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    重庆时时彩立体图标: 一株氧化木糖无色杆菌MG1及其应用.pdf

    关 键 词:
    氧化 无色 杆菌 MG1 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110020431.0

    申请日:

    2011.01.18

    公开号:

    CN102181379A

    公开日:

    2011.09.14

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20110118授权公告日:20130403终止日期:20140118|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20110118|||公开
    IPC分类号: C12N1/20; C02F3/34; C12R1/025(2006.01)N 主分类号: C12N1/20
    申请人: 云南大学
    发明人: 黄晓玮; 乔敏; 王纪爱; 周薇; 张克勤
    地址: 650091 云南省昆明市翠湖北路2号
    优先权:
    专利代理机构: 昆明今威专利代理有限公司 53115 代理人: 杨宏珍
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110020431.0

    授权公告号:

    |||102181379B||||||

    法律状态公告日:

    2015.03.18|||2013.04.03|||2011.11.02|||2011.09.14

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌MG1及其应用,属微生物环境应用领域。本发明通过常规的方法从从印染污水中分离到的细菌中筛选到,氧化木糖无色杆菌(Achromobacter?xylosoxidans)MG1菌株,已于2010年12月15日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCC?NO.4476。本发明的氧化木糖无色杆菌菌株MG1,对三苯甲烷类染料中的孔雀绿具有超强的脱色高效性,在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时,1小时对其脱色率可高达86±1%。此外,MG1菌株对结晶紫也有较好的脱色的作用,能够作为制备生物脱色剂的应用本发明具有能扩宽降解染料的菌种范围,使得环境中的孔雀绿、结晶紫多了一条人工降解的途径,降低环境污染治理成本的优点。

    权利要求书

    1: 一株氧化木糖无色杆菌 MG1 菌株, 从印染污水中分离到的细菌中筛选到, 其特征在 于: 氧化木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)MG1 菌株, 已于 2010 年 12 月 15 日 保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心, 保藏号 : CGMCC NO.4476。
    2: 权利要求 1 所述的氧化木糖无色杆菌 MG1 菌株, 其特征在于 : 该菌株从自然界分离 后, 经纯化、 培养、 驯化后, 对三苯甲烷类染料孔雀绿具有超强的脱色活性, 且对结晶紫亦有 较好的脱色的作用, 能够作为制备生物脱色剂的应用。

    说明书


    一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用

        技术领域 :
         本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用, 属微生物环境应用领域。 背景技术 :
         随着科技的发展, 合成染料被广泛应用于纺织、 皮革、 食品、 日用化工等行业中。 但 这些染料通常含有复杂的芳香环结构、 化学稳定性高、 环境可降解性低, 且多数染料及其代 谢中间产物具有致突变性、 致癌性和其他毒性, 这也使得染料成为重要的环境污染物之一。 作为污染源, 染料的首先特点就是污染量大。据统计, 目前世界染料年产量约为 80 ~ 90 万 吨, 我国染料年产量达 15 万吨, 位居世界前列。在染料的使用过程中大约有 10%~ 15%被 直接排放到污水处理系统或环境中。 其废水治理率不足 30%, 治理合格率仅 57.6%。 因此, 仅从废水治理方面来看, 染料行业的环境?;と挝褚彩窍嗟奔杈薜?。
         其中的三苯甲烷类染料是以三苯甲烷为母体的一类染料, 其分子结构是中心碳原 子上连有三个苯环, 不同的侧链基团决定了不同染料结构和一些相应的特性。这类染料具 有着色力强、 色泽鲜艳等特点, 因而被广泛用于纺织、 造纸、 医药、 食品和化妆品等领域。较 常见的有 : 孔雀绿、 结晶紫、 及碱性品红。此外, 它们还被广泛用做治疗皮肤病的药剂。但体 外试验表明, 这些化合物具有有丝分裂毒性??兹嘎淘谂ǘ鹊椭?0.1mg/L 时, 对哺乳动物细 胞都是高毒性的, 能促进肝脏肿瘤的形成以及导致小白兔和鱼的异常增殖。 因此, 必须采取 有效的措施来将染料的危害降到最低。
         对于染料处理, 目前各国主要有 : 物理、 化学和生物的方法。但物化法的运行成本 通常较高, 效率较差, 且容易产生二次污染。 生物降解染料废水具有成本低, 无二次污染, 生 态恢复性好等优点, 已成为国内外学者研究的热点。生物降解处理是一种急待开发的新技 术, 因而筛选高效广谱的染料脱色菌株具有重要的理论和实用价值。
         氧化木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans) 是一类广泛存在于环境中的 杆状革兰氏阴性细菌。 Achromobacter xylosoxidans MGl 是我们实验室从印染污水中分离 筛选, 并经过驯化得到的一株高效降解孔雀绿的菌株。关于其脱色活性和相关机理尚未见 报道。 发明内容 :
         本发明的目的在于提供一株氧化木糖无色杆菌 MG1 及其应用, 通过对一株氧化木 糖无色杆菌 MG1 的研究, 开发生物脱色剂。
         本发明人在开展染料脱色机理的研究中, 从印染污水分离到的细菌中筛选到氧化 木糖无色杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)MG1 菌株, MG1 菌株已于 2010 年 12 月 15 日 保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心, 保藏号 : CGMCC NO.4476, 保藏单位地 址: 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。
         本发明筛选到的一株氧化木糖无色杆菌 MG1, 其特征为 : 短杆状或圆棒状, 多以散 在形式存在, 革兰氏阴性。在 LB 平板培上菌落小呈圆形, 乳白色, 凸起, 不透明, 表面湿润,边缘较整齐。同时我们的研究还发现, 该菌株具有高效的降解三苯甲烷类染料孔雀绿和结 晶紫的活性, 其所具有的脱色功能主要源于胞内酶、 及胞外小分子化合物成份。巢式 PCR 结 果显示, 该菌含有降解三苯甲烷类染料的基因 tmr。 甲吡酮抑制实验表明, 细胞色素 P450 不 参与胞内的染料降解过程。此外, 菌体本身也具有对染料进行物理性吸附的作用。
         本发明通过常规的方法从自然界中进行菌株分离、 纯化、 培养, 然后经过五次驯化 处理, 使其具有超强的脱色高效性。 在孔雀绿的浓度高达 2000mg/L 时, 1 小时对其脱色率可 高达 86±1%。 本发明的菌株对三苯甲烷类染料中的结晶紫有较好的脱色的作用, 能够作为 制备生物脱色剂的应用。
         本发明具有能扩宽降解染料的菌种范围, 使得环境中的孔雀绿、 结晶紫多了一条 人工降解的途径, 降低环境污染治理成本的优点。 附图说明 :
         图 1 为氧化木糖无色杆菌 MG1 的菌落形态照片及其光镜下的菌体。其中图 1-a 为 氧化木糖无色杆菌 MG1 的菌落形态 ; 图 1-b 为光镜观察的氧化木糖无色杆菌 MG1。
         图 2 显示氧化木糖无色杆菌 MG1 在不同孔雀绿浓度下的脱色率。 图 3 为氧化木糖无色杆菌 MG1 中基因 tmr 的克隆和序列的比对结果。其中 3-a 为 PCR 扩增基因 tmr 的琼脂糖电泳图 ; 图 3-b 为基因 tmr 和 Citrobacter 来源的同源序列比 对的结果。
         具体实施方式 :
         以下是本发明的实施例, 但本发明的内容并不局限于此。
         本发明是这样实现的 :
         筛选纯化出氧化木糖无色杆菌后, 用孔雀绿对其进行多次驯化。然后测其最终的 脱色活性。并对其胞内和胞外的脱色机理进行探究。
         氧化木糖无色杆菌 MG1 的纯化、 培养及驯化方法 ( 以下为重量百分比 ) :
         1、 平板纯化培养
         LB 平 板 培 养 基 配 方 为 : 0.5 % YeastExtract, 1 % Tryptone, 1 % NaCl, 1.5-2 % Agar, pH 自然。将混合菌体接种到平板培养基上, 37℃下培养, 获得单菌落。
         2、 液体扩大培养
         LB 液体培养基配方为 : 0.5% Yeast Extract, 1 % Tryptone, 1 % NaCl, 余下的为 水, pH 自然。将平板上的单菌落接种进液体培养基, 过夜培养直到 OD600 为 0.50 ~ 0.60。恒 温摇床温度为 38℃, 转速为 190rpm。
         3、 菌株的驯化
         驯 化 培 养 基 的 配 方 为: KH2PO40.05 %, K2HPO40.15 %, NaCl 0.05 %, MgSO4·7H2O0.05%, NH4Cl 0.1%, 孔雀绿的浓度由 50mg/L 增至最后的 100mg/L。每次驯化 的时间为 5 天。驯化在 38℃的恒温摇床上进行, 转速为 190rpm。
         氧化木糖无色杆菌 MG1 对孔雀绿的脱色试验 :
         1、 不同菌株脱色能力的测试
         脱色培养基成分为 : 0.5% Yeast Extract, 1% Tryptone, 1% NaCl, 40mg/L 的孔雀绿。将经过过夜培养的菌液按一定的接种量接种进脱色培养基, 定时测试不同菌株的脱色 率, 筛选出其中脱色能力最强的一株。
         2、 脱色率的计算方法
         孔雀绿的特征性吸收波峰为 617nm, 脱色率就是通过紫外 - 可见光扫描式分光光 度仪测试在最大吸收波峰处峰值的降低情况来进行计算的。将脱色后的培养液离心处理 (12,000rpm, 2 分钟 ), 上清在 617nm 处测吸光度。脱色率的计算公式为 :
         脱色率 (% ) = 100(A-B)/A
         其中 A 是未经细菌脱色的 617nm 吸光度
         B 为细菌脱色后的 617nm 吸光度
         3、 外界不同环境对脱色率的影响
         (1) 测试温度、 PH、 溶氧对脱色率影响实验, 方法如下 :
         菌种接种在含 90ml LB 液体培养基的 250ml 三角瓶中过夜培养, 温度 38 ℃, 转 速 190rpm, 使最终菌体的 OD600 为 0.50 ~ 0.60。为测试温度对脱色率的影响, 无菌接入 10ml400mg/l 的孔雀绿 ( 终浓度为 40mg/l), 将培养物分别放入 28℃、 38℃及 48℃恒温摇床 上进行脱色培养, 转速 190rpm。测试 PH 值因素时, 将接入孔雀绿 ( 浓度同上 ) 的培养物用 HCl 和 NaOH 将其最终 PH 分别调至 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0、 12.0, 然后 置于 190rpm、 38℃的恒温摇床上。 溶氧也是影响脱色的一个因素, 我们通过选择不同转速的 摇床 (0rpm、 100rpm、 190rpm) 对溶氧量的影响进行了测试, 在 0rpm 的情况下, 还分别用矿物 油对脱色培养物采取液封和不液封两种情形检测其脱 色率的差异。
         (2) 不同碳源对菌体脱色影响的实验方法如下 :
         为了测试不同碳源下氧化木糖无色杆菌 MG1 对孔雀绿的降解情况, 我们选择了常 用的 5 种碳源进行了实验?;∨嘌?M9, 配方如下 : 12.8g/lNa2HPO4· 7H2O, 3g/lKH2PO4, 0.5g/l NaCl, 1.0g/lNH4Cl, 不同的碳源分别为 5.0g/l Yeast extracts, 10g/l Peptone, 3g/l BeefExtract, 10g/l Glucose 和 3g/l Beefextract 与 5g/l Peptone for Fish 的混 合碳源。最后添加孔雀绿, 使其终浓度为 40mg/l。细菌的培养方式同上, 之后将发酵液在 8,000rpm 下离心 10 分钟, 弃去上清, 沉淀的细胞在无菌条件下加入到上述的含不同碳源的 M9 脱色培养基中, 190rpm, 38℃下进行脱色培养。
         4、 脱色机理的探究实验
         (1) 验证脱色过程是否有细胞色素 P450 的参与 ( 甲吡酮抑制实验 )
         将氧化木糖无色杆菌 MG1 过夜培养, 发酵液 8,500rpm、 4℃离心 15 分钟。 沉淀用含 1mM EDTA 的 50mM 磷酸钠缓冲液 (PH 为 7) 吹洗悬浮, 然后在冰上通过超声将菌体破碎 ( 超声 5 秒, 停 7 秒, 破碎时间 15 分钟, 48%振幅 ), 之后加入 MgCl2 使其终浓度为 2mM。 12,000rpm、 4℃离心 1 分钟去掉未破碎的细胞, 12,000rpm、 4℃离心 30 分钟将细胞膜碎片 ( 沉淀 ) 和可 溶性物质 ( 上清 ) 分开后, 沉淀用含 1mM EDTA 的 50mM 磷酸钠缓冲液吹洗悬浮, 然后分别加 入甲吡酮使其终浓度为 10mM( 对照组不添加甲吡酮 ), 37℃温浴 10 分钟后, 加入一定量的孔 雀绿测其脱色活性。
         (2) 脱色基因的克隆 : 巢式 PCR
         设 计 巢 式 PCR 的 两 对 引 物,分 别 为 P1(F)5’ AGTCAAATCATTGCCATCGTG 3’; P1(R)5’GGTTTCCTTCAGAGGGGTC 3’; P2(F)5’GCTCTTTATCTCAGGTCCGC 3’;P2(R)5’ ACACCAGCGTTTACGAGGA 3’ 。 PCR 50tl 的体系为 : 模板 1μl, 正向引物 (10μM)1μl, 反 向 引 物 (10μM)1μl, 10×Taq Buffer 5μl, dNTP Mixture(2.5mM)4μl, Taq(2.5U/ μl)1μl, ddH2O 37μl。扩增的条件为 94℃ 30 秒, 56℃ 30 秒, 72℃ 1 分钟, 总共 35 个循 环。扩增出的片段测序后在 GenBank 中进行比对。
         (3) 胞外脱色活性实验
         将细菌在含 100ml LB 培养基的 250ml 的三角瓶中 38℃、 190rpm 过夜培养, 当 OD600 为 0.50 时, 8,000rpm 离心 10 分钟, 然后再 10,000rpm 离心 20 分钟以充分地去除菌体。上 清中加入孔雀绿使其终浓度为 40mg/l, 在不同的时间段内取样测脱色活性。对照组为不接 菌的 LB 和不经离心处理的发酵液。
         5、 实验结果
         从现在已有的报道来看, 能对孔雀绿脱色的最高浓度是 500μmol/l( 约 182mg/ l), Pseudomonas otitidis W/L3 在 12 小时内能降解到 95%, 而氧化木糖无色杆菌 MG1 在 孔 雀绿的浓度高达 2000mg/L 时, 1 小时对其脱色率可高达 86±1%。具体数据如下表。脱 色的最佳条件为 : 190rpm, 38℃, PH 为 6 时。在所测试的碳源中, 最佳营养为 Beefextract 与 Peptone for Fish 的混合碳源。巢式 PCR 结果显示, 该菌株含有三苯甲烷还原酶的基因 tmr。甲吡酮抑制实验证明, 尽管具有如此高效的脱色率, 脱色过程并没有细胞色素 P450 的 参与。而胞外物质则具有很强的脱色活性。
         表氧化木糖无色杆菌 MG1 在不同孔雀绿浓度下的脱色率
         本发明的氧化木糖无色杆菌菌株 MG1 同已报道的其它降解孔雀绿的菌株相比, 具有超强的脱色高效性, 在孔雀绿的浓度高达 2000mg/L 时, 1 小时对其脱色率可高达 86±1%。

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