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    助赢重庆时时彩破解版: 一种简单快速鉴定转基因种子以及估算拷贝数的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 简单 快速 鉴定 转基因 种子 以及 估算 拷贝 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010566526.8

    申请日:

    2010.11.30

    公开号:

    CN102229976A

    公开日:

    2011.11.02

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20111102|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20101130|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12Q1/02; G01N21/64; C12N15/11; A01H5/00; A01H5/10 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 北京未名凯拓作物设计中心有限公司; 北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司
    发明人: 邓兴旺; 王海洋; 万向元; 周君莉
    地址: 100085 北京市海淀区上地西路39号北大生物城
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010566526.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.01.01|||2011.12.14|||2011.11.02

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本项发明提供了一种简单快速鉴定转基因种子并且估算外源基因拷贝数的方法。我们将红色荧光蛋白FP基因(由愈伤组织/种皮特异启动子驱动)与目标基因紧密串联在一起,利用农杆菌介导的方法导入水稻ms26雄性不育突变体中。转基因植株自交,产生无荧光、不含转基因成分的种子以及发荧光、含有转基因成分的两种类型种子。这两种类型的种子能够通过肉眼或者借助荧光显微镜直接分开,这种简单的分离方法准确率高达百分之百。同时,根据荧光种子与非荧光种子的比例,可以估算出外源基因在转基因株系中的拷贝数。由于本方法不需要将种子萌发以及对幼苗进行分子检测,因此鉴定后的种子可以方便的用于后期的科研或者生产。

    权利要求书

    1.一种鉴定杂交后代中是否含有转基因成份的方法,此方法包括:a)?一段核苷酸,包括荧光筛选标记序列,并由愈伤组织和种皮特异启动子驱动;b)?筛选标记基因转化至水稻ms26雄性不育突变体愈伤组织中,转化载体的T-DNA区域不含有抗生素或除草剂筛选基因;c)?筛选带荧光的转化细胞;d)?转化细胞再生成植株。2.?权利要求书1所述荧光种子。3.??权利要求书1中所述,筛选标记基因选自一种荧光蛋白(FP)基因。4.?权利要求书1中是荧光筛选标记序列与由三个SNP修饰过的MS26序列紧密连接。5.??权利要求书3所述FP基因序列为SEQ?ID?NO:1。6.??权利要求书1中的转化植株包含修饰过的MS26序列,该序列与由愈伤组织/种皮特异性启动子END2驱动下的FP基因紧密连锁。

    说明书

    一种简单快速鉴定转基因种子以及估算拷贝数的方法

    技术领域

    本发明属于生物技术领域及植物育种技术领域。本发明提供了一种简单有效的快速鉴定转基因种子与非转基因种子的方法,该方法不需要将种子发芽,可以方便地将转基因和非转基因两类种子区分开并方便的用于科研或者生产。

    背景技术

    转基因技术在农作物的品质改良、抗性增强等方面展现了巨大的应用潜力。然而,转基因的T0代往往是转基因杂合体,其自交产生1:2:1三种基因型的种子,四分之一为纯合非转基因种子,四分之一为纯合转基因种子,二分之一为杂合转基因种子。在传统转化方法中,在种子期无法鉴定转基因种子与非转基因种子,所以要按照每个株系分开播种,目标基因表型明显的,可以通过其表型将转基因苗和非转基因苗鉴别开来,目标基因表型不明显的,只能通过分子生物学手段如PCR技术来鉴定,工作量非常大,费用也很高。另外一种方法,由于传统转化中大多使用除草剂或者抗生素抗性标记基因为筛选基因,因此在T1代苗期可以使用除草剂或者抗生素等将非转基因苗杀死。这个方法有很多问题,第一,幼苗发育的不同阶段,对除草剂和抗生素的抗性程度不同,筛选剂的剂量不好掌握,高了可能会将转基因苗杀死,低了可能会使非转基因苗混杂其中。第二,除草剂和抗生素对环境和食品安全的潜在风险已经受到越来越多的关注,因此转化过程中人们已经尽量选用更为安全的筛选标记如糖类代谢过程中的关键酶如PMI、xylA等,但这类筛选标记的转基因植物在大田里筛选比较困难。

    转基因种子中如果混杂了非转基因种子也是一个很严重的问题,会直接影响农民的生产收入。例如,据报道,印度市场上的转基因棉花种子,有46%都混有非转基因棉种,给农民造成了惨痛的经济损失,很多棉农因此负担了沉重的债务而自杀。

    因此,如果能够在种子期鉴定转基因种子和非转基因种子,将能够对下一步的科研工作以及生产中的实际应用带来巨大的便利。目前,还没有一种快速、稳定、安全的方法能够完成这一工作。本项发明将填补这一空白。我们使用荧光蛋白做转化过程中的筛选标记,荧光蛋白是一种安全的筛选标记,荧光的发生不需要任何底物和辅助因子,其表达产物也对细胞没有任何毒性,不会影响细胞的正常生长和功能,在种子期,利用荧光显微镜或者仅仅用肉眼就可以鉴定种子是否带有转基因成分,从而方便地将转基因和非转基因两类种子区分开。

    发明内容

    转基因植物T0代往往为转基因杂合体,自交产生1:2:1三种基因型的种子。从传统技术来讲,在种子期无法区分转基因和非转基因种子,因此给下一步的工作带来了诸多不便。本发明利用红色荧光蛋白基因做筛选标记,转基因植株所结种子利用荧光显微镜甚至只用肉眼就可以鉴定是否为转基因种子,有效地解决了这一难题。

    本发明的优点在于,无需将种子发芽,也无需借助分子生物学等手段,就能够简单的鉴定转基因种子与非转基因种子,准确率高达100%,同时,根据荧光种子和非荧光种子的比例,可以估计外源基因在植物基因组中的拷贝数。

    本发明依次通过下列步骤实现:

    1)??载体构建:将筛选标记基因融合于愈伤组织和种皮特异性启动子下游,用于转化个体的愈伤组织和种皮筛选。将目的基因和筛选标记基因紧密连锁构建于质粒载体T-DNA区。

    2)??转化:利用农杆菌介导的方法转化植物,利用筛选标记基因对转化个体进行筛选,进而分化成再生植株。

    3)??结实:阳性转基因植株自交,产生荧光种子和非荧光种子。

    4)??鉴定:利用肉眼或借助荧光显微镜鉴定荧光种子(转基因种子)和非荧光种子(非转基因种子)。

    5)??进一步检测:将分离开的种子发芽,长成幼苗,利用PCR,Southern?blot等分子生物学方法进一步检测。

    6)??估算拷贝数:根据荧光种子与非荧光种子的比例,估算外源基因在转基因株系内的拷贝数。

    本发明所涉及的植物叶片总DNA提取技术、PCR技术、Southern?blot技术、植物遗传转化技术等均为公知技术,其中来自玉米的愈伤组织和种子特异性启动子END2的核苷酸序列、FP基因编码序列及来自马铃薯的终止子PINⅡ终止子的序列均可在NCBI数据库中查阅。

    附图说明

    图1显示了实施例1中植物表达载体pSPT51结构示意图。

    图2显示了实施例2中经农杆菌转化后表达红色荧光蛋白的水稻愈伤组织。

    图3显示了实施例2中经农杆菌转化后获得的再生植株。

    图4显示了实施例3中部分植株的PCR鉴定(M:?DNA?分子量标准;?-:?负/阴性对照;?+:?正/阳性对照)。

    图5显示了实施例4中部分转基因植株的Southern?blot鉴定(C:阴性对照,M:分子量标准;质粒:以转化质粒作为阳性对照)。

    图6显示了实施例5中大田中肉眼观察到的转基因植株,所结实包括红色荧光种子和无荧光种子。

    图7显示实施例5中发荧光和不发荧光的糙米。

    具体实施方式

    下文结合实施例和附图具体描述本发明的技术方案,但不限于此。

    本发明实施例中具体涉及两个基因,分别是FPOsCYP704B2。FP用作报告/筛选标记基因,来源于礁珊瑚(Discosoma?sp.),它可编码红色荧光蛋白,可被激发出红色荧光,用于转基因的愈伤组织和种子的筛选,其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2;OsCYP704B2为水稻内源基因,催化脂肪酸羟基化,参与花药角质单体生物合成及花粉粒外壁型成,OsCYP704B2基因转入ms26雄性不育突变体可使其育性恢复。其核苷酸序列及氨基酸序列分别见SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4。

    实施例1:构建表达载体

    本发明中转化所使用表达载体名称为pSPT51(图1)。该载体是在pPZP基础上人工构建而来。表达载体上有2个基因表达盒:一是OsCYP704B2基因表达盒,该表达盒由OsCYP704B2基因和自身内源启动子和终止子构成。为了区别水稻本身的内源OsCYP704B2基因及通过表达载体转化入水稻的OsCYP704B2基因,在野生型等位基因OsCYP704B2中引入3个单核苷酸突变位点(SNP)突变后转化至水稻中,这3个SNP分别在第1468、1470和1473位碱基处,均由G突变为C。这些改变均不影响所编码的氨基酸序列。修饰后的OsCYP704B2基因核苷酸序列见SEQ?ID?NO.3所示,其中?SNP由方框标出;二是报告/筛选标记基因FP基因(SEQ?ID?NO.1)表达盒,该基因由来自玉米的愈伤组织/种子特异性启动子END2(其核苷酸序列见SEQ?ID?NO.5)驱动,并由来自马铃薯的终止子PINⅡ终止转录,PINⅡ的核苷酸序列见SEQ?ID?NO.6。

    T-DNA区段内不含抗生素抗性标记基因,也不含除草剂筛选标记基因。

    实施例2:转化水稻ms26雄性不育突变体材料,获得转基因水稻植株

    将实施例1中表达载体用电击法导入农杆菌菌株AGLO中,用于转化水稻ms26雄性不育材料的愈伤组织。利用红色荧光蛋白对转化愈伤组织进行筛选,附图2为表达外源基因的愈伤组织,进一步将其分化再生出表达外源基因的转化植株(附图3)。

    ?

    实施例3:转基因植株的PCR检测

    取实施例2中的转基因水稻植株叶片,抽取总DNA。以FP基因序列为模板设计引物,对T0代转基因水稻基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物片段为789bp。扩增程序为:94℃?10min;94℃?1min,60℃?1min,?72℃?1min;37?循环;72℃?10min。正向引物序列为5’-GGACTTGAACTCCACCAGG-3’;反向引物序列为:5’-ATAATGCCAATACGACACC-3’。附图4为部分转基因植株PCR扩增结果,说明外源基因已整合至水稻受体基因组中。

    ?

    实施例4:转基因植株的Southern?Blot检测

    对T0代转基因水稻基因组DNA进行Southern?Blot检测,以鉴定外源基因在水稻转化受体中的整合情况。取实施例2中T0代转基因水稻植株叶片,抽取总DNA。以FP基因序列中的526bp核苷酸片段为探针,选用NEB公司的XbaⅠ限制性内切酶进行消化反应。酶切反应体系为200ul:基因组DNA15ug、NE?Buffer?20ul、BSA?2ul、XbaⅠ4ul(20?U/ul)并用无离子水将体系补足至200?ul。37℃?温育?6小时。Southern?Blot检测结果表明,外源基因已整合至受体水稻基因组中。

    实施例5:鉴定转基因种子与非转基因种子

    在转基因水稻T1代植株上收获的种子(即T2代种子)中,表达FP基因的糙米(去除颖壳的种子)可被激发出红色荧光(附图7的左半部分),而非转基因种子无荧光(附图7的右半部分)。?

    序列表

    <110>??北京未名凯拓作物设计中心有限公司?

    ???????北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司

    <120>??一种简单快速鉴定转基因种子以及估算拷贝数的方法

    <160>??6?????

    <170>??PatentIn?version?3.3

    <210>??1

    <211>??678

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    <213>??人工合成

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    序列表

    <110>??北京未名凯拓作物设计中心有限公司

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    <120>??一种简单快速鉴定转基因种子以及估算拷贝数的方法

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