重庆时时彩后4走势: 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用.pdf

(10)申请公布号 CN 102206605 A (43)申请公布日 2011.10.05 CN 102206605 A *CN102206605A* (21)申请号 201110110227.8 (22)申请日 2011.04.29 CGMCC No.4114 2010.08.25 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 杨虹 田川 潘建良 谭晶 李道棠 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王锡麟 王桂忠 (54) 发明名称 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控 制中的应用 (57) 摘要 一种微生物应用技术领域的具有溶藻活性的 微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用， 通过从 太湖水体中分离获得具有较强溶藻活性的微小杆 菌 A27(Exiguobacterium sp.A27)， 保藏号 CGMCC No.4114。用于新型杀藻剂的研发和生产， 最终应 用于湖泊蓝藻水华的控制。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 CN 102206608 A1/1 页 2 1. 一株具有溶藻活性的微小杆菌 A27， 其特征在于， 其名称为 ： Exiguobacterium sp.A27， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号 CGMCC No.4114， 保藏日期为 2010 年 10 月 1 日。 2.一种根据权利要求1所述微小杆菌A27的无菌发酵液的制备方法， 其特征在于， 通过 将微小杆菌A27接种于pH7.0的灭菌LB液体培养基中， 在37℃、 200rpm的环境下发酵24小 时得到其含菌发酵液 ； 进一步经 12000g 离心 20min 后将上清再用 0.22μm 孔径的膜过滤， 得到无菌发酵液。 3. 一种根据权利要求 1 或 2 所述微小杆菌 A27 的应用， 其特征在于， 用于抑制蓝藻水 华。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征是， 通过将所述微小杆菌A27制备得到的无菌发 酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。 权 利 要 求 书 CN 102206605 A CN 102206608 A1/5 页 3 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用 技术领域 [0001] 本发明涉及的是一种微生物应用技术领域的菌株及方法， 具体是一种具有溶藻活 性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用。 背景技术 [0002] 随着全球水体富营养化的加剧， 有害藻类水华的爆发日趋频繁， 其造成的环境和 经济问题日益引起人们的重视， 针对我国湖泊面临的严重富营养化问题， 在湖内污染源、 流 域点源与面源污染控制需要投入巨大资金且短期内难以取得成效的情况下， 探索控制浮游 藻类生物量和抑制 “水华” 发生的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归纳为物理 方法、 化学方法和生物方法。物理方法主要是电磁场、 机械除藻等， 可作为蓝藻水华控制的 辅助性措施， 但处理能力有限?；С宓姆椒ㄖ饕ㄊ┯贸菁?、 杀藻剂及金属盐等， 化学药剂除藻技术虽有快速高效的优点， 但会带来水体的二次污染问题， 不适于在作为饮 用水源地的水域应用。 在利用物理、 化学和常规方法治理水华不甚理想的情况下， 寻找一种 更加有效的水华防治途径势在必行。 [0003] 溶藻细菌作为防治水华的可能微生物已经引起越来越多的关注。据报道， 多数溶 藻细菌能够分泌胞外物质， 可对宿主藻类起到抑制或者灭杀的作用， 因此通过筛选高效溶 藻细菌或分离富集溶藻细菌产生的高效溶藻物质开发生物杀藻剂就成为一个很有发展潜 力的新思路。从自然水体中分离纯化出可以抑制和灭杀铜绿微囊藻 (Microcystis)( 蓝藻 水华中最常见和主要藻类 ) 的溶藻细菌， 对于安全、 快速和高效治理蓝藻水华问题具有重 要的实践价值。 发明内容 [0004] 本发明针对现有技术存在的上述不足， 提供一种具有溶藻活性的微小杆菌及其在 蓝藻水华控制中的应用， 从太湖水体中分离获得了一株具有较强溶藻活性的微小杆菌 A27， 可以用于新型杀藻剂的研发和生产， 最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。 [0005] 本发明是通过以下技术方案实现的 ： [0006] 本发明涉及一株具有溶藻活性的微小杆菌 A27， 其学名为 ： Exiguobacterium sp.A27， 该菌株为杆菌， 1.1～1.2μm×1.4～3.2μm， 革兰氏阳性， 不生孢， 不抗酸。 以周生 鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦， 淡橙色， 色素不扩散。嗜碱， 能在 pH6.5 ～ 11.5 生长?；芤煅?， 发酵代谢?？梢岳闷咸烟?、 蔗糖、 半乳糖和一些其他糖产酸， 主 要产物是乳酸、 乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性， 氧化酶阴性?？梢曰乖跛嵫?， 水解明胶、 淀粉和酪素。最适生长温度 37℃。经 16s rRNA 基因序列分析和同源性比较， 得知其与某 微小杆菌菌株有 97％的同源性， 故鉴定为微小杆菌属细菌， 命名为微小杆菌 A27， 该菌种的 16s rRNA 基因在 GenBank 中的登录号是 FJ751911。 [0007] 上述具有溶藻活性的微小杆菌 A27 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 保藏号 CGMCC No.4114， 保藏日期为 2010 年 10 月 1 日。 说 明 书 CN 102206605 A CN 102206608 A2/5 页 4 [0008] 保藏机构地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所， 邮编 ： 100101 电话 ： 86-10-64807596。 [0009] 本发明涉及上述微小杆菌 A27 的无菌发酵液的制备方法， 通过将微小杆菌 A27 接 种于 pH7.0 的灭菌 LB 液体培养基中， 在 37℃、 200rpm 的环境下发酵 24 小时得到其含菌发 酵液 ； 进一步经12000g离心20min后将上清再用0.22μm孔径的膜过滤， 得到无菌发酵液。 [0010] 本发明涉及利用上述微小杆菌 A27 抑制蓝藻水华， 通过将所述微小杆菌 A27 制备 得到的无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。 [0011] 实验表明， 上述微小杆菌 A27 的溶藻效果具有广谱性。在细菌密度高于 4×107个 /mL时A27对铜绿微囊藻表现出了很好的溶藻效果， 同时微小杆菌A27对处于延滞期和对数 期的铜绿微囊藻具有很好的溶藻效果 ； 同时微小杆菌A27用液体LB培养后的含菌发酵液及 离心过滤除菌后的无菌发酵液都均有较强的溶藻活性。 该无菌发酵液经过高温处理后溶藻 活性没有明显下降， 说明发酵液中的溶藻成分具有热稳定性。微小杆菌 A27 发酵液中的溶 藻活性成分可以用甲醇提取出来， 该甲醇提取物也具有很强的溶藻活性。微小杆菌 A27 及 其发酵液和甲醇提取物均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制。 附图说明 [0012] 图 1 为加入的 A27 菌液中细菌密度差异对溶藻效果的影响示意图 ； [0013] 图中 ： (a) 微小杆菌 A27 不同接种浓度时铜绿微囊藻细胞密度随时间的变化曲线。 (b)微小杆菌A27不同接种浓度时细菌密度随时间的变化曲线(■ ： 对照， ● ： 1.5×104， ▲ ： 1.5×105，1.5×106，1.5×107和1.5×108个 /mL)。图中箭头表示接种点。 [0014] 图 2 为 A27 菌液对三个不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果示意图 ； [0015] 图中 ： ■ ： 对照， ● ： 对数期藻， ▲ ： 延滞期藻， 平台期藻 )。图中箭头表示接种 点。 [0016] 图 3 为 A27 无菌发酵液、 121℃热处理后的无菌发酵液、 发酵液甲醇提取物和空白 LB 培养基的溶藻效果示意图 ； [0017] 图中 ： (a) 微小杆菌 A27 的无菌发酵液溶藻效果 ( 浓缩 10 倍 )。(b) 微小杆菌 A27 的无菌发酵液经过高温灭菌后的溶藻效果 ( 浓缩 10 倍 )。(c) 微小杆菌 A27 发酵液的甲醇 提取物的溶藻效果 .(d)LB 培养基溶藻效果 ( 浓缩 10 倍， 作对照 )。 具体实施方式 [0018] 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的?；し段Р幌抻谙率龅氖凳?例。 [0019] 实施例 [0020] 1. 溶藻细菌的筛选 [0021] 将太湖梅梁湾水域采集的自然水样 50μl 接种于 5mL LB 液体培养基中培养富集 24h(37℃， 200rpm 发酵培养 )， 将培养液加入到 100mL 培养至对数期的铜绿微囊藻 PCC7806 的藻液(藻细胞密度约1×107个/mL)中。 两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂LB平板， 37℃ 培养 24h， 取菌落密度适中的平板， 按照菌落形态的不同挑选不同菌株。 说 明 书 CN 102206605 A CN 102206608 A3/5 页 5 [0022] 将筛选出来的溶藻细菌按照 1％的比例分别接种入 10mL LB 培养基中， 37℃， 200rpm培养24h， 将10mL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中(藻细胞 密度约 1×107个 /mL)。另外将 10mL 灭菌后的 LB 培养基同样加入 90mL 藻液中作为对照。 所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养 48h 后计算其溶藻效率， 选取了其中溶藻 效率最高的一株细菌进行进一步研究， 该菌株代号为 A27。 [0023] 藻液培养条件 ： 铜绿微囊藻用 BG11 液体培养基培养， 放置于光照培养箱中， 25℃， 光照强度 40μmol photons m-2s-1， 光暗周期比为 12 ∶ 12。 [0024] 溶藻效率计算方法 ： 溶藻效率(％)＝(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/ 对照组藻细胞密度＊ 100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度可以用血球计数板测定。 [0025] 2.A27 菌株的鉴定 [0026] 用形态观察、 染色、 生理生化反应、 16s rRNA 基因序列分析等方法对溶藻效果最强 的微小杆菌 A27 进行鉴定， 该菌株为杆状， 1.1 ～ 1.2μm×1.4 ～ 3.2μm， 革兰氏阳性， 不生 孢， 不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在 LB 平板上菌落平坦， 淡橙色， 色素不扩散。嗜 碱， 能在 pH6.5 ～ 11.5 生长?；芤煅?， 发酵代谢?？梢岳闷咸烟?、 蔗糖、 半乳糖和一 些其他糖产酸， 主要产物是乳酸、 乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性， 氧化酶阴性?？梢曰乖?硝酸盐， 水解明胶、 淀粉和酪素。最适生长温度 37℃。经 16s rRNA 基因序列分析和同源性 比较， 得知其与 GenBank 中某微小杆菌菌株有 97％的同源性， 故鉴定为微小杆菌属细菌， 命 名为微小杆菌A27。 该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏号为CGMCC No.4114， 保藏日期为2010年10月1日。 该菌种的16s rRNA基因在GenBank 中的登录号是 FJ751911。 [0027] 3.A27 菌体密度对溶藻效果的影响 [0028] 将微小杆菌 A27 按照 1％接种量分别接种于 5 份 LB 培养基中 ( 各 10mL)， 37℃， 200rpm 摇床培养 24h 后将菌液 12000g 离心， 弃上清， 离心下来的菌体用适量无菌 LB 重悬 后按照 1 ∶ 9 的比例加入 90mL 铜绿微囊藻藻液 ( 藻细胞密度约 1×107个 /mL) 中， 使得五 个实验组的初始 A27 细菌密度分别为 1.5×104个 /mL， 1.5×105个 /mL， 1.5×106个 /mL， 1.5×107个 /mL， 1.5×108个 /mL。使用 10mL 无菌 LB+90mL 藻液作为对照组。每 24h 测对 照组和五个实验组的藻细胞密度 ( 血球计数板法 ) 和藻液中的 A27 细菌密度 ( 平板涂布 法 )， 每个样品测三个平行样， 表示成平均值 ± 标准差的形式， 如图 1 所示。 [0029] 实验结果表明 ： 当藻液中的细菌浓度超过一个特定阈值时， 微小杆菌 A27 开始表 现出明显的溶藻效果， 从图 1 得出这个细菌密度阈值大约是 4×108个 /mL。 [0030] 4.A27 菌株对不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果 [0031] 将 3 份按照步骤 3 所述方法在 LB 培养液中培养 24 小时的 A27 菌液 ( 各 10mL) 分 别加入到处于延滞期 ( 藻细胞密度约 5.25×106个 /mL)、 对数期 ( 藻细胞密度约 1.22×107 个 /mL) 和平台期 ( 藻细胞密度约 2.20×107个 /mL) 的铜绿微囊藻藻液中 ( 各 90mL)， 在光 照培养箱中培养， 每 24 小时用血球计数板法测定对照组和实验组的藻细胞密度， 每个样品 测三个平行样， 表示成平均值 ± 标准差的形式， 如图 2 所示。 [0032] 实验结果表明微小杆菌 A27 对于处于延滞期和对数期的铜绿微囊藻具有较好的 溶藻效果 (2 天时溶藻率分别为 61.9％和 62.6％ )， 对于平台期藻细胞溶藻效果较差 (2 天 时溶藻率为 22.4％ )。 说 明 书 CN 102206605 A CN 102206608 A4/5 页 6 [0033] 5.A27 菌株对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果 [0034] 将 13 份按照步骤 3 所述方法培养好的 10mLA27 菌液分别加入 13 株蓝藻和真核藻 ( 表 1) 的藻液中 (90mL， 所有藻液均培养到对数期 )， 同样使用空白 LB 培养基分别加入 13 种藻液中作为对照(1∶9)， 在光照培养箱中培养48h后分别测定所有实验组和对照组的藻 液的叶绿素浓度， 计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样， 表示成平均值 ± 标准差的形 式。 [0035] 本实验中用到的藻种有7株购自武汉水生所藻种库， 另外6株筛选自太湖水体。 实 验结果表明， 微小杆菌 A27 对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果， 对两株真核藻种 ( 绿藻 M7 和衣藻 BS3) 没表现出很好的溶藻效果 ( 表 1)。此结果表明微小杆菌 A27 的溶藻 能力具有广谱性， 是一种非常有潜力的溶藻细菌。 [0036] 表 1. 微小杆菌 A27 对 13 株藻株的溶藻效果 [0037] [0038] [0039] 注 ： 表中用星号(＊)标记的藻株是从太湖梅梁湾水体中筛选得到的， 其余藻株都 是购买自武汉淡水藻种库。 [0040] 6.A27 发酵液、 无菌发酵液和其甲醇提取物的制备方法 [0041] 将微小杆菌 A27 按照 1％接种量接种于灭菌 LB 培养基中， 37℃下 200rpm 摇床培 养 24h 后得到微小杆菌 A27 发酵液 ( 含菌 )。此含菌发酵液经过 12000g 离心 20min 后再用 0.22μm 孔径的微孔滤膜过滤后得到 A27 无菌发酵液。将 100mL 无菌发酵液用旋转蒸发器 蒸干后， 残留固体用 1L 的甲醇浸泡过夜， 再将甲醇溶液经过 12000g 离心 20min 后取上清， 蒸干后得到 A27 无菌发酵液的甲醇提取物。 [0042] 7.A27 菌株溶藻方式的研究 [0043] 将 2mLA27 发酵液按照步骤 6 所述的方法制成无菌发酵液， 用离心干燥器浓缩 10 倍后得到其无菌浓缩上清。 另外将2mLA27无菌发酵液在121℃下灭菌20min后在用离心干 说 明 书 CN 102206605 A CN 102206608 A5/5 页 7 燥器浓缩 10 倍后得到其高温处理后的无菌浓缩上清。另外将 2mLA27 发酵液按照步骤 6 所 述的方法制成甲醇提取物， 用 200μl 无菌水溶解后备用。最后把 2mL 的灭菌 LB 培养基同 样离心干燥浓缩 10 倍作为对照。将按照上述方法制得的 A27 无菌浓缩上清、 高温处理的无 菌浓缩上清、 甲醇提取物以及浓缩 LB 对照分别加入圆纸片 ( 直径 1cm) 上， 放置于铜绿微囊 藻制成的 BG11 固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养 2 天后观察圆纸片周围的抑藻 圈的形成以判断其溶藻效果。 [0044] 铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法 ： 向每块平板上倒入适量 ( 约 20mL)BG11 固体培 养基(琼脂比例1.5％)， 待其凝固后备用。 将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液12000g离心 20min 后弃掉上清， 收集藻细胞沉淀加入到 100mL 灭菌后的 BG11 软琼脂固体培养基中 (1％ 琼脂， 放置于 53℃水浴中防止凝固 )， 摇匀后倒入制好的 BG11 固体平板上层 ( 每块平板约 倒入 20mL)， 待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。 [0045] 实验结果显示微小杆菌A27的无菌发酵液有很好的溶藻效果(图3a)， 这表明该菌 株是分泌某些胞外溶藻物质进行溶藻。经过 121℃高温处理后的无菌发酵液也表现出了很 好的溶藻能力 ( 图 3b)， 说明发酵液中的溶藻成分不是大分子蛋白质， 具有较强热稳定性。 甲醇提取物的溶藻能力 ( 图 3c) 表明发酵液中的溶藻成分极性较强， 容易溶于甲醇这种极 性较强的有机溶剂。 说 明 书 CN 102206605 A CN 102206608 A1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102206605 A CN 102206608 A2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102206605 A