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    一种 蚕丝 支架 及其 制备 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110149850.4

    申请日:

    2011.06.03

    公开号:

    CN102293688A

    公开日:

    2011.12.28

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||著录事项变更IPC(主分类):A61F 2/02变更事项:发明人变更前:邹晓晖 谢淑君 陈隆坤变更后:谢淑君 陈隆坤|||实质审查的生效IPC(主分类):A61F 2/02申请日:20110603|||公开
    IPC分类号: A61F2/02; A61F2/50; A61L27/34; A61L27/28 主分类号: A61F2/02
    申请人: 浙江星月生物科技股份有限公司
    发明人: 邹晓晖; 谢淑君; 陈隆坤
    地址: 311121 浙江省杭州市余杭区仓前镇海曙路9号3栋
    优先权:
    专利代理机构: 杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人: 王兵;黄美娟
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110149850.4

    授权公告号:

    102293688B|||||||||

    法律状态公告日:

    2013.09.04|||2013.06.12|||2012.02.15|||2011.12.28

    法律状态类型:

    授权|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种蚕丝支架及制备方法及在生物体组织修补与构建的应用,所述的蚕丝支架主要由基础层膜和水溶性天然高分子材料层膜构成,所述的基础层膜由蚕丝编制而成的网片结构,网孔大小为0.25~25mm2;所述的水溶性天然高分子材料为蚕丝丝素、透明质酸、胶原或壳聚糖;本发明的有益效果主要体现在:(1)本发明蚕丝支架结构平整,具有良好的生物学、力学性能和良好的组织相容性;(2)蚕丝支架网孔大小均匀,可调整;(3)材料易得,制备方法简便;(4)本发明蚕丝支架中所采用的天然高分子材料,生物相容性好,操作简单;(5)本发明蚕丝支架适合于生物体内组织修补或加强、生物体外组织构建。

    权利要求书

    1.一种蚕丝支架,其特征在于所述的蚕丝支架由基础支架及包覆在基础支
    架表面的水溶性天然高分子材料层膜构成,所述的基础支架是由蚕丝编制成
    网孔大小为0.25~25mm2的网片结构,所述的水溶性天然高分子材料为蚕丝
    丝素、透明质酸、胶原或壳聚糖。
    2.如权利要求1所述的蚕丝支架,其特征在于所述的水溶性天然高分子材
    料为蚕丝丝素。
    3.如权利要求1所述的蚕丝支架,其特征在于所述的基础支架由去除丝胶
    蛋白的蚕丝编制而成。
    4.如权利要求1所述的蚕丝支架,其特征在于所述的蚕丝支架为结构平整
    的片状。
    5.如权利要求1所述的蚕丝支架,其特征在于所述的基础支架按如下方法
    制成:先将蚕丝去掉丝胶蛋白,然后再使用机械或手工方法编织而成网孔大
    小为0.25~25mm2的网片结构制成基础支架。
    6.如权利要求1所述的蚕丝支架,其特征在于所述的基础支架按如下方法
    制成:先将蚕丝使用机械或手工方法编织而成网孔大小为0.25~25mm2的待
    去丝胶蛋白的网片结构,再将所述的待去丝胶蛋白的网片结构去掉丝胶蛋
    白。
    7.如权利要求3、5、6所述的蚕丝支架,其特征在于所述的去丝胶蛋白的
    方法为:(1)将蚕丝或待去丝胶蛋白的网片结构浸沉在质量浓度为
    0.1%~0.3%Na2CO3水溶液中,煮沸60~150min;(2)将步骤(1)煮沸处理
    后的蚕丝置于纯水中,清洗1~3遍,室温或干燥箱中干燥。
    8.如权利要求1所述的蚕丝支架的制备方法,其特征在于所述的方法按如
    下步骤制成:(1)将去除丝胶蛋白的蚕丝编制成网孔大小为0.25~25mm2的
    网片结构制成基础支架;(2)将基础支架喷涂质量浓度0.1%~20%的水溶性
    天然高分子材料的水溶液,喷涂量为0.5~3.0mL/cm2,在20~40℃干燥,在
    基础支架表面形成天然高分子材料层膜,钴-60辐照灭菌处理,获得所述的
    蚕丝支架。
    9.如权利要求1所述的蚕丝支架的制备方法,其特征在于所述的制备方法
    按照如下步骤进行:(1)将去除丝胶蛋白的蚕丝编制成网孔大小为
    0.25~25mm2的网片结构制成基础支架;(2)在步骤(1)制备的基础支架的
    表面喷涂质量浓度0.1%~20%蚕丝丝素水溶液,涂覆量为0.5~3.0mL/cm2,
    20~40℃干燥4~48h,钴-60辐照灭菌,获得所述的蚕丝支架。
    10.如权利要求1所述的蚕丝支架应用于生物体内组织修补或加强,或生物
    体外组织构建。

    说明书

    一种蚕丝支架及其制备与应用

    (一)技术领域

    本发明涉及一种组织工程网状支架,特别涉及一种可用于生物体内组
    织修补或加强,生物体外组织构建的网状蚕丝支架及其制备方法。

    (二)背景技术

    组织缺损、薄弱是临床上常见问题,引起的原因有先天缺损、病理因
    素及衰老等,临床表现为腹壁、盆地组织松弛、瘢痕及皱纹等。这些软组
    织的缺损、薄弱通常无法自行修复,极大的影响到相应器官组织的功能及
    外观表现。特别是由于产后或绝经后盆地松弛导致的张力性尿失禁,是妇
    女常见的疾病。自上世纪90年代中期以来,它已成为世界5大疾病之一。
    目前临床上主要采用组织补片修复组织缺损和薄弱。根据材料的化学成分
    和生物学特征,可将组织补片分为生物补片和非生物补片。

    目前进入市场的生物补片多为异体/异种的组织产品及其衍生物,异体
    /异种组织虽然来源广泛,但是可能会引起免疫排斥和疾病传播等,存在潜
    在的风险。

    而目前非生物补片主要是包括一些高分子聚合物产品。其中,聚丙烯
    补片已被广泛应用到临床,用于尿失禁治疗及疝修补等手术治疗。但此类
    补片存在不可吸收和终生不降解的特征,据报道会引起严重的近期排异反
    应和远期的侵蚀反应。

    研究表明,蚕丝由约75%的丝素和约25%的丝胶所组成,它是蚕在绢
    丝腺内分泌出来的天然蛋白质,由18种氨基酸组成,主要由重复的
    Gly-Ala-Gly-Ala-Ser多胎单元组成。它无毒性、无刺激性,具有良好的生
    物相容性,因此蚕丝是制造生物医学材料的较理想原料。

    专利200610051885.3,一种网状组织工程支架,提供了一种采用除丝
    胶蛋白的蚕丝编织网状结构的方法,其网孔大小为0.5-25mm2。并认为去
    除丝胶蛋白的蚕丝具有良好的力学性能和生物相容性。经过脱丝胶蛋白处
    理的蚕丝网状支架,容易发生卷边的现象,结构相对不平整;影响蚕丝支
    架的使用效果。因此,寻找一种对蚕丝支架的力学性能和生物学性能改良
    方法,制作一种能同时具备平整结构,且有良好力学性能和生物相容性良
    好的用于组织修补或加强的医用蚕丝支架,成为本发明的出发点。

    (三)发明内容

    本发明目的是提供一种蚕丝支架及其制备方法与应用,该蚕丝支架具
    备平整结构、良好力学性能和生物相容性,可应用于生物体内组织修补或
    加强、生物体外组织构建的医用支架。

    本发明采用的技术方案是:

    一种蚕丝支架,所述的蚕丝支架由基础支架及包覆在基础支架表面的
    水溶性天然高分子材料层膜构成,所述的基础支架是由蚕丝编制成网孔大
    小为0.25~25mm2的网片结构,所述的水溶性天然高分子材料为蚕丝丝素透
    明质酸、胶原、或壳聚糖。

    本发明优选所述的水溶性天然高分子材料为蚕丝丝素。

    所述的基础支架优选由去除丝胶蛋白的蚕丝编制而成。

    所述的蚕丝支架为结构平整的具有网孔结构的片状。

    所述的基础支架按如下方法制成:先将蚕丝去掉丝胶蛋白,然后再使
    用机械或手工方法编织而成网孔大小为0.25~25mm2的网片结构制成基础
    支架。

    进一步,所述的基础支架也可按如下方法制成:先将蚕丝使用机械或
    手工方法编织而成网孔大小为0.25~25mm2的待去丝胶蛋白的网片结构,再
    将待去丝胶蛋白的网片结构去掉丝胶蛋白。

    所述的蚕丝去丝胶蛋白的方法:将蚕丝或待去丝胶蛋白的网片结构浸
    没于质量浓度为0.1%~0.3%Na2CO3水溶液中,煮沸60~150min;(2)将步
    骤(1)经过煮沸处理的蚕丝置于纯水中,清洗1~3遍,室温或干燥箱干燥,
    通常在干燥4~48小时。

    本发明所述的蚕丝支架的制备方法为:(1)将去除丝胶蛋白的蚕丝编
    制成网孔大小为0.25~25mm2的网片结构制成基础支架;(2)将基础支架表
    面喷涂上一层质量浓度0.1%~20%的水溶性天然高分子材料的水溶液,喷
    涂量为0.5~3.0mL/cm2,在20~40℃干燥4~48h,在基础支架表面形成天然
    高分子材料层膜,钴-60辐照灭菌处理,获得所述的蚕丝支架。

    进一步,所述的蚕丝支架的制备方法优选按照如下步骤进行:(1)将
    去除丝胶蛋白的蚕丝编制成网孔大小为0.25~25mm2的网片结构制成基础
    支架;(2)在步骤(1)制备的基础支架的表面涂覆质量浓度0.1%~20%蚕
    丝丝素水溶液,喷涂的天然高分子的量为0.5~3.0mL/cm2,25~40℃干燥
    4~48h,钴-60辐照灭菌,获得所述的蚕丝支架。

    所述的蚕丝支架可应用于生物体内组织修补或加强及生物体外组织构
    建。

    所述的蚕丝支架优选应用于治疗女性尿失禁的医用蚕丝支架。

    本发明所述的蚕丝支架中的基础层膜可以是利用化学和物理方法先去
    除粗蚕丝的丝胶蛋白,在利用机械或手工方法编制成网片结构,还可以先
    利用机械或手工方法编制成网片结构,再利用化学和物理方法去除粗蚕丝
    的丝胶蛋白。

    本发明所述的去除桑蚕粗蚕丝丝胶蛋白的方法主有碳酸钠溶液煮沸去
    除法、还可以用去污剂煮沸去除法、硼酸煮沸去除法或者直接加热去除法,
    这些本领域技术人员所熟知的去丝胶蛋白的方法,都适合本发明。

    本发明采用水溶性天然高分子材料涂覆网片状蚕丝基础层膜形成具有
    平整结构且力学和生物学性能良好的蚕丝支架,所用的天然高分子材料性
    能:(1)蚕丝丝素:它是蚕丝的主要组成成分,其优点主要表现在,丝素涂
    覆整个蚕丝支架化学成分单一,加热干燥的过程可以导致丝素涂层晶体结
    构发生改变,增加了蚕丝支架的硬度;(2)透明质酸:它是一种直链状的高
    分子多糖,是自然界中最具亲水性的分子,具有良好的机体相容性,具有
    防组织粘连的作用;(3)胶原:它是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白,是
    构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维,给细胞提
    供抗张力和弹性,并在细胞的迁移和发育中起作用,胶原的加入可以促进细
    胞长入;(4)壳聚糖及其衍生物:它们具有止血杀菌,促进创面愈合等功能,
    是一种良好生物活性的材料,本发明优选蚕丝丝素为天然高分子材料。

    与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:(1)本发明蚕丝支
    架结构平整,既具有良好的生物学和力学性能,又具有良好的组织相容性;
    (2)本发明蚕丝支架,由机器编织而成,网孔大小均匀,且网孔大小根据
    需要可以在0.25~25mm2之间进行调整;(3)本发明蚕丝支架所用材料易
    得,制备方法简便,主要采用物理方法,不会涉及到其他化学物质的引入
    及除去,杜绝了化学方法可能带来的不良后果;(4)本发明蚕丝支架中所
    采用的天然高分子材料,生物相容性好,操作简单;(5)本发明蚕丝支架
    适合于生物体内组织修补或加强、生物体外组织构建,特别可应用于治疗
    女性尿失禁。

    (四)附图说明

    图1蚕丝脱丝胶处理前后的蚕丝表面电镜扫描图,1-1脱丝前,1-2脱
    丝后;

    图2脱丝胶后蚕丝基础支架的网状结构图;

    图3经过天然丝素蛋白喷涂后的蚕丝支架的大体照片;

    图4bMSCs复合蚕丝支架的荧光镜照片;

    图5实施例8bMSCs复合蚕丝支架植入动物(大鼠)尿道实验,4-A
    为bMSCs复合蚕丝支架图,4-B为bMSCs复合蚕丝支架植入动物尿道实
    验;

    图6实施例8bMSCs复合蚕丝支架植入动物(大鼠)尿道4周后图片,
    A为移植后4周bMSCs复合蚕丝支架大体图,B为细胞追踪仪荧光图,C
    为bMSCs复合蚕丝支架切片在激光共聚焦显微镜下图片,D为bMSCs复
    合蚕丝支架移植前CFDA标记荧光图;

    图77-1为实施例8术后4周动物压力性尿失禁图,及7-2为四组实验动
    物的LPP结果,A为A组,B为B组,C为C组,D为D组;

    图8实施例8术后12周,蚕丝支架及bMSCs复合蚕丝支架内部结构重建
    图,A为蚕丝支架HE染色图,B为bMSCs复合蚕丝支架HE染色图,C为蚕
    丝支架麦松染色图,D为bMSCs复合蚕丝支架麦松染色图;

    图9实施例8术后12周,蚕丝支架及bMSCs复合蚕丝支架胶原含量图,
    silk为蚕丝支架组,silk+bMSC为bMSCs复合蚕丝支架组。纵坐标表示两种
    不同的支架的胶原含量;

    图10实施例8术后12周,蚕丝支架及bMSCs复合蚕丝支架力学性能:
    A为抗张力实验,B为杨氏模量实验,其中silk为蚕丝支架组,silk+bMSC为
    bMSCs复合蚕丝支架组。A组纵坐标表示两种支架的抗张力,B组纵坐标表
    示两种支架的杨氏模量。

    (五)具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的?;し段?br />并不仅限于此:

    实施例1:

    将粗蚕丝编制成网片结构支架,规格为100mm×20mm×0.5mm,网孔
    大小为1.0mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,重复3次,
    用200mL医用纯化水漂洗3次,室温(25℃)晾干12h,获得基础支架;
    用4%丝素蛋白水溶液喷涂在基础支架上,涂覆量为0.5mL/cm2,室温(25
    ℃)下晾24小时。内外包装后,经钴-60辐照灭菌,获得蚕丝支架。

    实施例2:

    将粗蚕丝编制成网状结构支架,规格为100mm×100mm×0.5mm,网孔
    大小为1.0mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,重复3次。
    用200mL医用纯化水漂洗3次,烘箱40℃干燥4h,备用。将预先配制好的
    10%壳聚糖水溶液喷涂在蚕丝支架上,涂覆量为1.5mL/cm2,涂覆完成后
    40℃恒温烘箱干燥4小时,内外包装后,经钴-60辐照灭菌,即得到蚕丝支
    架。

    实施例3:

    将粗蚕丝编制成网状结构支架,规格为100mm×100mm×0.5mm,网孔
    大小为4.0mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,重复3次。
    用200mL医用纯化水漂洗3次,室温(25℃)晾干24h,备用。将预先配
    制好的20%壳聚糖水溶液喷涂在蚕丝支架上,涂覆量为0.5mL/cm2,涂覆
    结束经30℃恒温烘箱干12小时,内外包装后,经钴-60辐照灭菌,即得到
    蚕丝支架。

    实施例4:

    将粗蚕丝编制成网状结构支架,规格为50mm×50mm×0.5mm,网孔大
    小为0.5mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,重复3次。
    用200mL医用纯化水漂洗3次,烘箱40℃干燥6h,备用。将预先配制好
    的0.1%透明质酸水溶液喷涂在蚕丝支架上,涂覆量为3mL/cm2。室温(25
    ℃)下晾48小时,内外包装后,经钴-60辐照灭菌,即得到蚕丝支架。

    实施例5:

    将粗蚕丝编制成网状结构支架,规格为50mm×50mm×0.5mm,网孔大
    小为0.25mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,重复3次。
    用200mL医用纯化水漂洗3次,烘箱40℃干燥8h,备用。将预先配制好
    的0.2%胶原水溶液喷涂在蚕丝支架上,涂覆量为3mL/cm2,经30℃恒温烘
    箱干12小时,内外包装后,经钴-60辐照灭菌,即得到蚕丝支架。

    实施例6

    将粗蚕丝编制成网状结构支架,规格为60mm×20mm×0.5mm的蚕丝网
    片,网孔大小为1.0mm2,然后用0.2%Na2CO3溶液200mL,煮沸30min,
    重复3次,用200mL医用纯化水漂洗3次,室温(25℃)晾干12h,获得
    基础支架,扫描电镜图如图1、图2所示;用4%丝素蛋白水溶液喷涂在基
    础支架上,涂覆量为0.5mL/cm2,室温(25℃)下晾24小时,内外包装后,
    经钴-60辐照灭菌,获得蚕丝支架。蚕丝支架的大体照片如图3所示。

    实施例7

    取第二代的bMSCs,用血清含量10%的低糖培养基培养5-7天后,改
    用血清20%的高糖培养基继续培养两周,形成细胞片(cell?sheet),将按照
    实施例6获得蚕丝支架置于培养皿中,用细胞片将蚕丝支架裹在其中,即
    得到bMSCs复合蚕丝支架。图4显示为bMSCs复合蚕丝支架荧光图。

    实施例8:蚕丝支架在妇女压力性尿失禁中的应用

    (1)建立动物模型:经腹腔麻醉后,通过双侧坐骨神经近端横断术,
    从双侧背部皮肤做切口,分离坐骨直肠窝上方肌肉,暴露坐骨神经3cm,
    从坐骨神经发起处切除2cm,建立尿失禁动物模型,横断术后4周测量漏
    尿点压(Leak?Point?Pressure,LPP)确认为压力性尿失禁(SUI)模型。

    (2)蚕丝支架用于尿失禁治疗

    1)实验分组:将40只成年雌性的Sprague-Dawley大鼠分为四组,分
    别为:实验对照组:(A组,5只),未处理组:(B组,5只),蚕丝支架组:
    C组(15只),bMSCs复合蚕丝支架组:(D组,15只)。

    2)压力性尿失禁:A组为经过相同的手术处理过程,但未切除神经组;
    B/C/D三组均经过双侧坐骨神经近端横断术处理,术后4周,压力测试如
    图7所示,确认其为压力性尿失禁。

    3)压力性尿失禁的治疗:B组未进行蚕丝支架植入;C组进行实施
    例6制备的蚕丝支架植入;D组进行实施例7制备的bMSCs复合蚕丝支架
    植入,如图5所示,术后4周,蚕丝支架如图7所示,进行LPP测试及评
    价治疗效果,C组、D组的LPP接近正常值(A组),均显著高于B组,
    这表明,蚕丝支架及bMSCs复合蚕丝支架都能有效治疗压力性尿失禁;

    4)组织修复能力:手术后12周后,手术取出大鼠尿道组织,置于2.5%
    戊二醛中,4℃冰箱固定过夜,石蜡包埋,切片。

    HE染色:将片子依次置于二甲苯(I)10min,二甲苯(II)10min,
    95%乙醇(I)10min,95%乙醇(II)10min,80%乙醇5min,75%乙醇
    5min,脱蜡。脱蜡完成后置于苏木精液染色10min,流水稍洗去苏木精液10
    s,1%盐酸乙醇3s,稍水洗30s,促蓝液返蓝10s。而后流水冲洗30min。0.5%
    曙红液染色1min,蒸馏水稍洗2s,80%乙醇稍洗2s。而后依次经过95%乙
    醇(I)3min,95%乙醇(II)3min,无水乙醇5min,无水乙醇5min,
    二甲苯(I)3min,二甲苯(II)3min,二甲苯(III)3min,处理完毕
    后,用中性树胶封固。

    麦松染色:按照HE染色的方法至苏木精染色,自来水冲洗,盐酸乙醇
    分化,自来水冲洗;丽春红-品红溶液洗5min,自来水洗;1%磷钼酸分
    化直到各种成分被染清晰约5min;2%淡绿液染10分钟(或用2%苯胺蓝水溶
    液替代);1%醋酸水溶液洗5min,水洗;常规脱水、透明、封片(同HE染
    色)。

    通过HE染色和麦松染色,从组织学观察蚕丝支架植入组(C组)及
    bMSCs复合蚕丝支架植入组(D组)的内部结构重建,结果如图8、图9所
    示,从HE染色及麦松染色图可以看出,D组bMSCs复合蚕丝支架的组织修
    复能力及胶原含量均优于C组单纯的蚕丝支架。

    5)力学性能:手术12周后,检测蚕丝支架植入组(C组)和bMSCs
    复合蚕丝支架植入组(D组)的力学性能,分别对蚕丝支架及bMSCs复合
    蚕丝支架进行抗张力及杨氏模量测试,所采用的试验仪器为万能电子材料
    试验机(Model?5543,Instron)。为了保证样品的新鲜,用浸有生理盐水的
    纱布包裹样品,并迅速置于4℃冰箱进行保存。夹持样品,保持夹具两端
    各留5mm的试样。在0.1N预张力的处理下,保持5mm/min进行张力测
    试,直至样品断裂。

    结果如图10所示,C组单纯蚕丝支架的杨氏模量为3.045±0.388Mpa,
    D组bMSCs复合蚕丝支架的杨氏模量为4.468±0.510Mpa,而C组单纯蚕
    丝支架抗张力为1.521±0.087N,D组bMSCs复合蚕丝支架的抗张力为
    2.436±0.192N。两个结果均表明,D组bMSCs复合蚕丝支架的力学性能
    都要优于C组单纯蚕丝支架。

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