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    一种 气单胞菌 638 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010622537.3

    申请日:

    2010.12.28

    公开号:

    CN102181377A

    公开日:

    2011.09.14

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20101228|||公开
    IPC分类号: C12N1/20; C05F17/00; C05F9/04; C12R1/01(2006.01)N 主分类号: C12N1/20
    申请人: 中国农业大学
    发明人: 李季; 王莉瑛
    地址: 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
    优先权:
    专利代理机构: 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 代理人: 王加岭;张庆敏
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010622537.3

    授权公告号:

    102181377B||||||

    法律状态公告日:

    2013.03.20|||2011.11.02|||2011.09.14

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一株气单胞菌(Aeromonas?sp.)6-38,从冰冻的畜禽污水中分离得到,其保藏号为CGMCC?No.4402。该菌株能同时有效分解淀粉,蛋白和脂肪,在低温环境中,将其制成菌剂用于畜禽粪便堆肥中,能促进堆肥的升温,而且该菌剂的制备工艺简单,发酵周期短和易于保存。

    权利要求书

    1: 气单胞菌 (Aeromonas sp.) 菌株 6-38, 其保藏号为 : CGMCCNo.4402。
    2: 含有权利要求 1 所述的气单胞菌 6-38 的生物菌剂。
    3: 根据权利要求 2 所述的菌剂, 其特征在于, 含有气单胞菌 6-38 的活菌数为 108 ~ 109cfu/g。
    4: 一种制备权利要求 2 或 3 所述的菌剂的方法, 其特征在于, 在 LB 培养基中发酵气单 胞菌, 将得到的发酵液和基质混合得到微生物菌剂。
    5: 根据权利要求 4 所述的方法, 其特征在于, 所述的发酵条件中, 发酵温度为 15 ~ 25℃, 转速为 120r/min-180r/min, 发酵时间为 24 ~ 48h。
    6: 权利要求 1 所述的气单胞菌 6-38 在固体废弃物堆肥处理中的应用。
    7: 权利要求 1 所述的气单胞菌 6-38 在环境温度为 -10℃~ 25℃的固体废弃物堆肥处 理中的应用。
    8: 权利要求 1 所述的气单胞菌 6-38 在环境温度为 15℃~ 25℃的固体废弃物堆肥处理 中的应用。
    9: 根据权利要求 6 ~ 8 任一项所述的应用, 其特征在于, 将所述的气单胞菌 6-38 制备 8 9 成 10 ~ 10 cfu/ml 的液体菌种, 按 5‰~ 1%的接种量接种到堆肥中, 提高固体废弃物堆肥 的升温速度。
    10: 根据权利要求 9 所述的应用, 其特征在于, 所述的固体废弃物堆肥为 25 ~ 30%, 水 分 55 ~ 60%的有机物堆料。

    说明书


    一种气单胞菌 6-38 及其应用

        技术领域 本发明涉及一种微生物新菌株及其应用, 具体涉及一种气单胞菌 6-38 及其在低 温固体废弃物堆肥处理中的应用。
         背景技术
         随着有机固体废弃物的日益增多, 堆肥技术的作用也越来越大。堆肥化技术实际 上是微生物分解利用有机质使其腐熟的过程, 微生物是这一过程的主要活动者。微生物的 分解代谢活动受环境温度、 营养成分、 pH 等环境因子的影响, 它们只有在适宜的环境中, 才 能进行活跃的代谢活动, 分解利用有机废弃物。但是在一些低温地区或春冬季低温时节, 由于低温严重影响了微生物的代谢活动, 导致有机废弃物分解周期延长, 降低了堆肥的效 率。因此目前迫切需要寻找一类低温微生物, 它们在低温的环境下仍然能够进行生长代谢 活动, 降解利用有机物, 并且把这类低温微生物接种到有机固体废弃物的堆肥体系中来, 在 低温条件下发挥它们的降解能力, 缩短堆肥时间。发明内容 本发明的目的是提供一种气单胞菌 6-38 及其在固体废弃物堆肥处理中的应用。
         本发明菌株 6-38 是从冰冻的畜禽污水中分离筛选到的一株能同时有效分解淀 粉, 蛋白和脂肪的气单胞菌 (Aeromonas sp.) 新菌株, 已于 2010 年 12 月 03 日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 地址 : 北京市朝阳区大屯路甲 3 号, 中国科学 院微生物研究所, 邮编 100101), 保藏号 CGMCC No.4402。
         6-38 具体通过如下方法分离得到 :
         1、 驯化
         分别取黑龙江哈尔滨市污水处理厂的冰冻畜禽污水的 10 个样品, 每个样品 10g, 加入到 90mL 的无菌水中, 在 200r/min 的摇床中摇 30min, 放置 1h, 取 10mL 上清液接到 90mL 的灭菌的 LB 液体培养基中, 在 200r/min 的摇床中驯化培养 3 天, 为了使菌株有更强适应 性, 采取变温驯化培养的方式, 即第一天培养温度为 5℃, 第二天为 7℃, 后一天为 10℃, 此 为第一个周期的驯化。一个周期后, 无菌操作取 10mL 的驯化菌液接种到新鲜的驯化培养基 中进行第二周期的驯化培养, 每个周期都按以上的温度梯度进行驯化, 分别驯化一个周期、 四个周期和八个周期共 3 批样品。
         2、 初筛
         分别取驯化后的菌悬液 1mL, 加入到 9mL 无菌水中, 以梯度稀释法制成 10-1, 10-2, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 的稀释度, 取 0.1mL 平板涂布, 每个稀释度涂布 3 个平板。在 10-3, 4℃下培养 3d, 选择菌落分散较好的平板, 挑取单菌落, 反复 3 次划线分离纯化, 得到的单菌 落在 4℃下保存。取 1mL 的无菌水做上述同样的操作, 作为对照处理。
         3、 复筛
         将初筛得到的耐低温菌株在低温下 (4℃ ) 进行蛋白质、 淀粉、 脂类和维生素的分
         解试验, 最终筛选出一株能同时有效分解淀粉, 蛋白和脂肪的耐低温菌株 6-38。
         6-38 具有如下特性 :
         革兰氏染色阴性, 电子显微镜观察, 菌体杆状。单菌落在固体培养基上位乳白色, 直径为 4 ~ 5mm, 表面湿润, 中央稍突起, 边缘规整。其氧化酶、 葡萄糖氧化发酵 ( 发酵型代 谢 )、 半乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 明胶、 v-p、 精氨酸、 水解酶、 苯丙氨酸脱氨酶、 七夜灵水解、 H2S 等反应呈阳性, 酯酶、 脲酶等反应呈阴性。
         本发明菌株 6-38 的 16S rDNA 序列与目前发表的气单胞菌的 16S rDNA(GenBank 登录号 : ) 同源性达到 99%。综合形态特征与 16SrDNA 序列鉴定, 6-38 为气单胞菌菌新菌 株 (Aeromonas sp.)。
         本发明的还提供含有气单胞菌 6-38 的生物菌剂, 优选的菌剂含有 108 ~ 109cfu/g 活菌数的气单胞菌 6-38。
         本发明还提供制备含有气单胞菌 6-38 的生物菌剂的方法, 包括在种子培养基中 发酵气单胞菌 6-38, 将得到的发酵液和基质混合得到微生物菌剂。
         其中, 所述的种子培养基含有 10g/L 的蛋白胨、 3g/L 的酵母膏、 5g/L 的氯化钠, pH7.0。 其中, 所述的发酵条件中, 发酵温度为 15 ~ 25℃, 转速为 120r/min-180r/min, 发 酵时间为 24 ~ 48h。
         本发明还提供气单胞菌 6-38 菌株在固体废弃物堆肥处理中的应用。本发明提供 的气单胞菌 6-38 菌株适合在环境温度为 -10℃~ 25℃的固体废弃物堆肥处理中的应用, 特 别适合在 15 ~ 25℃的固体废弃物堆肥处理中的应用的。具体地, 将所述的气单胞菌 6-38 8 9 制备成 10 ~ 10 cfu/ml 的液体菌种, 按 5‰~ 1%的接种量接种到堆肥中, 提高固体废弃物 堆肥的升温速度。
         其中, 优选的固体废弃物堆肥为 25 ~ 30%, 水分 55 ~ 60%的有机物料堆肥, 包括 动物粪便、 植物秸秆、 污泥等的堆肥。
         本发明从冰冻的畜禽污水中分离筛选到一株能同时有效分解淀粉, 蛋白和脂肪的 耐低温气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38, 此菌株在低温条件下能够快速的降解多种有机物 底物, 在低温环境中, 将其制成菌剂用于畜禽粪便堆肥中, 能促进堆肥的升温。加入耐低温 菌剂 6-38 的堆体温度升高速率大于加入中温菌剂 P1(bacillus subtilis) 的堆体温度升 高速率。在堆肥升温实验进行 28h 时, 加入中温菌剂 P1(bacillus subtilis) 的堆体温度 达到 30.1℃, 而加入耐低温气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 的堆体温度达到了 39.6℃。
         附图说明
         图 1 为堆体温度随时间变化图。 图 2 气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 的生长曲线图。 图 3 气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 有机物降解率。具体实施方式
         以下实施例用于说明本发明, 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下, 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换, 均属于本发明的范围。若未特别指明, 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
         实施例 16-38 菌株的鉴定
         1.1 生理生化测定
         将分离到的菌株 ( 保藏号为 CGMCC No.4402) 进行鉴定, 生理生化测定的方法按照 标准方法 ( 中国科学院微生物研究所细菌分类组, 1978 ; 东秀珠、 蔡妙英等, 2001), 部分的 生理生化性状如表 1 所示。
         表 1 菌株生理生化鉴定
         1.216S rDNA 序列分析
         将菌株 6-38 接种于液体 LB 培养基中摇培 24h 后, 取 1mL 菌液于 1.5mL 离心管中, 12000r/min 离心 3min 后收集菌体 ;
         将菌体加 567μL TE 缓冲液震荡充分悬浮细胞 ; 加入 30μL 10 %的 SDS, 3μL 20mg/mL 蛋白酶 K 倒管并充分混匀, 37℃水浴 1h, 每隔 20min 颠倒混匀一次 ;
         加 100μL 5M 的 NaCl 混匀, 加 80μL CTAB/NaCl(10% /0.7M) 溶液轻混, 65℃水浴 20min, 每隔 4 分钟颠倒混匀一次 ;
         加入 750μL 的氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ;
         取上清加入 750μL 的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心5min ; 取上清加入 750μL 的氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ; 将水 相转移到新的离心管, 加 0.6 倍体积的异丙醇, 轻轻混匀, 13000rpm 离心 15min ;
         去上清, 加 1mL 无水乙醇, 轻混, 12000rpm 离心 5min ;
         去上清, 超净工作台吹干, 加 200μL TE 溶液溶解沉淀 ( 可在 50℃水浴条件下助 溶);
         加 1μL20mg/mL 的 RNaseA, 37 ℃ 水 浴 2h ; 加 入 200μL 的 苯 酚 ∶ 氯 仿 ∶ 异 戊 醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ;
         取水相, 加 200μl 的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀, 12000r/min 离心 5min ; 取水
         相, 加 20μL 3M 的 NaAc(pH5.2), 混匀, 加二倍体积的无水乙醇, 轻轻混匀, 13000rpm 离心 15min ;
         去上清, 加 1mL70%乙醇, 轻混, 12000rpm 离心 5min ; 去上清, 超净工作台吹干, 加 50μL TE 溶液溶解沉淀获得 6-38 基因组 DNA。
         PCR 扩增获得 6-3816S rDNA。其中, 引物序列如 SEQ ID No.2 和 SEQ ID No.3 所 示
         50μL 反 应 体 系 为 : 双 蒸 灭 菌 水 41.2μL, 10×PCR 缓 冲 液 5.0μL, 10mM dNTP 2μL, 上、 下游引物 (10μmol/L) 各 0.5μL, Taq 酶 1U, 模板 1μL ; PCR 反应条件 : 94℃预变 性 10min ; 主循环 94℃ 40s, 56℃ 40s, 72℃ 1min, 循环 34 次 ; 终延伸 72℃ 10min ; 4℃保存。
         PCR 扩 增 产 物 用 1 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析, 将 所 获 得 的 PCR 产 物 用 Gel Extraction Kit(Invitrogen) 回收后, 进行测序。测序结果表明, 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示。测序结果用 DNAman 处理后, 在 NCBI 上比对, 同源性最高的为气单胞菌, 达 99% (GenBanK 登录号 : HQ650798)。
         实施例 2
         1) 斜面培养 : 将 6-38 原始菌种在无菌条件下接种于 LB 固体培养基上, 在 25℃条 件下培养 2 ~ 6 天使菌种活化 ; 2) 一级种子培养 : 将步骤 1) 培养的菌种无菌条件下按体积比为 10%接种于 5ml 的 LB 液体培养基, 25℃条件下, 100 ~ 200r/min 摇床培养 2 ~ 6 天, 单菌种液体培养 OD600 值 1.5-2.4 之间时停止培养, 制得一级种子 ;
         3) 二级种子培养 : 按液体培养基的体积比为 5 ~ 20%的接种量, 将一级种子分别 接种于 1L 的 LB 培养基中, 在 25℃条件下, 100 ~ 200r/min 摇床培养 2 ~ 6 天, 菌浓度达到 8 9 10 -10 cfu/mL, 同基质玉米粉混合, 比例为 600g/L, 获得菌剂。
         实施例 3
         将实施例 2 制备的菌剂加入到堆肥体系中, 中温菌株巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium, 1.2393)( 购自中国普通微生物菌种保藏中心 ) 制成的菌剂为对照, 鸡粪和锯 末为堆肥材料, 调节 C/N 比为 28, 水分 60%, 在室温为 13 ~ 15℃进行堆肥, 每个 5h 测定堆 体温度的变化, 结果如表 1 所示, 结果表明, 接入 6-38 做成菌剂的堆体温度在 28h 时达到 39.6℃, 接入中温菌株巨大芽胞杆菌做成菌剂的堆体温度达到 30.1℃。
         实施例 4
         (1) 一级种子培养液
         在无菌操作下, 用接种针挑取斜面保存的一环 6-38, 接种到装有 100mL 牛肉膏蛋 白胨液体培养基的锥形瓶中, 置于 15℃的恒温摇床中, 160r/min 培养 24h, 此菌液为测定生 长曲线时用的种子培养液。
         (2) 校正零点
         分别取少许的液体培养基于 1cm 比色皿中, 在波长 600nm 处调节零点, 作为测定时 的对照。
         (3) 接种
         在无菌的条件下, 用移液枪取 1mL 的种子培养液, 接种于 100mL 无菌的培养基中, 分别在 15℃, 20℃, 25℃, 37℃, 40℃条件下, 160r/min 振荡培养。
         (4) 测定
         从接种结束后, 每隔 2h 移取 5mL 的菌液用分光光度计在 600nm 处测定并记录吸光 度 OD 值。
         (5) 生长曲线的绘制
         以时间 t 为横坐标, 吸光度值 OD 为纵坐标, 绘制曲线, 得到的曲线如图 2 所示, 即 为菌株 6-38 的温度生长曲线, 从图中可知菌株的最适生长温度为 25℃, 在 15 ~ 20℃下, 也 有很强的活性, 而在 37℃以上, 活性下降, 表明此菌株为耐低温菌株。
         实施例 5
         ( 一 ) 淀粉降解率测定
         (1) 菌株 6-38 活化
         取一环 6-38 接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取活化的 6-38 菌液 10mL 接种到淀粉发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培 养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 粗淀粉含量测定 取 100mL 的样品液, 放入三角瓶中, 加入 2 % HCL10mL, 在沸水浴中沸腾 3h, 用 5moL/LNaOH 中和, 加入 Ba(OH)23mL 加入一滴酚酞指示剂, 边搅拌边加入 ZnSO4 溶液, 直到红 色褪去, 过滤, 稀释至 250mL, 吸取 50mL 测定葡萄糖的含量, 葡萄糖含量用比色法测定, 粗淀 粉含量=葡萄糖含量 ×0.9
         (4) 淀粉降解率=粗淀粉含量 / 培养基中淀粉含量
         ( 二 ) 蛋白质降解率测定
         (1) 菌种活化
         取一环 6-38 接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取 6-38 菌液 10mL 接种到蛋白质发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 蛋白质含量的测定
         取上述样品液置于 1cm 的石英比色皿中, 于 751 型风光光度计波长 280nm 和 260nm 处, 分别读取 OD280 和 OD260, 蛋白质含量 (mg/mL) = 1.55OD280-0.76OD260
         (4) 蛋白降解率=蛋白含量 / 培养基中蛋白的含量
         ( 三 ) 脂肪降解率测定
         (1) 菌种活化
         取一环 6-38 细菌接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取 6-38 菌液 10mL 接种到脂肪发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 脂肪含量的测定
         取上述样品制备液 100mL, 加入 20mL 的无水乙醚, 充分混匀, 静置等分层后, 取无 水乙醚相放入索氏提取器的接受瓶中 (M1), 加热蒸去无水乙醚, 置 80℃烘箱中 30min 后称
         重 M2, 粗脂肪含量= M2-M1
         (4) 脂肪降解率=脂肪含量 / 培养基中脂肪含量
         菌株 6-38 对蛋白质, 淀粉, 脂肪三种有机物的降解率如图 3 所示, 结果表明, 菌株 6-38 对蛋白质, 淀粉, 脂肪三种有机物的降解率都比较高, 其中蛋白质降解率为 74.76%, 淀粉降解率为 61.23%, 脂肪降解率为 52.72%。
         实施例 6
         背景技术
         随着有机固体废弃物的日益增多, 堆肥技术的作用也越来越大。堆肥化技术实际 上是微生物分解利用有机质使其腐熟的过程, 微生物是这一过程的主要活动者。微生物的 分解代谢活动受环境温度、 营养成分、 pH 等环境因子的影响, 它们只有在适宜的环境中, 才 能进行活跃的代谢活动, 分解利用有机废弃物。但是在一些低温地区或春冬季低温时节, 由于低温严重影响了微生物的代谢活动, 导致有机废弃物分解周期延长, 降低了堆肥的效 率。因此目前迫切需要寻找一类低温微生物, 它们在低温的环境下仍然能够进行生长代谢 活动, 降解利用有机物, 并且把这类低温微生物接种到有机固体废弃物的堆肥体系中来, 在 低温条件下发挥它们的降解能力, 缩短堆肥时间。发明内容 本发明的目的是提供一种气单胞菌 6-38 及其在固体废弃物堆肥处理中的应用。
         本发明菌株 6-38 是从冰冻的畜禽污水中分离筛选到的一株能同时有效分解淀 粉, 蛋白和脂肪的气单胞菌 (Aeromonas sp.) 新菌株, 已于 2010 年 12 月 03 日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 地址 : 北京市朝阳区大屯路甲 3 号, 中国科学 院微生物研究所, 邮编 100101), 保藏号 CGMCC No.4402。
         6-38 具体通过如下方法分离得到 :
         1、 驯化
         分别取黑龙江哈尔滨市污水处理厂的冰冻畜禽污水的 10 个样品, 每个样品 10g, 加入到 90mL 的无菌水中, 在 200r/min 的摇床中摇 30min, 放置 1h, 取 10mL 上清液接到 90mL 的灭菌的 LB 液体培养基中, 在 200r/min 的摇床中驯化培养 3 天, 为了使菌株有更强适应 性, 采取变温驯化培养的方式, 即第一天培养温度为 5℃, 第二天为 7℃, 后一天为 10℃, 此 为第一个周期的驯化。一个周期后, 无菌操作取 10mL 的驯化菌液接种到新鲜的驯化培养基 中进行第二周期的驯化培养, 每个周期都按以上的温度梯度进行驯化, 分别驯化一个周期、 四个周期和八个周期共 3 批样品。
         2、 初筛
         分别取驯化后的菌悬液 1mL, 加入到 9mL 无菌水中, 以梯度稀释法制成 10-1, 10-2, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 的稀释度, 取 0.1mL 平板涂布, 每个稀释度涂布 3 个平板。在 10-3, 4℃下培养 3d, 选择菌落分散较好的平板, 挑取单菌落, 反复 3 次划线分离纯化, 得到的单菌 落在 4℃下保存。取 1mL 的无菌水做上述同样的操作, 作为对照处理。
         3、 复筛
         将初筛得到的耐低温菌株在低温下 (4℃ ) 进行蛋白质、 淀粉、 脂类和维生素的分
         解试验, 最终筛选出一株能同时有效分解淀粉, 蛋白和脂肪的耐低温菌株 6-38。
         6-38 具有如下特性 :
         革兰氏染色阴性, 电子显微镜观察, 菌体杆状。单菌落在固体培养基上位乳白色, 直径为 4 ~ 5mm, 表面湿润, 中央稍突起, 边缘规整。其氧化酶、 葡萄糖氧化发酵 ( 发酵型代 谢 )、 半乳糖、 麦芽糖、 海藻糖、 明胶、 v-p、 精氨酸、 水解酶、 苯丙氨酸脱氨酶、 七夜灵水解、 H2S 等反应呈阳性, 酯酶、 脲酶等反应呈阴性。
         本发明菌株 6-38 的 16S rDNA 序列与目前发表的气单胞菌的 16S rDNA(GenBank 登录号 : ) 同源性达到 99%。综合形态特征与 16SrDNA 序列鉴定, 6-38 为气单胞菌菌新菌 株 (Aeromonas sp.)。
         本发明的还提供含有气单胞菌 6-38 的生物菌剂, 优选的菌剂含有 108 ~ 109cfu/g 活菌数的气单胞菌 6-38。
         本发明还提供制备含有气单胞菌 6-38 的生物菌剂的方法, 包括在种子培养基中 发酵气单胞菌 6-38, 将得到的发酵液和基质混合得到微生物菌剂。
         其中, 所述的种子培养基含有 10g/L 的蛋白胨、 3g/L 的酵母膏、 5g/L 的氯化钠, pH7.0。 其中, 所述的发酵条件中, 发酵温度为 15 ~ 25℃, 转速为 120r/min-180r/min, 发 酵时间为 24 ~ 48h。
         本发明还提供气单胞菌 6-38 菌株在固体废弃物堆肥处理中的应用。本发明提供 的气单胞菌 6-38 菌株适合在环境温度为 -10℃~ 25℃的固体废弃物堆肥处理中的应用, 特 别适合在 15 ~ 25℃的固体废弃物堆肥处理中的应用的。具体地, 将所述的气单胞菌 6-38 8 9 制备成 10 ~ 10 cfu/ml 的液体菌种, 按 5‰~ 1%的接种量接种到堆肥中, 提高固体废弃物 堆肥的升温速度。
         其中, 优选的固体废弃物堆肥为 25 ~ 30%, 水分 55 ~ 60%的有机物料堆肥, 包括 动物粪便、 植物秸秆、 污泥等的堆肥。
         本发明从冰冻的畜禽污水中分离筛选到一株能同时有效分解淀粉, 蛋白和脂肪的 耐低温气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38, 此菌株在低温条件下能够快速的降解多种有机物 底物, 在低温环境中, 将其制成菌剂用于畜禽粪便堆肥中, 能促进堆肥的升温。加入耐低温 菌剂 6-38 的堆体温度升高速率大于加入中温菌剂 P1(bacillus subtilis) 的堆体温度升 高速率。在堆肥升温实验进行 28h 时, 加入中温菌剂 P1(bacillus subtilis) 的堆体温度 达到 30.1℃, 而加入耐低温气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 的堆体温度达到了 39.6℃。
        【附图说明】
        
        
        图 1 为堆体温度随时间变化图。 图 2 气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 的生长曲线图。 图 3 气单胞菌 (Aeromonas sp.)6-38 有机物降解率。具体实施方式
         以下实施例用于说明本发明, 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下, 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换, 均属于本发明的范围。若未特别指明, 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
         实施例 16-38 菌株的鉴定
         1.1 生理生化测定
         将分离到的菌株 ( 保藏号为 CGMCC No.4402) 进行鉴定, 生理生化测定的方法按照 标准方法 ( 中国科学院微生物研究所细菌分类组, 1978 ; 东秀珠、 蔡妙英等, 2001), 部分的 生理生化性状如表 1 所示。
         表 1 菌株生理生化鉴定
        1.216S rDNA 序列分析
         将菌株 6-38 接种于液体 LB 培养基中摇培 24h 后, 取 1mL 菌液于 1.5mL 离心管中, 12000r/min 离心 3min 后收集菌体 ;
         将菌体加 567μL TE 缓冲液震荡充分悬浮细胞 ; 加入 30μL 10 %的 SDS, 3μL 20mg/mL 蛋白酶 K 倒管并充分混匀, 37℃水浴 1h, 每隔 20min 颠倒混匀一次 ;
         加 100μL 5M 的 NaCl 混匀, 加 80μL CTAB/NaCl(10% /0.7M) 溶液轻混, 65℃水浴 20min, 每隔 4 分钟颠倒混匀一次 ;
         加入 750μL 的氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ;
        
        取上清加入 750μL 的苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心5min ; 取上清加入 750μL 的氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ; 将水 相转移到新的离心管, 加 0.6 倍体积的异丙醇, 轻轻混匀, 13000rpm 离心 15min ;
         去上清, 加 1mL 无水乙醇, 轻混, 12000rpm 离心 5min ;
         去上清, 超净工作台吹干, 加 200μL TE 溶液溶解沉淀 ( 可在 50℃水浴条件下助 溶);
         加 1μL20mg/mL 的 RNaseA, 37 ℃ 水 浴 2h ; 加 入 200μL 的 苯 酚 ∶ 氯 仿 ∶ 异 戊 醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 混匀后 12000rpm 离心 5min ;
         取水相, 加 200μl 的氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1), 混匀, 12000r/min 离心 5min ; 取水
         相, 加 20μL 3M 的 NaAc(pH5.2), 混匀, 加二倍体积的无水乙醇, 轻轻混匀, 13000rpm 离心 15min ;
         去上清, 加 1mL70%乙醇, 轻混, 12000rpm 离心 5min ; 去上清, 超净工作台吹干, 加 50μL TE 溶液溶解沉淀获得 6-38 基因组 DNA。
         PCR 扩增获得 6-3816S rDNA。其中, 引物序列如 SEQ ID No.2 和 SEQ ID No.3 所 示
         50μL 反 应 体 系 为 : 双 蒸 灭 菌 水 41.2μL, 10×PCR 缓 冲 液 5.0μL, 10mM dNTP 2μL, 上、 下游引物 (10μmol/L) 各 0.5μL, Taq 酶 1U, 模板 1μL ; PCR 反应条件 : 94℃预变 性 10min ; 主循环 94℃ 40s, 56℃ 40s, 72℃ 1min, 循环 34 次 ; 终延伸 72℃ 10min ; 4℃保存。
         PCR 扩 增 产 物 用 1 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析, 将 所 获 得 的 PCR 产 物 用 Gel Extraction Kit(Invitrogen) 回收后, 进行测序。测序结果表明, 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示。测序结果用 DNAman 处理后, 在 NCBI 上比对, 同源性最高的为气单胞菌, 达 99% (GenBanK 登录号 : HQ650798)。
         实施例 2
         1) 斜面培养 : 将 6-38 原始菌种在无菌条件下接种于 LB 固体培养基上, 在 25℃条 件下培养 2 ~ 6 天使菌种活化 ; 2) 一级种子培养 : 将步骤 1) 培养的菌种无菌条件下按体积比为 10%接种于 5ml 的 LB 液体培养基, 25℃条件下, 100 ~ 200r/min 摇床培养 2 ~ 6 天, 单菌种液体培养 OD600 值 1.5-2.4 之间时停止培养, 制得一级种子 ;
         3) 二级种子培养 : 按液体培养基的体积比为 5 ~ 20%的接种量, 将一级种子分别 接种于 1L 的 LB 培养基中, 在 25℃条件下, 100 ~ 200r/min 摇床培养 2 ~ 6 天, 菌浓度达到 8 9 10 -10 cfu/mL, 同基质玉米粉混合, 比例为 600g/L, 获得菌剂。
         实施例 3
         将实施例 2 制备的菌剂加入到堆肥体系中, 中温菌株巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium, 1.2393)( 购自中国普通微生物菌种保藏中心 ) 制成的菌剂为对照, 鸡粪和锯 末为堆肥材料, 调节 C/N 比为 28, 水分 60%, 在室温为 13 ~ 15℃进行堆肥, 每个 5h 测定堆 体温度的变化, 结果如表 1 所示, 结果表明, 接入 6-38 做成菌剂的堆体温度在 28h 时达到 39.6℃, 接入中温菌株巨大芽胞杆菌做成菌剂的堆体温度达到 30.1℃。
         实施例 4
         (1) 一级种子培养液
         在无菌操作下, 用接种针挑取斜面保存的一环 6-38, 接种到装有 100mL 牛肉膏蛋 白胨液体培养基的锥形瓶中, 置于 15℃的恒温摇床中, 160r/min 培养 24h, 此菌液为测定生 长曲线时用的种子培养液。
         (2) 校正零点
         分别取少许的液体培养基于 1cm 比色皿中, 在波长 600nm 处调节零点, 作为测定时 的对照。
         (3) 接种
         在无菌的条件下, 用移液枪取 1mL 的种子培养液, 接种于 100mL 无菌的培养基中, 分别在 15℃, 20℃, 25℃, 37℃, 40℃条件下, 160r/min 振荡培养。
         (4) 测定
         从接种结束后, 每隔 2h 移取 5mL 的菌液用分光光度计在 600nm 处测定并记录吸光 度 OD 值。
         (5) 生长曲线的绘制
         以时间 t 为横坐标, 吸光度值 OD 为纵坐标, 绘制曲线, 得到的曲线如图 2 所示, 即 为菌株 6-38 的温度生长曲线, 从图中可知菌株的最适生长温度为 25℃, 在 15 ~ 20℃下, 也 有很强的活性, 而在 37℃以上, 活性下降, 表明此菌株为耐低温菌株。
         实施例 5
         ( 一 ) 淀粉降解率测定
         (1) 菌株 6-38 活化
         取一环 6-38 接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取活化的 6-38 菌液 10mL 接种到淀粉发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培 养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 粗淀粉含量测定 取 100mL 的样品液, 放入三角瓶中, 加入 2 % HCL10mL, 在沸水浴中沸腾 3h, 用 5moL/LNaOH 中和, 加入 Ba(OH)23mL 加入一滴酚酞指示剂, 边搅拌边加入 ZnSO4 溶液, 直到红 色褪去, 过滤, 稀释至 250mL, 吸取 50mL 测定葡萄糖的含量, 葡萄糖含量用比色法测定, 粗淀 粉含量=葡萄糖含量 ×0.9
         (4) 淀粉降解率=粗淀粉含量 / 培养基中淀粉含量
         ( 二 ) 蛋白质降解率测定
         (1) 菌种活化
         取一环 6-38 接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取 6-38 菌液 10mL 接种到蛋白质发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 蛋白质含量的测定
         取上述样品液置于 1cm 的石英比色皿中, 于 751 型风光光度计波长 280nm 和 260nm 处, 分别读取 OD280 和 OD260, 蛋白质含量 (mg/mL) = 1.55OD280-0.76OD260
         (4) 蛋白降解率=蛋白含量 / 培养基中蛋白的含量
         ( 三 ) 脂肪降解率测定
         (1) 菌种活化
         取一环 6-38 细菌接种到 LB 培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下摇 24h。
         (2) 样品制备
         取 6-38 菌液 10mL 接种到脂肪发酵培养基中, 在 160r/min, 15℃条件下培养, 24h 后将培养液离心, 上清液作为样品液, 在 4℃冰箱中保存。
         (3) 脂肪含量的测定
         取上述样品制备液 100mL, 加入 20mL 的无水乙醚, 充分混匀, 静置等分层后, 取无 水乙醚相放入索氏提取器的接受瓶中 (M1), 加热蒸去无水乙醚, 置 80℃烘箱中 30min 后称
         重 M2, 粗脂肪含量= M2-M1
         (4) 脂肪降解率=脂肪含量 / 培养基中脂肪含量
         菌株 6-38 对蛋白质, 淀粉, 脂肪三种有机物的降解率如图 3 所示, 结果表明, 菌株 6-38 对蛋白质, 淀粉, 脂肪三种有机物的降解率都比较高, 其中蛋白质降解率为 74.76%, 淀粉降解率为 61.23%, 脂肪降解率为 52.72%。
         实施例 6
         将实施例 2 制备的菌剂加入到堆肥体系中, 其中牛粪和植物秸秆为堆肥材料, 调 节 C/N 比为 28, 水分 55 %, 在温度为 -10 ℃下进行堆肥, 经过 48h 测定堆肥的蛋白质、 淀 粉和脂肪含量。结果表明, 蛋白质降解率为 56.6%, 淀粉降解率为 48.9%, 脂肪降解率为 46.2%。8102181377 A CN 102181379
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         9102181377 A CN 102181379序列表2/2 页

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