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    重庆时时彩交流微信群: 一株水库杆菌及其在降解甲基叔丁基醚中的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610766802.2

    申请日:

    2016.08.30

    公开号:

    CN106244493A

    公开日:

    2016.12.21

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20160830|||公开
    IPC分类号: C12N1/20; A62D3/02(2007.01)I; B01D53/85; B01D53/72; C12R1/01(2006.01)N; A62D101/28(2007.01)N 主分类号: C12N1/20
    申请人: 浙江工业大学
    发明人: 陈东之; 陈建孟; 褚其英; 叶杰旭; 雷昱
    地址: 310014 浙江省杭州市下城区潮王路18号
    优先权:
    专利代理机构: 杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人: 黄美娟;李世玉
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610766802.2

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.01.18|||2016.12.21

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一株可降解甲基叔丁基醚的菌株—Piscinibacter?sp.MQ?18及其在微生物分解处理甲基叔丁基醚中的应用,所述Piscinibacter?sp.MQ?18,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏日期:2016年6月13日,保藏编号CCTCC?No:M?2016327;本发明提供的甲基叔丁基醚降解菌能利用甲基叔丁基醚作为唯一碳源与能源繁殖并将其完全矿化成CO2和H2O;该菌株于25℃~30℃、pH6.0~7.0的环境中能高效降解甲基叔丁基醚;接种该菌株的生物滴滤塔对MTBE废气的净化效率达70%~95%。该菌株有较强的环境适应能力,本发明将在甲基叔丁基醚污染治理实践中发挥重要作用。

    权利要求书

    1.水库杆菌(Piscinibacter sp.)MQ-18,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期
    为2016年6月13日,保藏编号CCTCC No:M2016327,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编430072。
    2.一种权利要求1所述Piscinibacter sp.MQ-18在微生物降解甲基叔丁基醚中的应
    用。
    3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用是将Piscinibacter sp.MQ-18接
    种至含有甲基叔丁基醚的无机盐培养基中,于25~37℃,pH4.0~10.0的条件下培养,实现
    对甲基叔丁基醚的降解。
    4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述甲基叔丁基醚在无机盐培养基中初始浓
    度为15~300mg/L;所述Piscinibacter sp.MQ-18以种子培养或发酵培养后的湿菌体经无
    机盐培养基稀释获得的菌悬液形式加入,所述菌悬液中湿菌体蛋白浓度为5-170mg/L,菌悬
    液体积接种量为1-5%。
    5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述的无机盐培养基组成为:CaCl2·2H2O
    0.03g/L,MgSO4·H2O 0.46g/L,(NH4)2SO4 1.23g/L,KH2PO4 0.7g/L,K2HPO4 0.85g/L,
    FeSO4·7H2O 0.001,微量元素母液1mL/L,溶剂为水,pH7.0~7.5;所述的微量元素母液组成
    为:FeSO4·7H2O 1.0g/L,CuSO4·5H2O 0.02g/L,H3BO3 0.014g/L,MnSO4·4H2O 0.10g/L,
    ZnSO4·7H2O 0.10g/L,Na2MoO4·2H2O 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.02g/L,溶剂为水。
    6.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述菌悬液按如下步骤获得:
    (1)斜面培养:将Piscinibacter sp.MQ-18接种于R2A固体培养基,28~32℃培养72h,获
    得斜面菌体;所述R2A固体培养基组成为:酵母粉0.50g/L,胰蛋白胨0.50g/L,干酪素0.50g/
    L,葡萄糖0.50g/L,可溶性淀粉0.50g/L,丙酮酸钠0.30g/L,KH2PO4 0.45g/L,MgSO4 0.05g/
    L,琼脂15~18g/L,溶剂为水,pH7.2;
    (2)种子培养:从步骤(1)斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中,28~32℃培
    养56~72h,获得种子液;所述的种子培养基为R2A液体培养基,除无琼脂外,其余组分与R2A
    固体培养基相同;
    (3)发酵培养:将步骤(2)获得的种子液以体积浓度5~10%的接种量接种至发酵培养
    基,于28~32℃,pH6.0~8.0条件下培养56~72h,获得发酵液;所述发酵培养基组成为:酵
    母粉0.5g/L,CaCl2 0.023g/L,MgSO4 0.2g/L,(NH4)2SO4 2.5g/L,KH2PO4 1.0g/L,Na2HPO4
    4.5g/L,微量元素母液1mL/L,溶剂为水,pH7.0~7.5;所述微量元素母液组成为:FeSO4·
    7H2O 1.0g/L,CuSO4·5H2O 0.02g/L,H3BO3 0.014g/L,MnSO4·4H2O 0.10g/L,ZnSO4·7H2O
    0.10g/L,Na2MoO4·2H2O 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.02g/L,溶剂为水;
    (4)菌悬液制备:将种子液或发酵液在8000rpm离心10min,弃上清液,用已灭菌的无机
    盐培养基清洗菌体,然后8000rpm离心10min,弃上清液,重复洗涤3次,将获得的湿菌体用无
    菌无机盐培养基悬浮,获得所述的菌悬液。
    7.如权利要求2所述应用,其特征在于所述的应用是利用Piscinibacter sp.MQ-18通
    过生物滴滤塔降解甲基叔丁基醚废气。
    8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述生物滴滤塔由设有废气进口的塔底,设有
    生物填料层、取样口和水浴保温夹套的塔身,安装有尾气出口、气体采样口和营养液喷淋系
    统的塔顶,空气泵,吹脱瓶和混合瓶组成,所述的塔身由两个生物处理单元至下而上叠置安
    装组成,相邻层的生物处理单元之间布置水流通道以及供相邻层气连通的通气口;所述的
    营养液喷淋系统由安装在塔顶的喷洒器,设在生物滴塔外部的循环营养液储存瓶、营养液
    输入管、pH控制仪、蠕动泵、碱液瓶连接组成;所述的pH控制仪分别与循环营养液储存瓶和
    碱液瓶连接,pH控制仪还设有与循环营养液储存瓶接通的pH计探头;所述循环营养液储存
    瓶通过蠕动泵与喷洒器连通;所述空气泵通过质量流量计和转子流量计分别与吹拖瓶和混
    合瓶连通,混合瓶中混匀废气通过转子流量计与塔底废气进口连通;所述生物填料层填料
    为拉西环。
    9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述应用是以Piscinibacter sp.MQ-18经发
    酵培养后的湿菌体经无机盐培养基稀释获得的菌悬液为营养液;所述营养液湿菌体蛋白含
    量为200mg/L,营养液的喷淋量为180ml/min,废气停留时间30-120s,甲基叔丁基醚浓度10-
    300mg/m3。
    10.如权利要求9所述的应用,其特征在于所述废气停留时间60s,甲基叔丁基醚浓度
    100mg/m3。

    说明书

    一株水库杆菌及其在降解甲基叔丁基醚中的应用

    (一)技术领域

    本发明涉及一株能够降解甲基叔丁基醚的新菌株——Piscinibacter sp.MQ-18
    及其应用。

    (二)背景技术

    甲基叔丁基醚(MTBE)作为一种很重要的石油化工产品,在20世纪80年代初成为一
    种汽油添加剂被广泛使用。高水溶的性质使它在地下储油罐泄漏之后便会很快的渗透到地
    下水中,并向四周扩散。同时因为MTBE和其他化合物具有共溶的性质,会使汽油里面的其它
    化合物在水中的溶解度提高1个数量级,造成严重的化学污染。这样的情况下,MTBE在汽油
    中的使用虽然会减少了空气中污染物的排放,但是会对土壤和地下水产生巨大的危害。动
    物实验表明,直接注射MTBE会产生癌症的症状。虽然还没发现明确的MTBE会对人类产生癌
    症症状的试验数据,但是美国的国家环保局(USEPA)已经在评估它潜在的危害,而且要将其
    列入可能致癌物和环境优先污染物的名单当中。

    目前,针对该污染物的处理方法有物理吸附法、曝气吹除法、超声波法、强化双氧
    水法和辐射分解法等,但多用于MTBE废水的处理。近年来,生物法被证明在醚类化合物的净
    化中具有良好的应用前景。生物净化技术是利用微生物代谢活动,将污染物转化为细胞代
    谢的能源、细胞组成物质及无害化的小分子物质(如H2O、CO2等),相较于其它方法具有高效、
    低耗,反应条件温和、二次污染小等优点。

    利用生物技术降解MTBE的关键之一便是获得MTBE高效降解菌。目前,国外学者已
    在这方面做了大量研究,国内对该方面的研究尚处于发展阶段。由于MTBE的碳链较短,抑制
    了微生物对碳的利用,使其生物降解速率较一般有机物缓慢,目前已分离得到的MTBE降解
    菌细胞得率都比较低,此外,已分离得到的菌株降解效率也有待提高。刘涉江等用混合微生
    物降解MTBE,发现以MTBE为碳源的微生物生长极其缓慢,使得MTBE降解性能较差,且不能矿
    化为二氧化碳(刘涉江等.农业环境科学学报,2007,26(2):563-567.);张杏青等发现的菌
    株Comamonas testosterone A1能够耐受50mg/L的MTBE,但需要经过7d才能降解完全(张杏
    青等.环境科学,2009,30(6):1785-1790.);Hatizinger等发现的菌株Hydrogenophaga
    flava ENV735能以MTBE为唯一的碳源和能源缓慢生长,对MTBE的降解速率为46nmol/
    (min·mgprotein),但是加入少量酵母浸出液可极大促进其生长并加速对MTBE的降解
    (Hatizinger等.Appiled and Environmental Microbiology,2001,67(12):5601-5607);
    Hanson等发现的菌株Methylibium petroleiphilum PM1在MTBE初始浓度分别为5、50、
    500mg/L时,PM1的降解速率与浓度成线性关系,分别为0.07、1.17和3.56mg·L-1·h-1
    (Hanson等.Appiled and Environmental Microbiology,1999,65(11):4788-4796)。

    (三)发明内容

    本发明针对现有MTBE生物降解效率低、微生物世代时间长的不足,提供了一株能
    高效降解MTBE的菌株及其应用。

    本发明采用的技术方案是:

    本发明提供一株可降解MTBE高效降解菌——水库杆菌(Piscinibacter sp.)MQ-
    18,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期:2016年6月13日,保藏编号:CCTCC NO:M
    2016327,地址:中国,武汉,武汉大学,邮编430072。

    本发明所提供的MTBE降解菌CCTCC NO:M 2016327来源于浙江某制药厂污水处理
    池的活性污泥,经人工驯化、富集、分离所得到。所述Piscinibacter sp.MQ-18的菌落特征
    如下:透射电镜观察,菌体呈杆状,大小(0.5–0.75)μm×(1.9–2.7)μm,有鞭毛,无芽孢;在固
    体R2A培养基上菌落呈圆形,淡黄色,凸起,边缘平整,形态饱满,光滑湿润,菌苔沿划线生
    长。硝酸盐还原反应为阳性,吲哚试验为阴性、不能同化柠檬酸、癸酸、己二酸、苹果酸、苯乙
    酸、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸盐,但能利用葡萄糖、麦芽糖、甘露糖和甘露醇,同时能够水
    解明胶、七叶灵,含有酯酶(C4),不含脲酶、革兰氏染色为阴性。

    本发明涉及所述的Piscinibacter sp.MQ-18在微生物降解甲基叔丁基醚(MTBE)
    中的应用。具体的,所述的应用为:将Piscinibacter sp.MQ-18接种至含MTBE的无机盐培养
    基中,在温度25~37℃,pH 4.0~10.0的条件下(优选25~30℃,pH 6.0~7.0)进行培养,实
    现对MTBE的降解。

    进一步,所述MTBE在无机盐培养基中初始浓度为15~300mg/L;所述
    Piscinibacter sp.MQ-18以种子培养或发酵培养后的湿菌体经无机盐培养基稀释获得的
    菌悬液形式加入,所述菌悬液中湿菌体蛋白浓度为5-170mg/L,菌悬液体积接种量为1-5%;
    优选湿菌体蛋白浓度为170mg/L,菌悬液体积接种量优选为4%。

    进一步,所述无机盐培养基组成为:CaCl2·2H2O,0.03g/L;MgSO4·H2O,0.46g/L;
    (NH4)2SO4,1.23g/L;KH2PO4,0.7g/L;K2HPO4,0.85g/L,FeSO4·7H2O,0.001;微量元素母液
    1mL/L;溶剂为水,pH 7.0~7.5。所述的微量元素母液组成为:FeSO4·7H2O,1.0g/L;CuSO4·
    5H2O,0.02g/L;H3BO3,0.014g/L;MnSO4·4H2O,0.10g/L;ZnSO4·7H2O,0.10g/L;Na2MoO4·
    2H2O,0.02g/L;CoCl2·6H2O,0.02g/L;溶剂为水。

    进一步,当菌液用量较小时,所述的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液可通过斜面
    培养、种子培养和菌悬液制备三个步骤获得;当用量较大时,可通过斜面培养、种子培养、发
    酵液培养和菌悬液制备四个步骤获得,具体过程如下:

    (1)斜面培养:将Piscinibacter sp.MQ-18接种于R2A固体培养基,28~32℃培养
    72h,获得斜面菌体;所述R2A固体培养基组成为:酵母粉0.50g/L,胰蛋白胨0.50g/L,干酪素
    0.50g/L,葡萄糖0.50g/L,可溶性淀粉0.50g/L,丙酮酸钠0.30g/L,KH2PO40.45g/L,
    MgSO40.05g/L,琼脂15~18g/L,溶剂为水,pH 7.2。

    (2)种子培养:从步骤(1)斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中,28~32
    ℃培养56~72h,获得种子液。所述的种子培养基为R2A液体培养基,除无琼脂外,其余组分
    与R2A固体培养基相同。

    (3)发酵培养:将步骤(2)获得的种子液以体积浓度5~10%的接种量接种至发酵
    培养基,于28~32℃,pH 6.0~8.0条件下培养56~72h,获得发酵液。所述发酵培养基组成
    为:酵母粉0.5g/L,CaCl2 0.023g/L,MgSO4 0.2g/L,(NH4)2SO4 2.5g/L,KH2PO4 1.0g/L,
    Na2HPO4 4.5g/L,微量元素母液,1mL/L,溶剂为水,pH 7.0~7.5,微量元素母液组成同无机
    盐培养基中微量元素母液。

    (4)菌悬液制备:将种子液(或发酵液)在8000rpm离心10min,弃上清液,用已灭菌
    的无机盐培养基清洗菌体,然后在8000rpm离心10min,弃上清液,重复洗涤3次。将获得的湿
    菌体用无菌无机盐培养基重悬浮,获得所需浓度的菌悬液。

    本发明还提供一种Piscinibacter sp.MQ-18在微生物降解甲基叔丁基醚中的应
    用,所述应用是利用Piscinibacter sp.MQ-18通过生物滴滤塔降解甲基叔丁基醚废气,具
    体,所述应用是以Piscinibacter sp.MQ-18经发酵培养后的湿菌体经无机盐培养基稀释获
    得的菌悬液为营养液;所述营养液湿菌体含量为200mg/L,营养液的喷淋量为180ml/min,废
    气停留时间30~120s,MTBE浓度10~300mg/m3,去除率达70%~95%。优选所述废气停留时
    间60s,甲基叔丁基醚浓度100mg/m3。

    所述生物滴滤塔由设有废气进口的塔底、设有生物填料层、取样口和水浴保温夹
    套的塔身、安装有尾气出口、气体采样口和营养液喷淋系统的塔顶、空气泵、吹脱瓶、混合瓶
    组成,所述的塔身由两个生物处理单元至下而上叠置安装组成,相邻层的生物处理单元之
    间布置水流通道以及供相邻层气连通的通气口;所述的营养液喷淋系统由安装在塔顶的喷
    洒器,设在生物滴塔外部的循环营养液储存瓶、营养液输入管、pH控制仪、蠕动泵、碱液瓶连
    接组成;所述的pH控制仪分别与循环营养液储存瓶和碱液瓶连接,pH控制仪还设有与循环
    营养液储存瓶接通的pH计探头;所述循环营养液储存瓶通过蠕动泵与喷洒器连通;所述空
    气泵通过质量流量计和转子流量计分别与吹拖瓶和混合瓶连通,混合瓶中混匀废气通过转
    子流量计与塔底废气进口连通;所述生物填料层填料为拉西环。

    与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:在25~30℃,pH 6.0~7.0条件
    下,Piscinibacter sp.MQ-18在46h内可将无机盐培养基中30mg/L的MTBE完全降解,对MTBE
    的最高降解浓度可达300mg/L。刘涉江等用混合微生物降解MTBE,发现以MTBE为碳源的微生
    物生长及其缓慢,使得MTBE降解性能较差,且不能矿化为二氧化碳(刘涉江等.农业环境科
    学学报,2007,26(2):563-567.);张杏青等发现的菌株Comamonas testosterone A1能够耐
    受50mg/L的MTBE,但需要经过7d才能降解完全(张杏青等.环境科学,2009,30(6):1785-
    1790.);Hatizinger等发现的菌株Hydrogenophaga flava ENV735能以MTBE为唯一的碳源
    和能源缓慢生长,对MTBE的降解速率为46nmol/(min·mgprotein),但是加入少量酵母浸出液
    可极大促进其生长并加速降解(Hatizinger等.Appiled and Environmental
    Microbiology,2001,67(12):5601-5607);Hanson等发现的菌株Methylibium
    petroleiphilum PM1在MTBE初始浓度分别为5、50、500mg/L时,PM1的降解速率与浓度成线
    性关系,分别为0.07、1.17和3.56mg·L-1·h-1(Hanson等.Appiled and Environmental
    Microbiology,1999,65(11):4788-4796)。相较于现有技术,本发明提供的Piscinibacter
    sp.MQ-18对MTBE的降解速率为26nmol/(min·mgprotein),具有降解速度快、耐受浓度大、扩
    大培养后延滞期短、性能稳定的特点,将在MTBE污染的治理实践中发挥重要作用。

    相关文献有用Methylibium petroleiphilum PM1降解MTBE的报道,但本发明的菌
    株MQ-18显然与Methylibium petroleiphilum PM1属于不同种的细菌。生理生化分析显示,
    菌株PM1能水解尿素,不能水解明胶、七叶灵、β-半乳糖甙、葡萄糖和阿拉伯糖,而菌株MQ-18
    则不能水解尿素,但是能够水解明胶、七叶灵和葡萄糖,对阿拉伯糖也有微弱的水解作用,
    并含有β-半乳糖甙酶。在培养过程中无论是在R2A培养基还是在MM培养基,菌株MQ在液体中
    的形态都是呈颗粒状的,而PM1能够形成均一液体;且两者的16s rDNA同源性只有96.75%,
    系统发育树显示菌株之间的遗传距离较远,所以可以确定为不同种的菌株。

    (四)附图说明

    图1为Piscinibacter sp.MQ-18透射电镜照片;

    图2为Piscinibacter sp.MQ-18的系统发育树图;

    图3为温度对MTBE降解的影响;

    图4为pH对MTBE降解的影响;

    图5为不同Piscinibacter sp.MQ-18菌体初始浓度对MTBE降解的影响;

    图6为不同MTBE初始浓度下Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE降解的影响;

    图7为不同MTBE初始浓度下,Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解速率的影响;

    图8为生物滴滤塔工艺流程图,1.空气泵,2.转子流量计,3.质量流量,4.吹脱瓶,
    5.混合瓶,6.循环营养液储存瓶,7.碱液瓶,8.pH控制仪,9.蠕动泵,10.填料取样口,11水浴
    保温夹套,12.气体采样口,13.尾气排放口;

    图9为生物滴滤塔处理模拟MTBE废气的进出口浓度及去除效率;

    表1为菌株MQ-18与Methylibium petroleiphilum PM1、Piscinibacter
    aquaticus的生理生化性能差异对比。

    (五)具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的?;し段Р⒉唤鱿抻?br />此:

    实施例中所用无机盐培养基组成为:CaCl2·2H2O 0.03g/L,MgSO4·H2O 0.46g/L,
    (NH4)2SO4 1.23g/L,KH2PO4 0.7g/L,K2HPO4 0.85g/L,FeSO4·7H2O 0.001;微量元素母液
    1mL/L,溶剂为水,pH 7.0~7.5。所述的微量元素母液组成为:FeSO4·7H2O 1.0g/L,CuSO4·
    5H2O 0.02g/L,H3BO3 0.014g/L,MnSO4·4H2O 0.10g/L,ZnSO4·7H2O 0.10g/L,Na2MoO4·
    2H2O 0.02g/L,CoCl2·6H2O 0.02g/L,溶剂为水。

    所用R2A固体培养基组成为:酵母粉0.50g/L,胰蛋白胨0.50g/L,干酪素0.50g/L,
    葡萄糖0.50g/L,可溶性淀粉0.50g/L,丙酮酸钠0.30g/L,KH2PO4 0.45g/L,MgSO4 0.05g/L,
    琼脂15~18g/L,溶剂为水,pH 7.2。

    所用R2A液体培养基组成为:酵母粉0.50g/L,胰蛋白胨0.50g/L,干酪素0.50g/L,
    葡萄糖0.50g/L,可溶性淀粉0.50g/L,丙酮酸钠0.30g/L,KH2PO4 0.45g/L,MgSO4 0.05g/L,
    溶剂为水,pH 7.2。

    所用发酵培养基组成为:酵母粉0.5g/L,CaCl2·2H2O 0.03g/L,MgSO4·H2O
    0.46g/L,(NH4)2SO4 1.23g/L,KH2PO4 0.7g/L,K2HPO4 0.85g/L,FeSO4·7H2O 0.001,微量元
    素母液1mL/L,溶剂为水,pH 7.0~7.5。

    实施例1:Piscinibacter sp.MQ-18的分离、纯化及其鉴定

    (1)Piscinibacter sp.MQ-18的分离及纯化

    现场采集浙江某制药厂污水处理池的活性污泥,以MTBE为唯一碳源和能源,进行
    驯化、富集。数月后,经富集后的活性污泥,接种到含50mL无机盐培养基的300mL密封螺旋瓶
    中,以MTBE作为唯一碳源和能源,继续培养、富集。

    摇瓶中的混合菌液经过5次传代富集后,在R2A固体培养基上稀释涂布,于30℃恒
    温培养箱中培养4~5天,依据菌体群落的差异性,挑取平板上长出的单菌落进行划线分离,
    得到8株纯菌落。将筛选到的8株菌接种至以MTBE为唯一碳源和能源的无机盐培养基中,考
    察各菌株对MTBE的处理效果,最终获得一株具有MTBE降解活性的菌株MQ-18。

    (2)Piscinibacter sp.MQ-18的鉴定

    菌株MQ-18细胞呈短杆状,大小为(0.5–0.75)μm×(1.9–2.7)μm,有鞭毛,无芽孢;
    在固体R2A培养基上菌落呈圆形,淡黄色,凸起,边缘平整,形态饱满,光滑湿润,菌苔沿划线
    生长,电镜照片见图1。

    菌株MQ-18的生理生化特征为:硝酸盐还原反应为阳性,吲哚试验为阴性、不能同
    化柠檬酸、癸酸、己二酸、苹果酸、苯乙酸、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸盐,但能利用葡萄糖、
    麦芽糖、甘露糖和甘露醇,同时能够水解明胶、七叶灵、含有酯酶(C4)、蛋白酶、革兰氏染色
    为阴性。

    斜面菌种委托宝生物工程(大连)有限公司进行PCR扩增以及测序,获得16S rDNA
    序列如SEQ ID NO.1所示。

    ACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACGCGGGGCAACCTGGCTGACGAGTGGCGA
    ACGGGTGAGTAATGCATCGGAACGTGCCCAGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGAC
    CTACGGGTGAAAGCGGGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTATTGGAGCGGCCGATGTCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTA
    AAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
    TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAG
    GCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTCGGGGAAGAAACGGTCTGCGCTAATACCGCGGGCTAATGACGGTACCCGAA
    GAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
    TAAAGCGTGCGCAGGCGGCTTTGCAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGCA
    TCGCTAGAGTGCGGCAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATG
    GCGAAGGCAATCCCCTGGGCCTGCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT
    AGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGACGGCTTGCTGTTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGAC
    CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTT
    TAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCTGGAATCCTGCAGAGATGTGGGAGTGCTCGAAA
    GAGAACCAGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG
    CAACCCTTATCATTAGTTGCTACGCAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA
    CGTCAGGTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCCAACCCGCG
    AGGGGGAGCTAATCTCAGAAAACCGGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCT
    AGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGG
    GTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGG

    据此建立系统发育树如图2所示,推测菌株MQ-18可能是Piscinibacter
    aquaticus。通过API 20NE、API ZYM指标,结合菌株MQ-18的生理生化特征,发现其与
    Piscinibacter aquaticus存在一定差异,如表1所示,确定该菌株MQ-18为水库杆菌
    (Piscinibacter sp.),记为水库杆菌(Piscinibacter sp.)MQ-18。

    表1





    实施例2:Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液的制备

    当菌液用量较小时,所述的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液可通过斜面培养、种
    子培养和菌悬液制备三个步骤获得;当用量较大时,可通过斜面培养、种子培养、发酵液培
    养和菌悬液制备四个步骤获得,具体过程如下:

    (1)斜面培养:将Piscinibacter sp.MQ-18接种于R2A固体培养基,28~32℃培养
    72h,获得斜面菌体;

    (2)种子培养:从步骤(1)斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中,28~32
    ℃培养72h,获得种子液;

    (3)发酵培养:将步骤(2)获得的种子液以体积浓度5%的接种量接种至发酵培养
    基,于28~32℃,pH 6.0~7.0条件下培养72h,获得发酵液;

    (4)菌悬液制备:将种子液(或发酵液)在8000rpm离心10min,弃上清液,用已灭菌
    的无机盐培养基清洗菌体,然后8000rpm离心10min,弃上清液,重复洗涤3次,将获得的湿菌
    体用无菌无机盐培养基稀释获得所需浓度的菌悬液。

    实施例3:Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE生物降解性能检测

    (1)温度对Piscinibacter sp.MQ-18降解MTBE的影响

    在不同温度下实施Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解实验,发现其在25~30
    ℃具有较高的降解MTBE的能力,具体实验方案如下:

    在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基,pH值6.7,110℃灭菌40分钟后,加入
    MTBE作唯一碳源,使MTBE的初始浓度为30mg/L,再加入2mL实施例2方法经斜面和种子培养
    至对数生长期的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液(湿菌体蛋白浓度为170mg/L)。实验过程
    中,每个温度设计三个平行样和一个空白对照(不加MQ-18菌悬液)。将各个样品分别放置在
    25℃、30℃、35℃、37℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm),分别在1h和46h取样,检
    测摇瓶中MTBE浓度和二氧化碳生成量。

    结果如图3所示,在温度为20~30℃时该菌株生长状况良好,MTBE的去除率均可达
    到80%以上;温度高于35℃时菌株对MTBE的去除率急速下降,高温严重影响MQ-18的活性。

    (2)pH对Piscinibacter sp.MQ-18降解MTBE的影响

    在不同pH下实施Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解实验,结果表明MQ-18在
    pH6.0~7.0具有较高的降解MTBE的能力,具体实验方案如下:

    在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基,用1mol/L NaOH水溶液或1mol/LH2SO4水
    溶液将无机盐培养基的pH调节至4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0,110℃灭菌40
    分钟灭菌后,加入MTBE作唯一碳源,使MTBE的初始浓度为30mg/L,再加入2mL实施例2方法经
    斜面和种子培养至对数生长期的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液(湿菌体蛋白浓度170mg/
    L)。实验过程中,每个pH设计三个平行样和一个空白对照(不加MQ-18菌悬液)。将各个样品
    放置在30℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm)。分别在0h和46h取样,检测摇瓶中的
    MTBE浓度和二氧化碳生成量。

    结果如图4所示,在pH为6.0、6.5、7.0时,Piscinibacter sp.MQ-18生长状况良好,
    在46h内对MTBE的去除率均达80%以上,对MTBE去除效率较高。而在pH为5、7.5和8条件下,
    经46h的培养,MTBE的去除率均在30%-40%左右,说明pH会影响MQ-18对MTBE的去除效率;
    在pH为4或者大于9时,去除率低于5%,表明在过酸或过碱的条件下,Piscinibacter
    sp.MQ-18都难以生存。

    (3)不同菌体浓度的Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解情况

    在不同Piscinibacter sp.MQ-18菌体初始浓度下,实施Piscinibacter sp.MQ-18
    对MTBE的降解,结果发现MQ-18菌体浓度越高,对MTBE降解能力越强,具体实验方案如下:

    在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基,pH值6.7,110℃灭菌40分钟后,中加入
    MTBE作唯一碳源,使MQ-18菌体的初始浓度分别为0.07、0.34、0.68、3.42、6.83mg/L,初始
    MTBE浓度为30mg/L。实验过程中,每个初始浓度设计三个平行样和一个空白对照(不加MQ-
    18菌悬液)。将各个样品放置在30℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm),检测MTBE浓
    度变化,绘制Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解曲线图。

    结果如图5所示,初始菌体浓度越高,其降解MTBE的停滞期越短,且降解速率越快。
    当初始菌体浓度为6.83mg/L时,经过46h,MTBE基本降解完全,降解速率为0.65mg·L-1·h
    -1。

    (4)Piscinibacter sp.MQ-18对不同初始浓度的MTBE的降解情况

    在不同MTBE初始浓度下,实施Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解,结果发现
    MQ-18对150mg/L的MTBE降解效果最好,具体实验方案如下:

    在300mL的摇瓶中加入50mL无机盐培养基,pH值6.7,110℃灭菌40分钟后,中加入
    MTBE作唯一碳源,使MTBE的初始浓度分别为30、60、90、120、150、225、300mg/L。再分别加入
    2mL实施例2方法经斜面和种子培养至对数生长期的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液(湿菌
    体蛋白浓度170mg/L)。实验过程中,每个初始浓度设计三个平行样和一个空白对照(不加
    MQ-18菌悬液)。将各个样品放置在30℃的摇床中恒温培养(摇床转速为均160rpm),检测
    MTBE浓度变化,绘制Piscinibacter sp.MQ-18对MTBE的降解曲线图。

    结果如图6所示,当MTBE初始浓度在150mg/L以下时,没有明显的停滞期,MTBE降解
    较快;当初始浓度高于150mg/L时,由于底物的抑制作用,出现了一个20h左右的停滞期。但
    是就菌株降解速率而言,如图7所示,初始湿菌体浓蛋白度相同的MQ-18,随着底物浓度的增
    大,对底物的平均降解速率也在提高。

    实施例4:Piscinibacter sp.MQ-18净化模拟MTBE废气

    利用生物滴滤塔处理模拟MTBE废气,工艺流程如图8所示。

    图8为生物滴滤塔工艺流程图,1.空气泵,2.转子流量计,3.质量流量计,4.吹脱
    瓶,5.混合瓶,6.循环营养液储存瓶,7.碱液瓶,8.pH控制仪,9.蠕动泵,10.取样口,11水浴
    保温夹套,12.气体采样口,13.尾气出口。

    所述生物滴滤塔由设有废气进口的塔底、设有生物填料层、取样口10和水浴保温
    夹套11的塔身、安装有尾气出口13、气体采样口11和营养液喷淋系统的塔顶、空气泵1、吹脱
    瓶4、混合瓶5组成,所述的塔身由若两个生物处理单元至下而上叠置安装组成,相邻层的生
    物处理单元之间布置水流通道以及供相邻层气连通的通气口;所述的营养液喷淋系统由安
    装在塔顶的喷洒器,设在生物滴塔外部的循环营养液储存瓶6、营养液输入管、pH控制仪8、
    蠕动泵9、碱液瓶7连接组成;所述的pH控制仪分别与循环营养液储存瓶和碱液瓶连接,pH控
    制仪还设有与循环营养液储存瓶接通的pH计探头;所述循环营养液储存瓶通过蠕动泵与喷
    洒器连通;所述空气泵通过质量流量计3和转子流量计2分别与吹拖瓶和混合瓶连通,混合
    瓶中混匀废气通过转子流量计与塔底废气进口连通;所述生物填料层填料为拉西环。

    由空气泵1鼓出的空气分为两路,一路经质量流量计3进入装有MTBE废液的吹脱瓶
    4中,用于吹脱MTBE,吹脱出的MTBE气体与另一路经过转子流量计2进入混合瓶5的空气混合
    均匀后,通过控制质量流量计和转子流量计模拟得到不同浓度的MTBE废气。气体自下而上
    流经填料塔,填料塔中填料为拉西环,循环营养液由蠕动泵9提升至塔顶后向下喷淋,为填
    料上附着的微生物提供其所需营养元素,在填料取样口10取样测定生物量,在塔顶的气体
    采样口12测定出气浓度,处理后的废气经尾气排放口13流出,营养液(按照实施例2方法经
    斜面、种子和发酵培养制备的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液(湿菌体蛋白200mg/L))喷淋
    后流入储液瓶6,利用碱液瓶7通过pH控制仪8调节储液瓶6内液体pH值。装置的操作温度由
    其外部的夹套水浴控温11,控温器控制在30℃左右。营养液的喷淋量为180ml/min,每隔2d
    更换一次营养液,其pH采用0.5mol/L的NaOH水溶液调节以维持在6.8~7.2之间。将按照实
    施例2方法经斜面、种子和发酵培养制备的Piscinibacter sp.MQ-18菌悬液(200mg/L)接种
    至生物滴滤塔中,接种量为2L。挂膜启动过程中停留时间为60s,初始MTBE进气浓度为
    100mg/m3。

    如图9所示,MTBE进口浓度为100mg/m3,生物滴滤塔运行20d后完成挂膜,此时MTBE
    的去除率为90%左右。

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    水库 杆菌 及其 降解 甲基叔丁基醚 中的 应用
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