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    微信赌重庆时时彩: 一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒.pdf

    关 键 词:
    一种 结核 分枝杆菌 链霉素 耐药 突变 检测 方法 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110138242.3

    申请日:

    2011.05.25

    公开号:

    CN102229991A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110525|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12Q1/02; G01N21/64 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 厦门大学; 厦门致善生物科技有限公司
    发明人: 李庆阁; 张婷; 胡思玉
    地址: 361005 福建省厦门市思明南路422号
    优先权:
    专利代理机构: 厦门南强之路专利事务所 35200 代理人: 马应森;何加友
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110138242.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.07.30|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及耐药突变的检测技术,提供一种有效提高灵敏度及特异性、操作简便、周期短结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法。根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列,设计引物和探针;提取结核分枝杆菌样本的DNA;构建PCR反应体系;进行PCR扩增及熔解曲线分析。利用特异性引物和探针,分别于两管中实验,采用耐热DNA聚合酶、四种核苷酸单体等成分,并应用实时PCR技术实现靶核苷酸序列的核算片段扩增以及之后的熔解曲线分析。荧光PCR熔解曲线法特异性好,可快速、准确地检测结核分枝杆菌链霉素耐药常见突变,有望直接用于临床样本链霉素耐药性检测。

    权利要求书

    1.一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列,利用引物设计
    软件Primer?Premier?5设计引物和探针;
    2)提取结核分枝杆菌样本的DNA;
    3)构建PCR反应体系;
    4)进行PCR扩增及熔解曲线分析:将步骤2)提取的DNA加入步骤3)的PCR反应体
    系中,设阴性对照、空白对照和阳性对照,进行PCR扩增及熔解曲线分析,将待测样本反应
    管所得熔解曲线与阳性对照反应管所得熔解曲线的Tm值进行比较,判断出待测样本中rpsL
    及rrs基因上耐药相关突变位点是否发生突变,从而判断样本耐药情况。
    2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,其特征在于在步
    骤1)中,所述设计引物和探针的具体方法为:
    a,引物设计在所检测的突变两端,探针覆盖突变位点;
    b,探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor中的任意一种,
    淬灭基团选择BHQ、Dabcyl。
    3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,其特征在于在步
    骤1)中,所述引物和探针的具体序列为:
    引物rpsL43F:5′-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3′
    引物rpsL43R:5′-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3′
    引物rpsL88F:5′-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3′
    引物rpsL88R:5′-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3′
    引物rrs512F:5′-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3′
    引物rrs512R:5′-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3′
    引物rrs904F:5′-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3′
    引物rrs904R:5′-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3′
    探针rpsL43P:5′-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3′
    探针rpsL88P:5′-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3′
    探针rrs512P:5′-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3′
    探针rrs904P:5′-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl
    -3′。
    4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,其特征在于在步
    骤2)中,所述PCT反应体系为:一种是rpsL体系,用来检测rpsL基因相关耐药突变,另
    一种是rrs体系,用来检测rrs基因相关耐药突变,反应液每份为20μl,每份反应液中含下列
    组分:
    rpsL体系:1×PCR?Buffer[10mmol/L?Tris,50mmol/L?KCl,50%(v/v)甘油],200μmol/L?dATP、
    200μmol/L?dCTP、200μmol/L?dGTP、400μmol/L?dUTP,1mmol/L?MgCl2,引物rpsL43R和引
    物rpsL88R各0.6μmol/L,引物rpsL43F、引物rpsL88F、探针rpsL43P和探针rpsL88P各
    0.06μmol/L,Taq?DNA聚合酶2U,UNG酶0.01U;
    rrs体系:1×PCR?Buffer[10mmol/L?Tris,50mmol/L?KCl,50%(v/v)甘油],200μmol/L?dATP、
    200μmol/L?dCTP、200μmol/L?dGTP、400μmol/L?dUTP,3mmol/LMgCl2,引物rrs512R和引物
    rrs904R各0.6μmol/L,引物rrs512F、引物rrs904F、探针rrs512P和探针rrs904P各0.06μmol/L,
    Taq?DNA聚合酶2U,UNG酶0.01U。
    5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,其特征在于在在
    步骤4)中,所述PCR扩增的条件为:50℃2min,95℃10min;95℃10s、70℃20s,每个循
    环降低1℃、75℃20s构成一个touchdown循环,共进行10个循环;95℃10s、60℃20s、75℃
    20s构成一个循环,共进行30个循环;之后是熔解分析步骤,95℃2min、40℃2min、40~
    80℃每0.5℃采集荧光。
    6.如权利要求1所述的结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒,其特征在于
    设有盒体、扩增试剂、TB?DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照;所述扩增试剂包括
    STR?PCR?Mix?A、STR?PCR?Mix?B和TB酶混合液,STR?PCR?Mix?A、STR?PCR?Mix?B、TB酶
    混合液、TB?DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性对照放置在盒体内;
    所述STR?PCR?Mix?A包括1×PCR?Buffer,dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,
    MgCl21mM,引物rpsL43R和rpsL88R各0.6μM,引物rpsL43F和rpsL88F各0.06μM,探针
    rpsL43P和rpsL88P各0.06μM;所述Buffer为10mM?Tris-HCl,50mM?KCl,50%(v/v)甘油;
    所述STR?PCR?Mix?B包括1×PCR?Buffer,dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,
    MgCl23mM,引物rrs512R和rrs904R各0.6μM,引物rrs512F和rrs904F各0.06μM,探针rrs512P
    和rrs904P各0.06μM,所述Buffer为10mM?Tris,50mM?KCl,50%(v/v)甘油;
    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG;
    所述STR阳性对照为STR野生型标准质粒;
    所述TB阴性对照为TB?DNA提取液、H2O、Tris或生理盐水;
    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。
    7.如权利要求6所述的结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方
    法,其特征在于包括以下步骤:
    1)试剂准备——配液区
    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温,PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    STR?PCR?Mix?A和n×0.4μL酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm离
    心数秒;另取n×19.6μL?STR?PCR?Mix?B和n×0.4μL酶混合液加入到另一1.5mL离心管中,
    振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒,配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使用;
    ②PCR反应液的分装,PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管;
    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间,贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕;
    2)样品提取及加样——提取区
    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中,液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌;
    ②封口膜封口,99℃加热20min,14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管,上清即为PCR扩增模板;
    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL;立即盖严管盖;
    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区;
    3)PCR扩增——扩增区
    ①仪器的程序设定如下:
    第一步:50℃2min,95℃10min;
    第二步:95℃10s,70℃20s,每个循环降低1℃,75℃20s,10个循环;
    第三步:95℃10s,60℃20s,75℃20s,30个循环,60℃20s处收集荧光信号;
    第四步:95℃2min,40℃2min;
    第五步:40~80℃,每0.5℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET;
    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染源处理;
    (3)试剂盒的参考值
    阳性对照,即野生型在各体系及各通道中的Tm值范围如下:
    反应体系A中FAM通道野生型对照峰的Tm值为57.0℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为65.0℃±1℃;
    反应体系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为63.5℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为60.0℃±1℃;
    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照所得的Tm值为准;
    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值;当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,通过调整基线或直接
    人工判读的方法获得Tm值。

    说明书

    一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒

    技术领域

    本发明涉及耐药突变的检测技术,特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线
    分析技术用于检测结核分枝杆菌链霉素耐药突变。

    背景技术

    结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官,
    但主要侵犯肺脏,称为肺结核病。到20世纪80年代后期,由于贫困、艾滋病、人口流动和
    耐药等因素,结核病发病率和死亡率在全球范围内出现快速回升,成为与艾滋病并列的全球
    性危害最严重的传染病。结核分枝杆菌耐药情况严重,耐药率高达46%,给结核病的预防和
    治疗构成严峻挑战。

    抗结核药物是结核病化学治疗的基础,而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手
    段。链霉素发现于20世纪40年代,是最早出现的有效抗结核药物,也是治疗结核病的一线
    药物之一(1、李志忠,高全金.链霉素在当今抗结核中的地位[J]中国误诊学杂志,2002.2(1):
    62-63)。链霉素是一种氨基环醇糖苷类抗生素,主要作用于结核分枝杆菌的核糖体,与结核
    分枝杆菌的核糖体30S亚单位结合,诱导遗传密码的错配,抑制mRNA翻译的开始,干扰翻
    译过程中的校对,从而抑制蛋白质的合成。链霉素经常单独给药,因此其耐药性发展较快。
    结核分枝杆菌耐链霉素的主要分子机制是编码小亚基的S12蛋白的rpsL基因和编码16S核糖
    体RNA的rrs基因突变,从而抑制药物结合核糖体的能力,造成对链霉素耐药(2、张晨钰,
    梁建琴.结核分枝杆菌耐药分子机制的研究进展[J]中国误诊学杂志.2006,6(17):3303-3305)。结
    核分枝杆菌链霉素耐药性的检测对于控制耐药性结核分枝杆菌的传播以及控制结核病有极其
    重要的意义。

    目前临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因型检测两类,并以前者为主(3、
    Heifets?L.Rapid?automated?methods(BACTEC?System)in?clinical?mycobacteriology[J]Semin?
    Respir?Infect,1986.1(4):242-249)。然而表型检测因为各种原因,如耗时、设备昂贵、有放射
    性危害或干扰因素多等,难以形成快速高效的筛查手段。相对而言,基因检测更为直接,目
    前已经使用的基因分析方法有单链构象多态性分析法(SSCP),限制性片段长度多态性分析
    法(RFLP),DNA测序法,线性探针杂交法(4、Mokrousov?I.Multicenter?evaluation?of?reverse?
    line?blot?assay?for?detection?of?drug?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis?clinical?isolates[J].J?
    Microbiol?Methods,2004.57(3):323-335),RNA/RNA错配分析法,以及DNA阵列(芯片)检
    测等(5、Wu?X.Detection?of?streptomycin?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis?clinical?isolates?
    using?four?molecular?methods?in?China[J].Yi?Chuan?Xue?Bao,2006.33(7):655-663)。这些方法虽
    然检出率和通量高低不同,但共同缺点是需要进行PCR后处理,不仅影响了检测效率,易引
    起扩增产物污染,而且增加了操作难度,提高了对实验室的要求。实时PCR技术将扩增和检
    测两步骤合一,具有快速、特异、灵敏、定量等优点,已在病原微生物检测和突变检测领域
    得到广泛应用,近年来在结核菌耐药检测上的应用也引起人们极大兴趣(6、El-Hajj?H.
    Detection?of?rifampin?resistance?in?Mycobacterium?tuberculosis?in?a?single?tube?with?molecular?
    beacons[J].J?Clin?Microbiol,2001.39(11):4131-4137)。

    荧光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上,在扩增反应体系中加入一对特异性引物
    的同时再加入一个特异性的荧光探针,使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列
    的技术。除了具有普通PCR的优点外,它还具有以下优点:(1)特异性更强,灵敏度更高。
    由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针,提高了特异性,并且由自动化仪器收集荧
    光信号,避免了人工判断的主观性,又可进一步提高灵敏度。(2)全封闭反应,在线式实时
    监测荧光,无需PCR产物的后处理,避免污染,保证了结果的可靠性。(3)可实现单管双重
    检测,降低成本。(4)不接触有毒试剂,操作安全。(5)根据探针与靶序列杂交的特异性以
    及与不完全匹配靶序列杂交的Tm值差异,可以利用熔解曲线区分野生与突变,结果容易判读。

    发明内容

    本发明的目的之一在于提供一种有效提高灵敏度及特异性、操作简便、周期短的结核分
    枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法,即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。

    本发明的另一目的在于提供一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒。

    所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法包括以下步骤:

    1)根据结核分枝杆菌全序列和结核分枝杆菌基因组rpsL和rrs基因序列,利用引物设计
    软件Primer?Premier?5设计引物和探针;

    2)提取结核分枝杆菌样本的DNA;

    3)构建PCR反应体系;

    4)进行PCR扩增及熔解曲线分析:将步骤2)提取的DNA加入步骤3)的PCR反应体
    系中,设阴性对照、空白对照和阳性对照,进行PCR扩增及熔解曲线分析,将待测样本反应
    管所得熔解曲线与阳性对照反应管所得熔解曲线的Tm值进行比较,判断出待测样本中rpsL
    及rrs基因上耐药相关突变位点是否发生突变,从而判断样本耐药情况。

    在步骤1)中,所述设计引物和探针的具体方法为:

    a,引物设计在所检测的突变两端,探针覆盖突变位点;

    b,探针的荧光基团可选择FAM、ROX、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor等任意一种,淬
    灭基团可选择BHQ、Dabcyl等,并且探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等。

    所述引物和探针的具体序列可为:

    引物rpsL43F:5′-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3′

    引物rpsL43R:5′-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3′

    引物rpsL88F:5′-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3′

    引物rpsL88R:5′-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3′

    引物rrs512F:5′-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3′

    引物rrs512R:5′-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3′

    引物rrs904F:5′-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3′

    引物rrs904R:5′-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3′

    探针rpsL43P:5′-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3′

    探针rpsL88P:5′-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3′

    探针rrs512P:5′-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3′

    探针rrs904P:5′-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3′

    在步骤2)中,所述PCR反应体系可为:一种是rpsL体系,用来检测rpsL基因相关耐
    药突变(rpsL密码子43和rpsL密码子88),另一种是rrs体系,用来检测rrs基因相关耐药
    突变(rrs512环区和rrs904环区),反应液每份为20μl,每份反应液中含下列组分:

    rpsL体系:1×PCR?Buffer[10mM?Tris-HCl,50mM?KCl,50%(v/v)甘油],dATP、dCTP、dGTP
    各200μM、dUTP?400μM,MgCl21mM,引物rpsL43R和rpsL88R各0.6μM,引物rpsL43F
    和rpsL88F各0.06μM,探针rpsL43P和rpsL88P各0.06μM,Taq?DNA聚合酶2U,UNG酶
    0.01U;

    rrs体系:1×PCR?Buffer[10mmol/L?Tris,50mmol/L?KCl,50%(v/v)甘油],dATP、dCTP、
    dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl23mM,引物rrs512R和rrs904R各0.6μM,引物rrs512F
    和rrs904F各0.06μM、探针rrs512P和rrs904P各0.06μM,Taq?DNA聚合酶2U,UNG酶0.01U。

    有经验的人也选择其它类型的buffer,或者通过优化找到更为合适的buffer类型。

    在步骤4)中,所述PCR扩增的条件为:50℃2min,95℃10min;95℃10s、70℃20s
    (每个循环降低1℃)、75℃20s构成一个touchdown循环(共进行10个循环);95℃10s、
    60℃20s(荧光数据采集)、75℃20s构成一个循环(共进行30个循环);之后是熔解分析步
    骤,95℃2min、40℃2min、40℃~80℃每0.5℃采集荧光。

    所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒设有盒体、扩增试剂(包括STR
    PCR?Mix?A、STR?PCR?Mix?B和TB酶混合液)、TB?DNA提取液、TB阴性对照和STR阳性
    对照;所述扩增试剂(包括STR?PCR?Mix?A、STR?PCR?Mix?B和TB酶混合液)、TB?DNA提
    取液、TB阴性对照和STR阳性对照放置在盒体内。

    所述STR?PCR?Mix?A包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris-HCl,50mM?KCl,50%(v/v)甘油),
    dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl21mM,引物rpsL43R和rpsL88R各
    0.6μM,引物rpsL43F和rpsL88F各0.06μM,探针rpsL43P和rpsL88P各0.06μM。

    所述STR?PCR?Mix?B包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris,50mM?KCl,50%(v/v)甘油),dATP、
    dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl23mM,引物rrs512R和rrs904R各0.6μM,
    引物rrs512F和rrs904F各0.06μM,探针rrs512P和rrs904P各0.06μM。

    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述STR阳性对照为STR野生型标准质粒。

    所述TB阴性对照可以为TB?DNA提取液,也可以为H2O、Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    STR?PCR?Mix?A和n×0.4μL酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm离
    心数秒;另取n×19.6μL?STR?PCR?Mix?B和n×0.4μL酶混合液加入到另一1.5mL离心管中,
    振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使用。

    ②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,70℃20s(每个循环降低1℃),75℃20s,10个循环;

    第三步:95℃10s,60℃20s,75℃20s,30个循环,60℃20s处收集荧光信号;

    第四步:95℃2min,40℃2min;

    第五步:40~80℃,每0.5℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    阳性对照,即野生型在各体系及各通道中的Tm值范围如下:

    反应体系A中FAM通道野生型对照峰的Tm值为57.0℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为65.0℃±1℃。

    反应体系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为63.5℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为60.0℃±1℃。

    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生
    型,试验菌株对链霉素敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突
    变型,试验菌株对链霉素耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂
    合样品,分3种情况:①当样品出现双峰时,即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性
    对照的熔点一致,但峰型与阳性对照的峰型有较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小
    峰或突起,即为杂合样品;③样品为一个融合峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰
    或突起,即为杂合样品。杂合样品对链霉素耐药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以
    确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。

    本发明的具体原理是利用4对靶核苷酸序列的特异性引物和4条特异性荧光探针,分别
    于两管中实验,采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分,并应用
    实时PCR技术实现靶核苷酸序列的核算片段扩增以及之后的熔解曲线分析。所使用的探针为
    两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸链。在探针为自由状态时,报告基团
    发射的荧光信号被淬灭基团所吸收,而在体系中存在大量可与探针结合的单链扩增子时,探
    针与扩增子结合使得荧光报告基团与荧光淬灭基团分离,荧光报告基团发出荧光。这样在熔
    解分析的过程中,随着温度的变化探针与扩增子的结合状态反应在荧光信号的改变上,而通
    过比较与探针完全匹配以及不完全匹配的靶序列在荧光信号改变上的差异即可判断出待测样
    本在耐药突变位点是否发生突变,从而判断样本耐药情况。本发明在PCR程序结束之后,直
    接增加一个熔解分析步骤即可对耐药相关位点是否突变进行判断。此方法不用进行PCR后处
    理,降低了污染以及假阳性出现的概率。荧光PCR熔解曲线法特异性好,可以快速、准确地
    检测结核分枝杆菌链霉素耐药常见突变,有望直接用于临床样本链霉素耐药性检测。

    本发明的突出优点如下:

    (1)由于本发明采用荧光PCR熔解曲线法作为检测方法,整个反应均在封闭的反应管内进
    行,避免了其它核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果。

    (2)操作简便,且对PCR产物进行实时监测,大大节省了检测时间。

    (3)由于各试剂用量均较少,大大降低了成本。

    附图说明

    图1为rpsL43位点典型熔解曲线结果图。在图1中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度
    与温度的负导数(-dF/dT),曲线1和2为rpsL43位点突变峰,曲线3为rpsL43位点野生峰,
    曲线4为空白对照。

    图2为rpsL88位点典型熔解曲线结果图。在图2中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度
    与温度的负导数(-dF/dT),曲线1、2和3为rpsL88位点突变峰,曲线4为rpsL88位点野生
    峰,曲线5为空白对照。

    图3为rrs513位点典型熔解曲线结果图。在图3中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度
    与温度的负导数(-dF/dT),曲线1和2为rrs513位点突变峰,曲线3为rrs513位点野生峰,
    曲线4为空白对照。

    图4为rrs905位点典型熔解曲线结果图。在图4中,横坐标为温度,纵坐标为荧光强度
    与温度的负导数(-dF/dT),曲线1为rrs905位点突变峰,曲线2为rrs905位点野生峰,曲线
    3为空白对照。

    图5为本发明所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒实施例结构示意
    图。

    具体实施方式

    实施例1引物和探针设计

    根据结核分枝杆菌野生型基因组序列在四个位点各设计多对引物和探针,引物3′端无互
    补序列。引物、探针序列组合可为:

    引物rpsL43F:

    5′-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3′

    引物rpsL43R:

    5′-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3′

    引物rpsL88F:

    5′-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3′

    引物rpsL88R:

    5′-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3′

    引物rrs512F:

    5′-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3′

    引物rrs512R:

    5′-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3′

    引物rrs904F:

    5′-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3′

    引物rrs904R:

    5′-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3′

    探针rpsL43P:

    5′-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3′

    探针rpsL88P:

    5′-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGg-Dabcyl-3′

    探针rrs512P:

    5′-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3′

    探针rrs904P:

    5′-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3′

    引物及探针均由上海生工生物有限公司合成。

    实施例2提取结核分枝杆菌基因组DNA

    用热裂解法提取结核分枝杆菌基因组DNA,具体过程是:

    A、固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心15min,
    丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    B、封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心管。
    上清即为PCR扩增模板。

    C.样本保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要反复冻融样本。

    实施例3反应体系的建立和优化

    利用野生型结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA作为待检样本,分装后储存于-20℃备用。

    2.1引物比例的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下,调整上下游引物的比例,
    将引物比例分别调至1∶5、1∶10、1∶15和1∶20,经过重复实验选定1∶10为上下游引物
    的比例。

    2.2MgCl2浓度的优化:在反应体系中其它条件相同的情况下,将MgCl2的浓度以1mmol/L
    至5mmol/L以1mmol/L递增,经过重复实验选定1mmol/L(rpsL体系)和3mmol/L(rrs体
    系)为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

    2.3Taq酶用量的优化:通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果,选定
    2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

    利用上述引物和探针进行反应体系的建立,最后确定采用的荧光PCR熔解曲线法快速筛
    查结核分枝杆菌链霉素耐药突变的反应体系为25μl体系,所需各组分及相应浓度见表1和表
    2。表1荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素rpsL基因耐药突变反应中的各组
    分情况,表2荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素rrs基因耐药突变反应中的
    各组分情况

    表1


    表2


    注:a.使用的仪器不同,应将反应参数做适当调整。

    ????b.根据检测样本来源不同,应适当调整模板加量。

    实施例4PCR检测

    在进行荧光PCR反应时,应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置,选择的荧光
    检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异,应参照仪器使用说
    明书。(本发明中以Bio-Rad?CFX?96TM?Real-Time?system为例)

    PCR条件选择如下:

    50℃2min,95℃10min;

    95℃10s、70℃20s(每个循环降低1℃)、75℃20s构成touchdown循环,10个循环;

    95℃10s、60℃20s(荧光数据采集)、75℃20s,30个循环;

    熔解分析步骤,95℃2min、40℃2min、40℃~80℃每0.5℃采集荧光。

    PCR反应后进行结果判定:

    1、管1中FAM通道有一个峰,检测rpsL基因43位密码子,野生型对照峰Tm值分别为
    57.0±1℃。TET通道有一个峰,检测rpsL基因88位密码子,野生型对照峰Tm值分别为
    65.0±1℃。管2中FAM通道有一个峰,检测rrs基因513~517区域,野生型对照峰Tm值分
    别为63.5±1℃。TET通道有一个峰,检测rrs基因905~908区域,野生型对照峰Tm值分别为
    60.0±1℃。

    2、管1和管2中,野生型对照FAM和TET通道必须都有熔解曲线峰,且峰Tm值在上
    述范围。否则实验结果视为无效。通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm
    值)的差异判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)
    时判定为野生型,试验菌株对链霉素敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)
    判定为突变型,试验菌株对链霉素耐药。

    3、关于杂合结果的判读,分3种情况:四个通道中任一通道①当样品出现双峰时,即为
    杂合样品;②样品为一个熔合峰,与阳性对照的熔点一致,但峰型跟阳性对照的峰型有较大
    差异,在有可能出现突变峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品;③样品为一个熔合峰,
    为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰或突起,即为杂合样品。杂合样品对链霉素耐药,
    建议出现杂合样品时将样品重复检测,以确定样品耐药性。

    实施例5反应体系的灵敏度和特异性考察

    1、反应体系的灵敏度考察:取链霉素野生型样本及典型突变型样本(每个位点一株),每
    种样本从2×108菌/mL的浓度以10倍梯度连续稀释至2×103菌/mL,每个样品作三份重复测
    定,三份均是阳性的最小病原体量为试剂盒的检测限度。结果显示灵敏度均可以达到1000拷
    贝/反应管。

    实际标本中可能会有混合菌,因此需考察检测混合菌的能力,将浓度为2×107菌/mL的野
    生型样本与浓度为2×107菌/mL的突变型样本(rpsL43AAG→AGG)按比例混合,其中突变
    型标本的比例分别为:100%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、0%。同样,浓度为2×106
    菌/mL及浓度为2×105菌/mL的突变及野生参考品按比例混合成如上突变比例。检测结果显
    示,能够准确地检测出混合菌中40%的突变。

    2、反应体系的分析特异性考察:取10株野生型样本和8株突变型样本,浓度2×106菌/mL,
    每个反应体系加5μL,野生型样本检测结果都为野生型,突变型样本检测结果都为突变型,
    无假阴性和假阳性现象,无漏检现象,且野生型样本的Tm和阳性对照的Tm波动范围在±1.0℃
    内,且所有突变型样本的Tm比阳性对照Tm低2.0℃以上。

    实施例6

    5.1待测模板的制备:用热裂解法提取92份结核分支杆菌基因组DNA。

    5.1.1用接种环收集适量2~3周菌龄的结核分枝杆菌菌落并悬在300μl纯水中;

    5.1.2封口膜封口,99℃加热20min;

    5.1.314000rpm离心10min,转移上清到新1.5ml离心管,上清即为PCR扩增模板;

    51.4样本保存于-20℃,并于1个月内完成实验,注意不要反复冻融样本。

    5.2荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素耐药突变反应的扩增及熔解

    根据表1和表2加样,将加好样的PCR管放在Bio-Rad?CFX?96TM?Real-Time?system中,
    设计相应荧光收集条件后进行扩增及熔解,程序如下:

    5.2.150℃2min,95℃10min;

    5.2.295℃10s、70℃20s(每个循环降低1℃)、75℃20s构成touchdown循环,10个循环;

    5.2.395℃10s、60℃20s(采集荧光)、75℃20s,30个循环;

    5.2.4熔解分析步骤,95℃预变性2min、40℃保温2min、40~80℃每1℃采集荧光。

    5.3荧光PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌链霉素耐药突变反应的检测结果

    经检测,若待检样本为野生型则熔解曲线显示野生型Tm值,若待检样本为突变型则其Tm
    比阳性对照Tm低2.0℃以上,提示本方法可以区分野生型与突变型样本。具体结果参见图1~
    4。

    实施例7链霉素耐药突变检测试剂盒检测链霉素耐药突变

    检测分两个反应体系进行双重双色检测:

    STR?PCR?MIX?A每份为19.6μl,每份反应液包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris-HCl,50mM
    KCl,50%(v/v)甘油),dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl21mM,引物rpsL43R
    和rpsL88R各0.6μM,引物rpsL43F和rpsL88F各0.06μM,探针rpsL43P和rpsL88P各0.06μM。
    检测前加入2U酶混合液(0.4μl),待测模板加入量为5μl。

    STR?PCR?Mix?B每份为19.6μl,每份反应液包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris,50mM?KCl,
    50%(v/v)甘油),dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl23mM,引物rrs512R
    和rrs904R各0.6μM,引物rrs512F和rrs904F各0.06μM,探针rrs512P和rrs904P各0.06μM。
    检测前加入2U酶混合液(0.4μl),待测模板加入量为5μl。

    各检测样本取5μlDNA作为模板,STR野生型标准质粒作为阳性对照,TB?DNA提取液
    做为阴性对照。PCR反应程序:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,70℃20s(每个循环降低1℃),75℃20s,10个循环;

    第三步:95℃10s,60℃20s,75℃20s,30个循环,60℃20s处收集荧光信号;

    第四步:95℃2min,40℃2min;

    第五步:40~80℃,每0.5℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET。

    结果判读:

    反应体系A中FAM通道野生型对照峰Tm值为57.0℃±1℃;TET通道野生型对照峰Tm
    值为65.0℃±1℃。

    反应体系B中FAM通道野生型对照峰Tm值为63.5℃±1℃;TET通道野生型对照峰Tm
    值为60.0℃±1℃。

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生
    型,试验菌株对链霉素敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突
    变型,试验菌株对链霉素耐药。

    图5给出所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒实施例的结构组成,设
    有盒体1、扩增试剂(包括ST?RPCR?Mix?A2、STR?PCR?Mix?B3和TB酶混合液4)、TB?DNA
    提取液5、TB阴性对照6和STR阳性对照7;所述扩增试剂(包括STR?PCR?Mix?A2、STR?PCR
    Mix?B3和TB酶混合液4)、TB?DNA提取液5、TB阴性对照6和STR阳性对照7放置在盒
    体1内。

    所述STR?PCR?Mix?A包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris-HCl,50mM?KCl,50%(v/v)甘油),
    dATP、dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl21mM,引物rpsL43R和rpsL88R各
    0.6μM,引物rpsL43F和rpsL88F各0.06μM,探针rpsL43P和rpsL88P各0.06μM。

    所述STR?PCR?Mix?B包括1×PCR?Buffer(10mM?Tris,50mM?KCl,50%(v/v)甘油),dATP、
    dCTP、dGTP各200μM、dUTP?400μM,MgCl23mM,引物rrs512R和rrs904R各0.6μM,
    引物rrs512F和rrs904F各0.06μM,探针rrs512P和rrs904P各0.06μM。

    所述TB酶混合液包括2U?Taq,0.01U?UNG。

    所述STR阳性对照为STR野生型标准质粒。

    所述TB阴性对照可以为TB?DNA提取液,也可以为H2O、Tris或生理盐水等。

    所述TB?DNA提取液的成分为乙二胺四乙酸二钠、Tris和TritonX-100。

    所述结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法的试剂盒检验标本的方法包括以下步骤:

    1)试剂准备——配液区

    ①首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为:取n×19.6μL
    STR?PCR?Mix?A和n×0.4μL酶混合液加入到1.5mL离心管中,振荡混匀数秒,3000rpm离
    心数秒;另取n×19.6μL?STR?PCR?Mix?B和n×0.4μL酶混合液加入到另一1.5mL离心管中,
    振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必需贮存在-20℃并在4h内使用。

    ②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

    ③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-20℃直至样品提取处理完
    毕。

    2)样品提取及加样——提取区

    ①固体培养基上生长的结核分枝杆菌,用22SWG标准接种环收集细菌1环,并悬在
    250μL?TB?DNA提取液中。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1mL,10000rpm离心
    15min,丢弃上清并在250μL?TB?DNA提取液中重悬细菌。

    ②封口膜封口,99℃加热20min。14000rpm离心10min,转移上清到新1.5mL离心
    管。上清即为PCR扩增模板。(模板可保存于-20℃,并于1个月内完成试验。注意不要
    反复冻融样品。)

    ③用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5
    μL。立即盖严管盖。

    ④将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。

    3)PCR扩增——扩增区

    ①仪器的程序设定如下:

    第一步:50℃2min,95℃10min;

    第二步:95℃10s,70℃20s(每个循环降低1℃),75℃20s,10个循环;

    第三步:95℃10s,60℃20s,75℃20s,30个循环,60℃20s处收集荧光信号;

    第四步:95℃2min,40℃2min;

    第五步:40~80℃,每0.5℃收集荧光信号,荧光通道选用FAM和TET。

    ②程序运行完毕,将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋,将封口封严,按污染
    源处理。

    (3)试剂盒的参考值(参考范围)

    阳性对照,即野生型在各体系及各通道中的Tm值范围如下:

    反应体系A中FAM通道野生型对照峰的Tm值为57.0℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为65.0℃±1℃。

    反应体系B中FAM通道野生型对照峰的Tm值为63.5℃±1℃;TET通道野生型对照峰
    的Tm值为60.0℃±1℃。

    其中各Tm值是在特定Bio-Rad?CFX96仪器上所得的常见值,作为参考。当使用其它仪器
    时,Tm值可能略有变动,以当次试验阳性对照(野生型)所得的Tm值为准。

    Tm值以仪器自动判读所得为准,当仪器给出一个以上Tm值时,请参考阳性对照和阴性
    对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自动给出Tm值的情况时,可通过调整基线或直
    接人工判读的方法获得Tm值。

    (4)结果判读

    通过比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点(Tm值)的差异判断样品是否发生
    突变。当四个通道中样品的熔点与阳性对照的熔点均一致(误差不超过1℃)时判定为野生
    型,试验菌株对链霉素敏感;样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时(ΔTm≥2℃)判定为突
    变型,试验菌株对链霉素耐药。

    关于杂合样品结果的判读:当四个通道中任一通道熔解曲线出现双峰或融合峰时即为杂
    合样品,分3种情况:①当样品出现双峰时,即为杂合样品;②样品为一个融合峰,与阳性
    对照的熔点一致,但峰型与阳性对照的峰型有较大差异,在有可能出现突变峰的位置出现小
    峰或突起,即为杂合样品;③样品为一个融合峰,为突变熔点,但在野生峰的位置出现小峰
    或突起,即为杂合样品。杂合样品对链霉素耐药,建议出现杂合样品时将样品重复检测,以
    确定样品耐药性。

    实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或
    试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。





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    本文标题:一种结核分枝杆菌链霉素耐药突变的检测方法及试剂盒.pdf
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