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    重庆时时彩后一杀一码: 一种检测宫颈癌血浆BMI1MRNA的专用试剂盒及方法.pdf

    关 键 词:
    一种 检测 宫颈癌 血浆 BMI1MRNA 专用 试剂盒 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110167829.7

    申请日:

    2011.06.21

    公开号:

    CN102230014A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20110621|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; G01N21/64 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 山东大学齐鲁医院
    发明人: 王传新; 张欣
    地址: 250014 山东省济南市历下区文化西路107号
    优先权:
    专利代理机构: 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 代理人: 杨琪
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110167829.7

    授权公告号:

    102230014B||||||

    法律状态公告日:

    2012.05.23|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,具有结果稳定、分析可靠等优点,包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物,如SEQUENCE?LISTING所示。本发明还公开了一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA表达量的方法,具有操作简便易行等优点,步骤如下:(1)提取样本血浆的总RNA;(2)RT-PCR扩增;(3)制作标准曲线,计算斜率slope,根据公式E=10(-1/slope)-1,计算扩增效率E;(4)计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值和校对样本阈值,根据公式Q=(E+1)-ΔCq,得出基因的校正起始拷贝数Q;将样本目的基因的Q值与内参基因的Q值的几何平均数相比,得到目的基因Bmi-1的相对表达量。

    权利要求书

    1.一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,其特征在于:包括Bmi-1基因、GAPDH
    基因和EEF1A1基因的mRNA的引物,引物序列如下所示:
    Bmi-1-F:5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’;
    Bmi-1-R:5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’;
    GAPDH-F:5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’;
    GAPDH-R:5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’;
    EEF1A1-F:5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’;
    EEF1A1-R:5’-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3’。
    2.根据权利要求1所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,其特征在于:还包
    括PCR反应液,PCR反应液由Syber?Green?I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲
    基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾和氯化镁组成。
    3.根据权利要求2所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,其特征在于:所述
    上游引物和下游引物的体积均为1μl,其中,Bmi-1-F、Bmi-1-R、GAPDH-F、GAPDH-R、
    EEF1A1-F和EEF1A1-R的浓度均为10μM;所述PCR反应液中,各组分的浓度为:DNA
    聚合酶的浓度为100U/ml,dNTPs的浓度为0.2mM,三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为
    16.5mM,氯化镁的浓度为6mM,氯化钾的浓度为89.3mM和1×Syber?Green?I荧光染
    料。
    4.一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA表达量的方法,其特征在于,步骤如下:
    (1)提取样本血浆的总RNA;
    (2)RT-PCR扩增:将上述提取的mRNA进行反转录成cDNA,取cDNA为模板,加入
    引物和PCR反应液,进行PCR反应,检测样本阈值Cq(test?sample);同时以宫颈癌细
    胞株Hela细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA作为校对样本,在每个PCR反应板中进行
    检测;
    (3)制作标准曲线:从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,梯度稀
    释后,作为标准品,同步骤(2)进行RT-PCR扩增,检测CT值;然后拷贝数以10为底
    取对数作为横坐标,CT值为纵坐标作图,给出数据点的趋势线,制作标准曲线,计算斜
    率slope,然后根据公式E=10(-1/slope)-1,计算扩增效率E;
    (4)计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本
    阈值Cq(test?sample)和校对样本阈值Cq(calibrator?sample),根据公式Q=(E+1)-ΔCq,
    ΔCq=[Cq(test?sample)-Cq(calibrator?sample)],得出基因的校正起始拷贝数Q;将样
    本目的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何平均数相比,
    得到目的基因Bmi-1的相对表达量。

    说明书

    一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒及方法

    技术领域

    本发明涉及一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,以及检测宫颈癌血浆Bmi-1
    mRNA表达量的方法,属于分子生物学检测技术领域。

    背景技术

    宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在女性恶性肿瘤中位居第二位,据统计,
    全球每年有新增病例49.3万,死亡约27.4万,严重危害妇女的身心健康。早期诊断和早期治
    疗是预防和控制宫颈癌的关键,宫颈癌如及时发现,并进行恰当的处理,其治愈率几乎达
    100%。传统的细胞学检查Pap细胞涂片检查,曾经大大降低了宫颈癌的死亡率,但其发展受
    到多方面的限制,如对细胞检查技术人员的要求高,存在判断主观性,另外取材也容易出现
    假阴性。阴道镜加上病理检查是早期宫颈癌检查的金标准,但其不适用于筛选检查。因此,
    寻找敏感性和特异性更强的早期诊断标志物,建立一种经济准确、安全有效的血清学宫颈癌
    筛查方法是目前关注的焦点。

    近年来,肿瘤相关mRNA陆续在肿瘤患者的血浆/血清中被检测出来,为肿瘤的无创性
    早期诊断、治疗监测和预后判断提供了一条新的途径。并且,随着分子生物学技术的发展,
    通过实时荧光定量PCR方法检测血浆/血清中微量的肿瘤相关mRNA已成为可能。所谓实时
    荧光定量PCR技术是指在PCR反映体系中加入荧光基因,利用荧光信号的积累实时监测PCR
    的进程,最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术具有敏感性高、重复性好、
    操作简便、检测快速等特点,目前已在临床核苷酸检测领域得到广泛应用。

    Bmi-1(B?cell-specific?moloney?leukemia?virus?integration?site-1)基因为一种属于PcG
    (Polycomegroup)家族成员的致癌基因,自1991年在鼠淋巴瘤中被发现后即引起生物医学
    领域的高度关注。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区,含有10个外显子和
    10个内含子。人类Bmi-1?cDNA长3203bp,共有959个腺嘌呤、591个胞嘧啶、678个鸟嘌
    呤和975个胸腺嘧啶。Bmi-1开放的阅读框编码一个含326个氨基酸的蛋白质,相对分子质
    量为44000-46000。氨基酸序列分析表明,Bmi-1蛋白有几个重要的模序:(1)环指模序(ring?
    finger?domain,RF):位于N-末端的环指结构域,由锌指和C3HC4保守序列组成。Bmi-1通
    过环指与其他蛋白结合形成多聚复合物。RING结构域则控制着BMI-1蛋白在细胞核内的亚
    定位,该结构域缺失后BMI-1蛋白不再主要局限在细胞核边缘分布而是散在分布于整个细
    胞核中。(2)位于中心保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNA?banding
    helix-turn-helix-turn?motif,H-T-H-T)介导Bmi-1与DNA结合,可以和c-myc共同作用导致
    细胞增殖和肿瘤形成。HTHTHT结构域决定了Bmi-1的转录抑制功能,而与Bmi-1蛋白的分
    布无关。(3)Bmi-1蛋白分子内还有两个核定位信号(nuclear?localization?signal,NLS)——
    NLSI和NLS2,其中NLS2是Bmi-1蛋白定位于细胞核所必需的。(4)Bmi-1的C-末端部分
    是富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的PEST区域,与Bmi-1蛋白在细胞内快速降
    解有关。Bmi-1基因作为c-myc癌基因的协同基因,在细胞的中心体扩增调节中起着重要的
    作用,异常的中心体可以导致染色体的异常分裂,最终使遗传稳定性发生改变,干扰细胞正
    ?;疃⑸┍?。目前已发现Bmi-1基因表达异常与人类多种肿瘤的发生、发展相关。

    发明内容

    针对上述现有技术,本发明提供了一种快速、简便、准确的检测宫颈癌血浆中Bmi-1基
    因mRNA的专用试剂盒,以及检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA表达量的方法。

    本发明是通过以下技术方案实现的:

    一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA的专用试剂盒,包括Bmi-1基因、GAPDH基因和
    EEF1A1基因的mRNA的引物,引物序列如下所示(如SEQUENCE?LISTING所示):

    Bmi-1-F:5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’;

    Bmi-1-R:5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’;

    GAPDH-F:5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’;

    GAPDH-R:5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’;

    EEF1A1-F:5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’;

    EEF1A1-R:5’-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3’。

    所述专用试剂盒还包括PCR反应液,PCR反应液由Syber?Green?I荧光染料、DNA聚
    合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾和氯化镁组成。

    本发明所提供的试剂盒的引物序列是根据GeneBank序列号为的基因序列NM?005180、
    NM?002046和NM?001402为模板所设计的,其序列、Tm值及扩增产物长度见表1,该引物
    序列均跨越了原基因序列中的两个外显子,省去了DNA酶对样本的处理,避免了基因组DNA
    对实验结果的影响。

    一种检测宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA表达量的方法,步骤如下:

    (1)提取样本血浆的总RNA;

    (2)RT-PCR扩增:将上述提取的mRNA进行反转录成cDNA,取cDNA为模板,加入
    引物和PCR反应液,进行PCR反应,检测样本阈值Cq(test?sample);同时以宫颈癌细胞株
    Hela细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA作为校对样本,在每个PCR反应板中进行检测;

    (3)制作标准曲线:从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA,梯度
    稀释后,作为标准品,同步骤(2)进行RT-PCR扩增,检测Cq值;然后拷贝数以10为底取
    对数作为横坐标,Cq值为纵坐标作图,给出数据点的趋势线,制作标准曲线,计算斜率slope,
    然后根据公式E=10(-1/slope)-1,计算扩增效率E;

    (4)计算:选中样本和校对样本检测孔,应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样
    本阈值Cq(test?sample)和校对样本阈值Cq(calibrator?sample),根据公式Q=(E?+1)-ΔCq,
    ΔCq=[Cq(test?sample)-Cq(calibrator?sample)],得出基因的校正起始拷贝数Q;将样本目
    的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何平均数相比,得到
    目的基因Bmi-1的相对表达量。

    本发明建立的宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA检测方法,为宫颈癌的早期发现、早期治疗提供
    了重要的参考依据。

    本发明使用了在宫颈癌中表达相对稳定的GAPDH基因和EEF1A1基因作为内参基因,
    对标本中的Bmi-1基因mRNA进行相对定量分析,避免了单一内参基因表达不稳定对结果产
    生的影响。

    本发明任意选取一个已知目标检测基因表达的样品的总RNA(或cDNA),按10进行系
    列稀释,提供5个浓度的标准品,制作标准曲线,得出斜率(slope),避免了传统方法构建标
    准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐。然后根据公式E=10(-1/slope)-1,
    计算扩增效率(E),根据公式Q=(E+1)-ΔCq计算Bmi-1基因相对GAPDH基因和EEF1A1
    基因的表达量,避免了传统2-ΔΔCq法必须要求PCR扩增效率为100%的限制,使结果分析更
    加可靠。

    附图说明

    图1为EEF1A1基因、GAPDH基因和Bmi-1基因的标准曲线,其中,A:EEF1A1基因;
    B:GAPDH基因;C:Bmi-1基因。

    图2为血浆Bmi-1?mRNA在80例健康对照者(healthy)、42例CIN1级患者(CIN1),
    45例CIN2级患者(CIN2),51例CIN3级(CIN3)和138例宫颈癌患者(UCC)中的相对
    表达水平。

    图3为血浆Bmi-1?mRNA检测对宫颈癌诊断的ROC曲线。

    具体实施方式

    下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

    实施例一

    1、试剂盒的组成及配制:

    根据GeneBank序列号为的基因序列NM_005180、NM_002046和NM_001402为模板,
    设计的检测目标基因(Bmi-1)和内参基因(GAPDH和EEF1A1)mRNA的引物,其引物序
    列、Tm值及扩增产物长度见表1。该引物序列均跨越了原基因序列中的两个外显子,省去了
    DNA酶对样本的处理,避免了基因组DNA对实验结果的影响。

    表1引物序列、Tm值及扩增产物长度


    所述试剂盒进一步包括PCR反应液:由Syber?Green?I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs
    和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁组成。

    所述DNA聚合酶在PCR反应液中的终浓度为100U/ml。

    所述dNTPs在PCR反应液中的终浓度为0.2mM。

    所述氯化镁在PCR反应液中的终浓度为6mM。

    所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在PCR反应液中的终浓度为16.5mM。

    所述氯化钾在PCR反应液中的终浓度为89.3mM。

    2、标本采集

    采集109例宫颈癌患者,138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(其中CIN1级42例,CIN2
    级45例,CIN3级51例),80例健康对照者空腹静脉血3ml,1600g离心5分钟,分离血浆,
    保存于-80℃待测。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。

    3、血浆RNA提取

    1)、将样本浓缩到500μl,向每250μl样品中加入750μl?Trizol?LS(Invitrogen公司),混
    匀,在15~30℃下孵育5min,让核蛋白质复合物充分溶解。

    2)、加200μl氯仿,小心盖上盖子,剧烈震荡15s,然后15~30℃下15min。

    3)、4℃下12000g离心15min。

    4)、取上层水相,加入一个新的EP管内,同时加入500μl异丙醇,15~30℃下10min。

    5)、4℃下12000g离心10min。

    6)、弃上清,加入1ml?75%乙醇,漩涡震荡,4℃下7500g心里5min。

    7)、弃上清,将RNA沉淀空气中干燥5-10min,加10μl?DEPC水溶解,如果A260/A280<1.6,
    则在55-60℃下溶解10min,立即使用或-80℃保存。

    4、RT-PCR

    采用Applied?Biosystems公司的High?Capacity?cDNA?Reverse?Transcription?Kit逆转录试剂
    盒对上述mRNA进行反转录成cDNA,取5μl?cDNA为模板,进行PCR反应。

    PCR反应体系:

    模板DNA.5ul

    PCR反应液:12.5μl

    上游引物(10μM):1μl

    下游引物(10μM):1μl

    无菌水:5.5μl

    反应条件为:37℃→20分钟,95℃→10分钟;(95℃15秒,??55℃1分钟)→40个循环。

    同时以宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA,逆转录成cDNA作为校对样本,在每个
    PCR反应板中进行检测。

    5、标准曲线制作

    将从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取的mRNA,逆转录成cDNA,然后10倍梯度稀释成5
    个浓度,作为标准品,同待测样本一同进行RT-PCR扩增,制作标准曲线。

    6、结果判断

    1)、使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行阈值测定,对不同浓度标准品进行分析,
    对拷贝数以10为底取对数,作为横坐标,Cq值为纵坐标作图,给出数据点的趋势线,获得
    相对定量的标准曲线和斜率,根据公式E=10(-1/slope)-1,计算扩增效率(E);

    2)、选中样本和校对样本检测孔,应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值
    Cq(test?sample)和校对样本阈值Cq(calibrator?sample),根据公式Q=(E+1)-ΔCq,ΔCq=[Cq
    (test?sample)-Cq(calibrator?sample)],得出基因的校正起始拷贝数Q;

    3)、将样本目的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何
    平均数相比,得到目的基因Bmi-1的相对表达量(R)。

    7、检测结果

    1)、标准曲线见图1。

    2)、109例宫颈癌患者,138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(其中CIN1级42例,CIN2
    级45例,CIN3级51例),80例健康对照者血浆Bmi-1检测结果见图2。宫颈癌患者血浆Bmi-1
    mRNA中位水平为0.129(0.030~0.2705),CIN3、CIN2、CIN1血浆Bmi-1?mRNA中位水平
    分别为0.037(0~0.051)、0.023(0~0.044)和0.004(0~0.004),健康对照组血浆Bmi-1?mRNA
    中位水平为0.003(0~0.017)(各数据是根据“结果判断”中说明的过程得到的,对应于“结
    果判断”中的R值)。宫颈癌患者血浆Bmi-1?mRNA水平明显高于CIN各组和健康对照组,
    差异具有统计学意义(P<0.05)。

    3)、宫颈癌血浆Bmi-1?mRNA检测方法对宫颈癌的诊断价值分析

    以109例宫颈癌患者作为宫颈癌组,138例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者和80例健康对
    照者作为非宫颈癌组(218例),采用SPSS13.0统计学软件中的受试者工作曲线分析,得出
    血浆Bmi-1?mRNA检测宫颈癌的临界值为0.057,敏感性为69.7%,特异性为95.9%,诊断效
    能为0.801(见图3),说明血浆Bmi-1?mRNA对宫颈癌具有较大的诊断价值。



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