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    重庆时时彩大底验证工具: 用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒.pdf

    关 键 词:
    用于 检测 鱼类 免疫 因子 水平 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110144765.9

    申请日:

    2011.05.31

    公开号:

    CN102229995A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110531授权公告日:20130320终止日期:20140531|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110531|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; G01N21/64 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 中国农业科学院饲料研究所
    发明人: 周志刚; 曹雅男; 毛玮; 姚斌; 何夙旭; 徐俐; 孟昆; 杨培龙
    地址: 100081 北京市海淀区中关村南大街12号
    优先权:
    专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 关畅
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110144765.9

    授权公告号:

    |||102229995B||||||

    法律状态公告日:

    2015.07.22|||2013.03.20|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒。本发明的用于检测鱼中免疫因子的引物组合物,由如下引物对组成:用于扩增TNF-α的引物对1:SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引物;用于扩增IL-1β的引物对2:SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;用于扩增HSP70的引物对3:SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物;用于扩增TGF-β的引物对3:SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物。本发明的用于实时定量PCR检测鱼类免疫因子体系的引物,具有特异性好、无干扰背景的特点。本发明中的鱼类饲料组合物可以提高鱼的免疫因子的表达量。因此,本发明在提高鱼的免疫能力及检测鱼的免疫系统领域具有广阔的应用前景。

    权利要求书

    1.一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:
    用于扩增TNF-α的引物对1:SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引
    物;
    用于扩增IL-1β的引物对2:SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;
    用于扩增HSP70的引物对3:SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引
    物;
    用于扩增TGF-β的引物对4:SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引
    物。
    2.一种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至4
    组成,每种试剂均独立包装;
    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;
    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同。
    3.根据权利要求1所述的试剂盒或权利要求2所述的实时荧光定量PCR试剂,
    其特征在于:所述免疫因子为鱼的免疫因子,具体为罗非鱼的免疫因子;
    所述免疫因子为TNF-α、IL-1β、HSP70和TGF-β。
    4.一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:
    用于扩增TNF-α的引物对1,为如下1)和/或2):
    1)SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引物;
    用于扩增IL-1β的引物对2,为如下1)和/或2):
    1):SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;
    2):SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物;
    用于扩增HSP70的引物对3,为如下1)和/或2)所示:
    1)SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引物;
    用于扩增TGF-β的引物对4,为如下1)和/或2)所示:
    1)SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引物;
    用于扩增IL-10的引物对5,SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物。
    5.一种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至9
    组成,每种试剂均独立包装;
    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;
    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂5组成:除引物为SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂6组成:除引物为SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂7组成:除引物为SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂8组成:除引物为SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂9组成:除引物为SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同。
    6.根据权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的实时荧光定量PCR试剂,
    其特征在于:所述免疫因子为鱼的免疫因子,具体为罗非鱼的免疫因子或锦鲤的免疫
    因子的免疫因子;
    所述免疫因子为TNF-α、IL-1β、HSP70、TGF-β和IL-10。
    7.一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:
    用于扩增TNF-α的引物对1,为如下1)、2)和3)中的至少一种:
    1)SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引物;
    3)SEQ?ID?NO:19所示引物和SEQ?ID?NO:20所示引物;
    用于扩增IL-1β的引物对2,为如下1)、2)和3)中的至少一种:
    1):SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;
    2):SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物;
    3):SEQ?ID?NO:21所示引物和SEQ?ID?NO:22所示引物;
    用于扩增HSP70的引物对3,为如下1)和/或2)所示:
    1)SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引物;
    用于扩增TGF-β的引物对4,为如下1)和/或2)所示:
    1)SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引物;
    用于扩增IL-10的引物对5,为如下1)和/或2)所示:
    1)SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引物;
    2)SEQ?ID?NO:27所示引物和SEQ?ID?NO:28所示引物;
    用于扩增IFNγ的引物对6,SEQ?ID?NO:23所示引物和SEQ?ID?NO:24所示引
    物;
    用于扩增iNOS2a的引物对7,SEQ?ID?NO:25所示引物和SEQ?ID?NO:26所示
    引物;
    用于扩增TLR5b的引物对8,SEQ?ID?NO:29所示引物和SEQ?ID?NO:30所示
    引物。
    8.一种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至15
    组成,每种试剂均独立包装;
    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;
    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂5组成:除引物为SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂6组成:除引物为SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂7组成:除引物为SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂8组成:除引物为SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂9组成:除引物为SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂10组成:除引物为SEQ?ID?NO:19所示引物和SEQ?ID?NO:20所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂11组成:除引物为SEQ?ID?NO:21所示引物和SEQ?ID?NO:22所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂12组成:除引物为SEQ?ID?NO:23所示引物和SEQ?ID?NO:24所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂13组成:除引物为SEQ?ID?NO:25所示引物和SEQ?ID?NO:26所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂14组成:除引物为SEQ?ID?NO:27所示引物和SEQ?ID?NO:28所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;
    PCR试剂15组成:除引物为SEQ?ID?NO:29所示引物和SEQ?ID?NO:30所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同。
    9.根据权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的实时荧光定量PCR试剂,
    其特征在于:
    所述免疫因子为鱼的免疫因子,具体为罗非鱼的免疫因子、锦鲤的免疫因子或斑
    马鱼的免疫因子;
    所述免疫因子选自TNF-α、IL-1β、HSP70、TGF-β、IL-10、IFNγ、iNOS2a和TLR5b。
    10.一种检测鱼免疫因子表达量的方法,包括如下步骤:以鱼的基因组mRNA的
    反转录cDNA为模板,分别用权利要求2-9中任一所述PCR试剂中的各个试剂进行实时
    荧光定量PCR;所述实时荧光定量PCR的反应程序为:95℃?3min;95℃?20sec,55℃
    20sec,72℃?20sec?40个循环,72℃收集荧光信号。

    说明书

    用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒

    技术领域

    本发明涉及用于检测鱼类免疫因子水平的试剂盒。

    背景技术

    细胞因子(cytokine)是由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子
    量的可溶性蛋白质,包括淋巴因子、干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋势化因子和
    集落刺激因子等。细胞因子是免疫系统细胞间,以及免疫系统细胞与其他类型细胞间
    联络的核心,能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质,通过与细胞特异的膜受
    体而起作用。

    鱼类通过免疫系统抵抗外界病原微生物的侵害,实现自身的免疫?;?。与高等脊
    椎动物一样,鱼类免疫系统中也存在许多细胞因子,它们行使非特异性和特异性免疫
    防御,在维持机体内环境的稳定方面发挥重要作用。目前在鱼类中发现多种细胞因子
    的存在,并且利用分子生物学技术,已经克隆到部分细胞因子的基因。

    实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质基团,通过荧光定
    量PCR仪实时、自动监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累,检测PCR扩增产物
    及对未知模板进行定量分析的方法。在整个PCR实验中,所有反应均在同一体系中进
    行,而且不需要任何后处理过程。荧光信号的产生和检测与PCR扩增过程密切相关,
    被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关,可以通过测量每次循环产生的荧光信号
    强度,并参照对照基因的标准曲线来定量。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、实时检
    测、污染少、操作简单方便、安全等优点,已被广泛应用于基因表达量的研究中。

    实时荧光定量PCR分标准曲线定量(绝对定量)和采用内标物作参照(相对定量)。
    标准曲线定量是采用已知物的标准曲线(5倍、10倍等系列稀释)用来定量未知目的物。
    相对定量的方法用目的基因与对照基因进行样品间的比较。通过目的基因的Ct减去对
    照基因Ct获得相对于对照基因的定量数据,循环数差别是基数2的指数,表示这两个
    基因的倍数差别。

    发明内容

    本发明的一个目的是提供三种用于检测免疫因子表达量的试剂盒及三种用于检
    测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂。

    第一种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:

    用于扩增TNF-α的引物对1:SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引
    物;

    用于扩增IL-1β的引物对2:SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;

    用于扩增HSP70的引物对3:SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引
    物;

    用于扩增TGF-β的引物对4:SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引
    物。

    上述第一种试剂盒中,所述免疫因子为鱼的免疫因子,具体为罗非鱼的免疫因子;

    所述免疫因子为TNF-α、IL-1β、HSP70和TGF-β。

    第一种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至4组
    成,每种试剂均独立包装;

    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;

    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同。

    上述第一种实时荧光定量PCR试剂,所述免疫因子为鱼的免疫因子,具体为罗非
    鱼的免疫因子;所述免疫因子为TNF-α、IL-1β、HSP70和TGF-β。

    第二种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:

    用于扩增TNF-α的引物对1,为如下1)和/或2):

    1)SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引物;

    用于扩增IL-1β的引物对2,为如下1)和/或2):

    1):SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;

    2):SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物;

    用于扩增HSP70的引物对3,为如下1)和/或2)所示:

    1)SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引物;

    用于扩增TGF-β的引物对4,为如下1)和/或2)所示:

    1)SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引物;

    用于扩增IL-10的引物对5,SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物。

    第二种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至9组
    成,每种试剂均独立包装;

    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;

    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂5组成:除引物为SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂6组成:除引物为SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂7组成:除引物为SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂8组成:除引物为SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂9组成:除引物为SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同。

    上述第二种试剂盒或第二种实时荧光定量PCR试剂,所述免疫因子为鱼的免疫因
    子,具体为罗非鱼的免疫因子或锦鲤的免疫因子的免疫因子;

    所述免疫因子为TNF-α、IL-1β、HSP70、TGF-β和IL-10。

    第三种用于检测免疫因子表达量的试剂盒,由如下引物对组成:

    用于扩增TNF-α的引物对1,为如下1)、2)和3)中的至少一种:

    1)SEQ?ID?NO:1所示引物和SEQ?ID?NO:2所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引物;

    3)SEQ?ID?NO:19所示引物和SEQ?ID?NO:20所示引物;

    用于扩增IL-1β的引物对2,为如下1)、2)和3)中的至少一种:

    1):SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物;

    2):SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物;

    3):SEQ?ID?NO:21所示引物和SEQ?ID?NO:22所示引物;

    用于扩增HSP70的引物对3,为如下1)和/或2)所示:

    1)SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引物;

    用于扩增TGF-β的引物对4,为如下1)和/或2)所示:

    1)SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引物;

    用于扩增IL-10的引物对5,为如下1)和/或2)所示:

    1)SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引物;

    2)SEQ?ID?NO:27所示引物和SEQ?ID?NO:28所示引物;

    用于扩增IFNγ的引物对6,SEQ?ID?NO:23所示引物和SEQ?ID?NO:24所示引
    物;

    用于扩增iNOS2a的引物对7,SEQ?ID?NO:25所示引物和SEQ?ID?NO:26所示
    引物;

    用于扩增TLR5b的引物对8,SEQ?ID?NO:29所示引物和SEQ?ID?NO:30所示
    引物。

    第三种用于检测免疫因子表达量的实时荧光定量PCR试剂,由如下试剂1至15
    组成,每种试剂均独立包装;

    PCR试剂1组成:每18ul?PCR试剂1由1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:1所
    示引物溶液、1μL浓度为4μM的SEQ?ID?NO:2所示引物溶液、10μL实时荧光定
    量PCR缓冲液组成和6μL?ddH2O组成;

    PCR试剂2组成:除引物为SEQ?ID?NO:3所示引物和SEQ?ID?NO:4所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂3组成:除引物为SEQ?ID?NO:5所示引物和SEQ?ID?NO:6所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂4组成:除引物为SEQ?ID?NO:7所示引物和SEQ?ID?NO:8所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂5组成:除引物为SEQ?ID?NO:9所示引物和SEQ?ID?NO:10所示引物
    外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂6组成:除引物为SEQ?ID?NO:11所示引物和SEQ?ID?NO:12所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂7组成:除引物为SEQ?ID?NO:13所示引物和SEQ?ID?NO:14所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂8组成:除引物为SEQ?ID?NO:15所示引物和SEQ?ID?NO:16所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂9组成:除引物为SEQ?ID?NO:17所示引物和SEQ?ID?NO:18所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂10组成:除引物为SEQ?ID?NO:19所示引物和SEQ?ID?NO:20所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂11组成:除引物为SEQ?ID?NO:21所示引物和SEQ?ID?NO:22所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂12组成:除引物为SEQ?ID?NO:23所示引物和SEQ?ID?NO:24所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂13组成:除引物为SEQ?ID?NO:25所示引物和SEQ?ID?NO:26所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂14组成:除引物为SEQ?ID?NO:27所示引物和SEQ?ID?NO:28所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同;

    PCR试剂15组成:除引物为SEQ?ID?NO:29所示引物和SEQ?ID?NO:30所示引
    物外,其余均与所述PCR试剂1相同。

    上述第三种试剂盒或第三种实时荧光定量PCR试剂,所述免疫因子为鱼的免疫因
    子,具体为罗非鱼的免疫因子、锦鲤的免疫因子或斑马鱼的免疫因子;

    所述免疫因子选自TNF-α、IL-1β、HSP70、TGF-β、IL-10、IFNγ、iNOS2a和TLR5b。

    上述三种PCR试剂中,所用的实时荧光定量PCR缓冲液均购自宝生物工程(大连)
    有限公司;产品名称:Premix?Ex?TaqTM?II.产品型号:DRR081B.产品品牌:
    Takara。

    本发明的最后一个目的是提供一种检测鱼免疫因子表达量的方法。

    本发明所提供的检测鱼免疫因子表达量的方法,包括如下步骤:以鱼的基因组
    mRNA的反转录cDNA为模板,分别用上述任一所述PCR试剂中的各个试剂进行实时荧
    光定量PCR;所述实时荧光定量PCR的反应程序为:95℃?3min;95℃?20sec,55℃?20sec,
    72℃?20sec?40个循环,72℃收集荧光信号。

    本发明的用于实时定量PCR检测鱼类免疫因子体系的引物,具有特异性好、无干
    扰背景的特点。本发明中的鱼类饲料添加剂可以提高鱼的免疫因子的表达量。因此,
    本发明在检测鱼的免疫系统领域具有一定的应用前景。

    附图说明

    图1为添加植酸酶对罗非鱼不同组织器官免疫因子表达量的影响。

    图2为添加益生芽孢杆菌对锦鲤肝脏免疫因子表达量的影响。

    图3为添加淬灭酶对斑马鱼中A.hydrophila?NJ-1引发的免疫因子表达量的影响。

    图4为实施例1的实时荧光PCR结果图。

    图5为实施例2的实时荧光PCR结果图。

    图6为实施例3的实时荧光PCR结果图。

    具体实施方式

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

    下述实施例中使用的实时荧光定量PCR缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公
    司;产品名称:Premix?Ex?TaqTM?II.产品型号:DRR081B.产品品牌:Takara。

    实施例1、添加植酸酶对罗非鱼免疫因子表达量的影响

    一、实验动物及其饲喂方法

    实验动物:罗非鱼鱼苗,5月份购自广东佛山南??拼锖闵邢薰?,在鱼塘
    中饲养,用颗粒饵料每天饲喂2次。至7月份罗非鱼生长稳定后,开始实验。将罗非
    鱼分为2组,分别饲喂2种饲料,每组鱼设4个平行,每个平行15条鱼。2组饲料分
    别为:CK组和M组。每日饲喂2次,饲喂13周,取样前24h停止喂食。

    表1.实验饲料配方



    CK组:向基础日粮中添加磷酸二氢钙得到的混合饲料;磷酸二氢钙与基础日粮
    的配比为10g/kg。

    M组:向基础日粮中添加微生物来源植酸酶得到的混合饲料;配比为1000U/kg
    混合饲料;

    微生物来源植酸酶购自北京挑战生物技术有限公司,产品目录号为挑战特节酶
    1314加强型。

    多维由如下各个组分组成,各个组分的配比如下:硫胺素(thiamine),20mg;核
    黄素(riboflavin),20mg;吡哆醇(pyridoxine),20mg;氰钴胺素(cyanocobalamine),
    0.020mg;维生素K(phylloquinone),10mg;叶酸(folic?acid),5mg;泛酸钙
    (calcium?pantothenate),50mg;肌醇(inositol),100mg;烟酸(niacin),100mg;
    维生素E(tocopherol),50mg;生物素(biotin),0.1mg;小麦面粉(wheat?flour),
    645.2mg;维生素C(ascorbic?acid),100mg;氯化胆碱(choline?chloride),1000mg;
    视黄醇(retinol),55000IU;维生素D(cholecalciferol),10000IU.

    多矿由如下各个组分组成,各个组分的配比如下:NaCl,1;MgSO4.7H2O,15;
    KH2PO4,32;Ca(H2PO4)2,20;FeC6H5O7.5H2O,2.5;C6H10CaO6.5H2O,3.5;ZnSO4.7H2O,0.353;
    MnSO4.4H2O,0.162;GuSO4.5H2O,0.031;CoCl.6H2O,0.001;KIO3,0.003;纤维素,
    0.45.

    二、扩增罗非鱼免疫因子

    (一)罗非鱼免疫因子cDNA的合成

    1.内脏器官的取材

    分别取4组(每组4个平行)罗非鱼的肝脏、肠道、肾脏,放入1.5mL离心管中,
    -70℃保存。

    2.罗非鱼内脏器官RNA的提取

    将每组罗非鱼的同一器官的4个平行样混合,使用北京康为世纪生物科技有限公
    司TRIzon?Reagent?RNA提取试剂提取RNA,具体方案如下:

    1).取-70℃冻存的器官组织30-50mg,充分液氮研磨,加入1mL?TRIzon,匀浆仪
    进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRIzon体积的10%。

    2).将以上样品在15-30℃放置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离。

    3).4℃12000rpm离心10min,取上清。

    4).向以上溶液中加入0.2mL氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15s,室温放置3min。

    5).4℃12000rpm离心10min,测试样品分成三层,把上层水相(RNA主要在水
    相中,约500μL)转移到一个新的RNase-Free离心管中。

    6).在得到的水相溶液中加入500μL异丙醇,混匀,室温放置10min。

    7).4℃12000rpm离心10min,弃上清。

    8).加入1mL?75%乙醇(用RNase-Free?water配制)洗涤沉淀。

    9).4℃5000rpm离心3min,用墙头小心吸出上层液体,保留沉淀。

    10).室温放置2-3min,晾干,加入50μL?RNase-Free?water,充分溶解RNA。所
    得到RNA置-70℃保存。

    1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA质量。

    3.罗非鱼免疫因子第一链cDNA的合成:以提取的罗非鱼内脏RNA为模板,使
    用Rever?Tra?Ace-α-RT-PCR?Kit(TOYOBO),进行RT-PCR合成第一链cDNA。

    RT-PCR反应体系(表2):.

    表2RT-PCR反应体系


    RT-PCR反应参数:30℃?10min,42℃?20min,99℃?5min,4℃?5min。PCR产物4℃
    保存。

    (二)、罗非鱼免疫因子基因片段的克隆

    1.免疫因子基因片段扩增引物的准备

    根据Genbank的ACT(beta-actin)、TNF-α(tumor?necrosis?factor)、HSP70(heat?shock?
    protein)、TGF-β(transforming?growth?factor)和IL-1β(interleukin?1)已知序列设计引物,
    如表3.

    表3、罗非鱼免疫因子基因片段扩增引物及扩增产物序列号



    2.免疫因子基因片段的克隆

    以合成的第一链cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR反应参数为:95℃?5min;
    94℃?30sec,55℃?30sec,72℃?1min?30sec,35个循环;72℃延伸10min。PCR产
    物用(1.2%)琼脂糖凝胶电泳分析,将大小正确的目的片段用胶回收试剂盒(北京康为
    世纪有限公司)进行回收。将所得的PCR产物与pEASY-T(购自北京全式金生物公
    司)连接后进行测序。

    测序得到的DNA序列去除载体序列后,使用BLASTx工具与GenBank中的序列
    进行相似性比对。β-actin基因与Mauremys?mutica来源的beta-actin具有最高相似性,
    相似性为99%;TGF-β基因与Pleuronectes?platessa来源的transforming?growth?factor?beta
    1具有最高相似性,相似性为77%。TNF-α基因与Oreochromis?niloticus来源的tumor?
    necrosis?factor-alpha具有最高相似性,相似性为100%。IL-1β基因与Psetta?maxima来
    源的interleukin?1beta?protein具有最高相似性,相似性为67%。HSP70基因与
    Oreochromis?aureus来源的heat?shock?protein?70具有最高相似性,相似性为99%。

    证明扩增得到的免疫因子正确。

    三、罗非鱼各个免疫因子表达量检测

    (一)罗非鱼实时定量PCR引物设计

    根据步骤二获得的免疫因子的基因片段,设计Act、TNF-α、IL-1β、HSP70、TGF-β
    实时定量PCR引物,如表4。

    表4、罗非鱼免疫因子实时定量PCR引物



    (二)实时定量PCR

    实时定量PCR用SYBR?Green?Premix?Ex?Taq?TMII(TaKaRa)在iQ5Real-Time?PCR
    System(Bio-Rad)进行。

    PCR反应体系为(表5):

    表5、实时定量PCR反应体系


    Real-Time?RT-PCR程序依据SYBR?Green?Premix?Ex?Taq?TM?II(TaKaRa)说明书。为
    95℃?3min;95℃?20sec,55℃?20sec,72℃?20sec?40个循环,72℃收集荧光信号;反
    应完成后65℃-95℃绘制溶解曲线。

    (三)数据分析

    采用相对定量法分析荧光定量PCR数据的方法。相对定量方法是通过比较已处理
    样品和未经处理样品表达差异。比较CT值法(2-ΔΔCT法)是相对定量常用的方法。即
    改变的倍数=2-ΔΔCT,而ΔΔCT=(CT靶基因-CT内参)处理组-(CT靶基因-CT
    内参)未处理组。

    添加植酸酶对罗非鱼免疫因子mRNA表达量的影响的结果见图1。

    结果表明,在肾脏中,M组饲料对TNF-α、HSP70、TGF-β的mRNA具有下调作
    用,而对IL-1β具有上调作用;在肝脏中,M组饲料对TNF-α、IL-1β具有下调作用,
    对HSP70、TGF-β有上调作用;在肠中,M组饲料对TNF-α、HSP70、IL-1β、TGF-β
    基因具有上调作用。

    实时定量PCR结束后,观察熔解曲线,引物特异性很高,没有非特异性扩增(图
    4)。该图4中包含了表4中所有引物的扩增结果。

    实施例2、饲料中添加益生芽孢杆菌对锦鲤免疫因子表达量的影响

    一、实验动物及其饲喂方法

    锦鲤鱼苗购自花鸟鱼市场。

    实验动物:锦鲤鱼苗2~3g,饲养于玻璃缸中,用颗粒饵料每天饲喂2次。锦鲤生
    长一周稳定后,开始实验。将锦鲤分为2组,分别饲喂2种饲料,每组鱼设8个平行,
    每个平行24条鱼。2组饲料分别为:CK组和S组。每日饲喂2次,饲喂35d,取样
    前24h停止喂食。取肝脏作为试验器官。

    CK组:基本饲料:鱼粉、豆粕和面粉的混合物;鱼粉、豆粕和面粉的质量份数
    比为鱼粉47:豆粕24:面粉24;

    S组:向基本饲料中添加益生芽孢杆菌得到的混合饲料;1×107CFU/g混合饲料。

    益生芽孢杆菌购自日本Calpis?Co.Ltd.,产品目录号为(Bacillus?subtilis?
    C-3102存活孢子数≥1×1010CFU/g)。

    二、锦鲤免疫因子基因片段的克隆

    (一)锦鲤免疫因子cDNA的合成:同实施例1中罗非鱼疫因子cDNA的合成。

    (二)锦鲤免疫因子基因片段的克隆

    1.免疫因子基因片段扩增引物设计

    根据Genbank的40S(40s?ribosomal?protein)、HSP70(heat?shock?protein)、
    TGF-β(transforming?growth?factor)、IL-1β(interleukin-1beta)、TNF-α(tumour?necrosis?
    factor)和IL-10(interleukin-10)已知序列设计引物,如表6。

    表6、锦鲤免疫因子基因片段扩增引物及产物序列号



    2.免疫因子基因片段的克隆

    以合成的第一链cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR反应参数为:95℃?5min;
    94℃?30sec,55℃?30sec,72℃?1min?30sec,35个循环;72℃延伸10min。PCR产
    物用(1.2%)琼脂糖凝胶电泳分析,将大小正确的目的片段用胶回收试剂盒(北京康为
    世纪有限公司)进行回收。将所得的PCR产物与pEASY-T(购自北京全式金生物公
    司)连接后进行测序。测序得到的DNA序列去除载体序列后,使用BLASTx工具与
    GenBank中的序列进行相似性比对。40s基因与Danio?rerio来源的40S?ribosomal?protein?
    S11具有最高相似性,相似性为98%;IL-1β基因与Carassius?auratus来源的interleukin-1
    beta?1具有最高相似性,相似性为99%;IL-10基因与Carassius?auratus来源的
    interleukin-10具有最高相似性,相似性为100%;TNF-α基因与Carassius?auratus来源
    的tumor?necrosis?factor?alpha?1具有最高相似性,相似性为98%;HSP70基因与Carassius?
    gibelio来源的heat?shock?cognate?70kDa?protein具有最高相似性,相似为99%;TGF-β
    基因与Carassius?auratus来源的transforming?growth?factor-beta具有最高相似性,相似
    性为99%。证明扩增得到的免疫因子正确。

    三、锦鲤免疫因子表达量

    (一)锦鲤免疫因子实时定量PCR引物设计

    根据步骤二获得的免疫因子的基因片段,设计40S、IL-1β、IL-10、TNF-α、HSP70、
    TGF-β实时定量PCR引物。

    表7、锦鲤免疫因子实时定量PCR引物



    (二)实时定量PCR:方法除了引物不同外,其余与实施例1中实时定量PCR
    方法相同。

    (三)数据分析:采用同实施例1相对定量法分析数据。结果如图2所示。

    结果表明,在肝脏中,S组饲料对HSP70、TGF-β具有上调作用,而对IL-1β、
    TNF-α、IL-10具有下调作用。

    实时定量PCR结束后,观察熔解曲线,引物特异性很高,没有非特异性扩增(图
    5)。该图5中包含了表7中所有引物的扩增结果。

    实施例3、斑马鱼饲料中添加淬灭酶后对引发的免疫因子表达的影响

    一、实验动物及其饲喂方法

    斑马鱼鱼苗购自花鸟鱼市场。

    实验动物:试验用斑马鱼鱼苗饲养于温度24℃循环水系统中稳定后,用于试验研
    究。所用试验用斑马鱼约4月龄,重200mg,长度4cm。每个实验组3个平行缸,每
    缸10尾鱼。试验用饲料分为4组:I型饲料为CK组、II型饲料为单加酶组、III型饲
    料为菌酶同加组、IV型饲料为单加菌组。各组于实验当日一次性投喂鱼体重5%的饲
    料后,于0.5,3,6,12h后取整鱼提取总RNA。

    淬灭酶AiiA-B546的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:31所示。按照文献“Ruidong?Chen,
    Microbial?Cell?Factories?2010,9:39”中所述方法制备。

    各组所喂养的饲料具体如下:

    基本饲料的组成:鱼粉、豆粕、面粉、小麦粉、豆油和预混料的混合物;其质量
    分数比为鱼粉47、豆粕24、面粉24、小麦粉2、豆油2、预混料3;所述预混料的组
    成及各个组分的质量份数比如下:磷酸二氢钙1.00、Vc磷酸酯0.05、氯化胆碱0.20、
    多矿0.10、多维0.10、抗氧化剂0.05、防霉剂0.10;所述抗氧化剂为乙氧基喹啉;所
    述防霉剂为丙酸盐;所述粘合剂为羟甲基纤维素钠;

    CK组:I型饲料——将1g基本饲料溶于1ml?pH?7.4、1×PBS缓冲液中得到。

    单加酶组(E组):II型饲料——向基本饲料中添加淬灭酶AiiA-B546得到的混合
    饲料;配比为3.72U/g混合饲料。

    菌酶同加组(EM组):III型饲料——向基本饲料中添加淬灭酶AiiA-B546和菌
    (Aeromonas?hydrophila)NJ-1得到的混合饲料;配比为3.72U/g混合饲料和1012
    CFU/g混合饲料。

    单加菌组(M组):IV型饲料——向基本饲料中添加菌(Aeromonas?hydrophila)
    NJ-1得到的混合饲料;配比为1012CFU/g混合饲料。

    二、斑马鱼免疫因子实时定量PCR

    (一)斑马鱼免疫因子cDNA的合成:方法同实施例1中免疫因子cDNA的合成。

    (二)斑马鱼实时定量PCR引物设计:

    根据斑马鱼的基因组序列设计Act、IL-1β、TNF-α、IFNγ、IL-10、TLR5b和iNOS2a
    的实时定量PCR引物(见表8)。

    表8、斑马鱼免疫因子实时定量PCR引物


    (三)、实时定量PCR:方法除了引物外,其余均与实施例1中实时定量PCR相
    同。

    (四)、数据分析采用同实施例1相对定量法。结果如图3所示。

    结果表明,与菌体LPS(不受群体感应调控的抗原)相关的免疫因子(IL-1β、TNF-α、
    iNOS2a)的表达量在饲喂III型和IV型饲料的斑马鱼中没有显著性变化(P>0.05)。
    而与A.hydrophila?NJ-1毒力因子(受群体感应调控的抗原)相关的细胞因子(IFNγ、
    IL-10、TLR5b)的表达量在饲喂III型和IV型饲料的斑马鱼中变化显著(P<0.05)。

    与CK组相比,各组中免疫因子的mRNA表达量情况如下(12h):

    II型饲料组:IL-1β、IFNγ、iNOS因子的mRNA表达量提高,IL-10、TLR5、TNF-α
    因子的mRNA表达量降低。

    III型饲料组:IL-1β、IFNγ因子的mRNA表达量提高,IL-10、TLR5、TNF-α、iNOS
    因子的mRNA表达量降低。

    IV型饲料组:IL-1β、IFNγ因子的mRNA表达量提高,IL-10、TLR5、TNF-α、iNOS
    因子的mRNA表达量降低。

    实时定量PCR结束后,观察熔解曲线,引物特异性很高,没有非特异性扩增(图
    6)。该图6中包含了表8中所有引物的扩增结果。

    测序得到的DNA序列去除载体序列后,使用BLASTx工具与GenBank中的序列
    进行相似性比对,结果均为100%。













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