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    手机买重庆时时彩: Α?淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201580018483.0

    申请日:

    2015.04.10

    公开号:

    CN106170545A

    公开日:

    2016.11.30

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/24申请日:20150410|||公开
    IPC分类号: C12N9/24; C11D3/386; C12C5/00; D06L1/14; A21D8/04; C12P7/00 主分类号: C12N9/24
    申请人: 诺维信公司
    发明人: P·桑德斯; C·安诺生
    地址: 丹麦,鲍斯韦
    优先权: 2014.04.10 US 61/977,857; 2014.04.10 US PCT/US2014/033620
    专利代理机构: 北京尚诚知识产权代理有限公司 11322 代理人: 顾小曼
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201580018483.0

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.05.03|||2016.11.30

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及α?淀粉酶变体,该α?淀粉酶变体在葡萄糖存在下具有改进的稳定性和/或对长链底物比短链底物具有相对更高的活性。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸;包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞;以及使用这些变体的方法。

    权利要求书

    1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体,该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编
    号的一个或多个取代,或者组a)和b)中的对应的取代:
    组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437;
    组b)另外的赖氨酸残基至非天然氨基酸的取代;
    其中该变体与以下各项具有至少80%,但小于100%序列一致性:
    (i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽,或
    (ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481;
    并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
    2.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体,该α-淀粉酶变体包括使用SEQ ID NO:1进行编
    号的一个或多个取代,或者组a)和b)中的对应的取代:
    组a)K176、E185、I201、H205、K213、Q360、D416、R437;
    组b)K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392;其中该变体与以下各
    项具有至少80%,但少于100%的序列一致性:
    (i)SEQ ID NO:1或14中的任何一个的成熟多肽,或
    SEQ ID NO:1的氨基酸1至483或SEQ ID NO:14的氨基酸1至481;并且其中该变体具有
    α-淀粉酶活性。
    3.如权利要求1或2所述的变体,该变体是一种分离的α-淀粉酶变体。
    4.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体包括或具有以下取代或对应的组
    a)和组b)取代:
    组a):K176L+E185P+I201Y+H205Y+K213T+Q360S+D416V+R437W;或
    K176L+I201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W

    组b)中以下取代中的一个或多个:
    K136、K154、K170、K234、K237、K251、K306、K315、K319、K392(使用SEQ ID NO:1进行编
    号)。
    5.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    6.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K154A、H、S(使用SEQ ID NO:1进行编
    号)。
    7.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K170R、S(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    8.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K234T(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    9.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K237R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    10.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K306M或K251Q(使用SEQ ID NO:1进行
    编号)。
    11.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K315A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、
    W、Y、V(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    12.如权利要求4所述的变体,其中该组b)取代是K319Q、L(使用SEQ ID NO:1进行编
    号)。
    13.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该组b)取代选自下组,该组由以下各项
    组成:
    ·K136R;
    ·K154A;
    ·K154H;
    ·K154S;
    ·K170R;
    ·K170S;
    ·K234T;
    ·K237R;
    ·K251Q;
    ·K306M
    ·K315M;
    ·K319Q;
    ·K319L;
    ·K392V;
    ·K392V+Q393D;和
    ·H133Y+K136R(使用SEQ ID NO:1进行编号)。
    14.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体进一步包括以下位置中任一个
    处的取代:H68、H133、H142、Y156、Y158、H316、L318;优选H68W、H133Y、H142Y、Y156W、Y158W、
    H316W、L318W;这些取代使用SEQ ID NO:1进行编号。
    15.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽
    或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少
    93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少99%,但小于100%的序
    列一致性。
    16.如以上权利要求中任一项所述的变体,该变体是一种亲本α-淀粉酶的变体,该亲本
    α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸1至483具有至少
    80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的
    序列一致性。
    17.如权利要求1-3中任一项所述的变体,其中该变体包括或具有以下取代或对应的组
    a)和组b)取代:
    组a):K174L+E183P+F199Y+H203Y+K211+Q358S+D414V+R435W;或
    K174L+F199Y+H203Y+K211T+E253P+Q358S+D414V+R435W

    组b)中以下取代中的一个或多个:
    K134、K152、K168、K232、K235、K249、K304M、K313、K317、K390(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    18.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K134R(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    19.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K152A、H、S(使用SEQ ID NO:14进行
    编号)。
    20.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K168R、S(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    21.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K232T(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    22.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K235R(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    23.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K249Q(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    24.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K313A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、
    T、W、Y、V(使用SEQ IDNO:14进行编号)。
    25.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K317Q、L(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    26.如权利要求17所述的变体,其中该组b)取代是K390V(使用SEQ ID NO:14进行编
    号)。
    27.如权利要求17-26中任一项所述的变体,其中该组b)取代选自下组,该组由以下各
    项组成:
    ·K134R;
    ·K152A;
    ·K152H;
    ·K152S;
    ·K168R;
    ·K168S;
    ·K232T;
    ·K235R;
    ·K249Q;
    ·K304M
    ·K313M;
    ·K317Q;
    ·K317L;
    ·K390V;
    ·K390V+Q391D;
    ·H131Y+K134R(使用SEQ ID NO:14进行编号)。
    28.如权利要求17-27中任一项所述的变体,该变体进一步包括以下位置中任一个处的
    取代:H66、H131、H140、Y154、Y156、H314、L316;优选以下取代中的一种或多种:H66W、H131Y、
    H140Y、Y154W、Y156W、H314W、L316W;这些取代使用SEQ ID NO:14进行编号。
    29.如权利要求1、2、和17-28中任一项所述的变体,其中该变体与(i)SEQ ID NO:14的
    成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1-481具有至少80%、至少85%、至少90%、至少
    91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少
    99%,但小于100%的序列一致性。
    30.如权利要求1、2、和17-28中任一项所述的变体,该变体是一种亲本α-淀粉酶的变
    体,该亲本α-淀粉酶与(i)SEQ ID NO:14的成熟多肽或(ii)SEQ ID NO:14的氨基酸1至481
    具有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序
    列一致性。
    31.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1或14的
    成熟多肽的片段,其中该片段具有α-淀粉酶活性。
    32.如以上权利要求中任一项所述的变体,分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比,
    该变体具有改进的稳定性,特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。
    33.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有
    至少80%,但少于100%序列一致性,并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽相比,具有改进的稳定
    性,特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。
    34.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483
    具有至少80%,但少于100%序列一致性,并且与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483相比,具有改
    进的稳定性,特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。
    35.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有
    至少80%,但少于100%序列一致性,并且与SEQ ID NO:14的成熟多肽相比,具有改进的稳
    定性,特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。
    36.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1至483
    具有至少80%,但少于100%序列一致性,并且与SEQ ID NO:14的氨基酸1至481相比,具有
    改进的稳定性,特别是在葡萄糖存在下具有改进的稳定性。
    37.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中该稳定性是通过将残余活性计算为所
    述变体用10%(w/w)葡萄糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用
    10%(w/w)葡萄糖在4℃下孵育6小时后所呈现的活性两者之间的比率来确定的。
    38.如以上权利要求中任一项所述的变体,其中当被确定为所述变体用10%(w/w)葡萄
    糖在60℃下孵育6小时后所呈现的α-淀粉酶活性与所述变体用10%(w/w)葡萄糖在4℃下孵
    育6小时后所呈现的活性两者之间的比率时,所述变体的稳定性是至少35%,如至少36%、
    37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、55%、
    60%、65%、70%、75%或至少80%。
    39.如以上权利要求中任一项所述的变体,分别与SEQ ID NO:1或14的成熟多肽相比,
    该变体对长链底物比对短链底物具有相对更高的活性。
    40.一种编码如权利要求1-39中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
    41.一种包括如权利要求40所述的多核苷酸的核酸构建体。
    42.一种包括如权利要求40所述的多核苷酸或如权利要求41所述的构建体的表达载
    体。
    43.一种包括如权利要求42所述的多核苷酸的宿主细胞。
    44.一种生产α-淀粉酶变体的方法,该方法包括:
    c.在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求43所述的宿主细胞;并且
    d.回收该变体。
    45.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法,该方法包括(a)向亲本α-淀粉酶中引入如权利
    要求1-39中任一项所定义的取代;并且(b)回收该变体。
    46.一种包含如权利要求1至39中任一项所述的变体以及一种或多种选自下组的酶的
    组合物,该组由以下各项组成:β-淀粉酶、纤维素酶(β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶以及内
    切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如,木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸
    酶、蛋白酶以及支链淀粉酶。
    47.一种生产液化淀粉的工艺,该工艺包括用如权利要求1至39中任一项所述的变体或
    如权利要求46所述的组合物来液化一种含淀粉材料。
    48.一种生产发酵产物的方法,该方法包括
    (a)用如权利要求1至39中任一项所述的变体来液化一种含淀粉材料,以产生一种液化
    醪液;
    (b)将该液化醪液糖化,以产生可发酵的糖;并且
    (c)使这些可发酵的糖在一种发酵生物存在下发酵。
    49.如权利要求48所述的工艺,其中在步骤(a)中的液化期间温度高于初始糊化温度,
    例如在80℃-90℃之间,例如约85℃。
    50.如权利要求47-49中任一项所述的工艺,其中在pH 4-6下进行步骤(a),优选4.2-
    5.5,例如约4.5。
    51.如权利要求47-50中任一项所述的工艺,其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时,例
    如0.5-5小时。
    52.如权利要求47-51中任一项所述的工艺,其中在步骤(b)或预糖化期间的温度在30
    ℃-70℃的范围内,例如55℃-65℃,典型地约60℃。
    53.如权利要求47-52中任一项所述的工艺,其中使用一种产碳水化合物源的酶,如葡
    糖淀粉酶,来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。
    54.如权利要求47-53中任一项所述的工艺,其中步骤(b)中的糖化和步骤(c)中的发酵
    顺序完成或同时完成。
    55.如权利要求47-54中任一项所述的工艺,其中步骤(c)或同时步骤(b)和(c)期间的
    温度是从25℃至40℃,例如从28℃至35℃,例如从30℃至34℃,优选约32℃。
    56.如权利要求47-55中任一项所述的工艺,其中发酵是步骤(c),或者使用酵母,例如
    酵母菌属,例如特别是酿酒酵母完成同时步骤(b)和(c)。
    57.如权利要求47所述的工艺,其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于
    所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度,例如至少58℃,例如约60℃-70℃。
    58.如权利要求47-57中任一项所述的工艺,其中该pH是在3.0至7.0,优选从3.5至6.0,
    优选从4.0-5.0,优选4.5-5.5的范围内,更优选4.5。
    59.一种生产糖的工艺,该工艺包括:
    (a)用如权利要求1至33中任一项所述的α-淀粉酶变体来液化一种含淀粉材料,以产生
    一种液化醪液;
    (b)将该液化醪液糖化,以产生可发酵的糖。
    60.如权利要求59所述的工艺,其中在步骤(a)期间的温度高于初始糊化温度,例如在
    80℃-90℃之间,例如约85℃。
    61.如权利要求59或60所述的工艺,其中在pH 4-6下进行步骤(a),例如pH 4.5-5.5,例
    如pH 4-5。
    62.如权利要求59-61中任一项所述的工艺,其中步骤(a)中的液化进行0.1-12小时,例
    如0.5-5小时。
    63.如权利要求59-62中任一项所述的工艺,其中在步骤(b)或预糖化期间的温度是在
    30℃-70℃之间的范围内,例如55℃-65℃,典型地约60℃。
    64.如权利要求59-63中任一项所述的工艺,其中使用一种产碳水化合物源的酶,如葡
    糖淀粉酶,来完成步骤(b)中的糖化或同时糖化发酵。
    65.如权利要求59-64中任一项所述的工艺,其中在糖化步骤(b)后回收糖。
    66.如权利要求59-65中任一项所述的工艺,其中将步骤(b)中所获得的糖例如使用固
    定的葡糖异构酶进一步加工为,例如,高果糖糖浆。
    67.如权利要求59所述的工艺,其中在步骤(a)中的液化期间的温度处于低于或略高于
    所述颗粒状淀粉的初始糊化温度的温度,例如至少58℃,例如约60℃-70℃。
    68.如权利要求59-67中任一项所述的工艺,其中该pH是在3.0至7.0,优选从3.5至6.0,
    优选从4.0-5.0,优选4.5-5.5的范围内,更优选4.5。
    69.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
    70.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于使纺织品退浆的用途。
    71.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于产生烘焙产品的用途。
    72.如权利要求1-39中任一项所述的变体用于液化一种含淀粉材料的用途。
    73.如权利要求1-39中任一项所述的变体在生产糖浆的过程中用于液化一种含淀粉材
    料的用途。
    74.如权利要求1-39中任一项所述的变体在生产发酵产物如乙醇的过程中用于液化一
    种含淀粉材料的用途。

    关 键 词:
    淀粉酶 变体 以及 进行 编码 多核苷酸
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