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    重庆时时彩宝宝: 一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒.pdf

    关 键 词:
    一种 结核 分枝杆菌 异烟肼 耐药 突变 检测 方法 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110137792.3

    申请日:

    2011.05.25

    公开号:

    CN102229987A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110525|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12Q1/02; G01N21/64 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 厦门大学; 厦门致善生物科技有限公司
    发明人: 李庆阁; 胡思玉; 权胜卯
    地址: 361005 福建省厦门市思明南路422号
    优先权:
    专利代理机构: 厦门南强之路专利事务所 35200 代理人: 马应森;何加友
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110137792.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.07.16|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术,提供一种低成本、高通量、简便和特异的结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,设计引物和探针:根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列,利用引物设计软件Primer?Premier?5设计引物和探针;提取结核分枝杆菌样本的DNA;建立PCR反应体系;PCR反应结束后,产物通过熔解曲线进行分析,根据熔解峰的熔点和形状的差异,区分野生型和突变型。采用实时PCR熔解曲线法,不仅能够覆盖几乎所有已知的耐药突变类型,而且具有成本低、操作简便、反应快速、通量高等优点。

    权利要求书

    1.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)设计引物和探针:根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列,利用引物
    设计软件Primer?Premier?5设计引物和探针;
    2)提取结核分枝杆菌样本的DNA;
    3)建立PCR反应体系;
    4)结果判定:PCR反应结束后,产物通过熔解曲线进行分析,根据熔解峰的熔点和形状
    的差异,区分野生型和突变型,即完成对结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的检测。
    2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于在步骤
    1)中,所述设计引物和探针的具体方法如下:
    a,引物设计在所检测的突变两端,探针覆盖突变位点;
    b,探针的荧光基团选择通用的探针标记染料,淬灭基团选择通用的探针标记淬灭剂,所
    述探针标记染料为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX、CAL?Fluor系列染料,所
    述探针标记淬灭剂为BHQ1、BHQ2或DABCYL。
    3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于在步骤
    1)中,所述引物和探针的序列为:
    ahpC-F:5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′
    ahpC-F:5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′
    ahpC-R:5′-CCAATGGTTAGCAGTGGCATGACT-3′
    inhA94-F:5′-ATCGGGGCGGGCAACAAG-3′
    inhA94-R:5′-TAGGGCGCGTCGAAGAACGG-3′
    inhA-F:5′-CGGAAATCGCAGCCACGTTAC-3′
    inhA-R:5′-ACGGGATACGAATGGGGGTTTG-3′
    katG-F:5′-GCGGTCACACTTTCGGTAAGAC-3′
    katG-R:5′-CGTACAGGATCTCGAGGAAACTG-3′
    ahpC?P1:5′-FAM-GTCAGGCATATATCACCTTTGCCTGAC-DABCYL-3′
    ahpC?P2:5′-FAM-CGCTGCGGCACGATGGAATGTGCAGCG-DABCYL-3′
    inhA94-P:5′-TET-GGTGCAACCCAATCGAATGCACC-DABCYL-3′
    inhA-P:5′-FAM-CGAGGCCGACAACCTATCGTCTCCCTCG-DABCYL-3′
    katG-P:5′-TET-CCGAGGCACCAGCGGCATCGACCTCGG-DABCYL-3′。
    4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于在步骤
    2)中,所述提取结核分枝杆菌样本的DNA的具体方法采用水煮法、酚氯仿抽提法或磁珠提
    取法。
    5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于在步骤
    3)中,所述建立PCR反应体系的具体方法如下:
    采用一对引物扩增一个反应的单重PCR方式,以单个探针与一对引物对搭配,进行PCR
    反应;或
    采用至少二对引物共同扩增的多重PCR方式,以探针混合搭配,进行PCR反应。
    6.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,其特征在于在步骤
    4)中,所述区分野生型和突变型的具体方法如下:比较样品与野生型对照熔点值的差异,若
    样品与野生型对照在四个检测区的Tm值均一致,则判定为野生型;若样品任一检测区的Tm
    值低于野生型对照至少2℃。
    7.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒,其特征在
    于设有盒体、扩增试剂、对照试剂和提取试剂,扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体
    内;所述扩增试剂包括INH?PCR?Mix?A、INH?PCR?Mix?B和TB酶混合液;所述对照试剂包
    括INH阳性对照和TB阴性对照;所述提取试剂为TB?DNA提取液。
    8.如权利要求7所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒,其特征在
    于所述INH?PCR?Mix?A包括10mM?Tris-HCl,pH8.5,25℃、50mM?KCl、5%甘油、4.5mM?MgCl2、
    200μM?dNTPs/dUTP?mix、引物ahpC-F?021μM、ahpC-R?2μM、inhA94-F?0.1μM、inhA94-R?1μM,
    探针ahpC-P1、ahpC-P2、inhA94-P各0.2μM;
    所述INH?PCR?Mix?B包括50mM?Tris-HCl,pH8.5,25℃、50mM?KCl、3.3%甘油、4.5mM
    MgCl2、160μM?dNTPs/dUTP?mix、引物inhA-F?0.2μM、inhA-R?2μM、katG-F?0.3μM、katG-R?3μM,
    探针inhA-P、katG-P各0.2μM。
    9.如权利要求7所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒,其特征在
    于所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG;所述INH阳性对照为INH野生型质粒;所
    述TB阴性对照为TB?DNA提取液、H2O、Tris或生理盐水;所述TB?DNA提取液的成分为
    乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。
    10.如权利要求7所述的一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒检验标本
    的方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)试剂准备——配液区
    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温,PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    INH?PCR?Mix?A和n×0.4μL?TB酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒;另取n×19.6μL?INH?PCR?Mix?B和n×0.4μL?TB酶混合液加入到另一1.5mL离心
    管中,振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒,配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使
    用;
    ②PCR反应液的分装,PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管;
    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间,贮存在-20℃直至样品提取处理
    完毕;
    2)样品提取及加样——提取区
    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中,液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌;
    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管,上清即为PCR扩增模板;
    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL,立即盖严管盖;
    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区;
    3)PCR扩增——扩增区
    ①仪器的程序设定如下:
    第一步:50℃2min,95℃5min;
    第二步:95℃10s,71℃25s,每个循环降低1℃,75℃30s,10个循环;
    第三步:95℃10s,61℃25s,75℃25s,45个循环;
    第四步:95℃2min,40℃2min;
    第五步:40~80℃,每1℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET;
    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染源处理;
    (3)试剂盒的参考值
    INH阳性对照在各体系及各通道中的Tm值范围如下:
    反应体系A中FAM通道有两个连续峰,分别检测ahpC启动子区,Tm值分别为58℃±1℃
    和69℃±1℃,TET通道检测inhA94密码子,峰Tm值为66℃±1℃;
    反应体系B中FAM通道检测inhA启动子区的-17~-8位点,峰Tm值为64℃±1℃,TET
    通道检测katG315密码子,峰Tm值为68℃±1℃;
    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考,当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照所得的Tm值为准;
    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值;当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,通过调整基线或直接
    人工判读的方法获得Tm值。

    说明书

    一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒

    技术领域

    本发明涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术,尤其涉及一种结核分枝杆菌异烟肼耐药
    突变检测方法及试剂盒,该方法是一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于
    检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变。

    背景技术

    20世纪80年代以来,由于艾滋病和多重耐药结核菌的出现以及流动人口的增加,结核
    病发病率重新上升,逐渐成为全球危害最严重的传染病。根据世界卫生组织2009年的报告,
    目前全球有三分之一的人口即20亿人感染结核分枝杆菌,每年新增病人超过900万,其中
    42万为多药耐药结核,死亡200万。我国是世界上22个结核病高负担国家之一,患病人数
    仅次于印度居全球第二位,而且耐药情况严重,耐药率高达27.8%,给结核病的预防和治疗
    构成严峻挑战。

    药敏实验周期过长(需6~8周时间)成为多药耐药结核(MDR-TB)传播的一个主要原
    因,因此快速诊断对于合理有效地指导临床用药和控制MDR-TB的传播十分必要。由于结核
    菌耐药的产生主要是基因组DNA中抗结核药物作用靶基因突变所致,因此基因检测更为直
    接,近年来也得到较快发展?;蚣觳夥ǖ幕竟涛壤┰瞿鸵┫喙鼗?,然后分析扩增
    产物。

    异烟肼(isoniazid,INH)是1952年开始用于临床的酰肼类化学合成药,是结核病治疗
    的一线核心药物,同时也是结核分枝杆菌隐性感染的首选药物。但是到目前为止,异烟肼作用
    的靶分子、作用机制以及结核分枝杆菌耐异烟肼的机制仍不完全明确。较多文献报道它是一
    种前提药物,在菌体内被katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶激活,作用于细胞壁分枝
    菌酸合成途径中的酶系而干扰分枝菌酸的生物合成,最终导致菌体细胞壁损伤而死亡。异烟肼
    耐药相关突变主要发生在KatG315位点,inhA94位点,inhA启动子区和ahpC启动子区(除-46
    位点)(1.Hazbon,M.H.,et?al.,Population?genetics?study?of?isoniazid?resistance?mutations?and?
    evolution?of?multidrug-resistant?Mycobacterium?tuberculosis.Antimicrob?Agents?Chemother,2006.
    50(8):2640-2649.2.Luo,T.,et?al.,Selection?of?mutations?to?detect?multidrug-resistant?
    Mycobacterium?tuberculosis?strains?in?Shanghai,China.Antimicrob?Agents?Chemother.54(3):
    1075-1081.3.Zhang,M.,et?al.,Detection?of?mutations?associated?with?isoniazid?resistance?in?
    Mycobacterium?tuberculosis?isolates?from?China.J?Clin?Microbiol,2005.43(11):5477-5482.)。
    ahpC启动子区-46G→A为多态性位点,在野生株和突变株均有存在,与耐药突变无关(4、
    Doustdar,F.,et?al.,Molecular?analysis?of?isoniazid?resistance?in?different?genotypes?of?
    Mycobacterium?tuberculosis?isolates?from?Iran.Microb?Drug?Resist,2008.14(4):273-279.)。

    目前,应用较多的结核耐药突变分析技术包括Sanger测序、线性探针反向杂交法和固相
    芯片法等。Sanger测序是突变检测的“金标准”,但是在结核耐药检测上,仅适用于突变热点
    集中的利福平耐药检测,而对于异烟肼耐药位点分散的情况,需要进行多个测序反应,费时
    费力而且花费昂贵(5.Hazbon,M.H.,Recent?advances?in?molecular?methods?for?early?diagnosis?of?
    tuberculosis?and?drug-resistant?tuberculosis.Biomedica,2004.24?Supp?1:149-162.)。

    2008年世界卫生组织推荐使用德国Hain公司的GenoType?MTBDRplus?assay试剂盒来检
    测结核多药耐药(MDR-TB)。它采用线性探针杂交纸条膜技术,在一张试纸条上分别用8条
    野生型和4条突变型探针覆盖利福平rpoB核心区及其常见突变,用3条野生型和6条突变型
    探针分别覆盖异烟肼耐药katG315位点和inhA启动子区基因及其常见突变。GenoType?
    MTBDRplus检测临床分离株和抗酸染色阳性标本有更高的灵敏度和特异性(6.Ling,D.I.,
    A.A.Zwerling,and?M?Pai,GenoType?MTBDR?assays?for?the?diagnosis?of?multidrug-resistant?
    tuberculosis:a?meta-analysis.Eur?Respir?J,2008.32(5):1165-1174.)。博奥结核分枝杆菌耐药基
    因检测试剂盒采用DNA微阵列芯片法,能够筛查利福平耐药rpoB核心区13种突变,以及
    异烟肼耐药katG315位点和inhA启动子区4种突变。

    上述两种试剂盒的共同特点是均采用固相杂交模式对PCR产物进行检测,需通过显色反
    应步骤或者荧光信号来判读结果。整个过程操作步骤多,时间长,易引起PCR产物对后续扩
    增的污染。尤其是,这两种试剂盒都通过终点信号判读结果,无论人工判读还是机器自动判
    读,都会因为标本中经常出现的不均一杂交信号而产生所谓的“灰区”,导致结果无法判读。
    另外,当突变基因或位点成为试剂盒不覆盖的类型时,在结果中由于仅出现野生信号,而造
    成误判。

    针对结核耐药位点分散、突变类型复杂等特点,近年来还出现了高通量筛查技术应用于
    结核耐药突变分析的报道,如液相芯片(QIAplex多重扩增联合Luminex?xMAP平台检测(
    7.Gegia,M.,et?al.,Prevalence?of?and?Molecular?Basis?for?Tuberculosis?Drug?Resistance?in?the?
    Republic?of?Georgia:Validation?of?a?QIAplex?System?for?Detection?of?Drug?Resistance-Related?
    Mutations.Antimicrob?Agents?Chemother,2008.52(2):725-729.])、MLPA(8.Bergval,I.L.,et?al.,
    Development?of?multiplex?assay?for?rapid?characterization?of?Mycobacterium?tuberculosis.J?Clin?
    Microbiol,2008.46(2):689-699.)、焦磷酸测序(9.Jureen,P.,et?al.,Rapid?detection?of?rifampin?
    resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis?by?Pyrosequencing?technology.J?Clin?Microbiol,2006.
    44(6):1925-1929.)等。这些方法检出率和成本高低不同,但均需要昂贵的专用设备,对实验
    室条件和操作人员要求高,特别是由于需要复杂的PCR后处理步骤,大大增加了产物污染的
    几率。

    建立在完全闭管操作上的实时PCR技术近年来发展迅速,以其简便快捷,成本低廉等显
    著优势,在临床上广泛应用。近年来发展的高分辨熔解曲线技术(High?Resolution?Melting,
    HRM)在结核利福平和异烟肼耐药突变分析上已有报道(10.Pietzka,A.T.,et?al.,Rapid?
    identification?of?multidrug-resistant?Mycobacterium?tuberculosis?isolates?by?rpoB?gene?scanning?
    using?high-resolution?melting?curve?PCR?analysis.J?Antimicrob?Chemother,2009.63(6):
    1121-1127.11.Ong,D.C.,et?al.,Rapid?detection?of?rifampicin-and?isoniazid-resistant?
    Mycobacterium?tuberculosis?by?high-resolution?melting?analysis.J?Clin?Microbiol.48(4):
    1047-1054.)。然而,HRM技术使用非特异的嵌合染料,难以区分PCR特异和非特异扩增产物。
    尤其是扩增结核基因组时,受其平均GC含量高达67%的影响,非特异扩增难以避免,HRM技
    术的突变区分能力会受到一定影响。而且为了提高杂合子检出率,还需将标本和参考品基因
    组DNA或PCR产物混合,再进行扩增熔解分析,这也增加了操作复杂性。另外,HRM分型对
    DNA模板纯度和样品间DNA浓度均一性要求也很高。这些都限制了HRM技术在结核耐药突变
    筛查上的临床应用。

    发明内容

    本发明的目的之一在于针对现有技术中存在的上述问题,提供一种低成本、高通量、简
    便和特异的结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法,即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔
    解曲线分析技术的方法。

    本发明的另一目的在于提供一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒。

    所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法包括以下步骤:

    1)设计引物和探针:根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列(登录号:
    NC_000962),利用引物设计软件Primer?Premier?5设计引物和探针;

    2)提取结核分枝杆菌样本的DNA;

    3)建立PCR反应体系;

    4)结果判定:PCR反应结束后,产物通过熔解曲线进行分析,根据熔解峰的熔点和形状
    的差异,区分野生型和突变型,即完成对结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的检测。

    在步骤1)中,所述设计引物和探针的具体方法如下:

    a,引物设计在所检测的突变两端,探针覆盖突变位点;

    b,探针的荧光基团可选择通用的探针标记染料,淬灭基团可选择通用的探针标记淬灭剂,
    所述探针标记染料可为FAM、ROX、HEX、CY5、CY3、TET、ALEX、CAL?Fluor等系列染
    料,所述探针标记淬灭剂可为BHQ1、BHQ2或DABCYL等;

    所述引物和探针的序列可为:

    ahpC-F:5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′

    ahpC-F:5′-CGGCCGGCTAGCACCTCT-3′

    ahpC-R:5′-CCAATGGTTAGCAGTGGCATGACT-3′

    inhA94-F:5′-ATCGGGGCGGGCAACAAG-3′

    inhA94-R:5′-TAGGGCGCGTCGAAGAACGG-3′

    inhA-F:5′-CGGAAATCGCAGCCACGTTAC-3′

    inhA-R:5′-ACGGGATACGAATGGGGGTTTG-3′

    katG-F:5′-GCGGTCACACTTTCGGTAAGAC-3′

    katG-R:5′-CGTACAGGATCTCGAGGAAACTG-3′

    ahpC?P1:5′-FAM-GTCAGGCATATATCACCTTTGCCTGAC-DABCYL-3′

    ahpC?P2:5′-FAM-CGCTGCGGCACGATGGAATGTGCAGCG-DABCYL-3′

    inhA94-P:5′-TET-GGTGCAACCCAATCGAATGCACC-DABCYL-3′

    inhA-P:5′-FAM-CGAGGCCGACAACCTATCGTCTCCCTCG-DABCYL-3′

    katG-P:5′-TET-CCGAGGCACCAGCGGCATCGACCTCGG-DABCYL-3′。

    在步骤2)中,所述提取结核分枝杆菌样本的DNA的具体方法可采用水煮法、酚氯仿抽
    提法或磁珠提取法等。

    在步骤3)中,所述建立PCR反应体系的具体方法如下:

    采用一对引物扩增一个反应的单重PCR方式,以单个探针与一对引物对搭配,进行PCR
    反应;或

    采用至少二对引物共同扩增的多重PCR方式,以探针混合搭配,进行PCR反应;

    在步骤4)中,所述区分野生型和突变型的具体方法如下:比较样品与野生型对照熔点
    (Tm)值的差异,若样品与野生型对照在四个检测区的Tm值均一致(野生型对照Tm值
    ±1℃),则判定为野生型;若样品任一检测区的Tm值低于野生型对照至少2℃。

    所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂、对照试剂和
    提取试剂,扩增试剂、对照试剂和提取试剂放置在盒体内;所述扩增试剂包括INH?PCR?Mix?A、
    INH?PCR?Mix?B和TB酶混合液;所述对照试剂包括INH阳性对照和TB阴性对照;所述提
    取试剂为TB?DNA提取液;

    所述INH?PCR?Mix?A包括10mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mM?KCl、5%甘油、4.5mM
    MgCl2、200μM?dNTPs/dUTP?mix、引物ahpC-F?0.21μM、ahpC-R?2μM、inhA94-F?0.1μM、
    inhA94-R?1μM,探针ahpC-P1、ahpC-P2、inhA94-P各0.2μM。

    所述INH?PCR?Mix?B包括50mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mM?KCl、3.3%甘油、4.5mM
    MgCl2、160μM?dNTPs/dUTP?mix、引物inhA-F?0.2μM、inhA-R?2μM、katG-F?0.3μM、katG-R?3μM,
    探针inhA-P、katG-P各0.2μM。

    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述INH阳性对照为INH野生型质粒。

    所述TB阴性对照可为TB?DNA提取液、H2O、Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    INH?PCR?Mix?A和n×0.4μL?TB酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒;另取n×19.6μL?INH?PCR?Mix?B和n×0.4μL?TB酶混合液加入到另一1.5mL离心
    管中,振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使
    用。

    ②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理
    完毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃5min;

    第二步:95℃10s,71℃25s(每个循环降低1℃),75℃30s,10个循环;

    第三步:95℃10s,61℃25s,75℃25s,45个循环;

    第四步:95℃2min,40℃2min;

    第五步:40~80℃,每1℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    INH阳性对照在各体系及各通道中的Tm值范围如下:

    反应体系A中FAM通道有两个连续峰,分别检测ahpC启动子区(-44~-30以及-15~3
    位点),Tm值分别为58℃±1℃和69℃±1℃。TET通道检测inhA94密码子,峰Tm值为66℃±1℃。

    反应体系B中FAM通道检测inhA启动子区(-17~-8)位点,峰Tm值为64℃±1℃。TET
    通道检测katG315密码子,峰Tm值为68℃±1℃。

    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生
    型,试验菌株对异烟肼敏感;四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时
    (ΔTm≥2℃)判定为突变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    INH反应体系AFAM通道,有些类型的突变会引起该通道两个峰融合成一个峰,此时判
    定为突变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    若出现INH反应体系B?TET通道无信号的情况,则表明katG基因缺失,此时判定为突
    变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂
    合样品,分3种情况:①当样品出现双峰时(反应体系A?FAM通道出现两个以上的峰时),
    即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性对照的熔点一致,但峰型与阳性对照的峰型有
    较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品;③样品为一个融合
    峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品。杂合样品对异烟肼耐
    药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。

    本发明首先利用PCR扩增产生大量靶序列,靶序列与探针杂交,杂交产物具有特定的熔
    点,而含有突变的靶序列与探针的杂交产物熔点较低。根据熔点变化,判断靶序列有无发生
    突变。熔解曲线分析技术属于均相检测,探针预先置于管内,PCR扩增步骤与熔解分析步骤
    可以用单一程序完成。就异烟肼耐药突变检测而言,在完成熔解分析步骤后,通过比较样品
    与野生型对照熔点(Tm)值的差异,若样品与野生型对照在四个检测区的Tm值均一致(野
    生型对照Tm值±1℃),则判定为野生型;若样品任一检测区的Tm值低于野生型对照2℃以
    上,则判定为突变型,突变型的存在则指示耐药菌的存在。本发明采用实时PCR熔解曲线法,
    不仅能够覆盖几乎所有已知的耐药突变类型,而且具有成本低、操作简便、反应快速、通量
    高等优点。

    附图说明

    图1为ahpC启动子区典型检测结果图。在图1中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度与
    温度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为-30C→T,曲线3为-10C→T,曲线4为阴性
    对照。

    图2为inhA94位点典型检测结果图。在图2中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度与温度
    的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为S94A?GCG,曲线3为阴性对照。

    图3为inhA启动子区典型检测结果图。在图3中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度与温
    度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为-15C→T,曲线3为-8T→C,曲线4为阴性对
    照。

    图4为katG315位点典型检测结果图。在图4中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度与温度
    的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为S315T?ACC,曲线3为S315T?ACG,曲线4为阴
    性对照。

    图5为inhA启动子区-15C→Y?1℃熔解时不均一耐药结果图。在图5中,横坐标为温度,纵
    坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为inhA启动子区-15C→Y。

    图6为inhA启动子区-15C→Y?0.5℃熔解时不均一耐药结果图。在图6中,横坐标为温度,
    纵坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为inhA启动子区-15C→Y。

    图7为katG315AGC→ASC?1℃熔解时不均一耐药结果图。在图7中,横坐标为温度,纵坐
    标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为katG315AGC→ASC。

    图8为katG315AGC→ASC?0.5℃熔解时不均一耐药结果图。在图8中,横坐标为温度,纵
    坐标为荧光强度与温度的负导数(-dF/dT),曲线1为野生型,曲线2为katG315AGC→ASC。

    图9为inhA启动子区-15C→Y不均一耐药型标本的测序结果图。AGATGATA为碱基,测序
    图均有明显的野生和耐药突变杂合双峰。

    图10为katG315AGC→ASC不均一耐药型标本的测序结果图。ACCACCGG为碱基,测序
    图均有明显的野生和耐药突变杂合双峰。

    图11为本发明所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒实施例的结构示意
    图。

    具体实施方式

    本发明设计了4对特异性的结核分枝杆菌异烟肼耐药基因扩增引物,进行两个两重实时
    PCR反应,扩增相应的4个结核异烟肼耐药相关基因检测区域,即ahpC启动子区(-44~-30
    以及-15~3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17~-8)位点和katG315位点。然后采
    用熔解曲线技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变情况。

    实施例1

    引物和探针的制备:

    根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列(登录号:NC_000962)设计并合
    成表1中引物和探针。用于检测ahpC启动子区(-44~-30以及-15~3位点)、inhA94
    密码子、inhA启动子区(-17~-8)位点、katG315密码子,确定对异烟肼的耐药性。

    引物和探针设计采用Clustal?X(1.8)、Primer?Premier5.0、Oligo6.0和Tm?Utility?v1.3等
    设计软件辅助完成。探针5′端标记一种荧光基团(FAM或TET),3′端标记焠灭基团
    DABCYL。由于ahpC启动子区较长,一条探针无法有效覆盖,所以采用两条探针覆盖的方
    案。设计好的引物和探针均通过BLAST进行同源性比对以保证其特异性。引物和探针由上
    海生工生物工程有限公司合成。结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测体系引物和探针的具体序
    列参见表1。

    表1


    实施例2

    结核分枝杆菌样本的提?。?br />

    痰标本提取方法:加痰标本1~3倍体积的1M?NaOH,液化标本15min。NaOH加量视
    痰标本粘稠度,粘稠度低的加1~2倍,高的加2~3倍体积,以液化完全为标准。

    吸出1mL液化后标本置1.5mL离心管,13500rpm离心10min,去上清。加800μl?TE洗
    涤液(10mM?Tris-Cl?8.5,0.5mM?EDTA),13000rpm离心10min,去上清。

    加300μl裂解液(10mM?Tris-Cl?8.0,0.1%mM?EDTA,1%TX-100),封口膜封口。99℃加
    热20min。13500rpm离心10min,转移上清到1.5mL离心管。上清即为PCR扩增模板,保
    存于-20℃。

    固体培养标本提取方法:用接种环收集适量2~3周菌龄的结核分枝杆菌菌落并悬在
    300μl裂解液(10mM?Tris-Cl?8.0,0.1%mM?EDTA,1%TX-100)中,封口膜封口。99℃加热
    20min。13500rpm离心10min,转移上清到1.5mL离心管。上清即为PCR扩增模板,保存
    于-20℃。

    液体培养标本提取方法:直接吸取1毫升菌液,13500rpm离心15min,去上清,加300μl
    裂解液(10mM?Tris-Cl?8.0,0.1%mM?EDTA,1%TX-100),封口膜封口。99℃加热20min。
    13500rpm离心10min,转移上清到1.5mL离心管。上清即为PCR扩增模板,保存于-20℃。

    实施例3

    结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测反应液(INH?PCR?MIX)的制备:

    检测分两个反应体系进行双重双色检测:

    INHPCRMIXA每份为19.6μl,每份反应液中含10mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mM
    KCl、3.3%甘油、4.5mM?MgCl2、200μM?dNTPs/dUTP?mix、引物ahpC-F?0.21μM、ahpC-R?2μM、
    inhA94-F?0.1μM、inhA94-R?1μM,探针ahpC-P1、ahpC-P2、inhA94-P各0.2μM。检测前加入
    2U酶混合液(0.4μl),待测模板加入量为5μl。

    INH?PCR?MIX?B每份为19.6μl,每份反应液2中含10mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mM
    KCl、3.3%甘油、4.5mM?MgCl2、160μM?dNTPs/dUTPmix、引物inhA-F?0.2μM、inhA-R2μM、
    katG-F?0.3μM、katG-R?3μM,探针为inhA-P、katG-P各0.2μM。检测前加入2U酶混合液(0.4μl),
    待测模板加入量为5μl。

    反应条件:在Bio-rad?CFX96实时荧光PCR仪上进行PCR,PCR反应程序为:

    95℃5min;95℃10s,71℃25s(每个循环降1℃),75℃30s(10次循环);95℃10s,
    61℃25s,75℃25s(45个循环);95℃2min,40℃2min,40℃-80℃熔解分析,检测FAM
    和TET通道荧光。

    结果判定:

    1)体系A中FAM通道有两个峰,分别检测ahpC启动子区(-44~-30以及-15~3
    位点),野生型对照峰Tm值分别为58±1℃和69±1℃。TET通道检测inhA94密码子,野生型
    对照峰Tm值为66±1℃。

    2)体系B中FAM通道检测inhA启动子区(-17~-8)位点,野生型对照峰Tm值为64±1℃。
    TET通道检测katG315密码子,野生型对照峰Tm值为68±1℃。

    3)体系A和体系B中,野生型对照FAM和TET通道必须都有熔解曲线峰,且峰Tm
    值在上述范围。否则实验结果视为无效。

    4)检测样品所产生的熔解曲线和野生型对照所产生的熔解曲线峰值一致(Tm值±1℃)
    时则判定为野生型。除体系A?FAM通道外,如果检测样品所产生的熔解峰低于野生型对照
    Tm值2℃及以上,则判断为耐药型。

    5)在体系A?FAM通道中,如果检测样品所产生的熔解曲线和野生型对照一致(两
    个峰均为Tm值±1℃),则判断为野生型。如果检测样品所产生的峰型和Tm不能与野生型完
    全一致,则判断为突变型。

    6)除体系A?FAM通道外,如果检测样品产生的熔解曲线出现两个峰,一个与野生型
    一致(Tm值±1℃),一个低于野生型对照Tm值2℃及以上,则判断为不均一耐药型。

    7)体系A?FAM通道中,如果检测样品产生的熔解峰大于两个,除了两个与野生型一致
    (Tm值±1℃)的峰,还有低于野生型对照Tm值2℃及以上的峰,则判断为不均一耐药型。

    某些突变类型的不均一耐药型可能出现野生峰和突变峰融合成一个异??矸?。对于不容易
    判断是否为不均一耐药型的样品,建议用0.5度变温速率再做一次熔解曲线,以使杂合双峰
    明显。

    运用本发明所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)对
    1096株结核分枝杆菌临床标本进行异烟肼耐药突变筛查。和临床药敏结果比较,本发明的临
    床灵敏度可达90.2%,临床特异性可达96.4%,阳性预测率为94.3%,阴性预测率为93.7%,
    总准确度为93.9%。本发明检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变体系四个通道典型标本检测结
    果见图1~4。野生型对照为野生型标准质粒,阴性对照为TB?DNA提取液。结果显示通过比
    较熔解峰的Tm值和峰形能够区别野生型(野生型对照Tm值±1℃)和突变型(低于野生型
    对照Tm值至少2℃),检出耐药标本。

    不均一耐药菌株可采用1℃/step的熔解速率,部分菌株可以用0.5℃/step进行熔解以使不
    均一耐药菌株中的突变峰形更明显,结果见图5~8。野生型对照为野生型标准质粒,阴性对
    照为TB?DNA提取液。熔解速率为1℃/step时,inhA启动子区-15C→Y和katG315?AGC→ASC
    不均一耐药株出现不同于野生型标准质粒的宽峰。熔解速率为0.5℃/step时,不均一耐药株峰
    形变化更加明显,出现熔点低于野生型的肩峰。这种肩峰是由标本扩增产物中存在的少量突
    变型模板所形成。结果显示通过比较峰Tm值和峰形能够区别野生型和不均一耐药突变型,
    检出部分不均一耐药型标本。图9为inhA启动子区-15C→Y不均一耐药型标本的测序结果图,
    测序图均有明显的野生和耐药突变杂合双峰。图10katG315AGC→ASC不均一耐药型标本的
    测序结果图,测序图均有明显的野生和耐药突变杂合双峰。

    图11给出所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒实施例的结构示意图,设
    有盒体1、扩增试剂(包括INH?PCR?Mix?A2、INH?PCR?Mix?B3和TB酶混合液4)、对照试
    剂(包括INH阳性对照7和TB阴性对照6)和提取试剂(TB?DNA提取液5),扩增试剂、
    对照试剂和提取试剂放置在盒体内。

    所述INH?PCR?Mix?A包括10mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mMKCl、5%甘油、4.5mM
    MgCl2、200μM?dNTPs/dUTP?mix、引物ahpC-F?0.21μM、ahpC-R?2μM、inhA94-F?0.1μM、
    inhA94-R?1μM,探针ahpC-P1、ahpC-P2、inhA94-P各0.2μM。

    所述INH?PCR?Mix?B包括50mM?Tris-HCl(pH8.5,25℃)、50mM?KCl、3.3%甘油、4.5mM
    MgCl2、160μM?dNTPs/dUTP?mix、引物inhA-F?0.2μM、inhA-R?2μM、katG-F?0.3μM、katG-R?3μM,
    探针inhA-P、katG-P各0.2μM。

    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述INH阳性对照为INH野生型质粒。

    所述TB阴性对照可为TB?DNA提取液、H2O、Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    所述结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    INH?PCR?Mix?A和n×0.4μL?TB酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm
    离心数秒;另取n×19.6μL?INH?PCR?Mix?B和n×0.4μL?TB酶混合液加入到另一1.5mL离心
    管中,振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使
    用。

    ②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理
    完毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃5min;

    第二步:95℃10s,71℃25s(每个循环降低1℃),75℃30s,10个循环;

    第三步:95℃10s,61℃25s,75℃25s,45个循环;

    第四步:95℃2min,40℃2min;

    第五步:40~80℃,每1℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    INH阳性对照在各体系及各通道中的Tm值范围如下:

    反应体系A中FAM通道有两个连续峰,分别检测ahpC启动子区(-44~-30以及-15~3
    位点),Tm值分别为58℃±1℃和69℃±1℃。TET通道检测inhA94密码子,峰Tm值为66℃±1℃。

    反应体系B中FAM通道检测inhA启动子区(-17~-8)位点,峰Tm值为64℃±1℃。TET
    通道检测katG315密码子,峰Tm值为68℃±1℃。

    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生
    型,试验菌株对异烟肼敏感;四个通道任一通道中样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时
    (ΔTm≥2℃)判定为突变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    INH反应体系AFAM通道,有些类型的突变会引起该通道两个峰融合成一个峰,此时判
    定为突变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    若出现INH反应体系B?TET通道无信号的情况,则表明katG基因缺失,此时判定为突
    变型,试验菌株对异烟肼耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂
    合样品,分3种情况:①当样品出现双峰时(反应体系A?FAM通道出现两个以上的峰时),
    即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性对照的熔点一致,但峰型与阳性对照的峰型有
    较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品;③样品为一个融合
    峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品。杂合样品对异烟肼耐
    药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。





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    本文标题:一种结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测方法及试剂盒.pdf
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