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    重庆时时彩大小经验: 一株源于大豆根际能够拮抗病原真菌的芽孢杆菌及其用途.pdf

    关 键 词:
    源于 大豆 能够 拮抗 病原 真菌 芽孢 杆菌 及其 用途
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110247545.9

    申请日:

    2011.08.26

    公开号:

    CN102296040A

    公开日:

    2011.12.28

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20110826授权公告日:20130731终止日期:20170826|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20110826|||公开
    IPC分类号: C12N1/20; A01N63/02; A01P3/00; C05F11/08; C12N9/00; C12R1/07(2006.01)N 主分类号: C12N1/20
    申请人: 哈尔滨君龙实业有限公司; 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
    发明人: 宋燕军; 王会智; 孙建光
    地址: 150020 黑龙江省哈尔滨市道外区草市街60号
    优先权:
    专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人: 关畅;任凤华
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110247545.9

    授权公告号:

    |||102296040B||||||

    法律状态公告日:

    2018.08.17|||2013.07.31|||2012.02.15|||2011.12.28

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了拮抗多种病原真菌的大豆根际固氮菌及其用途。该大豆根际固氮菌是芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的藏编号为CGMCC?No.5152。本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152具有固氮活性,可以有效拮抗作物赤霉病菌(Gibberellazeae)和菌核病菌(Sclerotinia?sclerotiorum),在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

    权利要求书

    1.芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711,它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微
    生物中心的藏编号为CGMCC?No.5152。
    2.一种菌剂,它的活性成分为权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711
    CGMCC?No.5152。
    3.根据权利要求2所述的菌剂,其特征在于:所述菌剂为下述1)-4)中任一的
    菌剂:
    1)用于抑制病原真菌的菌剂;
    2)用于防治植物真菌病害的菌剂;
    3)用于固氮的菌剂;
    4)产生固氮酶的菌剂。
    4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152在制
    备下述1)-4)中任一菌剂中的应用:
    1)用于抑制病原真菌的菌剂;
    2)用于防治植物真菌病害的菌剂;
    3)用于固氮的菌剂;
    4)产生固氮酶的菌剂。
    5.根据权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的应用,其特征在于:所述病
    原真菌为引起赤霉病的真菌、或为引起菌核病的真菌;所述植物真菌病害为赤霉病或
    菌核病。
    6.根据权利要求5所述的菌剂或应用,其特征在于:所述引起赤霉病的真菌为
    玉米赤霉菌(Gibberella?zeae)或禾谷镰刀菌(Fusarium?graminearum);所述引起菌核
    病的真菌为核盘菌(Sclerotinia?sclerotiorum)。
    7.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152、或权利要
    求2、3、5或6所述菌剂在生产固氮酶中应用;

    权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152、或权利要求
    2、3、5或6所述菌剂在制备生物有机肥中应用。
    8.含有权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152、或权利
    要求2、3、5或6所述菌剂的生物有机肥。
    9.培养权利要求1所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152的方法,
    包括将芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152在用于培养芽孢杆菌的培养基
    中培养的步骤。
    10.权利要求2、3、5或6所述菌剂的制备方法,包括如下步骤:将权利要求1
    所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152作为活性成分,得到所述菌剂。

    说明书

    一株源于大豆根际能够拮抗病原真菌的芽孢杆菌及其用途

    技术领域

    本发明涉及拮抗多种病原真菌的大豆根际固氮菌及其用途,特别涉及一种可以拮
    抗作物赤霉病菌和菌核病菌,并具有在大豆根际进行固氮功能的细菌。

    背景技术

    氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源,占生产
    总成本的70%~80%。近年来能源日趋紧张,我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮
    肥价格上涨,农民难以承受,反响强烈。此外,化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮
    食安全方面发挥了巨大作用,但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染,造成一系
    列的严重危害,如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水
    安全造成了威胁。

    大气中含有78%的氮素,但其存在形式是分子态氮气,动植物不能直接利用,自
    然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力,将其还原成氨,这就是生
    物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂,或进一步与其它富含植
    物营养的物料复合加工成生物制品,应用于农业生产,可以提供作物氮素营养,改善
    作物根际生态环境,提高土壤生物肥力性状,这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固
    氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势:①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生
    物组成,可以再生,不存在资源枯竭问题,是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环
    境友好型肥料,其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质,而且能改善土壤理化
    性质,提高土壤肥力,是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低,其成
    本仅为等效化学氮肥的20%~40%,可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物
    资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本,提高农产品品质,提升土壤肥力,
    使农民受益,促进社会和谐发展。

    作物赤霉病的病原菌为玉米赤霉菌(Gibberella?zeae)无性世代为禾谷镰刀菌
    (Fusarium?graminearum),是粮食作物的重要致病菌。我国小麦赤霉病有95%是麦类
    赤霉病菌引起的,是长江中下游冬麦区和东北春麦区的重要病害,发病时经常造成
    20%~30%的产量损失。此外,该菌还侵染玉米、水稻、大麦等作物,引起苗枯、茎
    腐、基腐、穗腐等。菌核病的病原菌是核盘菌(Sclerotinia?sclerotiorum),其形态特征表
    现为:子囊盘小,呈小杯状,浅肉色至褐色,单个或几个从菌核上生出,直径0.5-1cm,
    柄褐色细长,弯曲,长3-5cm,向下渐细,与菌核相连。菌丝体可以形成菌核,长柄的
    褐色子囊盘产生在菌核上。菌核形状多样,长3-15μm。子囊圆柱形,120-140μm×11μm,
    孢子通常8个,单行排列,椭圆形,8-14μm×4-8μm,侧丝细长,线形,无色,顶部较粗。
    该菌是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌,广泛地侵染、危害十字花
    科、豆科、茄科、芸香科等植物,如造成油菜、大豆、向日葵、黄瓜、辣椒等经济作
    物和蔬菜菌核病。目前对上述真菌病害的防治主要依靠化学农药,然而化学防治不仅
    成本高、污染环境,而且防效也不理想,同时食品的安全性也受到严重影响。

    菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前,限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈
    就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性强、
    货架期长的微生物肥料生产用菌种。

    发明内容

    本发明的目的是提供一株可以在作物根际进行高效固氮,并且拮抗作物赤霉病菌
    (Gibberellazeae)和菌核病菌(Sclerotinia?sclerotiorum)的细菌。

    本发明所提供的细菌,是芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711,该菌株已于2011年8
    月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址
    为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCC?No.5152。

    本发明的另一个目的是提供一种菌剂,该菌剂的活性成分为所述的芽孢杆菌
    (Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152。

    该菌剂除包含作为活性成分的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152
    外,还可包括辅料,如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。

    该菌剂可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、产生固氮酶等。

    所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152在制备下述1)-4)中任一
    菌剂中的应用也属于本发明的?;し段В?br />

    1)用于抑制病原真菌的菌剂;

    2)用于防治植物真菌病害的菌剂;

    3)用于固氮的菌剂;

    4)产生固氮酶的菌剂。

    所述病原真菌可为通过土壤、施入土壤中的肥料、和/或种子传播的真菌,具体可
    为引起赤霉病的真菌、或为引起菌核病的真菌;所述植物真菌病害可为赤霉病或菌核
    病。

    所述引起赤霉病的真菌可为玉米赤霉菌(Gibberellazeae)或禾谷镰刀菌(Fusarium?
    graminearum);所述引起菌核病的真菌可为核盘菌(Sclerotinia?sclerotiorum)。

    所述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152或以该芽孢杆菌(Bacillus?
    sp.)GD5711CGMCC?No.5152为活性成分的菌剂在生产固氮酶中的应用以及在制备
    生物有机肥中的应用也属于本发明的?;し段?。

    本发明的再一个目的是提供一种含有所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711?CGMCC
    No.5152或以所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152为活性成分的菌剂
    的生物有机肥。

    本发明的又一目的是提供一种培养芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.
    5152的方法,该方法包括将芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152在用于培
    养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。

    本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法,该方法包括如下步骤:将所
    述的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152作为活性成分,得到所述菌剂。

    实验证明,本发明是从土壤样品中经过层层筛选,最终筛选出了芽孢杆菌(Bacillus?
    sp.)GD5711CGMCC?No.5152,该菌株具有固氮酶活性,能够拮抗作物赤霉病病原菌
    玉米赤霉菌(Gibberella?zeae)和菌核病病原菌核盘菌(Sclerotinia?sclerotiorum),竞争
    适应能力强,接种效果好,在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前
    景。

    保藏说明

    菌种名称:芽孢杆菌

    拉丁名:(Bacillus?sp.)

    菌株编号:GD5711

    保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

    保藏机构简称:CGMCC

    地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号

    保藏日期:2011年8月17日

    保藏中心登记入册编号:CGMCC?No.5152

    附图说明

    图1为芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152的固氮酶活性。

    图2为芽孢杆菌(Bacillus?sp.)拮抗赤霉病菌玉米赤霉菌(Gibberella?zeae)。左侧菌
    落为芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152,右侧菌落为玉米赤霉菌
    (Gibberella?zeae)。

    图3为芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152拮抗菌核病菌(Sclerotinia?
    sclerotiorum)。左侧菌落为芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152,右侧菌落
    为菌核病菌(Sclerotinia?sclerotiorum)。

    具体实施方式

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

    固氮菌富集培养液ACCC55成份:蔗糖10g、K2HPO4·3H2O?0.5g、NaCl?0.2g、
    CaCO3?1g、MgSO4·7H2O?0.2g、蒸馏水1000ml、pH?7.0~7.2。

    改良固氮培养基成份:蔗糖10g、K2HPO4·3H2O?0.5g、NaCl?0.2g、CaCO3?1g、
    MgSO4·7H2O?0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5%~2.0%,pH?7.0~7.2。

    无氮培养基:蔗糖10g,NaCl?0.12g,K2HPO4·3H2O?0.5g,CaCO31g,MgSO4·7H2O
    0.2g,蒸馏水1000mL,pH7.2。

    赤霉病菌-玉蜀黍赤霉菌(Gibberella?zeae)(中国农业微生物菌种保藏管理中心,
    ACCC31053)。

    菌核病菌-核盘菌(Sclerotinia?sclerotiorum)(中国农业微生物菌种保藏管理中心,
    ACCC30046)。

    实施例1、大豆根际固氮菌GD5711的分离与鉴定

    一、大豆根际固氮菌GD5711的分离

    取10g土样(采自中国黑龙江)放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液,
    吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中,100rpm,28℃进行摇床振荡培养,
    72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢菌分离。吸取1ml上述
    固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成10-1稀释度,继续稀释制成10-2、10-3、10-4、
    10-5稀释度的菌悬液,在100℃沸水中加热10min,冷却后每个稀释度取0.1ml涂布在
    固氮菌分离培养基平板上,29℃静置培养。2~3d待菌落形成后,在改良的ACCC55
    固氮菌培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命
    名为大豆根际固氮菌GD5711。

    二、大豆根际固氮菌GD5711的鉴定

    从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的大豆根际固氮菌:

    1、形态学鉴定

    将处于对数生长期,且菌落大小稳定,上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌
    GD5711进行单菌落状态描述,主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落
    表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放
    射状等)。

    对于处于对数生长期的所述固氮菌GD5711,经涂片染色后采用光学显微镜观察
    菌体的形态。

    结果表明,上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GD5711菌落圆形凸起,水滴状,
    半透明,有光泽,表面湿润光滑,边缘整齐;菌体杆状,1.0×3.5~4.0μm。

    2、生理生化特征分析

    参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:
    科学出版社,2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三
    版).北京:高等教育出版社,1999.)测定上述固氮菌GD5711的生理生化特征。

    所述固氮菌GD5711的生理生化特征测定结果如下:

    接触酶反应:阳性

    氧化酶反应:阴性

    生长温度:4℃不生长,28℃生长,37℃不生长,60℃不生长

    耐盐性试验:2%NaCl生长,5%NaCl生长,7%NaCl生长,10%NaCl生长

    苯丙氨酸脱氨酶试验:阴性

    利用柠檬酸盐:阳性

    水解淀粉:阳性

    卵黄卵磷脂酶:阳性

    甲基红试验:阴性

    V.P试验:阳性

    PH?5.7生长:阳性

    糖醇发酵产酸:葡萄糖阳性,甘露醇阳性,乳糖阴性,蔗糖阳性

    3、16s?rDNA序列同源性分析

    常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的固氮菌GD5711,提取菌株的总DNA作
    为基因扩增模板,以细菌16s??rDNA??通用引物,27f:
    5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492r:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′
    进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为:
    95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min,共30个循环。DNA测序由北京三博
    远志生物技术公司完成,序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成,序列比对通
    过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(//www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。

    固氮菌GD5711菌株16s?rDNA的序列详见序列表中序列1。

    4、生长特性分析

    进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基,分别在4℃、28℃、
    37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性,每个处理3次重复。调整酸度分别
    为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11,每个处理3次重复,培
    养、观察、记录菌株生长的最适pH。

    结果表明,所述大豆根际固氮菌GD5711的最适生长温度为28℃,最适生长pH
    为pH7~8。

    鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s?rDNA序列同源性分析结果,将步骤一
    分离并纯化得到的大豆根际固氮菌GD5711鉴定为变型细菌α亚群芽孢杆菌科芽孢杆
    菌属(Bacillus?sp.)。该大豆根际固氮菌GD5711已于2011年8月17日保藏于中国微生
    物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰
    西路1号院3号),保藏编号为CGMCC?No.5152。

    实施例2、芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152固氮酶活性测定

    对实施例1所得到的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152进行固氮酶
    活性测定,具体方法如下所述:在15×150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培养基
    制成斜面,接种固氮菌,28℃培养。以不接种空白斜面为阴性对照,设3个重复。培
    养72h后,换橡胶塞,注入乙炔气体使终浓度为10%,用医用胶布密封,继续培养72h,
    取100μl反应气体,用气相色谱仪测定乙烯生成量,根据以下公式计算芽孢杆菌
    (Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h)
    =C2H4nmol/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)],其中C2H4nmol=1000×C2H4体积(μl)
    ×273×P/[22.4×(273+t)×760],其中P为气压(mm汞柱),t为反应温度(℃)。

    其中,菌体蛋白含量测定方法如下所述:用5ml生理盐水将试管斜面上的菌苔洗
    入离心管中,收集菌体,向沉淀中加入3ml?0.5M的NaOH沸水煮沸5min,加入3ml?0.5M
    的HCl混合,离心后取上清1.0ml,加入5ml考马斯亮蓝溶液,在漩涡混合器上混合,
    显色3min,测定595nm处的吸光值A595,根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含
    量。

    结果显示,筛选到的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152的固氮酶活
    性为2.820nmol?C2H4/h·mg蛋白,如图1所示。这一结果表明,本发明的芽孢杆菌
    (Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152具有固氮能力。

    实施例3、芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152拮抗病原真菌抑菌率
    测定

    采用两点对峙法对实施例1所得到的芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.
    5152进行拮抗病原真菌抑菌率测定,具体操作如下所述:在PDA平板上距离中心2cm
    的两点上分别接种作物赤霉病菌(Gibberella?zeae)(或者菌核病菌(Sclerotinia?
    sclerotiorum)和芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152,每个筛选处理3个重
    复,以只接病原真菌不接固氮菌的平板为对照。28℃恒温培养,15d后用毫米刻度尺
    测量对峙平板上病原真菌沿被测芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152方向
    的菌落半径r1、及对照平板上病原真菌的菌落半径r0。病原真菌生长抑制率(%)=(对
    照半径r0-对峙培养病原真菌菌落半径r1)/对照半径r0×100%。

    结果显示,赤霉病菌(Gibberella?zeae)的r0是63.3±2.8mm,r1是29.0±0.5mm;
    菌核病菌(Sclerotinia?sclerotiorum)的r0是63.0±2.1mm,r1是23.5±0.5mm。将平均值代
    人上述公式计算得:所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711CGMCC?No.5152对赤霉病菌
    (Gibberella?zeae)的抑菌率为54.19%,如图2所示;对菌核病菌(Sclerotinia?sclerotiorum)
    的抑菌率为62.69%,如图3所示。这一结果表明所述芽孢杆菌(Bacillus?sp.)GD5711
    CGMCC?No.5152可以有效拮抗作物赤霉病菌(Gibberellazeae)和菌核病菌(Sclerotinia?
    sclerotiorum)。



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