置在盒体内;

    所述扩增试剂2为FQ?PCR?Mix,其成分为1×PCR?buffer(10mM?Tris-HCl,pH8.6,50mM
    KCl,5%甘油),2.0mM?MgCl2,dATP、dCTP、dGTP各0.2mM,dUTP?0.4mM,0.8μM?Primer-R,
    0.08μM?Primer-F,0.08μM?Probe-A。

    所述TB酶混合液3包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述FQ阳性对照4为FQ野生型标准质粒,TB阴性对照5可选自TB?DNA提取液、H2O、
    Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液6的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    利用结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)检测279株菌
    株,结果显示,其中270份为氟喹诺酮敏感菌株,9份为氟喹诺酮耐药菌株,和临床药敏结
    果比较,该试剂盒的总准确率达99.28%,灵敏度77.78%,特异性100%。

    采用所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒对标本的检验方法包括以
    下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    FQ?PCR?Mix和n×0.4μL?TB酶混合液a加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在-20℃并在4h内使用。

    ②PCR反应液的分装,将PCR反应液以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在250
    μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心15min,
    丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,65℃20s(每个循环降低1℃),78℃25s,10个循环;

    第三步:95℃10s,55℃20s,78℃25s,40个循环;

    第四步:95℃2min;

    第五步:40℃2min;

    第六步:45~85℃,每1℃收集荧光信号,选用FAM荧光通道。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    阳性对照,即野生型的Tm值范围:反应体系中FAM通道野生型对照峰的Tm值为
    71℃±1℃。

    其中Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器时,
    Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)时判定为野生型,试验菌株对
    氟喹诺酮敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突变型,试验菌
    株对氟喹诺酮耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂合样品,分3种情况:
    ①当样品出现双峰时,即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性对照的熔点一致,但峰
    型跟阳性对照的峰型有较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样
    品;③样品为一个融合峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品。
    杂合样品对氟喹诺酮耐药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。

    由上述结果分析可见,本试剂盒根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药相关基因gyrA序列,设
    计引物扩增该片段,并设计分子信标探针覆盖氟喹诺酮耐药决定区,通过单管单色实时荧光
    PCR7熔解曲线方法实现了对该区域突变的检测。


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