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    重庆时时彩等号方法: 一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法.pdf

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    一种 粉状 噬菌蛭 弧菌 制剂 及其 制备 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110088162.1

    申请日:

    2011.04.08

    公开号:

    CN102217655A

    公开日:

    2011.10.19

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A01N 63/02申请公布日:20111019|||专利申请权的转移IPC(主分类):A01N 63/02变更事项:申请人变更前权利人:上海海洋大学变更后权利人:上海绿奥生物科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:201306 上海市浦东新区临港新城沪城环路999号变更后权利人:200240 上海市闵行区江川路611号4楼变更事项:申请人变更后权利人:曹海鹏登记生效日:20130412|||实质审查的生效IPC(主分类):A01N 63/02申请日:20110408|||公开
    IPC分类号: A01N63/02; A01N25/12; A01P3/00; A01P1/00; C02F3/34; C12N1/20; C12R1/19(2006.01)N; C12R1/01(2006.01)N 主分类号: A01N63/02
    申请人: 上海海洋大学
    发明人: 曹海鹏; 何珊; 杨先乐; 吕利群; 卫若鹏
    地址: 201306 上海市浦东新区临港新城沪城环路999号
    优先权:
    专利代理机构: 上海智力专利商标事务所 31105 代理人: 瞿承达;罗芳英
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110088162.1

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2015.08.19|||2013.05.08|||2011.11.30|||2011.10.19

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||专利申请权、专利权的转移|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。?克服了目前噬菌蛭弧菌制剂保藏期短、菌含量不稳定的缺陷。本发明以沸石粉作为赋形载体,利用喷雾干燥技术制备粉状噬菌蛭弧菌制剂。本发明提供的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法,能增强噬菌蛭弧菌在养殖环境中的生存能力,从而能够促进其生长与长期保藏,提高噬菌蛭弧菌制剂对水产动物病害防治与水质改良效果,对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种粉状噬菌蛭弧菌制剂,其特征在于,所述的制剂以沸石粉作为赋形载体。

    2.  如权利要求1所述的粉状噬菌蛭弧菌制剂,其特征在于,所述的粉状制剂成品水分含量为0.5%-3%。

    3.  如权利要求2所述的粉状噬菌蛭弧菌制剂,其特征在于,所述的粉状制剂成品水分含量为1%。

    4.  一种粉状噬菌蛭弧菌制剂制备方法,包括如下步骤:
    1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备
    将大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中,摇床振荡培养后,离心洗涤,制成浓度为2.0×108 --2.0×1012个/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液;
    2)噬菌蛭弧菌培养液的制备
    取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×103--2.0×106个/ml的噬菌蛭弧菌,接种于沸石粉含量为8-12%的普通营养肉汤中,同时加入0.5‰--3‰的大肠杆菌5α菌悬液,摇床振荡培养,直至噬菌蛭弧菌的活菌含量为1×106—1×1012 个/ml;
    3)喷雾干燥法制备粉状噬菌蛭弧菌制剂
    将步骤2)中所得的活菌含量1×106—1×1012个/ml的噬菌蛭弧菌培养液,在漩涡振荡仪上充分混合均匀,用喷雾干燥仪加工成水分含量为0.5%-3%的制剂。

    5.  如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中,所述的大肠杆菌DH5α菌悬液浓度为2.0×1010个/ml。

    6.   如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中所述的中甘油保藏的噬菌蛭弧菌终浓度为2.0×104个/ml;所述的大肠杆菌5α菌悬液加入量为1‰;所述的噬菌蛭弧菌的活菌含量为1×108 个/ml。

    7.   如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中所述的制剂水分含量为1%。

    8.   如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤3)中所述的喷雾干燥仪加工设置参数为:风量显示 100%,进风温度100℃,出风温度40℃-50℃,进料量20-35 ml/h,通针频率5 s;喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h;气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度100℃。

    9.   如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
    1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备:在无菌条件下将试管斜面培养基上保存的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中,于30℃,150 转/min摇床振荡培养24 h后于3000 转/min离心20 min,用无菌生理盐水洗涤3次,制成2.0×1010 个/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液;
    2)噬菌蛭弧菌培养液的制备:取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104 个/ml的噬菌蛭弧菌接种于100ml pH7.2,沸石粉含量为10%的10倍稀释的普通营养肉汤中,同时加入100 μl大肠杆菌5α菌悬液,于30℃、150 转/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌的活菌含量>106 个/ml,于4℃冰箱保存;
    3)喷雾干燥法制备粉状噬菌蛭弧菌制剂:将4℃冰箱保存的、活菌含量>106个/ml的噬菌蛭弧菌培养液在漩涡振荡仪上充分混合均匀,打开鼓风机,紧接着打开喷雾干燥仪、蠕动泵和通针泵,设置参数为:风量显示 100%,进风温度100℃,出风温度46℃,进料量25 ml/h,通针频率5s;喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h;气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度100℃,蠕动泵将噬菌蛭弧菌培养液传送到喷雾器,粉状噬菌蛭弧菌制剂则通过旋风分离器收集,并测得水分含量为1%,于30℃恒温箱中保存。

    说明书

    说明书一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法
    技术领域
    本发明属于生物制剂领域,尤其涉及一种粉状噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
    背景技术
    噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)是一种具有寄生特性的弧形或杆形细菌,菌体大小为0.2~0.5微米×0.8~1.2微米,是养殖水体环境致病菌滋生的天然生物控制因子,能够有效地控制养殖水体的化学耗氧量以及硫化物和氨氮的含量,对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。
    目前我国市售的噬菌蛭弧菌制剂的剂型较少,主要以水剂和冻干粉剂为主,但菌含量不稳定,保藏期短,质量也参差不齐。因此,针对目前噬菌蛭弧菌制剂保藏期短、菌含量不稳定的缺陷,迫切需要开发新型优质的噬菌蛭弧菌制剂,以提高噬菌蛭弧菌对水产动物病害防治与水质改良效果。
    发明内容
    为了克服现有噬菌蛭弧菌制剂含量不稳定,保藏期短,质量也参差不齐的缺陷,本发明提供一种新型优质的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法,以克服现有缺陷,提高噬菌蛭弧菌对水产动物病害防治与水质改良效果。实现本发明效果的技术方案如下:
    提供一种粉状噬菌蛭弧菌制剂,所述的制剂以沸石粉作为赋形载体。
    所述的粉状制剂成品水分含量为0.5%-3%,水分含量优选为1%。
    本发明还提供一种粉状噬菌蛭弧菌制剂制备方法,包括如下步骤:
    1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备
    将大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中,摇床振荡培养后,离心洗涤,制成浓度为2.0×108 --2.0×1012个/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液;
    2)噬菌蛭弧菌培养液的制备
    取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×103--2.0×106个/ml的噬菌蛭弧菌,接种于沸石粉含量为8-12%的普通营养肉汤中,同时加入0.5‰--3‰的大肠杆菌5α菌悬液,摇床振荡培养,直至噬菌蛭弧菌的活菌含量为1×106—1×1012 个/ml;
    3)喷雾干燥法制备粉状噬菌蛭弧菌制剂
    将步骤2)中所得的活菌含量1×106—1×1012个/ml的噬菌蛭弧菌培养液,在漩涡振荡仪上充分混合均匀,用喷雾干燥仪加工成水分含量为0.5%-3%的制剂。
    上述制备方法的优选例如下:
    步骤1)中所述的大肠杆菌DH5α菌悬液浓度优选为2.0×1010个/ml。
    步骤2)中所述的中甘油保藏的噬菌蛭弧菌终浓度优选为2.0×104个/ml;所述的大肠杆菌5α菌悬液加入量优选为1‰;所述的噬菌蛭弧菌的活菌含量优选为1×108 个/ml;
    步骤3)中所述的制剂水分含量优选为1%。
    上述制备方法的步骤3),更优选为所述的喷雾干燥仪加工设置参数为:风量显示 100%,进风温度100℃,出风温度40℃-50℃,进料量20-35 ml/h,通针频率5 s;喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h;气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度100℃。
    上述制备方法的又一优选例,包括如下步骤:
    1)大肠杆菌DH5α菌悬液的制备:在无菌条件下将试管斜面培养基上保存的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中,于30℃,150 转/min摇床振荡培养24 h后于3000 转/min离心20 min,用无菌生理盐水洗涤3次,制成2.0×1010 个/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液;
    2)噬菌蛭弧菌培养液的制备:取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104 个/ml的噬菌蛭弧菌接种于100ml pH7.2,沸石粉含量为10%的10倍稀释的普通营养肉汤中,同时加入100 μl大肠杆菌5α菌悬液,于30℃、150 转/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌的活菌含量>106 个/ml,于4℃冰箱保存;
    3)喷雾干燥法制备粉状噬菌蛭弧菌制剂:将4℃冰箱保存的、活菌含量>106个/ml的噬菌蛭弧菌培养液在漩涡振荡仪上充分混合均匀,打开鼓风机,紧接着打开喷雾干燥仪、蠕动泵和通针泵,设置参数为:风量显示 100%,进风温度100℃,出风温度46℃,进料量25 ml/h,通针频率5s;喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h;气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度100℃,蠕动泵将噬菌蛭弧菌培养液传送到喷雾器,粉状噬菌蛭弧菌制剂则通过旋风分离器收集,并测得水分含量为1%,于30℃恒温箱中保存。
    本发明以噬菌蛭弧菌为研究对象,采用喷雾干燥技术制备了粉状噬菌蛭弧菌制剂,并进一步观察了粉状噬菌蛭弧菌制剂中噬菌蛭弧菌的形态与活菌数量的变化,提供了一种新型优质的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法。
    固定化技术是以物理或化学的手段将游离微生物定位或限制在一个特定的空间,使其保持活性,可以被反复利用。固定化微生物的密度高、活性强、反应速度快,而且流失少,与利用游离微生物处理废水相比,具有明显的优越性。微生物固定化的主要技术有载体结合法、交联法和包埋法。研究表明,噬菌蛭弧菌具有载体吸附能力,这种吸附能力有利于减轻外界环境不良因素对其造成的影响,增强其在养殖环境中的生存能力,因此选用载体结合法对噬菌蛭弧菌进行固定化,然后通过喷雾干燥技术制备粉状噬菌蛭弧菌制剂。
    沸石在我国分布广、储量大,较易开采,是一种架状结构的具有许多排列整齐的晶穴和孔道的铝硅盐矿物,含有钙、镁、磷、钾、钠、锰等20多种常量和微量元素,具有比表面积大和吸附能力强的特点。研究表明,钙、镁离子有助于噬菌蛭弧菌的吸附作用,并且对噬菌蛭弧菌-宿主系统具有稳定作用,而且载体上积聚的大量细菌也可以满足噬菌蛭弧菌生长的宿主菌需求,从而能够促进其生长与长期保藏。此外,沸石粉对净化水产养殖水质、促进水产动物生长发育、预防疾病以及提高经济经济效益等重要意义。
    本发明以一株噬菌蛭弧菌BDF-H16为发明测试研究对象,利用沸石粉作为赋形载体。本发明的测试实验结果表明利用沸石粉作为赋形载体,粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌的含量均可保持在5.00×104个/g~3.85×105个/g,显著高于温崇庆等(温崇庆,薛  明,张金燕,等. 水产养殖用蛭弧菌类生物制剂的检测[J]. 水产学报,2009,33(2):326-333.)报道的8个企业生产的噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂的有效活菌含量,而且运输更方便,保存更简易。此外,本实验制备的粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂保藏期可达500天以上,与黄文等(黄文,杨莉. 噬菌蛭弧菌Bd-9五种保藏方法的比较研究. 大连水产学院学报,2002,17(4):341-344.)报道的在实验室条件下采用-20℃甘油和4℃普通营养肉汤保藏法对噬菌蛭弧菌的保藏效果相当,但较-20℃甘油和4℃普通营养肉汤保藏法操作更简便,保藏条件更宽松。
    因此,以沸石粉作为赋形载体,利用喷雾干燥技术制备粉状噬菌蛭弧菌制剂是目前一种优良的生产工艺与保藏方法。本发明提供的噬菌蛭弧菌制剂及其制备方法,能增强噬菌蛭弧菌在养殖环境中的生存能力,从而能够促进其生长与长期保藏,提高噬菌蛭弧菌制剂对水产动物病害防治与水质改良效果,对开拓水产动物病害生物防治新途径具有重要的意义。本发明以一株噬菌蛭弧菌BDF-H16为发明测试研究对象,并不表示本发明的技术方案局限于该菌株。本发明的技术文案同样适用于用其它的噬菌蛭弧菌菌种制备相同用途的粉状制剂。
    附图说明
    图1 粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形态。
    图2 不同时间条件下粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的数量。
    具体实施方式
    应当理解,下面实施例中未说明的常规条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版,或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
    本发明涉及的材料来源如下:
    噬菌蛭弧菌BDF-H16,购于农业部渔业动植物病原库;大肠杆菌DH5α,购于天根生物基因技术有限公司。
    沸石粉、普通营养肉汤、琼脂条和无菌生理盐水,购于上海国药集团化学试剂有限公司;pH7.2沸石粉含量为10%的10倍稀释的普通营养肉汤、pH7.2的普通营养肉汤、自来水双层琼脂平板,底层琼脂浓度1.5%,上层软琼脂浓度0.6%,均在1×105 Pa高压湿热灭菌20 min后备用;温控摇床,购于美国Thermo Forma公司;生化培养箱,购于上海一恒生物科技有限公司;全自动灭菌锅和高速离心机,购于日本三洋公司;漩涡振荡仪,购于上海淇特分析仪器有限公司;小型喷雾干燥仪SY-6000,购于上海世远生物设备工程有限公司。
    实施例一:
    大肠杆菌DH5α菌悬液的制备
    在无菌条件下将试管斜面培养基上保存的大肠杆菌DH5α接种于pH7.2的普通营养肉汤中,于30℃,150 转/min摇床振荡培养24 h后于3000 转/min离心20 min,用无菌生理盐水洗涤3次,制成2.0×1010 个/ml的大肠杆菌DH5α菌悬液。
    实施例二:
    噬菌蛭弧菌BDF-H16培养液的制备
    取-70℃甘油保藏的终浓度为2.0×104 个/ml的噬菌蛭弧菌BDF-H16接种于100ml pH7.2沸石粉含量为10%的10倍稀释的普通营养肉汤中,同时加入100 μl大肠杆菌5α菌悬液,于30℃、150 转/min条件下摇床振荡培养直至噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量>106 个/ml,于4℃冰箱保存。
    实施例三:
    喷雾干燥法制备粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂
    将4℃冰箱保存的、活菌含量>106个/ml的噬菌蛭弧菌BDF-H16培养液在漩涡振荡仪上充分混合均匀,打开鼓风机,紧接着打开喷雾干燥仪、蠕动泵和通针泵,设置参数为:风量显示 100%,进风温度100℃,出风温度46℃,进料量25 ml/h,通针频率5 s。喷雾干燥期间保持气流量为600 m3/h。气体通过鼓风机后被过滤并加热到设置温度100℃,蠕动泵将噬菌蛭弧菌BDF-H16培养液传送到喷雾器,粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂则通过旋风分离器收集,并测得水分含量为1%,于30℃恒温箱中保存。
    通过下面的试验验证本发明的发明效果
    试验实施例一:
    粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形态观察
    将制备的粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂进行固定,然后于扫描电镜下对噬菌蛭弧菌BDF-H16的形态进行观察。
    在扫描电镜下,粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的形态见图1。试验结果表明,以沸石粉作为赋形载体,噬菌蛭弧菌BDF-H16为杆状,大小约为0.2~0.5微米×0.8~1.2微米,端生鞭毛,吸附在沸石粉颗粒上,或者吸附在吸附于沸石粉颗粒上的大肠杆菌DH5α上。
    试验实施例二:
    粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16在不同存放时间时活菌含量的变化
    将粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂在制备后0天、15天、30天、60天、70天、140天、350天、500天取样,采用自来水双层琼脂平板法(曹海鹏,杨先乐,钱云云,邓璐. 异育银鲫肠道蛭弧菌的分离及其生物学特性的研究. 微生物学通报,2007,34(1):52-56.),检测粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量。
    粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16活菌含量的稳定性
    粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的保藏效果见图2。不同时间条件下粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的数量。试验结果表明,粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中噬菌蛭弧菌BDF-H16的初始活菌含量为1.73×105个/g,在存放60天时达到最高,为3.85×105 个/g;在存放500天时达到最低,为5.00×104 个/g,虽然较初始活菌含量降低了71%,但粉状噬菌蛭弧菌BDF-H16制剂中的噬菌蛭弧菌BDF-H16仍具有明显的噬菌斑。在整个试验保存时期内,噬菌蛭弧菌BDF-H16的活菌含量保持在不低于5.00×104个/g。

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