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    多发性 硬化 诊断
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    摘要
    申请专利号:

    CN200980154256.5

    申请日:

    2009.11.12

    公开号:

    CN102388307A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/53申请日:20091112|||公开
    IPC分类号: G01N33/53; G01N33/00; C07K16/00 主分类号: G01N33/53
    申请人: 耶达研究与发展有限公司; 伯莱翰女子医院公司
    发明人: 霍华德·L·韦纳; 艾润·R·科恩; 弗朗西斯科·J·昆塔纳
    地址: 以色列雷霍沃特
    优先权: 2008.11.12 US 61/113,645
    专利代理机构: 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 代理人: 陶贻丰;郑霞
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200980154256.5

    授权公告号:

    102388307B||||||

    法律状态公告日:

    2014.09.03|||2012.05.02|||2012.03.21

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及用于诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法和试剂盒。特别地,本发明涉及用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒,所述亚型选自复发缓解型MS(RRMS)、继发进展型MS(SPMS)、原发进展型MS(PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病变的病理亚型。

    权利要求书

    1.一种诊断受试者的多发性硬化(MS)亚型的方法,该方法包括确
    定从该受试者获得的样品中的抗体对选自由表1到表4中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对所述多种抗原的反应性模
    式,并且比较所述样品的反应性模式与对照反应性模式,其中所述MS亚
    型选自由以下组成的组:
    (i)复发缓解型多发性硬化(RRMS),其中所述多种抗原选自由表1
    中列出的抗原组成的组;
    (ii)原发进展型多发性硬化(PPMS),其中所述多种抗原选自由表2
    中列出的抗原组成的组;
    (iii)继发进展型多发性硬化(SPMS),其中所述多种抗原选自由表3
    中列出的抗原组成的组;以及
    (iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型,其中所述多种抗原选
    自由表4中列出的抗原组成的组。
    2.如权利要求1所述的方法,其中在获自该受试者的所述样品的反应
    性模式与对照样品的反应性模式之间的显著性差异是该受试者患MS亚型
    的指示。
    3.如权利要求2所述的方法,其中使用学习与模式识别算法计算该差
    异。
    4.如权利要求1所述的方法,所述方法用于诊断受试者的复发缓解型
    多发性硬化(RRMS),其中所述多种抗原选自表1中列出的抗原,并且
    所述对照反应性模式从健康受试者获得。
    5.如权利要求4所述的方法,其中所述多种抗原包括表1中列出的抗
    原中的至少5种不同的抗原。
    6.如权利要求4所述的方法,其中所述多种抗原包括表1中列出的所
    有抗原。
    7.如权利要求4所述的方法,其中所述多种抗原包括不超过大约130
    种抗原。
    8.如权利要求1所述的方法,所述方法用于诊断受试者的原发进展型
    多发性硬化(PPMS),其中所述多种抗原选自表2中列出的抗原,并且
    所述对照反应性模式从健康受试者获得。
    9.如权利要求8所述的方法,其中所述多种抗原包括表2中列出的抗
    原中的至少5种不同的抗原。
    10.如权利要求8所述的方法,其中所述多种抗原包括表2中列出的
    所有抗原。
    11.如权利要求8所述的方法,其中所述多种抗原包括不超过大约100
    种抗原。
    12.如权利要求1所述的方法,所述方法用于诊断受试者的继发进展
    型多发性硬化(SPMS),其中所述多种抗原选自表3中列出的抗原,并
    且所述对照反应性模式从RRMS受试者获得。
    13.如权利要求12所述的方法,其中所述多种抗原包括表3中列出的
    抗原中的至少5种不同的抗原。
    14.如权利要求12所述的方法,其中所述多种抗原包括表3中列出的
    所有抗原。
    15.如权利要求12所述的方法,其中所述多种抗原包括不超过大约
    100种抗原。
    16.如权利要求1所述的方法,所述方法用于在患有MS的受试者中
    诊断I型病变,其中所述多种抗原选自表4中列出的抗原,并且所述对照
    反应性模式从具有II型病变的受试者获得。
    17.如权利要求1所述的方法,所述方法用于在患有MS的受试者中
    诊断II型病变,其中所述多种抗原选自表4中列出的抗原,并且所述对照
    反应性模式从具有I型病变的受试者获得。
    18.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述对照选自由以下
    组成的组:来自至少一个个体的样品、来自一组个体的一小组对照样品和
    来自对照个体的一组储存的数据。
    19.如权利要求1所述的方法,其中所述样品是血清样品。
    20.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括在确定所述样品中的
    抗体的反应性之前1∶10稀释所述样品。
    21.如权利要求1所述的方法,其中所述多种抗原以抗原阵列形式使
    用。
    22.一种用于诊断MS亚型的试剂盒,该试剂盒包括:
    (i)选自由表1中列出的抗原组成的组的用于诊断RRMS的多种抗原;
    (ii)选自由表2中列出的抗原组成的组的用于诊断PPMS的多种抗原;
    (iii)选自由表3中列出的抗原组成的组的用于诊断SPMS的多种抗
    原;和/或
    (iv)选自由表4中列出的抗原组成的组的用于在患有MS的受试者中
    区分I型病变与II型病变的多种抗原。
    23.如权利要求22所述的试剂盒,所述试剂盒用于诊断RRMS,该试
    剂盒包括选自由表1中列出的抗原组成的组的多种抗原。
    24.如权利要求23所述的试剂盒,该试剂盒包括表1中列出的所有抗
    原。
    25.如权利要求23所述的试剂盒,其中所述多种抗原包括表1中列出
    的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
    26.如权利要求22所述的试剂盒,所述试剂盒用于诊断PPMS,该试
    剂盒包括选自由表2中列出的抗原组成的组的多种抗原。
    27.如权利要求26所述的试剂盒,该试剂盒包括表2中列出的所有抗
    原。
    28.如权利要求26所述的试剂盒,其中所述多种抗原包括表2中列出
    的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
    29.如权利要求22所述的试剂盒,所述试剂盒用于诊断SPMS,该试
    剂盒包括选自由表3中列出的抗原组成的组的多种抗原。
    30.如权利要求29所述的试剂盒,该试剂盒包括表3中列出的所有抗
    原。
    31.如权利要求29所述的试剂盒,其中所述多种抗原包括表3中列出
    的抗原中的至少5种、至少10种或至少15种不同的抗原。
    32.如权利要求22所述的试剂盒,所述试剂盒用于在患有MS的受试
    者中区别I型病变与II型病变,该试剂盒包括选自由表4中列出的抗原组
    成的组的多种抗原。
    33.如权利要求22所述的试剂盒,其中所述试剂盒是以抗原阵列的形
    式。
    34.如权利要求22所述的试剂盒,该试剂盒还包括用于确定样品中的
    抗体对所述多种抗原的反应性的装置。
    35.如权利要求22所述的试剂盒,该试剂盒还包括用于比较不同样品
    中的抗体对所述多种抗原的反应性模式的装置。
    36.如权利要求35所述的试剂盒,其中所述用于比较反应性模式的装
    置包括学习与模式识别分析仪。
    37.一种抗原探针组,该抗原探针组包括表1中列出的抗原探针。
    38.一种抗原探针组,该抗原探针组包括表2中列出的抗原探针。
    39.一种抗原探针组,该抗原探针组包括表3中列出的抗原探针。
    40.一种抗原探针组,该抗原探针组包括表4中列出的抗原探针。
    41.一种制品,该制品包括权利要求37-40中任一项所述的抗原探针
    组。
    42.抗原探针组用于制备诊断MS亚型的诊断组合物的用途,所述抗
    原探针组包含选自由表1到表4之一列出的抗原组成的组的多种抗原,其
    中所述MS亚型选自由以下组成的组:
    (i)RRMS,其中所述多种抗原选自由表1中列出的抗原组成的组;
    (ii)PPMS,其中所述多种抗原选自由表2中列出的抗原组成的组;
    (iii)SPMS,其中所述多种抗原选自由表3中列出的抗原组成的组;以

    (iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型,其中所述多种抗原选
    自由表4中列出的抗原组成的组。
    43.如权利要求42所述的用途,其中所述诊断组合物用于确定样品中
    的抗体的反应性,从而确定所述样品对所述多种抗原的反应性模式,其中
    在所述样品的反应性模式与对照样品的反应性模式之间的显著性差异是
    MS亚型的指示。

    说明书

    多发性硬化的诊断

    发明领域

    本发明涉及用于诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法和试剂盒。特
    别地,本发明涉及用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒,所述亚型
    选自复发-缓解型MS(RRMS)、继发-进展型MS(SPMS)、原发-进展
    型MS(PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病变的病理
    亚型。

    发明背景

    多发性硬化(MS)是推测具有自身免疫病因的中枢神经系统(CNS)
    的慢性炎症性疾病。MS的特征为脑和脊髓中的局灶性病变(斑块),导
    致进行性神经功能异常。MS的病因是未知的,但是认为它是由遗传因素
    和环境因素联合产生的。目前,没有用于诊断MS的特异性测试,诊断依
    赖于对受试者临床病史的认识。大脑和脊髓的MRI、脑脊液的分析以及视
    觉途径和躯体感觉途径的诱发电位的研究可支持诊断。此外,必须排除具
    有相似表现的全身性病因或传染性病因。多发性硬化可以不可预测地进展
    和退化;然而,存在几种模式的症状。大约85-90%的患者开始于复发-缓
    解型(RRMS)进程并且40%患者最终变为进展型(继发进展型MS,SPMS);
    在10%患者中,MS呈现原发进展型病程(PPMS)。不同的MS亚型以过
    去的疾病进程(例如,神经衰退不可预测的复发、缓解和进展)为特征。
    从临床角度看,具有不同病程的患者显示不同的治疗响应。例如,具有复
    发-缓解型MS的患者相比于具有进展型病程的患者更有可能响应于免疫
    调节疗法(Bitsch和Brück,CNS?Drugs,2002;16(6):405-18)。因此,表
    征MS亚型不仅对于预后而且对于治疗决策而言都是重要的。

    MS不仅在其临床症状和进展速率上是多样的,而且在其对疗法的响
    应和组织病理学发现上也是多样的(Lucchinetti等人,2000,Ann?Neurol?47,
    707-17)。在从给定MS患者检查的多种病变中主动脱髓鞘的模式是相同
    的,但在不同患者之间是多样的,暗示了致病异质性。I型以T细胞/巨噬
    细胞介导的脱髓鞘为特征。II型以抗体/补体相关联的脱髓鞘为特征。III
    型根据远端少突胶质细胞病变(distal?oligodendrogliopathy)定义,IV型以
    斑块周边(periplaque)白质中的少突胶质细胞变性为特征;迄今为止IV
    型仅在尸检病例中被鉴定。I型病变和II型病变显示典型的静脉周分布和
    分明的边界,它们是MS病变的病理标志并且被认为由经典自身免疫机制
    产生(Lucchinetti,等人,2004,Ann?Neurol?56,308)。MRI通常用来观察体
    内MS病变。然而,利用MRI研究MS病变受限制,因为它不能提供关于
    病变的病理构成的信息。从临床观点看,已报道具有II型而不是I型的患
    者响应于血浆去除术(Keegan等人,2005,Lancet?366,579-82)。因此,对
    于鉴定将响应于用血浆去除术治疗的患者存在需要。

    McDonald标准作为有助于多发性硬化(MS)的早期诊断和准确诊断
    的指南于2001年被引入并修订于2005年(Polman等人,2006,Ann?
    Neurol.;59(4):727-8)。将诊断分类减少至a)有MS,b)没有MS,或c)可
    能有MS。该标准的优点包括在单症状表现后或者在原发进展型进程的情
    况下作出确定的MS诊断的能力。然而,诊断分类方案和MRI标准仍是复
    杂的和繁琐的,这种复杂性限制了其在日常实践中的使用。此外,这些标
    准的特异性相对较低,突出了排除其他诊断的临床判断的重要性。此外,
    研究已观察到,标准的MS疾病调修药剂(disease-modifying?medication)
    能够使还不满足这些诊断标准的患者受益。最后,McDonald标准大大减
    少了MS诊断所需的时间,然而它对于被诊断可能患有MS或最终将接受
    PPMS诊断的那些个体而言仍受限制。

    尽管MS被认为是T细胞介导的疾病,但几条证据支持B细胞在该病
    中的作用(Archelos等人,2000,Ann?Neurol.47,694-706)。B细胞能够通
    过其分泌抗体和细胞因子或者通过充当激活致病性T细胞的抗原递呈细胞
    (APC)对MS进展产生影响。B细胞在加工和递呈由其产生的抗体所识
    别的抗原上明显更为有效。因此,在MS的人模型和实验模型中,线性B
    细胞表位和T细胞表位共同定位于由自身免疫应答所靶向的CNS抗原中
    并不出人意料(Meinl等人,2006,Ann?Neurol.59,880-92;Wucherpfennig
    等人,1997,J?Clin?Invest.100,1114-22)。

    免疫系统生物标志

    免疫系统的先天分支和适应性分支可视为一种类型的生物健康维持
    系统。在生理学方面,认为构成免疫系统的细胞和分子起作用以对付炎症
    (Cohen,2000,Academic?Press,London)。炎症被经典地定义为导致痊
    愈的由损伤激活的共同过程。根据免疫系统发起并应付炎症的方式,免疫
    系统通过愈合伤口、包含病原体、组织结缔组织的结构、生长(血管发生)
    或破坏血管、触发某些器官的再生、激活衰老细胞和具有无法修复的DNA
    损坏的细胞的凋亡、降解累积的异常分子、除去废物以及进行其他生命活
    动来维持身体(Cohen,2000)。炎症的这些不同的表现维持器官的完整性
    以响应于其不间断的发育后衰变,器官不间断的发育后衰变是由于瘤形
    成,环境损伤及感染,代谢产物、废物以及其他中毒物的累积,以及不可
    抗拒的熵增加。

    已详细调查在MS患者中产生脑脊液(CSF)抗体作为对髓鞘自身抗
    原的响应的可能性。已描述了对几种CNS抗原有反应性的抗体,包括针对
    如下蛋白的那些抗体:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、少突胶质细胞
    特异性蛋白(OSP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、
    髓鞘相关糖蛋白、2′,3′-环核苷酸3′磷酸二酯酶(CNP酶)以及ab-晶状体
    蛋白。当分析时,这些抗体的亚类与促炎症免疫应答相关。这些自身抗体
    中许多也在血液中被检出(Lalive等人,2006,Proc?Natl?Acad?Sci?US.103,
    2280-5)。此外,还在MS患者中发现对非髓鞘自身抗原(Annunziata等
    人,1999,J?Neurol?Sci.168,32-6;Barned等人,1995,Neurology.45,384-5;
    Colaco等人,1987,Clin?Exp?Immunol.68,313-9;Roussel等人,2000,J?
    Autoimmun.14,259-65;Spadaro等人,1999,.Mult?Scler.5,121-5)有反应
    性和对病原体(Cepok等人,2005,J?Clin?Invest.115,1352-60)有反应性的
    高滴度抗体。

    抗体在MS中所起的作用仍有待进一步分类。针对MOG中的构象表
    位的抗体已从MS病变中被纯化并且其显示改变CNS细胞的生理学(Lalive
    等人,2006)。因此,美国专利申请公布第2005/0009096号提供了利用针
    对髓鞘/MOG组分的特异性表位的自身抗体的检测或定量以用于MS的诊
    断或预后的方法。

    对CNS抗原中的线性表位有反应性的抗体也已经从MS病变中分离
    (Dalakas,2006,Pharmacol?Ther.112,57-70,Genain等人,1999,Nat?Med.5,
    170-5),暗示它们还在MS病理学中起直接作用。而且,从MS患者中分
    离的针对MBP的抗体已显示具有直接的蛋白水解活性(Ponmarenko等人,
    2006,Proc?Natl?Acad?Sci?US.103,281-6)。美国专利申请公布第
    2003/0092089号涉及用于检测MBP自身抗体的测定,该测定可选地结合
    与MS及相关疾病有关的其他生物化学标志的测量。

    生物标志是与特定的疾病状态有关的解剖学、生理学、生物化学或分
    子的参数。对MS生物标志的寻找已聚焦于炎症过程的一般活动的指示物。
    几种生物标志目的在于不是追踪炎症过程本身,而是追踪其后果,诸如神
    经变性和轴突缺失。因此,已描述神经微丝轻链、tau和14-3-3蛋白的水
    平改变与MS患者的轴突缺失相关。

    因为MS被认为是器官特异性自身免疫疾患,所以免疫生物标志具有
    反映疾病活动及其对疗法的响应的潜力。几项大规模蛋白质组学研究已尝
    试表征CSF和血清中的抗体,目的是鉴定MS患者中还未知的自身免疫攻
    击的靶(Lefran等人,2004,J?Immunol?172,669-78)。而且,已研究特异性
    抗体作为MS的生物标志,导致鉴定针对CSF和/或血清中的髓鞘抗原的
    若干上调的抗体应答。然而,这些生物标志不可概括至大多数MS患者或
    者不能在独立研究中被验证(Rinaldi和Gallo,2005,Neurol?Sci.26,S215-7;
    Lim等人,2005,Mult?Scler.11,492-4)。与其他自身免疫疾病诸如糖尿病
    (Quintana等人,2004,Proc?Natl?Acad?Sci,14615-21)和系统性红斑狼疮(Li
    等人,2005,J?Clin?Invest.115,3428-39)中观察到的类似,有可能单个生物
    标志将不是决定性的,而是需要形成指纹的几种生物标志的一种模式。

    抗原芯片

    抗原微阵列是用于免疫应答的高通量表征的新开发的工具(Robinson
    等人,2002,Nat?Med?8,295-301),已用于分析免疫接种中和自身免疫疾患
    中的免疫应答(Robinson等人,2002;Robinson等人,2003,Nat?Biotechnol.21,
    1033-9;Quintana等人,2004;Kanter等人,2006,Nat?Med?12,138-43)。已
    经假定,多种反应性的模式可能比单一抗原-抗体关系更能说明问题
    (Quintana等人,2006,Lupus?15,428-30),如之前对健康和患病的小鼠
    (Quintana等人,2004;Quintana等人,2001,J?Autoimmun?17,191-7)以及
    人(Merbl等人,2007,J?Clin?Invest?117,712-8;Quintana等人,2003,J?
    Autoimmun?21,65-75)的自身免疫所有组成部分的分析所显示的。因此,
    自身抗体所有组成部分具有提供对疾病发病机理的新见解和充当疾病过
    程的免疫生物标志的潜力(Cohen,2007,Nat?Rev?Immunol.7,569-74)。

    抗原微阵列已用于表征系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和视神经脊
    髓炎中的血清自身抗体。然而,没有报道MS中的高亲和力特异性抗体以
    某种规律存在于血清中(Meinl等人,2006,Ann?Neurol.59,880-92;
    O’Connor等人,2007,Nat?Med?12,12;Zhou等人,2006,Proc?Natl?Acad?Sci?
    US.103,19057-62)。与血清中的自身抗体相反,Kanter和同事使用微阵
    列来检测CSF中的脂质(Kanter等人,2006)和ααB-晶状体蛋白(Ousman
    等人,2007,Nature.448,474-9)反应性抗体。引人注目地,针对αB-晶状体
    蛋白的抗体具有低亲和力,以1∶20稀释度可检出(Ousman等人,2007)。

    本发明的发明人中的一些发明人的PCT公布第WO?02/08755号涉及
    用于对预定抗原分类并藉此鉴定它们的方法、系统和制品,所述预定抗原
    对源自需要诊断疾病或监测治疗的患者受试者的血清的未确定的免疫球
    蛋白有反应性。该′755公布公开了抗原阵列用于鉴定对源自患多种疾病的
    受试者的血清的免疫球蛋白有反应性的抗原的用途?;构剂苏锒戏椒ê?br />可用于这些方法的系统,这些方法和系统采用对多种抗原的抗原亚组进行
    分类的步骤,所述抗原亚组对源自患有免疫系统受损或遭受疾病的多个患
    者的多种抗体有反应性,并且将受试者的抗体与得到的类(cluster)相关
    联或去关联。尽管WO?02/08755公开了可用于诊断除其他自身免疫疾病之
    外的MS的方法,但没有公开诊断MS的不同亚型或监测MS进展。

    本发明的发明人中的一些发明人的美国专利申请公布第2005/0260770
    号公开了抗原阵列系统及其诊断用途。该申请提供了在受试者诊断免疫疾
    病且特别是1型糖尿病或免疫疾病倾向的方法,该方法包括确定受试者的
    免疫球蛋白特异性结合抗原探针组的每种抗原探针的能力??乖秸胱榘?br />括选自由以下组成的组的多种抗原探针:细胞/组织结构分子的至少一部
    分、热休克蛋白的至少一部分、免疫系统分子的至少一部分、同聚多肽的
    至少一部分、激素的至少一部分、代谢酶的至少一部分、微生物抗原的至
    少一部分、软体动物抗原的至少一部分、核酸的至少一部分、植物抗原的
    至少一部分、血浆分子的至少一部分、以及组织抗原的至少一部分,其中
    受试者的免疫球蛋白的结合能力指示免疫疾病或免疫疾病倾向。然而,现
    有技术没有公开可提供用于诊断MS、具体用于区别MS的不同亚型并预
    测或监测疾病进展的特异性、可靠的、准确的且区别性测定的抗原阵列。
    这些区别性测定在为每位患者定制适当的治疗方法上将具有高度价值。

    PCT公布第WO?07/137410号涉及用于诊断MS、MS的不同形式或另
    外的脱髓鞘疾患的方法。具体地说,WO?07/137410涉及根据分子质量鉴定
    的、发现在临床诊断的MS或其他神经疾患与正?;颊咧渚哂胁煌姆?br />度或强度的特异性代谢产物。尽管如此,WO?07/137410既没有公开也没有
    提及利用测试抗体反应性模式来鉴定不同MS亚型中的独特特征标记
    (signature)模式并且区分患有MS的患者与患其他神经疾患的患者。

    因此,对可用于在受试者中诊断MS且特别是诊断MS亚型的改进的
    诊断方法和试剂盒存在需要。

    发明概述

    本发明提供了用于诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法和试剂盒,
    用于实施这种诊断的抗原探针阵列以及用于产生这些阵列的抗原探针组。
    特别地,本发明提供了用于诊断受试者的MS亚型的方法和试剂盒,其中
    所述MS亚型选自复发-缓解型MS(RRMS)、继发进展型MS(SPMS)、
    原发进展型MS(PPMS)以及选自I型MS病变和II型MS病变的MS病
    变的病理亚型。

    本发明部分地基于当使用抗原阵列测试MS患者的抗体反应性时获得
    的出人意料的结果。该分析导致自身抗体反应性的独特特征标记模式的鉴
    定。现在第一次公开的是,根据对中枢神经系统(CNS)抗原、热休克蛋
    白(HSP)和脂质抗原的反应性,独特自身抗体特征标记模式表征MS亚
    型,也就是复发-缓解型MS(RRMS)、继发进展型MS(SPMS)以及原
    发进展型MS(PPMS)。引人注目地,独特自身抗体特征标记模式区分
    MS亚型与其他的神经疾病或自身免疫驱动性疾病,包括阿尔兹海默病
    (AD)、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和红斑狼疮?;构耍焊?br />对脂质和CNS来源的肽的反应性,独特的自身抗体特征标记模式表征MS
    病变的不同免疫病理学模式,由此第一次提供用于对MS类别和阶段进行
    分亚型的基于生物标志的测定。

    因此,本发明涉及用于诊断MS亚型的方法和试剂盒。根据本发明的
    原理,试剂盒包括在本文也称为抗原探针组的多种抗原。包括多种抗原的
    这些抗原探针组与患有MS的受试者的血清特异性反应。根据本发明的原
    理,多种抗原可有利地以抗原阵列的形式使用。根据一些实施方案,抗原
    阵列便利地以抗原芯片形式排列。

    本发明鉴定了与MS亚型相关的抗原的类,并且确定了用测试血清相
    比于对照血清观察到的反应性。尽管没有鉴定凭自身足以充分诊断患有
    MS或MS亚型的受试者的单一抗原,但本文在以下表1到表4中详述的
    这些抗原的特定组合比每种单独的抗原在区别患者受试者和对照受试者
    上明显地更加准确和可靠。如以下详述的表1包含SEQ?ID?NO:7、14、23-83
    及98-100,源自SEQ?ID?NO:4-6、10以及12的片段和非肽部分乳糖脑苷
    脂(lactocerebroside)。如以下详述的表2包含SEQ?ID?NO:7、8、13、16、
    22、29、42、51、60、67-71、84、85及101,源自SEQ?ID?NO:4-6、9、
    10、12以及20的片段,以及非肽部分明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)
    LPS、大肠杆菌LPS和硫酸软骨素4。如以下详述的表3包含SEQ?ID?NO:
    6、7、19、21、25、26、28、29、31、32、35-38、40-42、44、48、53、
    55、56、64、70、73、75、85-96、100、102及103,源自SEQ?ID?NO:4-6、
    10、12及15的片段,以及非肽部分无唾液酸神经节苷脂-GM2、心磷脂和
    胆固醇。如以下详述的表4包含SEQ?ID?NO:17、29、43、85及97,源自
    SEQ?ID?NO:5及12的片段,以及非肽部分:15-酮胆甾烷、15α-羟基胆甾
    烯、神经节苷脂-GM4、15-酮胆甾烯、四唾液酸神经节苷脂-GQ1B、脑L-α-
    溶血磷脂酰丝氨酸(L-α-lysophosphatidylserine)和乳糖基神经酰胺。

    表1-区别RRMS与健康对照(HC)的抗原




    表2-区别PPMS与健康对照(HC)的抗原



    表3-区别SPMS与RRMS的抗原




    表4-区别I型病变和II型病变的抗原


    表5-在表1至表4中列出的蛋白的获取号和SEQ?ID?NO.



    根据第一方面,本发明提供了诊断受试者的多发性硬化(MS)亚型的
    方法,该方法包括:确定从该受试者获得的样品中的抗体对选自由表1到
    表4中列出的抗原组成的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多
    种抗原的反应性模式,并且比较所述样品的反应性模式与对照反应性模
    式,其中MS亚型选自由以下组成的组:

    (i)复发缓解型多发性硬化(RRMS),其中所述多种抗原选自由表1
    中列出的抗原组成的组;

    (ii)原发进展型多发性硬化(PPMS),其中所述多种抗原选自由表2
    中列出的抗原组成的组;

    (iii)继发进展型多发性硬化(SPMS),其中所述多种抗原选自由表3
    中列出的抗原组成的组;以及

    (iv)选自以I型病变和II型病变为特征的MS的MS病理亚型,其中
    所述多种抗原选自由表4中列出的抗原组成的组。

    根据这方面的某些实施方案,在获自该受试者的所述样品的反应性模
    式与对照样品的反应性模式之间的显著差异是该受试者患MS亚型的指
    示。

    如本文所用,针对“多种抗原”的“样品中抗体的反应性”是指该样品中
    的每种抗体对选自所述多种抗原的特定抗原的免疫反应性??固宥钥乖?br />免疫反应性即抗体特异性结合抗原的能力可用来确定样品中抗体的量。样
    品的反应性模式因此反映样品中的测试抗体中的每一种的水平。

    通常,确定样品中的抗体对多种抗原的反应性是使用免疫测定进行。
    有利地,多种抗原可以抗原阵列形式使用。

    在反应性模式之间的“显著差异”在不同的实施方案中指统计学上显著
    的差异,或者在其他实施方案中指普通技术人员公认的显著差异。有利地,
    本发明的方法可采取学习与模式识别分析仪、聚类算法等等的使用,以区
    别对照受试者的反应性模式与患有MS亚型的患者的反应性模式。像这样,
    该术语确切地包括通过如下方式测量的差异:例如,确定测试样品中的抗
    体对多种抗原的反应性,并且使用这些算法和/或分析仪比较得到的反应性
    模式与阴性对照样品和阳性对照样品(例如,分别从未患MS亚型的对照
    受试者或患测试的MS亚型的患者获得的样品)的反应性模式。根据某些
    实施方案,对照样品是从患另一MS亚型的患者获得(即,可能测试样品
    的SPMS,而对照样品从RRMS患者获得)?;箍梢酝ü冉喜馐匝返?br />反应性模式与以这种方式获得的预设分类规则来测量差异。

    因此,在另一个实施方案中,测试样品的反应性模式与对照样品的反
    应性模式之间的显著差异(其中该差异使用学习与模式识别算法来计算)
    指示受试者患MS亚型。例如,算法可包括但不限于:监督或非监督分类
    法,包括:统计算法,所述统计算法包括但不限于,主成分分析(PCA)、
    偏最小二乘法(PLS)、多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)、
    包括线性判别分析(LDA)在内的判别函数分析(DFA)、以及包括最近
    邻(nearest?neighbor)在内的聚类分析;人工神经网络;耦合双向聚类算
    法;多层感知器(MLP);广义回归神经网络(GRNN);模糊推理系统
    (FIS);自组织映射图(SOM);遗传算法(GAS);神经模糊系统(NFS);
    自适应共振理论(ART)。

    根据本发明的方法的某些实施方案,对照选自由以下组成的组:来自
    至少一个个体的样品、来自一组个体的一小组对照样品、和来自对照个体
    的一组储存数据。

    根据另外的实施方案,样品为血清样品。根据另一个实施方案,样品
    为脑脊液(CSF)。在其他的特定实施方案中,测试样品和对照样品可包
    括IgG和/或IgM抗体。在另一个实施方案中,本发明的方法和试剂盒的
    表1到表4包括用于确定IgG和IgM抗体反应性的双份的特定抗原(例如,
    表2中PLP?215-232、牛MBP及CNP?1-20和表3中的PLP?1-19、OSP?121-140
    及CNP?240-259)。在另一实施方案中,一种抗体对特定抗原(来自所述
    多种抗原)的反应性被上调。在另一实施方案中,一种抗体对特定抗原的
    反应性被下调。

    根据一些实施方案,所述方法还包括在确定样品中抗体的反应性之前
    将样品稀释例如1∶10或更多。

    根据其他实施方案,多种抗原以抗原阵列形式使用。根据一些实施方
    案,抗原阵列以抗原芯片形式排列。

    根据某些实施方案,MS亚型为复发缓解型多发性硬化(RRMS)并且
    多种抗原选自表1。根据这一特定的实施方案,对照反应性模式是从健康
    患者或来自健康患者的一组储存数据获得。根据具体的实施方案,多种抗
    原包括表1中列出的抗原中的至少5种、至少10种、至少15种、至少20
    种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少
    50种、至少55种、至少60种、至少65种、至少70种、至少75种、至
    少80种、至少85种、至少90种不同的抗原。根据另一实施方案,多种
    抗原包括表1中列出的所有抗原。优选地,在诊断和患者病症之间提供可
    靠且准确的相关性所需的抗原组由不超过100种、优选不超过115种、更
    优选不超过130种、并且最优选不超过150种抗原组成。在另一实施方案
    中,多种抗原由表1中列出的抗原组成。每种可能性代表本发明的单独的
    实施方案。

    根据某些实施方案,MS亚型为原发进展型多发性硬化(PPMS)并且
    多种抗原选自表2。根据这一特定的实施方案,对照反应性模式是从健康
    患者或来自健康患者的一组储存数据获得。根据具体的实施方案,多种抗
    原包括表2中列出的抗原中的至少5种、至少10种、至少15种、至少20
    种、至少25种、至少30种、至少35种不同的抗原。根据另一实施方案,
    多种抗原包括表2中列出的所有抗原。优选地,在诊断和患者病症之间提
    供可靠且准确的相关性所需的抗原组由不超过50种、优选不超过70种、
    更优选不超过80种、并且最优选不超过100种抗原组成。在另一实施方
    案中,多种抗原由表2中列出的抗原组成。每种可能性代表本发明的单独
    的实施方案。

    根据某些实施方案,MS亚型为继发进展型多发性硬化(SPMS)并且
    多种抗原选自表3。根据这一特定的实施方案,对照反应性模式选自由以
    下组成的组:来自患RRMS的至少一个个体的样品、来自患RRMS的一
    组个体的一小组对照样品、和来自患RRMS的对照个体的一组储存数据。
    根据具体的实施方案,多种抗原包括表3中列出的抗原中的至少5种、至
    少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、
    至少40种、至少45种、至少50种、至少55种、至少60种不同的抗原。
    根据另一实施方案,多种抗原包括表3中列出的所有抗原。优选地,在诊
    断和患者病症之间提供可靠且准确的相关性所需的抗原组由不超过80种、
    优选不超过90种、并且最优选不超过100种抗原组成。在另一实施方案
    中,多种抗原由表3中列出的抗原组成。每种可能性代表本发明的单独的
    实施方案。

    根据一些实施方案,MS亚型是选自I型MS病变和II型MS病变的
    MS病理类型并且多种抗原选自表4。根据一个实施方案,本发明提供了用
    于诊断患有MS的受试者的I型病变,并且对照反应性模式是从患有II型
    病变的患者获得。根据另一实施方案,本发明提供了用于诊断患有MS的
    受试者的II型病变的方法,并且对照反应性模式是从患有I型病变的患者
    获得。根据另一实施方案,本发明提供了用于在患MS的受试者中区分具
    有I型病变的受试者和具有II型病变的受试者的方法。根据具体的实施方
    案,多种抗原包括表4中列出的抗原中的至少4种、至少6种、至少8种、
    至少10种、至少12种不同的抗原。根据另一实施方案,多种抗原包括表
    4中列出的所有抗原。优选地,在诊断和患者病症之间提供可靠且准确的
    相关性所需的抗原组由不超过20种、优选不超过30种、并且最优选不超
    过50种抗原组成。在另一实施方案中,多种抗原由表4中列出的14种抗
    原组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于诊断受试者的MS亚型的方法,
    该方法包括:

    (a)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表1中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从健康受试者获得的对照反应性模式;

    (b)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表2中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从健康受试者获得的对照反应性模式;

    (c)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表3中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从患RRMS的受试者获得的对照反应
    性模式;

    (d)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表4中列出的抗原
    组成的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模
    式,并且比较所述样品的反应性模式与从具有I型病变的受试者获得的对
    照反应性模式和/或与从具有II型病变的受试者获得的对照反应性模式;

    其中:

    (i)(a)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试者
    患RRMS的指示;

    (ii)(b)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试
    者患PPMS的指示;

    (iii)(c)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试者
    患SPMS的指示;以及

    (iv)(d)的反应性模式与从具有I型病变的受试者获得的对照反应性模
    式之间的显著差异是受试者患II型病变的指示,并且(d)的反应性模式与从
    具有II型病变的受试者获得的对照反应性模式之间的显著差异是受试者患
    I型病变的指示。

    根据一些实施方案,对于表1和表2的对照反应性模式是从健康对照
    受试者或来自健康对照受试者的一组储存数据获得。根据另一实施方案,
    对于表3的对照反应性模式是从患RRMS的受试者或来自患RRMS的受
    试者的一组储存数据获得。

    根据另一方面,本发明提供了用于诊断MS亚型的试剂盒,该试剂盒
    包括:

    (i)选自由表1中列出的抗原组成的组的用于诊断RRMS的多种抗
    原;

    (ii)选自由表2中列出的抗原组成的组的用于诊断PPMS的多种抗原;

    (iii)选自由表3中列出的抗原组成的组的用于诊断SPMS的多种抗原;
    以及

    (iv)选自由表4中列出的抗原组成的组的用于区别患有MS的受试者
    的I型病变与II型病变的多种抗原。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于诊断RRMS的试剂盒,该试剂
    盒包括选自由表1中列出的抗原组成的组的多种抗原。根据具体的实施方
    案,多种抗原包括表1中列出的抗原中的至少5种、至少10种、至少15
    种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少
    45种、至少50种、至少55种、至少60种、至少65种、至少70种、至
    少75种、至少80种、至少85种、至少90种不同的抗原。根据另一实施
    方案,多种抗原包括表1中列出的所有抗原。每种可能性代表本发明的单
    独的实施方案。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于诊断PPMS的试剂盒,该试剂
    盒包括选自由表2中列出的抗原组成的组的多种抗原。根据具体的实施方
    案,多种抗原包括表2中列出的抗原中的至少5种、至少10种、至少15
    种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种不同的抗原。根据另
    一实施方案,多种抗原包括表2中列出的所有抗原。每种可能性代表本发
    明的单独的实施方案。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于诊断SPMS的试剂盒,该试剂
    盒包括选自由表3中列出的抗原组成的组的多种抗原。根据具体的实施方
    案,多种抗原包括表3中列出的抗原中的至少5种、至少10种、至少15
    种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少
    45种、至少50种、至少55种、至少60种不同的抗原。根据另一实施方
    案,多种抗原包括表3中列出的所有抗原。每种可能性代表本发明的单独
    的实施方案。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于区别患有MS的受试者的I型
    病变与II型病变的试剂盒,该试剂盒包括选自由表4中列出的抗原组成的
    组的多种抗原。根据具体的实施方案,多种抗原包括表4中列出的抗原中
    的至少4种、至少6种、至少8种、至少10种、至少12种不同的抗原。
    根据另一实施方案,多种抗原包括表4中列出的所有抗原。每种可能性代
    表本发明的单独的实施方案。

    在其他实施方案中,试剂盒还可以包括用于确定样品中的抗体对多种
    抗原的反应性的手段。例如,试剂盒可包含可用于测量抗体对本发明的抗
    原探针的特异性结合的试剂、可检测标记和/或容器。在特定的实施方案中,
    所述试剂盒是以抗原阵列的形式。在其他实施方案中,所述试剂盒还可以
    包括阴性和/或阳性对照样品。例如,阴性对照样品可包含来自至少一个健
    康个体或至少一个鉴定具有另一MS亚型的个体的样品(例如,当试剂盒
    为诊断测试样品中的SPMS的手段时,从患RRMS的至少一个个体获得的
    样品用作阴性对照)。阳性对照可包含来自患被诊断的MS亚型的至少一
    个个体的样品。其他非限制性实例是来自一组健康个体或患病个体的一小
    组对照样品、或者来自对照个体的一组存储数据。

    在其他实施方案中,试剂盒还可以包括用于比较不同样品中的抗体对
    多种抗原的反应性模式的手段。在具体的实施方案中,用于比较反应性模
    式的手段包括学习与模式识别分析仪(例如,利用本文详述的学习与模式
    识别算法)。

    根据其他实施方案,本发明的方法和试剂盒可用于监测MS进展。

    根据另一方面,本发明提供了包含表1中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表1中列出的抗原的亚组,如本
    文详述的。

    根据另一方面,本发明提供了包含表2中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表2中列出的抗原的亚组,如本
    文详述的。

    根据另一方面,本发明提供了包含表3中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表3中列出的抗原的亚组,如本
    文详述的。

    根据另一面,本发明提供了包含表4中列出的抗原探针的抗原探针组。
    根据某些实施方案,抗原探针组包括表4中列出的抗原的亚组,如本文详
    述的。

    根据另一方面,本发明提供了包含本发明的抗原探针组的制品。

    根据另一方面,本发明提供了抗原探针组用于制备诊断MS亚型的诊
    断组合物的用途,所述抗原探针组包含选自由表1到表4之一列出的抗原
    组成的组的多种抗原,其中MS亚型选自由以下组成的组:

    (i)RRMS,其中所述多种抗原选自由表1中列出的抗原组成的组;

    (ii)PPMS,其中所述多种抗原选自由表2中列出的抗原组成的组;

    (iii)SPMS,其中所述多种抗原选自由表3中列出的抗原组成的组;以

    (iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型,其中所述多种抗原选
    自由表4中列出的抗原组成的组。

    在一个实施方案中,诊断组合物可用于确定样品中抗体的反应性,从
    而确定该样品对所述多种抗原的反应性模式,其中所述样品的反应性模式
    与对照样品的反应性模式之间的显著差异是MS亚型的指示。

    从以下描述和附图,本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。

    附图简述

    图1显示抗原微阵列的表现。将RRMS或健康对照(HC)血清样品
    以不同的浓度在抗原微阵列上杂交,并且测量了IgG(图1A)和IgM(图
    1B)对点在微阵列上的CNS、HSP或脂质抗原的平均反应性。结果以IgG
    或IgM在每种稀释度对CNS、HSP或脂质抗原的反应性的平均值+SEM
    呈现。与相同稀释度测试的HC样品相比,*P<0.05,**P<0.01以及***
    P<0.001(双因素ANOVA)。图1C显示在抗原微阵列上测量用不同浓
    度的PLP261-277或HSP601-20预孵育的RRMS血清(1∶10稀释)的IgG
    对PLP261-277的反应性。当与未用竞争物预孵育的样品比较时,**P<
    0.01以及***P<0.001(单因素ANOVA)。

    图2显示在RRMS、PPMS和SPMS中的血清抗体反应性。图2A和
    图2B显示将RRMS(图2A)或PPMS(图2B)与HC区别的抗体反应性。
    在热图中每列代表患者,该热图在底部以颜色标识指示其对应于RRMS样
    品(图2A)、PPMS样品(图2A)或是HC样品(图2A和图2B),并
    且每行显示根据左侧显示的比色标(colorimetric?scale)的针对抗原的标准
    化抗体反应性(详述于以下实施例2和实施例3中)。图2C-2D显示在
    RRMS和PPMS中的抗原特异性。在RRMS和PPMS中区别性的抗体的特
    异性被显示为相对于HC在MS中发现被上调或下调(分别为图2C和图
    2D)的CNS、HSP和脂质抗原的相对贡献(相对于区别性的抗原的总数
    的%)。图2E显示描绘SPMS和RRMS样品中的抗体反应性的热图。图
    2F和图2G显示在SPMS中的抗原特异性,其被显示为相对于RRMS在
    SPMS中发现被上调或下调(分别为图2F和图2G)的CNS、HSP和脂质
    抗原的相对贡献(相对于区别性的抗原的总数的%)。图2H是概括与
    RRMS、SPMS和PPMS相关的免疫特征标记的简图。

    图3显示与脑病理学相关的抗体反应性。在热图中每列代表患者,该
    热图在底部以颜色标识指示其是对应于I型样品还是II型样品,该热图显
    示根据左侧显示的比色标的针对抗原的标准化抗体反应性。用于构建此热
    图的抗体反应性在以下实施例5中列出。

    图4显示向EAE施用氧化的胆固醇衍生物的作用。图4A显示向EAE
    施用氧化的胆固醇衍生物使EAE恶化。图4B-4D描绘了MOG35-55、MOG35-55
    +oxChol或MOG35-55+oxChol+AIQ小鼠的脊髓的细胞浸润(图4B)、
    脱髓鞘(图4C)和轴突缺失(图4D)的定量。

    发明详述

    本发明提供了诊断受试者的多发性硬化(MS)的方法,所述方法使用
    实施这种诊断的抗原探针阵列,并且鉴定了用于产生这种阵列的具体抗原
    探针组。根据一些实施方案,本发明涉及用于MS的早期诊断以及用于监
    测MS进程的基于自身抗体的生物标志测试。具体地说,本发明的方法和
    试剂盒可区分受试者的MS形式(也就是RRMS、SPMS或PPMS)。此
    外,本发明的方法和试剂盒可区分MS患者的病变模式,特别是区分I型
    病变和II型病变。

    如本文在以下举例说明的,自身抗体的抗原微阵列分析能够鉴定与
    MS的不同临床形式及病理亚型相关的血清和CSF自身抗体特征标记;这
    些特征标记基于集合的自身抗体模式,而不是单一自身抗体反应性。这些
    信息模式是由结合髓鞘分子和HSP的肽、蛋白和脂质的自身抗体呈现。而
    且,这些信息模式包括自身抗体反应性相对于在HC中发现的自身抗体反
    应性的减少以及增加。

    此外,独特的抗体模式与不同的MS病理学模式相关。II型MS病理
    学与针对HSP60、OSP、MOG和PLP肽表位的IgG抗体增加有关,而对
    神经节苷脂、乳糖基神经酰胺和L-α-溶血磷脂酰丝氨酸的抗体反应性增加
    与I型有联系。已描述针对乳糖基神经酰胺和L-α-溶血磷脂酰丝氨酸的抗
    体在MS患者和EAE小鼠的CSF中(Kanter等人,2006)。I型血清样品
    还包括针对氧化的胆固醇衍生物(15-酮胆甾烯、15-酮胆甾烷和15a-羟基
    胆甾烯)的抗体。在MS患者的CSF中已发现一种相关的胆固醇氧化衍生
    物7-酮胆固醇的水平升高。值得注意地,7-酮胆固醇和神经节苷脂分别通
    过PARP途径和toll样受体4依赖性途径激活小神经胶质细胞。

    本文呈现的研究的重大发现是在MS患者的CSF和血清中的抗体所有
    组成部分明显是有差别的。这些结果与MS受试者的CSF中的免疫应答的
    区室化(compartmentalization)是一致的。尽管已在MS中广泛地研究CSF
    中的抗体,但以前没有描述本文所述的独特的抗体免疫特征标记。

    最初的研究启示,独特的特征标记可能与对治疗的响应和疾病进程有
    关。例如,大约50%的RRMS患者变为SPMS,这种转变与免疫机制和神
    经变性机制的改变有关。如本文在以下所展示的,用抗原阵列进行的SPMS
    研究揭示共享RRMS患者和PPMS患者两者的特性的抗体特征标记,暗示
    抗原阵列可用于监测疾病模式的这一改变。而且,如果在疾病过程的早期
    建立这些抗体模式,那么它们将可用于MS易感性的早期诊断和筛选,因
    为可以在少量血清中测量到它们。因此,本文提供的发现显示,血清微阵
    列抗体模式提供监测MS,例如确定该病的预后并表征该病的免疫病理学
    机制的新途径。

    抗原探针和抗原探针组

    根据另外的实施方案,本发明提供了可用于诊断MS的抗原探针和抗
    原探针组,如本文详述的。

    根据本发明的原理,本发明还提供了在本文也称为抗原探针组的多种
    抗原。包括多种抗原的这些抗原探针组与患有MS的受试者的血清特异性
    反应。根据本发明的原理,多种抗原可有利地以抗原阵列的形式使用。根
    据一些实施方案,抗原阵列以抗原芯片形式方便地排列。

    如本文所用的“探针”表示能够特异性结合组分的任何化合物。根据一
    方面,本发明提供了包括表1中列出的抗原探针的抗原探针组。根据某些
    实施方案,抗原探针组包括表1中列出的抗原的亚组。根据某些实施方案,
    本发明的抗原探针组包括选自表1的多种抗原,如本文详述的,以用于
    RRMS的诊断。优选地,多种抗原包括表1中列出的一组抗原?;乖谄渌?br />实施方案中,抗原探针组包括抗原探针组的亚组或者由抗原探针组的亚组
    组成,例如,各自选自表1中指明的名单的至少5、10、15、20、25、30、
    35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90种不同的抗原,其中
    每种可能性代表本发明的单独的实施方案??裳≡裾庑┭亲橐员悴锒?br />阵列的最佳的灵敏性和/或特异性。在其他的实施方案中,探针组包括高达
    115种,或者在其他实施方案中高达130种或150种不同的抗原。在其他
    的实施方案中,由表1中指明的抗原组成的探针组足以区别RRMS患者与
    未患RRMS的健康个体。应注意,尽管认为这些探针组足以可靠地鉴定患
    有RRMS的受试者,但在某些实施方案中可以便利地以包括更大数目的抗
    原例如大约130种抗原或更多的抗原阵列的形式使用本发明的抗原探针
    组。

    根据另一方面,本发明提供了包括表2中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表2中列出的抗原的亚组。根据
    其他的实施方案,本发明的抗原探针组包括选自表2的多种抗原,如本文
    详述的,以用于PPMS的诊断。优选地,多种抗原包括表2中列出的一组
    抗原?;乖谄渌凳┓桨钢?,抗原探针组包括抗原探针组的亚组或者由抗
    原探针组的亚组组成,例如,各自选自表2中指明的名单的至少5、10、
    15、20、25、30、35种不同的抗原,其中每种可能性代表本发明的单独的
    实施方案??裳≡裾庑┭亲橐员悴锒险罅械淖罴训牧槊粜院?或特异
    性。在其他的实施方案中,探针组包括高达50种,或者在其他实施方案
    中高达70种或100种不同的抗原。在其他的实施方案中,由表2中指明
    的抗原组成的探针组足以区别PPMS患者与未患PPMS的健康个体。应注
    意,尽管认为这些探针组足以可靠地鉴定患有PPMS的受试者,但在某些
    实施方案中可以便利地以包括更大数目的抗原例如大约100种抗原或更多
    的抗原阵列的形式使用本发明的抗原探针组。

    根据另一方面,本发明提供了包括表3中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表3中列出的抗原的亚组。根据
    某些实施方案,本发明的抗原探针组包括选自表3的多种抗原,如本文详
    述的,以用于SPMS的诊断。优选地,多种抗原包括表3中列出的一组抗
    原?;乖谄渌凳┓桨钢?,抗原探针组包括抗原探针组的亚组或者由抗原
    探针组的亚组组成,例如,各自选自表3中指明的名单的至少5、10、15、
    20、25、30、35、40、45、50、55、60种不同的抗原,其中每种可能性代
    表本发明的单独的实施方案??裳≡裾庑┭亲橐员悴锒险罅械淖罴训?br />灵敏性和/或特异性。在其他的实施方案中,探针组包括高达80种,或者
    在其他实施方案中高达100种或150种不同的抗原。在其他的实施方案中,
    由表3中指明的抗原组成的探针组足以区别SPMS患者和RRMS患者。应
    注意,尽管认为这些探针组足以可靠地鉴定患有SPMS的受试者,但在某
    些实施方案中可以便利地以包括更大数目的抗原例如大约130种抗原或更
    多的抗原阵列的形式使用本发明的抗原探针组。

    根据另一方面,本发明提供了包括表4中列出的抗原探针的抗原探针
    组。根据某些实施方案,抗原探针组包括表4中列出的抗原的亚组。根据
    某些实施方案,本发明的抗原探针组包括选自表4的多种抗原,如本文详
    述的,以用于区分I型MS病变与II型MS病变。优选地,多种抗原包括
    表4中列出的一组14种抗原?;乖谄渌凳┓桨钢?,抗原探针组包括抗
    原探针组的亚组或者由抗原探针组的亚组组成,例如,各自选自表4中指
    明的名单的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种不同的抗原,其
    中每种可能性代表本发明的单独的实施方案??裳≡裾庑┭亲橐员悴?br />断阵列的最佳的灵敏性和/或特异性。在其他的实施方案中,探针组包括高
    达20种,或者在其他实施方案中高达30种或50种不同的抗原。在其他
    的实施方案中,由表4中指明的14种抗原组成的探针组足以区别患有I
    型MS病变的患者和患有II型MS病变的患者。应注意,尽管认为这些探
    针组足以可靠地鉴定MS模式,但在某些实施方案中可以便利地以包括更
    大数目的抗原例如大约50种抗原或更多的抗原阵列的形式使用本发明的
    抗原探针组。

    将在本发明的测定中使用的抗原探针可以使用本领域公知的方法来
    纯化或者合成。例如,抗原性蛋白或抗原性肽可使用已知的重组方法或合
    成方法产生,包括但不限于固相(例如,Boc或f-Moc化学)和溶液相合
    成方法(Stewart和Young,1963;Meienhofer,1973;Schroder和Lupke,1965;
    Sambrook等人,2001)。本领域技术人员拥有获得或合成本发明的抗原探
    针的专业技能。一些抗原探针也可以从以下来源商购获得:例如,Sigma
    (St.Louis,MO,USA)、Abnova(Taipei?City,Taiwan)、Matreya?LLC
    (Pleasant?Gap,PA,USA)、Avanti?Polar?Lipids(Alabaster,AL,USA)、
    Calbiochem(San?Diego,CA,USA)、Chemicon(Temecula,CA,USA)、
    GeneTex(San?Antonio,TX,USA)、Novus?Biologicals(Littleton,CO,
    USA)、Assay?Designs(Ann?Arbor,MI,USA)、ProSci?Inc.(Poway,
    CA,USA)、EMD?Biosciences(San?Diego,CA,USA)、Cayman?Chemical
    (Ann?Arbor,MI,USA)、HyTest(Turku,Finland)、Meridian?Life?Science
    (Memphis,TN?USA)和Biodesign?International(Saco,ME,USA),如
    本文在以下详述的。

    应注意,本发明利用具有表1到表4中列出的氨基酸序列的抗原探针
    及其同源物(homolog)、片段和衍生物,只要这些同源物、片段和衍生
    物与这些抗原探针进行免疫交叉反应。如本文所用的术语“免疫交叉反应”
    是指被同一种抗体特异性结合的两种或多种抗原。如本文所用的术语“同源
    物”是指与抗原的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少
    85%或至少90%同一性的肽。交叉反应性可通过许多免疫测定技术中的任
    何一种来确定,诸如竞争测定(测量测试抗原竞争性抑制抗体与其已知抗
    原结合的能力)。

    术语肽通常是指长度达大约50个氨基酸残基的多肽。根据特定的实
    施方案,本发明的抗原性肽可以为10-50个氨基酸长度,通常为大约10-30
    个氨基酸或大约15-25个氨基酸长度。

    该术语涵盖天然肽(降解产物、合成的合成肽、或重组肽),模拟肽
    (通常为合成的合成肽),以及肽类似物类肽(peptoid)和半类肽
    (semipeptoid),并且可具有例如使肽在体内更稳定或者更加能够渗透到
    细胞中的修饰。这些修饰包括但不限于:N端修饰;C端修饰;肽键修饰,
    包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、O=C-NH、CH2-O、CH2-CH2、
    S=C-NH、CH=CH和CF=CH;骨架修饰;以及残基修饰。

    可使用具有末端羧酸的本发明的抗原,作为羧基酰胺,为还原性末端
    醇或者为任何药学上可接受的盐,例如,为金属盐,包括钠盐、钾盐、锂
    盐或钙盐,或者为有机碱的盐,或者为包括硫酸、盐酸或磷酸的无机酸的
    盐,或者为有机酸例如乙酸或马来酸的盐。

    官能衍生物由对所述肽的氨基酸侧链和/或羧基和/或氨基部分的化学
    修饰组成。这些衍生的分子包括例如如下那些分子:在所述分子中游离氨
    基已被衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺?;?、苄氧羰基基团、叔丁氧羰
    基基团、氯乙?;呕蚣柞;?。游离的羧基基团可被衍生形成盐、
    甲酯及乙酯或者其他类型的酯或酰肼。游离的羟基基团可被衍生形成O-
    ?;騉-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-im-苄基组氨酸。
    化学衍生物还包括如下那些多肽:所述多肽包含二十种标准氨基酸残基的
    一种或多种天然存在的或修饰的氨基酸衍生物。例如:4-羟基脯氨酸可代
    替脯氨酸;5-羟基赖氨酸可代替赖氨酸;3-甲基组氨酸可代替组氨酸;高
    丝氨酸可代替丝氨酸;鸟氨酸可代替赖氨酸。

    除非另外指明,否则本文所述的氨基酸残基是以“L”同分异构体形式。
    然而,“D”同分异构体形式的残基可代替任何L氨基酸残基,只要该肽基
    本上保留期望的抗体特异性。

    适合的类似物可通过现在标准的肽合成方法及装置或重组方法容易
    地合成。所有这些类似物就其氨基酸序列来说在本质上基于本发明的抗
    原,但是将具有缺失的、取代的或添加的一个或多个氨基酸残基。当氨基
    酸残基被取代时,所设想的这些保守性替换是不显著改变多肽的结构或抗
    原性的那些替换。例如,碱性氨基酸被其他碱性氨基酸替换,酸性氨基酸
    被酸性氨基酸替换,中性氨基酸被中性氨基酸替换。除了包括以上详述的
    保守性取代的类似物以外,还考虑包括非保守性氨基酸取代的类似物,只
    要这些类似物与本发明的肽进行免疫交叉反应。

    在其他方面,提供了编码这些肽的核酸、包含这些核酸的载体和包含
    这些核酸的宿主细胞。这些核酸、载体和宿主细胞通过本领域已知的重组
    方法容易地产生(见,例如,Sambrook等人,2001)。例如,编码本发明
    的抗原的分离的核酸序列可以作为整个(即完整)基因或整个基因的一部
    分从其天然来源获得。核酸分子还可以使用重组DNA技术(例如,聚合
    酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成产生。核酸序列包括天然核酸
    序列及其同源物,包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸序列,在
    所述修饰的核酸序列中核苷酸以如下方式被插入、缺失、取代和/或倒置:
    所述方式使得这些修饰基本上不妨碍该核酸分子编码本发明的功能肽的
    能力。

    将在本发明的测定中使用的脂质抗原可使用本领域公知的方法来纯
    化或合成(见,例如,Biochemistry?of?Lipids,Lipoproteins,and?Membranes
    (脂质、脂蛋白和膜的生物化学),第4版(2002;Vance?D?E和Vance,J?
    E,编辑;Elsevier,Amsterdam,Boston);Enzymes?in?Lipid?Modification(脂
    质修饰中的酶)(2000;Bornsheuer,U?T,编辑;Wiley-VCH,Weinheim,
    N.Y.);Lipid?Synthesis?and?Manufacture(脂质合成与制造)(1999;Gunstone,
    F?D,编辑;Sheffield?Academic?Press,Sheffield,England;CRC?Press,Boca?
    Raton,Fla.);Lipid?Biochemistry(脂质生物化学),第5版(2002;Gurr,
    M?I,Harwood,J?L,和Frayn,K?N,编辑;Blackwell?Science,Oxford,Malden,
    Mass)。在另一实施方案中,将在本发明的测定中使用的脂质抗原可以如
    本文以下详述的从商业上购买。

    诊断方法

    根据一些实施方案,本发明提供了可用于MS特别是RRMS、PPMS
    和SPMS的检测的诊断方法。在另一实施方案中,本发明提供了可用于区
    别MS脱髓鞘模式特别是I型MS病变和II型MS病变的诊断方法。

    根据一些实施方案,本发明的方法通过如下方式实施:确定从测试受
    试者获得的样品中的抗体对选自由表1到表4中列出的抗原组成的组的多
    种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,并且比较
    所述样品的反应性模式与对照反应性模式。在一个实施方案中,在所述样
    品的反应性模式与对照样品的反应性模式之间的显著差异指示受试者患
    MS。根据一个实施方案,抗原选自表1,用于诊断RRMS,并且对照反应
    性模式是从健康患者获得。根据另一实施方案,抗原选自表2,用于诊断
    PPMS,并且对照反应性模式是从健康患者获得。根据另一实施方案,抗
    原选自表3,用于诊断SPMS,并且对照反应性模式是从患RRMS的患者
    获得。根据另一实施方案,抗原选自表4,用于区别I型MS病变和II型
    MS病变(即,测试样品的I型MS,对照反应性模式是从患有II型MS病
    变的患者获得;或者测试样品的II型MS,对照反应性模式是从患有I型
    MS病变的患者获得)。根据特定的实施方案,抗原选自由表1到表4中
    任一个表中列出的抗原组成的组,并且所述样品的所述反应性模式指示受
    试者的MS阶段,其中(i)在对照反应性模式与样品对选自表1的多种抗
    原的反应性模式之间的显著差异指示受试者患有RRMS;(ii)在对照反
    应性模式与样品对选自表2的多种抗原的反应性模式之间的显著差异指示
    受试者患有PPMS;(iii)在对照反应性模式与样品对选自表3的多种抗
    原的反应性模式之间的显著差异指示受试者患有SPMS;以及(iv)在对
    照反应性模式与样品对选自表4的多种抗原的反应性模式之间的显著差异
    指示受试者具有I型MS病变或II型MS病变。

    如本文中所使用,针对“多种抗原”的“样品中抗体的反应性”是指该样
    品中的每种抗体对选自多种抗原的具体抗原的免疫反应性??固宥钥乖?br />免疫反应性即抗体特异性结合抗原的能力可用来确定样品中抗体的量。在
    样品中的测试抗体的每一种的计算水平被选择性称为样品对这些抗原的
    反应性模式。例如,在以下实施例中,每种抗原的反应性被计算并呈现为
    换算的每个斑点(抗原)的平均log强度。

    在其他实施方案中,所述方法包括确定获自受试者的样品中针对于选
    自由表1到表4中列出的抗原组成的组的多种抗原的抗体的水平,其中在
    获自该受试者的样品中的抗体水平与对照群体中的抗体水平之间的统计
    学显著差异是该受试者患MS亚型的指示,其中MS亚型选自由以下组成
    的组:(i)RRMS,其中所述多种抗原选自由表1中列出的抗原组成的组;
    (ii)PPMS,其中所述多种抗原选自由表2中列出的抗原组成的组;(iii)
    SPMS,其中所述多种抗原选自由表3中列出的抗原组成的组;以及(iv)
    选自I型病变和II型病变的MS病理亚型,其中所述多种抗原选自由表4
    中列出的抗原组成的组。

    如本文所用“针对于”抗原的抗体是能够特异性结合该抗原的抗体。确
    定针对于多种抗原的抗体的水平包括测量样品中每种抗体的水平,其中每
    种抗体针对于表1到表4中列出的抗原中的具体抗原。该步骤通常利用免
    疫测定进行,如本文详述。

    在其他的实施方案中,所述方法包括确定获自受试者的样品中多种抗
    体的水平,每种抗体是针对于选自由表1到表4中列出的抗原组成的组的
    抗原,其中在获自受试者的样品中抗体的水平与抗体的对照水平之间的显
    著差异是受试者患MS亚型的指示,所述MS亚型选自由以下组成的组:
    (i)RRMS,其中所述抗原选自由表1中列出的抗原;(ii)PPMS,其中
    所述抗原选自由表2中列出的抗原;(iii)SPMS,其中所述抗原选自由表
    3中列出的抗原;以及(iv)选自I型病变和II型病变的MS病理亚型,其
    中所述抗原选自由表4中列出的抗原。

    在其他的实施方案中,确定所述样品中的抗体对所述多种抗原的反应
    性(以及样品中的测试抗体的每一种的水平)通过如下过程进行,所述过
    程包括:

    在可形成特异性抗原-抗体复合物的条件下使该样品与包含所述多种
    抗原的抗原探针组接触,并且

    对每种抗原探针形成的抗原-抗体复合物的量进行定量??乖?抗体复
    合物的量指示该样品中的测试抗体的水平(或该样品与该抗原的反应性)。

    根据某些实施方案,本发明提供了用于鉴别诊断受试者的MS的方法,
    该方法包括:

    (a)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表1中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从健康受试者获得的对照反应性模式;

    (b)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表2中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从健康受试者获得的对照反应性模式;

    (c)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表3中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从患RRMS的受试者获得的对照反应
    性模式;

    (d)确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表4中列出的抗原组成
    的组的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,
    并且比较所述样品的反应性模式与从具有I型病变的受试者获得的对照反
    应性模式和/或与从具有II型病变的受试者获得的对照反应性模式;

    其中:

    (i)(a)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试者
    患RRMS的指示;

    (ii)(b)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试
    者患PPMS的指示;

    (iii)(c)的反应性模式与所述对照反应性模式之间的显著差异是受试者
    患SPMS的指示;以及

    (iv)(d)的反应性模式与从具有I型病变的受试者获得的对照反应性模
    式之间的显著差异是受试者患II型病变的指示,(d)的反应性模式与从具有
    II型病变的受试者获得的对照反应性模式之间的显著差异是受试者患I型
    病变的指示。

    根据一些实施方案,对于表1和表2的对照反应性模式是从健康对照
    受试者或来自健康对照受试者的一组储存数据获得。根据另一实施方案,
    对于表3的对照反应性模式是从患RRMS的受试者或来自患RRMS的受
    试者的一组储存数据获得。根据另一实施方案,本发明的方法和试剂盒的
    对照反应性模式是从患其他自身免疫疾病或退行性疾病(例如,SLE、ALD
    和AD)的受试者获得。根据另一实施方案,将样品的反应性模式与之前
    获自同一受试者的对照反应性模式(例如,作为一组储存数据而保留)进
    行比较,以监测疾病进展。应理解,对照样品和获自受试者的样品的抗体
    所有组成部分是从同一部分获得(例如,将血清对照样品的抗体所有组成
    部分与获自受试者血清的样品的抗体所有组成部分进行比较)。

    在另一实施方案中,提供了诊断有此需要的受试者的MS亚型(即,
    RRMS、PPMS、SPMS、I型病变和II型病变)的方法,所述方法包括:

    a)从受试者获得含抗体的生物样品(例如,血清);

    b)使该样品在可以形成抗原-抗体复合物的条件下与包括本文表1
    到表4中指明的多种抗原(或其免疫原性片段、类似物、衍生物和盐)的
    抗原探针组接触;并且

    c)确定所述样品的抗体特异性结合该抗原探针组的多种抗原的能
    力;

    其中在所述能力与对照样品(例如,从未患有MS的受试者获得的样
    品)的能力之间的显著差异指示该受试者患MS亚型。

    根据另一实施方案,本发明提供了诊断受试者的复发缓解型多发性硬
    化(RRMS)的方法,所述方法包括确定从该受试者获得的样品中的抗体
    对选自由表1中列出的抗原组成的组的多种抗原的反应性,从而确定该样
    品对该多种抗原的反应性模式,并且比较所述样品的反应性模式与对照反
    应性模式(例如,从健康对照获得的样品),其中在从该受试者获得的所
    述样品的反应性模式与该对照样品的反应性模式之间的显著差异是该受
    试者患RRMS的指示。

    根据另一实施方案,本发明提供了诊断受试者的原发进展型多发性硬
    化(PPMS)的方法,所述方法包括确定从该受试者获得的样品中的抗体
    对选自由表2中列出的抗原组成的组的多种抗原的反应性,从而确定该样
    品对该多种抗原的反应性模式,并且比较所述样品的反应性模式与对照反
    应性模式(例如,从健康对照获得的样品),其中在从该受试者获得的所
    述样品的反应性模式与该对照样品的反应性模式之间的显著差异是该受
    试者患PPMS的指示。

    根据另一实施方案,本发明提供了诊断受试者的继发进展型多发性硬
    化(SPMS)的方法,所述方法包括确定从该受试者获得的样品中的抗体
    对选自由表3中列出的抗原组成的组的多种抗原的反应性,从而确定该样
    品对该多种抗原的反应性模式,并且比较所述样品的反应性模式与对照反
    应性模式(例如,从患RRMS的患者获得的样品),其中在从该受试者获
    得的所述样品的反应性模式与该对照样品的反应性模式之间的显著差异
    是该受试者患SPMS的指示。

    根据另一实施方案,本发明提供了在患有MS的受试者中区别(即,
    区分)具有I型病变的受试者与具有II型病变的受试者的方法,该方法包
    括确定从受试者获得的样品中的抗体对选自由表4中列出的抗原组成的组
    的多种抗原的反应性,从而确定该样品对该多种抗原的反应性模式,并且
    比较所述样品的反应性模式与对照反应性模式。根据某些实施方案,在抗
    体对选自由15-酮胆甾烷、15a-羟基胆甾烯、神经节苷脂-GM4、四唾液酸
    神经节苷脂-GQ1B、脑L-α-溶血磷脂酰丝氨酸、乳糖基神经酰胺或160KDa
    神经微丝组成的组的多种抗原的反应性上的差异是受试者具有I型病变的
    指示,并且其中在抗体对选自由HSP60、MOG、OSP和PLP肽表位组成
    的组的多种抗原的反应性上的差异(例如,提高)是受试者具有II型病变
    的指示。在另一实施方案中,用于区别具有I型病变的受试者和具有II型
    病变的受试者的抗体选自IgM和/或IgG抗体。在特定的实施方案中,所
    有与表4中列出的抗原反应的抗体均为IgG抗体,与160kDa神经微丝反
    应的抗体除外,它为IgM抗体。

    在某些实施方案中,测试样品和对照样品可包括IgG和/或IgM抗体。
    在另一实施方案中,至少一种抗体对来自表1到表4中列出的多种抗原的
    具体抗原的反应性被上调。在另一实施方案中,至少一种抗体对具体抗原
    的反应性被下调。

    根据特定的实施方案,用于区别RRMS与健康患者的反应性模式由
    94种抗体反应性组成。根据一个实施方案,所述反应性模式由90种上调
    的反应性和4种下调的反应性组成。在另一实施方案中,从受试者获得的
    样品中的抗体为IgG抗体,其中该抗体与选自由以下组成的组的抗原反应:
    MBP?31-50;HSP70481-500;PLP?65-84;和GFAP。在另一实施方案中,
    从受试者获得的样品中的抗体为IgM抗体,其中该抗体与选自由以下组成
    的组的抗原反应:HSP70?511-530;MBP?41-60;HSP60?286-305;HSP60
    496-515;HSP70?151-170;HSP60?526-545;MBP?84-94;OSP?61-80;HSP70
    31-50;CNP?286-305;HSP60?255-275;HSP60?106-125;OSP?31-50;P2?61-80;
    MBP?11-30;HSP60?376-395;HSP70?286-305;HSP60?136-155;HSP70
    136-155;P2?46-65;OSP?136-155;P2?1-20;MOG?91-110;HSP60?361-380;
    HSP70?451-470;HSP70?210-229;HSP60?240-259;HSP60?271-290;OSP
    76-95;PLP?178-191;CNP?271-290;P2?76-95;HSP70?631-640;PLP?248-259;
    HSP60?195-214;CNP?61-80;MOG?196-215;HSP60?46-65;HSP70?195-214;
    HSP70?436-455;HSP60?166-185;MBP?104-123;MBP?71-92;PLP?180-199;
    HSP70?255-275;MOBP?166-185;CNP?240-259;HSP60?16-35;HSP60
    301-320;MOBP?151-170;CNP?91-110;HSP70?106-125;CNP?406-421;
    HSP60?421-40;HSP60?61-80;淀粉状蛋白β10-20;HSP60?511-530;乳糖
    脑苷脂;HSP70?406-425;MOG?76-95;HSP70?316-335;HSP60?225-244;
    HSP60?76-95;MOG?106-125;HSP70?466-485;CNP?1-21;HSP70?166-185;
    HSP70?121-140;淀粉状蛋白β1-42;MBP?89-101;CNP?301-320;HSP70
    1-20;MBP?51-70;HSP70?496-515;CNP?16-35;CNP?76-95;PLP?10-29;
    PLP?190-209;HSP60?346-365;HSP60?151-170;HSP70?376-395;牛MBP;
    HSP70?556-575;CNP?391-410;MOG?211-230;PLP?220-249;HSP70
    616-635;淀粉状蛋白β1-12;HSP60?556-573;和PLP?250-269。

    根据另外的实施方案,至少一种抗体对选自表1中列出的多种抗原或
    其亚组的具体抗原的反应性被上调,其中该抗原选自:HSP70?511-530、
    MBP?41-60、HSP60?286-305、HSP60?496-515、HSP70?151-170、HSP60
    526-545、MBP?84-94、OSP?61-80、HSP70?31-50、CNP?286-305、HSP60
    255-275、HSP60?106-125、OSP?31-50、P2?61-80、MBP?11-30、HSP60?376-395、
    HSP70?286-305、HSP60?136-155、HSP70?136-155、P2?46-65、OSP?136-155、
    P21-20、MOG?91-110、HSP60?361-380、HSP70?451-470、HSP70?210-229、
    HSP60?240-259、HSP60?271-290、OSP?76-95、PLP?178-191、CNP?271-290、
    P2?76-95、HSP70?631-640、PLP?248-259、HSP60?195-214、CNP?61-80、
    MOG?196-215、HSP60?46-65、HSP70?195-214、HSP70?436-455、HSP60
    166-185、MBP?104-123、MBP?71-92、PLP?180-199、HSP70?255-275、MOBP
    166-185、CNP?240-259、HSP60?16-35、HSP60?301-320、MOBP?151-170、
    CNP?91-110、HSP70?106-125、CNP?406-421、HSP60?421-40、HSP60?61-80、
    淀粉状蛋白β10-20、HSP60?511-530、乳糖脑苷脂、HSP70?406-425、MOG
    76-95、HSP70?316-335、HSP60?225-244、HSP60?76-95、MOG?106-125、
    HSP70?466-485、CNP?1-21、HSP70?166-185、HSP70?121-140、淀粉状蛋白
    β1-42、MBP?89-101、CNP?301-320、HSP70?1-20、MBP?51-70、HSP70
    496-515、CNP?16-35、CNP?76-95、PLP?10-29、PLP?190-209、HSP60?346-365、
    HSP60?151-170、HSP70?376-395、牛MBP、HSP70?556-575、CNP?391-410、
    MOG?211-230、PLP?220-249、HSP70?616-635、淀粉状蛋白β1-12、HSP60
    556-573和PLP?250-26。根据其他的实施方案,至少一种抗体对选自表1
    中列出的多种抗原或其亚组的具体抗原的反应性被下调,其中该抗原选自
    MBP?31-50、HSP70?481-500、PLP?65-84和GFAP。

    根据特定的实施方案,用于区别PPMS与健康患者的反应性模式由39
    种抗体反应性组成。在另一实施方案中,从受试者获得的样品中的抗体为
    IgG抗体,其中该抗体与选自由以下组成的组的抗原反应:PLP?215-232;
    HSP70?195-214;HSP70?166-185;牛MBP;PLP?137-150;MOG?46-65;
    CNP?406-421;P231-50;CNP?1-20;MOG?16-35;P2?76-95;HSP70?466-485;
    HSP60?76-95;MOG?151-170;P21-20;OSP?61-80;PLP?178-191;HSP70
    16-35;HSP70?121-140;和OSP?1-20。在另一实施方案中,从受试者获得
    的样品中的抗体为IgM抗体,其中该抗体与选自由以下组成的组的抗原反
    应:PLP?215-232;mMBP;smLPS;HSP70?210-229;硫酸软骨素4;牛
    MBP;神经微丝68kDa;β淀粉状蛋白;AB?1-40;PLP?161-180;PLP?40-59;
    PLP?137-150;分泌的APPα;gpMBP;MBP?104-123;SOD;CNP?1-20;
    ecLPS;和MOBP?61-80。

    根据另外的实施方案,至少一种抗体对选自表2中列出的多种抗原或
    其亚组的具体抗原的反应性被上调,其中该抗原选自β淀粉状蛋白、HSP70
    466-485、AB?1-40、PLP?161-180、PLP?40-59、PLP?137-150、HSP60?76-95、
    MOG?151-170、P2?1-20、OSP?61-80、分泌的APPα、PLP?178-191、gpMBP、
    HSP70?16-35、MBP?104-123、SOD、CNP?1-20、ecLPS、HSP70?121-140、
    MOBP?61-80和OSP?1-20。根据其他的实施方案,至少一种抗体对选自表
    2中列出的多种抗原或其亚组的具体抗原的反应性被下调,其中该抗原选
    自PLP?215-232、PLP?215-232、mMBP、HSP70?195-214、smLPS、HSP70
    210-229、硫酸软骨素4、HSP70?166-185、牛MBP、PLP?137-150、MOG?46-65、
    CNP?406-421、P2?31-50、CNP?1-20、MOG?16-35、P2?76-95和神经微丝
    68kDa。

    根据特定的实施方案,用于区别SPMS与健康患者的反应性模式由66
    种抗体反应性组成。在另一实施方案中,从受试者获得的样品中的抗体为
    IgM抗体,其中该抗体与选自由以下组成的组的抗原反应:MOG?61-80;
    HSP60?376-395;MOG?31-50;CNP?361-380;淀粉状蛋白β1-23;CNP
    346-365;HSP60?496-515;OSP?1-20;HSP60?511-530;OSP?61-80;HSP60
    286-305;CNP?240-259;HSP70?601-620;HSP60?210-229;HSP60?451-470;
    MOBP?166-185;HSP60?166-185;MBP?138-147;CNP?195-214;MBP?1-20;
    HSP60?526-545;P2?1-20;HSP70?286-305;MBP?155-178;P2?46-65;HSP60
    195-214;P2?31-50;HSP60?271-290;HSP60?136-155;CNP?286-305;HSP70
    210-229;HSP70?136-155;PLP?150-163;HSP70?166-185;HSP60?255-275;
    HSP60?16-35;牛MBP;CNP?181-199;CNP?121-140;无唾液酸神经节苷
    脂-GM2;淀粉状蛋白β1-12;OSP?121-140;分泌的APPβ;心磷脂;HSP70
    406-425;和IgM?PLP?1-19。在另一实施方案中,从受试者获得的样品中
    的抗体为IgG抗体,其中该抗体与选自由以下组成的组的抗原反应:HSP60
    361-380;淀粉状蛋白β17-40;胆固醇;淀粉状蛋白β1-42;PLP?80-99;PLP
    65-84;PLP?40-59;PLP?1-19;PLP?151-173;HSP70?421-440;huMBP;
    MOBP?16-35;CNP?16-35;RBP;HSP70?331-350;OSP?121-140;MBP
    113-132;β晶状体蛋白;CNP?240-259;和PLP?178-191。

    根据另外的实施方案,至少一种抗体对选自表3中列出的多种抗原或
    其亚组的具体抗原的反应性被上调,其中该抗原选自淀粉状蛋白β17-40、
    胆固醇、淀粉状蛋白β1-42、PLP?80-99、PLP?65-84、PLP?40-59、PLP?1-19、
    PLP?1-19、PLP?151-173、HSP70?421-440、huMBP、MOBP?16-35、CNP?16-35、
    RBP、HSP70?331-350、OSP?121-140、MBP?113-132、β晶状体蛋白、CNP
    240-259和PLP?178-191。根据其他的实施方案,至少一种抗体对选自表3
    中列出的多种抗原或其亚组的具体抗原的反应性被下调,其中该抗原选自
    MOG?61-80、HSP60?376-395、MOG?31-50、CNP?361-380、淀粉状蛋白β1-23、
    CNP?346-365、HSP60?496-515、OSP?1-20、HSP60?511-530、OSP?61-80、
    HSP60?286-305、CNP?240-259、HSP70?601-620、HSP60?210-229、HSP60
    451-470、MOBP?166-185、HSP60?166-185、MBP?138-147、CNP?195-214、
    MBP?1-20、HSP60?526-545、P21-20、HSP70?286-305、MBP?155-178、P2
    46-65、HSP60?195-214、P231-50、HSP60?271-290、HSP60?136-155、CNP
    286-305、HSP70?210-229、HSP70?136-155、PLP?150-163、HSP70?166-185、
    HSP60?255-275、HSP60?16-35、牛MBP、CNP?181-199、CNP?121-140、无
    唾液酸神经节苷脂-GM2、淀粉状蛋白β1-12、OSP?121-140、分泌的APPβ、
    心磷脂、HSP70?406-425和HSP60?361-380。

    在一些实施方案中,本发明的方法采用抗原微阵列系统将抗体的信息
    模式以信息方式表征为MS亚型的特异性生物标志,如本文详述的。

    抗体、样品和免疫测定

    抗体或免疫球蛋白包括通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻
    链,每条轻链以“Y”形构型通过二硫键与对应的重链相连。每条重链在一
    端具有可变结构域(VH),接着为若干恒定结构域(CH)。每条轻链在
    一端具有可变结构域(VL),在其另一端具有恒定结构域(CL),轻链
    可变结构域与重链的可变结构域对齐,轻链恒定结构域与重链的第一恒定
    结构域(CH1)对齐。每对轻链和重链的可变结构域形成抗原结合位点。

    重链的同种型(γ、α、δ、ε或μ)决定免疫球蛋白的类(分别为IgG、
    IgA、IgD、IgE或IgM)。轻链在所有抗体类中发现具有两种同种型之一
    (kappa,κ或lambda,λ)。

    应理解当使用术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”时,旨在
    包括完整的抗体诸如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)及其蛋白水解片段
    诸如Fab或F(ab′)2片段。本发明的范围内还包括(例如,作为免疫测定试
    剂,如本文详述)嵌合抗体、重组抗体和工程化抗体、以及它们的片段。

    包括轻链和重链的整个可变区或基本上整个可变区的示例性功能抗
    体片段定义如下:

    (i)Fv,定义为由轻链可变区和重链可变区组成的遗传工程片段,表示
    为两条链;

    (ii)单链Fv(“scFv”),包含通过适合的多肽接头连接的轻链可变区
    和重链可变区的遗传工程单链分子。

    (iii)Fab,通过如下方式获得的含有抗体分子的单价抗原结合部分的抗
    体分子片段:用酶木瓜蛋白酶处理整个抗体产生完整的轻链和由重链的可
    变结构域和CH1结构域组成的重链Fd片段;

    (iv)Fab’,通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体接着还原获得的含有抗体
    分子的单价抗原结合部分的抗体分子片段(每个抗体分子获得两个Fab’片
    段);以及

    (v)F(ab’)2,通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体获得的含有抗体分子的单
    价抗原结合部分的抗体分子片段(即,通过两个二硫键保持在一起的Fab’
    片段的二聚体)。

    如本文所用的术语“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分。
    抗原通常能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体??乖删哂幸?br />个或多个表位。以上提到的特异性反应旨在表示该抗原将以高度选择性方
    式与其对应的抗体反应而不与可能由其他抗原激发的许多其他抗体反应。
    “抗原性肽”是能够特异性结合抗体的肽。

    在另一实施方案中,可通过对特异性抗原-抗体复合物的形成进行定量
    来执行抗体特异性结合抗原探针的能力的检测。如本文所用的术语“特异性
    结合”表示抗体与抗原探针的结合不因不相关分子的存在而被竞争抑制。

    在某些实施方案中,通过确定本发明的肽特异性结合分离自受试者的
    IgG同种型抗体或在其他实施方案中IgM或IgE同种型抗体的能力来执行
    本发明的方法。

    从受试者获得适合的含抗体的生物样品的方法完全在本领域技术人
    员的能力之内。通常,适合的样品包括全血和源自全血的产物,诸如血浆
    和血清。在其他的实施方案中,可使用其他含抗体的样品,例如,CSF、
    尿和唾液样品。从测试受试者获得血清样品的非限制性实例呈现在以下的
    实施例部分中。

    依据本发明,任何适合的免疫测定可用于受试肽。这些技术是本领域
    技术人员公知的,并且被描述在许多标准的免疫学手册和教科书中。在某
    些优选的实施方案中,确定抗体特异性结合抗原探针的能力是使用基于抗
    原探针阵列的方法而进行。优选地,将阵列与适当稀释的受试者血清(例
    如,1∶10稀释)孵育以允许在该血清中包含的抗体与固定的抗原探针之
    间的特异性结合,从该阵列中洗出未结合的血清,将该洗涤后的阵列与期
    望同种型的抗体的可检测标记轭合的配体孵育,从该阵列中洗出未结合的
    标记,并且测量与每种抗原探针结合的标记的水平。

    根据一些方面,本发明的方法可使用在本发明的发明人中的一些发明
    人的WO?02/08755和U.S.2005/0260770中公开的抗原阵列来实施。WO
    02/08755涉及用于分类从而鉴定与源自需要诊断疾病或监测治疗的患者受
    试者的血清的未确定的免疫球蛋白反应的预定抗原的系统和制品?;构?br />了诊断方法和可用于这些方法的系统,这些方法和系统采用将多种抗原的
    抗原亚组分类的步骤,所述抗原亚组与源自多个患者的多种抗体反应,并
    且将受试者的抗体与得到的类相关联或去关联。本发明的发明人中的一些
    发明人的美国专利申请公布第2005/0260770号公开了抗原阵列系统及其
    诊断用途。该申请提供了在受试者诊断免疫疾病特别是1型糖尿病或免疫
    疾病倾向的方法,该方法包括确定受试者的免疫球蛋白特异性结合抗原特
    征组的每种抗原探针的能力。所述公开内容的教导以整体并入本文就如同
    在本文完全列出一样。

    在其他的实施方案中,可使用各种其他的免疫测定,包括但不限于:
    酶联免疫吸附测定(ELISA)、带有多重微珠的流式细胞术(诸如由Luminex
    制造的系统)、表面等离子体共振(SPR)、椭圆光度法,以及采用例如
    激光扫描、光检测、借助光电倍增管的光子检测、用基于数码相机的系统
    或视频系统摄影、辐射计数、荧光检测、电子检测、磁性检测和允许定量
    测量抗原-抗体结合的任何其他系统的多种其他的免疫测定法。

    已研制了多种方法用于制备适合于本发明的方法的阵列。现有技术方
    法包括使用机器人装置将含有抗原探针的不同溶液施加或“点”至平面支持
    体表面上的紧密间隔的特定的可寻址位置,所述平面支持体通常为玻璃支
    持体,诸如显微镜载玻片,随后通过适合的热处理和/或化学处理对该平面
    支持体进行处理以使抗原探针附着于该支持体的表面。便利地,首先通过
    化学处理活化玻璃表面,所述化学处理在表面上留下一层反应性基团诸如
    环氧基团,该反应性基团共价地结合含有游离的胺或硫醇基团的任何分
    子。适合的支持体还可以包括硅、硝酸纤维素、纸、纤维素支持体等等。

    优选地,将附着于阵列的特定可寻址位置的本发明的每种抗原探针或
    抗原探针的不同亚组独立地附着于该阵列的至少两个、更优选至少三个单
    独的特定可寻址位置以便使得能够产生统计学上稳健的数据。

    除了本发明的抗原探针以外,阵列可有利地包括对照抗原探针或其他
    标准化学品。这些对照抗原探针可包括标准化对照探针。从标准化对照探
    针获得的信号为结合条件、标记强度、“读取”效率和可引起给定的结合抗
    体-探针配体相互作用的信号改变的其他因素的变化提供对照。例如,将从
    抗原探针阵列的所有其他抗原探针读取的信号诸如荧光强度除以来自标
    准化对照探针的信号(例如,荧光强度),从而使测量结果标准化。标准
    化对照探针能够与抗原探针阵列上的多个可寻址位置结合来控制抗体-配
    体探针效率的空间变化。优选地,标准化对照探针位于阵列的角或边缘来
    控制边缘效应,以及位于阵列的中间。

    标记的抗体配体可以为多种适合的抗体配体类型中的任何一种。优选
    地,抗体配体为能够特异性结合所用的受试者的抗体的Fc部分的抗体。
    例如,在受试者的抗体为IgM同种型时,抗体配体优选为能够特异性结合
    受试者的IgM抗体的Fc部分的抗体。

    受试者的抗体的配体可与各种可检测标记类型中的任何一种轭合。优
    选地,标记为荧光团,最优选为Cy3??裳〉?,荧光团可以为各种荧光团
    中的任何一种,包括Cy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、
    若丹明、德克萨斯红等等。对特定的同种型抗体具有特异性的适合的荧光
    团轭合的抗体可广泛地购自商业供应商,其生产方法已充分地建立。

    取决于应用和目的,可以分离受试者的抗体以用于以各种方法中的任
    何一种分析其抗原探针结合能力。尽管受试者的抗体可以适当地且便利地
    以血清或血浆形式或血清和血浆的稀释形式(例如,1∶10稀释),但在
    测试抗体特异性结合抗原探针的能力之前可对抗体进行任何期望程度的
    纯化??墒褂檬苁哉叩恼隹固寤虬固蹇杀淝氖苁哉叩目固迤卫?br />实施本发明的方法。

    数据分析

    有利地,本发明的方法可采取学习与模式识别分析仪的使用、聚类算
    法等等,以便区别患有MS亚型的患者的反应性模式与对照受试者的反应
    性模式。例如,所述方法可包括确定测试样品中的抗体对多种抗原的反应
    性,并且利用这些算法和/或分析仪比较得到的模式与阴性对照和阳性对照
    样品的反应性模式。

    在某些实施方案中,一种或多种算法或计算机程序可用于对照预设截
    断值(cutoff)(或对照若干预设截断值)来比较测试样品中量化的每种抗
    体的量??裳〉?,可提供用于人们手动执行必要步骤的一种或多种说明。

    用于确定和比较模式分析的算法包括但不限于:主成分分析、Fischer
    线性分析、神经网络算法、遗传算法、模糊逻辑模式识别等等。在完成分析
    后,得到的信息可以例如展示在显示器上,传递至主计算机,或者储存在储
    存设备上用于后面的检索。

    这些算法中许多为基于神经网络的算法。神经网络具有输入层、处理
    层和输出层。神经网络中的信息被分布遍及处理层。处理层由结点(node)
    组成,通过其结点互连来模拟神经元。与揭示数据收集中的潜在模式
    (underlying?pattern)的统计分析相似,神经网络基于预设标准对数据收集
    中的一致模式(consistent?pattern)定位。

    适合的模式识别算法包括但不限于:主成分分析(PCA)、Fisher线性
    判别分析(FLDA)、簇类独立软模式法(soft?independent?modeling?of?class?
    analogy,SIMCA)、K近邻法(KNN)、神经网络、遗传算法、模糊逻辑
    以及其他模式识别算法。在一些实施方案中,使用Fisher线性判别分析
    (FLDA)和典型判别分析(CDA)及其组合来比较输出签名(output?signature)
    与来自数据库的可用数据。

    在其他的实施方案中,使用主成分分析。主成分分析(PCA)包括将若
    干相关变量转化成少量不相关变量的数学方法。少量不相关变量称为主成
    分。第一主成分或特征向量尽可能多地解释数据变化性,每个后继成分尽可
    能多地解释余下变化性。PCA的主要目标是减少数据集的维度并且鉴定新
    的潜在变量(underlying?variable)。

    主成分分析以分层方式比较两个或多个协方差矩阵的结构。例如,除
    了一个矩阵的每个元素乘以单个常数以外,该矩阵可与另一个矩阵相同。
    这些矩阵因此彼此成比例。更具体地说,这些矩阵共有相同的特征向量(或
    主成分),但它们的特征值的差别在于常数。矩阵之间的另一种关系是它
    们拥有共同的主成分,但是它们的特征值不同。在主成分分析中使用的数
    学方法被称作特征分析(eigenanalysis)。与最大的特征值相关的特征向量
    具有与第一主成分相同的方向。与第二大特征值相关的特征向量决定第二
    主成分的方向。特征值之和等于方阵的迹(trace)并且特征向量的最大数
    目等于这个矩阵的行数。

    在另一个实施方案中,算法为分类法。一种类型的分类法是通过用来
    自训练集的数据“训练”算法而创建,并且它的表现用测试集数据评估。与
    本发明一起使用的分类法的实例为判别分析、决策树分析、受试者工作曲
    线(receiver?operator?curve)或裂区及评分分析(split?and?score?analysis)。

    术语“决策树”是指分类采用的具有流程图样树结构的分类法。决策树
    由成为子集的数据集的重复裂区组成。每个裂区由应用至一个变量的简单
    规则组成,例如,“如果“变量1”的值大于“阈值1”;那么向左走,否则向
    右走”。因此,给定的特征空间被划分成一组矩形,其中每个矩形被指定为
    一类。

    术语“测试集”或“未知集”或“验证集(validation?set)”是指由未包括在
    训练集中的那些输入条目(entry)组成的整个可用数据集的子集。应用测
    试数据来评估分类法表现。

    术语“训练集”或“已知集(known?set)”或“参考集”是指相应整个可用
    数据集的子集。这种子集通常被随机选择,并且只用于分类法构建的目的。

    有利地,区别患有MS形式(例如,亚型)的患者与对照个体(例如,
    健康个体或患另一MS形式的个体)在多维空间中进行。例如,用由本文
    表1中列出的抗原组成的抗原阵列进行的诊断测试在94维中进行。便利
    地,通过将空间划分成患者特征性的区域来进行这种分析,并且一个分析
    用于对照个体,如以下举例说明的。

    提供以下实施例以便更完整地阐述本发明的一些实施方案。然而,不
    应以任何方式将它们解释为限制本发明的宽范围。

    实施例

    程序

    ELISA

    将抗原(对于蛋白来说在磷酸盐缓冲盐水中1mg/ml,对于脂质来说
    在乙醇中5mg/ml)包被在96孔Maxisorp?ELISA板(NalgeNunc,Rochester,
    NY)中,并且按照描述进行ELISA(Quintana等人,J?Autoimmun?21,65-75,
    2003)。

    抗原微阵列芯片

    将稀释于PBS中的抗原以0.1-1mg/ml浓度放在384孔板中。使用具
    有0.2mm直径的固体点样针的机器人MicroGrid阵列器(arrayer)
    (BioRobotics,Cambridge,U.K.)将抗原点到ArrayIt?SuperEpoxi微阵列
    基质载玻片上(TeleChem,Sunnyvale,CA)。每种抗原以三个或四个重
    复点样。将点样的微阵列储存于4℃。

    用PBS洗涤芯片,用1%?BSA在37℃封闭1h,并且将其在湿环境中
    的盖玻片之下与封闭缓冲液中1∶10稀释的测试血清在37℃孵育2小时。
    然后洗涤阵列并将其与山羊抗人IgG?Cy3轭合的抗体和与Cy5轭合的山羊
    抗人IgM(两种抗体均购自Jackson?ImmunoResearch,West?Grove,PA)
    的1∶500稀释的混合物在37℃孵育45min。用ScanArray?4000×扫描仪(GSI?
    Luminomics,Billerica,Massachusetts,USA)扫描阵列,分别记录IgM和
    IgG的结果。将结果记录为TIFF文件。

    图像和数据处理

    通过使用直方图分割来鉴定TIFF文件中每个斑点包含的像素和局部
    背景。将每个斑点的强度及其局部背景计算为对应像素强度的平均值。含
    有抗原的斑点均未显示饱和。通过目视检查鉴定技术上有缺陷的斑点并将
    其从数据集中移除。对于每个斑点来说,从斑点强度中减去局部背景强度。
    将具有负强度的斑点从数据集中除去。

    强度以2为底的log转换在所有强度水平产生适当恒定的变化性。将
    每种抗原的log强度计算为每个载玻片上重复样品的log强度的平均值。
    在每个阵列上的重复样品之间的变化性的系数在10%以下。为了消除阵列
    之间强度的总体差异,通过减去阵列上所有抗原的平均log强度的中位数
    来换算每个阵列上的每种抗原的平均log强度?;凰愕目乖骄鵯og强度
    表示抗原的反应性。

    使用Gene?Spring软件(Silicon?Genetics,Redwood?City,CA)对原始
    数据进行标准化并分析。将抗原反应性定义为与微阵列上该抗原的重复样
    品结合的平均强度。使用具有0.05(分析RRMS和PPMS样品)或0.2(分
    析免疫病理学I型和II型样品)错误发现率的Benjamini和Hochberg的方
    法,用非参数的Wilcoxon-Mann-Whitney测试分析数据以确定显著性。在
    训练集中的留一交叉验证分析(LOOCV)和对测试集样品的分类使用支持
    向量机来执行,该支持向量机基于对训练集被鉴定为区别性的抗体反应性
    对样品进行分类。

    患者和血清样品

    在Partners?MS?Center从临床缓解过程中的未治疗的RRMS、PPMS患者
    或HC中收集血清样品。这些患者没有呈现出患有其他自身免疫疾患。从属
    于MS病变项目(MSLP)的780个中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病(CNS?IDD)
    活组织检查病例的原始同期群组中鉴定患有活组织检查证明的CNS炎性脱
    髓鞘疾病的六十二位患者。MSLP数据库由具有详细的病理材料、临床材
    料、成像材料和血清学材料的活组织检查证明的CNS?IDD病例的独特集合
    组成(NMSS?RG3184-B-3-02)?;谥肮嫉谋曜?,将活动性的脱髓鞘
    病变分为I型或II型(Lucchinetti等人,2000)。在随访时对所有包括的患者
    获得血清和面对面神经学评价。在塞维利亚大学医学院的大学医院
    (University?Hospital,School?of?Medicine,University?of?Sevilla)从具有证实
    的鞘内IgG分泌和IgG寡克隆条带的RRMS患者中收集成对的CSF和血清样
    品?;颊?、病理同期群组和健康对照的临床特征列在本文下面的表6中。
    对照样品对于年龄、性别和种族而言是成对匹配的。

    表6-患者和健康对照(HC)的特征


    如本文所用“EDSS”是指Kurtzke扩展的残疾状态量表(Kurtzke?
    Expanded?Disability?Status?Scale,EDSS),它在本领域中已知是用于对多
    发性硬化中的残疾进行定量的方法。EDSS对八个功能系统(即,锥体系
    统、小脑系统、脑干系统、感觉系统、肠和膀胱系统、视觉系统、大脑系
    统和其他系统)中的残疾进行定量,并且允许神经学家指定每个系统中的
    功能系统评分。EDSS等级1.0到4.5是指完全能行走的患有MS的人。EDSS
    等级5.0到9.5界定行走受损。

    来自阿尔兹海默病患者的血清样品和CSF样品由马萨诸塞州,波士顿,
    哈佛医学院,布莱根妇女医院,神经病学中心(Center?for?Neurologic?
    Diseases,Brigham?and?Women’s?Hospital,Harvard?Medical?School,Boston,
    MA)的Denis?Selkoe博士提供。来自SLE患者的血清样品由马萨诸塞州,
    波士顿,布莱根妇女医院,风湿病学/免疫学系的Peter?H.Schur博士提供。

    采集样品如下:将血液样品采集到无菌测试管中,通过将测试管放在
    室温30分钟使血液样品凝固。接下来,将试管以2000g离心15分钟。将
    液相转移至新的测试管中,分成等份并储存于≤-20℃。

    抗原

    在哈佛医学院(HMS)的生物化学与分子药理学系的生物聚合物实验
    室合成肽。重组蛋白和脂质从以下来源购买:Sigma(St.Louis,MO,USA)、
    Abnova(Taipei?City,Taiwan)、Matreya?LLC(Pleasant?Gap,PA,USA)、
    Avanti?Polar?Lipids(Alabaster,AL,USA)、Calbiochem(San?Diego,CA,
    USA)、Chemicon(Temecula,CA,USA)、GeneTex(San?Antonio,TX,
    USA)、Novus?Biologicals(Littleton,CO,USA)、Assay?Designs(Ann?Arbor,
    MI,USA)、ProSci?Inc.(Poway,CA,USA)、EMD?Biosciences(San?Diego,
    CA,USA)、Cayman?Chemical(Ann?Arbor,MI,USA)、HyTest(Turku,
    Finland)、Meridian?Life?Science(Memphis,TN?USA)和Biodesign?
    International(Saco,ME,USA)。

    在抗原微阵列的构建中使用的抗原如下:热休克蛋白27kDa(HSP27)、
    HSP32、HSP40、HSP47、HSP60、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)HSP65、
    HSP70、结核分枝杆菌HSP71、HSP90和GroEL(全部购自Stressgen);
    由氨基酸106-125、1-20、121-140、136-155、151-170、16-35、166-185、
    181-199、195-214、210-229、225-244、240-259、255-275、271-290、
    286-305、301-320、31-50、316-335、331-350、346-365、361-380、376-395、
    391-410、406-425、421-440、436-455、451-470、466-485、46-65、481-500、
    496-515、511-530、526-545、541-560、556-573、61-80、76-95和91-110
    组成的HSP60肽(全部在HMS生物聚合物实验室合成);由氨基酸
    106-125、1-20、121-140、136-155、151-170、16-35、166-185、181-199、
    195-214、210-229、225-244、240-259、255-275、271-290、286-305、
    301-320、31-50、316-335、331-350、346-365、361-380、376-395、391-410、
    406-425、421-440、436-455、451-470、466-485、46-65、481-500、496-515、
    511-530、526-545、541-560、556-575、571-590、586-605、601-620、616-635、
    61-80、631-640、76-95和91-110组成的HSP70肽(全部在HMS生物聚
    合物实验室合成)。

    由氨基酸106-125、1-20、121-140、136-155、151-170、16-35、166-185、
    181-200、195-215、211-230、226-245、241-260、256-275、271-290、286-305、
    301-320、31-50、316-335、331-350、346-365、361-380、376-395、391-410、
    406-421、46-65、61-80、76-95和91-110组成的CNS蛋白2′,3′-环核苷酸
    3′-磷酸二酯酶肽(CNP)(全部在HMS生物聚合物实验室合成);乙酰胆
    碱酯酶、ADAM-10、β-晶状体蛋白、牛髓鞘碱性蛋白、脑提取物I、脑提
    取物II、脑提取物III、豚鼠髓鞘碱性蛋白、人髓鞘碱性蛋白(全部购自Sigma?
    Aldrich);α-晶状体蛋白(购自Stressgen);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(购
    自Research?Diagnostic);由氨基酸106-125、1-20、121-140、136-155、
    151-170、16-35、166-185、181-200、31-50、46-65、61-80、76-95和
    91-110组成的髓鞘相关的少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)肽(全部在
    HMS生物聚合物实验室合成);由氨基酸106-125、1-20、121-140、136-155、
    151-170、16-35、166-185、181-200、196-215、211-230、226-247、31-50、
    35-55、46-65、61-80、76-95和91-110组成的髓鞘/少突胶质细胞糖蛋白
    (MOG)肽(全部在HMS生物聚合物实验室合成);鼠髓鞘碱性蛋白
    (mMBP)和髓鞘相关糖蛋白(购自Sigma?Aldrich);由氨基酸104-123、
    11-30、113-132、1-20、121-138、124-142、138-147、141-161、143-168、
    155-178、26-35、31-50、41-60、51-70、61-80、71-92、84-94、89-101和
    93-112组成的髓鞘碱性蛋白(MBP)肽(全部在HMS生物聚合物实验室
    合成);由氨基酸106-125、1-20、121-132、16-35、31-50、46-65、61-80、
    76-95和91-110组成的髓鞘蛋白2(P2)肽(在HMS生物聚合物实验室
    合成);神经微丝160kd、神经微丝200kd、神经微丝68kd(全部购自
    Chemicon);神经元烯醇化酶(购自Calbiochem);Nicastrin(购自GeneTex);
    NMDA受体(购自Novus?Biologicals);NOGO(购自Sigma?Aldrich);由
    氨基酸106-125、1-20、121-140、136-155、151-170、16-35、166-185、
    181-199、195-217、31-50、46-65、61-80、76-95和91-110组成的少突
    胶质细胞特异性蛋白(OSP)肽(全部在HMS生物聚合物实验室合成);
    蛋白脂质蛋白(Abnova);由氨基酸100-119、10-29、110-129、1-19、125-141、
    137-150、137-154、150-163、151-173、158-166、161-180、178-191、180-199、
    190-209、20-39、205-220、215-232、220-239、220-249、248-259、250-269、
    265-277、35-50、40-59、50-69、65-84、80-99和91-110组成的蛋白脂质
    蛋白肽(全部在HMS生物聚合物实验室合成);视黄醇结合蛋白、超氧化
    物歧化酶、β突触核蛋白、γ突触核蛋白(Sigma?Aldrich);和S100β蛋白(Assay?
    Designs)。

    组织抗原(购自ProSci?Inc.):杏仁核、杏仁核AD、脑裂解物、脑组
    织膜、小脑脚、大脑脑膜、脑胼胝体、脑胼胝体AD、间脑、胎脑、额叶、
    额叶AD、海马、海马AD、岛叶、枕叶、枕叶AD、嗅区、视神经、顶叶、
    顶叶AD、脑桥、脑桥AD、中央后回、中央后回AD、中央前回、中央前
    回AD、脊髓、颞叶、颞叶AD、丘脑和丘脑AD。

    AD相关抗原:淀粉状蛋白β(AB)、AB?10-20、AB?1-12、AB?12-28、
    AB?1-23、AB?1-38、AB?17-40、AB?25-35、AB?34-42、淀粉状蛋白bri蛋白
    前体227、淀粉状蛋白DAN蛋白片段1-34、淀粉状蛋白前体蛋白、无AB
    组分的淀粉状蛋白、分泌的淀粉状蛋白前体蛋白(SAP)β、Tau同种型变
    体0N3R、Tau同种型变体1N3R、Tau同种型变体0N4R、Tau同种型变体
    2N3R、Tau?phospho?Ser412、Tau?phospho?Ser441和Tau?phospho?Thr181(全
    部购自Sigma?Aldrich);以及人Tau蛋白(购自EMD?Biosciences)。

    脂质抗原:1棕榈酰-2-(5′氧代-戊?;?-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、15a-羟
    基胆甾烯、15-酮胆甾烷、15-酮胆甾烯、1-棕榈酰-2-(9′氧代-壬酰)-sn-甘油
    基-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-壬二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰-2-戊
    二酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、5α-胆甾烷-3β,15α-二醇、脑神经酰胺、脑D-
    赤鞘氨醇、脑溶血磷脂酰乙醇胺、脑L-α-溶血磷脂酰丝氨酸、脑L-α-磷脂
    酰胆碱、脑L-α-磷脂酰-乙醇胺、脑L-α-磷脂酰丝氨酸、脑极性脂质提取物、
    脑鞘磷脂、脑硫脂、脑总脂质提取物、无唾液酸神经节四糖基神经酰胺
    -GM1、总脑神经节苷脂和总脑苷脂(全部购自Avanti?Polar?Lipids);
    9(S)-HODE、(±)9-HODE、异前列腺素(Isoprostane)F2I(Cayman?Chemical);
    无唾液酸神经节苷脂-GM1、无唾液酸神经节苷脂-GM2、心磷脂、神经酰
    胺、神经酰胺1-磷酸、胆固醇、二唾液酸神经节苷脂-GD1B、二唾液酸神
    经节苷脂-GD2、二唾液酸神经节苷脂GD1a、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂
    混合物、HDL、二十六烷酸(26)、羟基脂肪酸神经酰胺、乳糖脑苷脂、
    LDL、来自肠道沙门氏菌(Salmonella?enterica)的二磷酰类脂A、来自大
    肠杆菌(Escherichia?coli)的脂多糖、来自铜绿假单胞菌(Pseudomona?
    aeruginosa)的脂多糖、来自肠道沙门氏菌的脂多糖、单唾液酸神经节苷脂
    GM1、单唾液酸神经节苷脂GM2、N-己?;?D-鞘氨醇、无羟基脂肪酸神
    经酰胺、磷脂酰肌醇-4磷酸、角鲨烯、硫脂、二十四烷酸(24)、TNPAL
    半乳糖脑苷脂和三唾液酸神经节苷脂-GT1B(Sigma?Aldrich);二唾液酸神
    经节苷脂GD3和三唾液酸神经节苷脂GT1a(HyTest);岩藻糖基-GM1、
    神经节苷脂-GM4、乳糖基神经酰胺、溶血-GM1和四唾液酸神经节苷脂
    -GQ1B(Calbiochem);和单唾液酸神经节苷脂GM3(全部购自Meridian)。

    实施例1

    检测MS中的特异性微阵列自身抗体的条件

    使用362种髓鞘和炎症相关抗原(本文在以上列出)构建抗原微阵列,
    所述抗原包括怀疑与MS相关的CNS抗原、怀疑与其他神经疾病相关的
    CNS抗原以及热休克蛋白(HSP)。按之前所述(Quintana等人,2004),
    使用机器人阵列器将抗原点在环氧玻璃载玻片上。

    将抗原微阵列技术的灵敏性与使用商购的针对CNS、HSP和脂质抗原
    的单克隆抗体和多克隆抗体的标准ELISA技术的灵敏性进行比较??乖?br />阵列在log10稀释度检测抗原反应性,比通过使用ELISA方法检测的反应
    性大1-2个log值(表7)。因此,抗原微阵列表现为比标准ELISA测定
    更灵敏。

    表7-抗原微阵列与ELISA的比较



    为了确定哪个血清稀释度对调查MS的免疫特征标记是最佳的,对于
    IgG和IgM抗体以1∶10、1∶100和1∶1000的稀释度分析健康对照(HC)
    和RRMS受试者的反应性。如图1A所示,在MS中,相比于1∶100和1∶
    1000,在1∶10时对CNS抗原、脂质和热休克蛋白(HSP)的平均IgG抗
    体反应性最高,在1∶1000观察到最小反应性(P<0.0001,双因素
    ANOVA)。在1∶10稀释度时平均IgG反应性在HC中也是最高的(P<
    0.0001,双因素ANOVA),但是这种反应性比MS受试者中表现的反应
    性小(对CNS抗原、脂质和热休克蛋白分别为P<0.001、P<0.001和P<
    0.05,双因素ANOVA);实际上,在1∶100和1∶1000的稀释度,在
    MS与HC的IgG反应性量值之间没有差异。对照中的IgM反应性如果不
    比MS受试者中的IgM反应性高的话,就与其一样高(图1B)。这与如
    下观察结果一致:健康人出生时带有针对髓鞘抗原和热休克蛋白的IgM自
    身抗体(Merbl等人,2007,J?Clin?Invest?117,712-8)。因为MS受试者在1∶
    10稀释度表现出显著升高的血清IgG自身抗体,所以使用这个稀释度研究
    抗原微阵列的血清抗体模式。

    为了确认在1∶10稀释度检测的反应性是特异性的,进行抑制实验,
    该实验显示针对抗原阵列上的PLP261-277的反应性可受血清与过量未结合
    的PLP261-277预孵育抑制,但不受血清与对照肽HSP601-20预孵育抑制(图
    1C)。

    实施例2

    自身抗体模式分析鉴定RRMS的免疫特征标记

    为了调查是否能鉴定RRMS中的独特的抗体特征标记,对38位患有
    RRMS的患者和30位健康对照(HC)受试者中的抗体所有组成部分进行
    研究。将样品分派到训练集(24个RRMS和20个对照)和随机选择的测
    试集(14个RRMS和10个对照)中。使用训练集来确定是否可以鉴定能
    够区别RRMS与对照样品的抗体反应性模式。如果发现这些模式,就将它
    们对测试集验证。使用Wilcoxon-Mann-Whitney测试分析训练集;使用
    Benjamini和Hochberg的方法控制错误发现率(Cohen,I.R.,2007,Nat?Rev?
    Immunol.7,569-74)。在表6中列出了患者和HC的临床特征。

    如图2A中的热图所示,鉴定了区分RRMS与HC的反应性模式(P<
    0.0001,Fisher精确检验)。图2A所示的热图中包括的抗体反应性在此列
    出(以与热图中相同的次序,即,从上到下):IgG_MBP?31-50;IgG_HSP70
    481-500;IgG_PLP?65-84;IgG_GFAP;IgM_HSP70?511-530;IgM_MBP
    41-60;IgM_HSP60?286-305;IgM_HSP60?496-515;IgM_HSP70?151-170;
    IgM_HSP60?526-545;IgM_MBP?84-94;IgM_OSP?61-80;IgM_HSP70?31-50;
    IgM_CNP?286-305;IgM_HSP60?255-275;IgM_HSP60?106-125;IgM_OSP
    31-50;IgM_P2?61-80;IgM_MBP?11-30;IgM_HSP60?376-395;IgM_HSP70
    286-305;IgM_HSP60?136-155;IgM_HSP70?136-155;IgM_P2?46-65;
    IgM_OSP?136-155;IgM_P21-20;IgM_MOG?91-110;IgM_HSP60?361-380;
    IgM_HSP70?451-470;IgM_HSP70?210-229;IgM_HSP60?240-259;
    IgM_HSP60?271-290;IgM_OSP?76-95;IgM_PLP?178-191;IgM_CNP
    271-290;IgM_P2?76-95;IgM_HSP70?631-640;IgM_PLP?248-259;
    IgM_HSP60?195-214;IgM_CNP?61-80;IgM_MOG?196-215;IgM_HSP60
    46-65;IgM_HSP70?195-214;IgM_HSP70?436-455;IgM_HSP60?166-185;
    IgM_MBP?104-123;IgM_MBP?71-92;IgM_PLP?180-199;IgM_HSP70
    255-275;IgM_MOBP?166-185;IgM_CNP?240-259;IgM_HSP60?16-35;
    IgM_HSP60?301-320;IgM_MOBP?151-170;IgM_CNP?91-110;IgM_HSP70
    106-125;IgM_CNP?406-421;IgM_HSP60?421-40;IgM_HSP60?61-80;IgM_
    淀粉状蛋白β10-20;IgM_HSP60?511-530;IgM乳糖脑苷脂;IgM_HSP70
    406-425;IgM_MOG?76-95;IgM_HSP70?316-335;IgM_HSP60?225-244;
    IgM_HSP60?76-95;IgM_MOG?106-125;IgM_HSP70?466-485;IgM_CNP
    1-21;IgM_HSP70?166-185;IgM_HSP70?121-140;IgM淀粉状蛋白β1-42;
    IgM_MBP?89-101;IgM_CNP?301-320;IgM_HSP70?1-20;IgM_MBP?51-70;
    IgM_HSP70?496-515;IgM_CNP?16-35;IgM_CNP?76-95;IgM_PLP?10-29;
    IgM_PLP?190-209;IgM_HSP60?346-365;IgM?HSP60?151-170;IgM_HSP70
    376-395;IgM牛MBP;IgM_HSP70?556-575;IgM_CNP?391-410;IgM_MOG
    211-230;IgM_PLP?220-249;IgM_HSP70?616-635;IgM淀粉状蛋白β1-12;
    IgM_HSP60?556-573;和IgM_PLP?250-269。

    这种模式由94种抗体反应性组成。在这94种模式中,相比于对照
    (HC),在MS中90种被上调,4种被下调。因此,RRMS与特定自身
    反应性的获得和缺失有关。在上调的反应性中,50%为与CNS抗原的肽结
    合的IgM抗体,49%为与热休克蛋白的肽结合的IgM抗体。在1∶100或
    1∶1000的稀释度没有观察到区别MS与对照的能力。

    为了验证图2A中所示的区别性的模式,在训练集中进行留一交叉验
    证分析(LOOCV)(Stekel,D.,2003,Microarray?Bioinformatics(微阵列生
    物信息学),Cambridge?University?Press,Cambridge),然后对测试集验证
    该分析。对于训练集中的LOOCV来说,计算真实(正确)分类和错误(不
    正确)分类的数目来估计训练集中的成功率、阳性预测值(PPV)、阴性
    预测值(NPV)。LOOCV揭示了阳性预测值(PPV)-定义为RRMS患
    者按其抗原微阵列反应性被鉴定为RRMS的分数-为0.75,以及阴性预
    测值(NPV)-定义为HC按其抗原微阵列反应性被鉴定为HC的分数-
    为0.90;成功率为0.83(P<0.0001)。最严密的验证是测试训练集中鉴定
    的模式以确定它们是否能够在测试集中区别MS受试者与HC。类似地,
    在训练集中鉴定的模式能够以0.85的PPV、0.80的NPV且以0.83的成功
    率(P=0.004,Fisher精确检验)对测试集的样品分类。

    为了进一步验证这些发现,对从西班牙塞维利亚大学获得的51位未
    治疗的RRMS进行分析以确定使用来自另一机构和地理区域的独立同期
    群组的样品是否可以区分RRMS与HC。鉴定的模式能够在这个独立的同
    期群组中以0.69的成功率、0.73的PPV和0.58的NPV(P=0.01,Fisher
    精确检验)区别RRMS与HC。

    作为在MS中检测的模式的特异性对照,调查了来自患有系统性红斑
    狼疮(SLE)、肾上腺脑白质营养不良(ALD)和阿尔兹海默病(AD)的
    患者的血清。SLE为以针对宽范围的自身抗原的循环抗体为特征的慢性自
    身免疫疾病。ALD为退行性疾患,其特征为极长链脂肪酸的积累和与MS
    共有特征的CNS神经炎症过程。AD不被认为是自身免疫疾??;然而,已
    报道了对β-淀粉状蛋白来源的肽的免疫应答。显著地,在抗原微阵列上检
    测的抗体模式区别RRMS与SLE、ALD和AD样品(P<0.0001,Fisher
    精确检验)。

    实施例3

    自身抗体模式分析鉴定PPMS的免疫特征标记

    PPMS具有不同于RRMS的临床过程,并且已表明PPMS可能包括不
    同于RRMS的疾病机制(Miller?&?Leary,2007,Lancet?Neurol.6,903-12)。
    研究了训练集中的24位PPMS以及25位年龄和性别匹配的HC,以及测
    试集样品中的13位PPMS和12位对照。

    图2B所示的热图中包括的抗体反应性在此列出(以与热图中相同的
    次序,即,从上到下):IgM_PLP?215-232;IgG_PLP?215-232;IgM_mMBP;
    IgG_HSP70?195-214;IgM_smLPS;IgM_HSP70?210-229;IgM_硫酸软骨素
    4;IgG_HSP70166-185;IgG_牛MBP;IgM_牛MBP;IgG_PLP?137-150;
    IgG_MOG?46-65;IgG_CNP?406-421;IgG_P231-50;IgG_CNP?1-20;
    IgG_MOG?16-35;IgG_P2?76-95;IgM_神经微丝68kDa;IgM_β淀粉状蛋
    白;IgG_HSP70?466-485;IgM_AB?1-40;IgM_PLP?161-180;IgM_PLP?40-59;
    IgM_PLP?137-150;IgG_HSP6076-95;IgG_MOG?151-170;IgG_P21-20;
    IgG_OSP?61-80;IgM_分泌的APPα;IgG_PLP?178-191;IgM_gpMBP;
    IgG_HSP70?16-35;IgM_MBP?104-123;IgM_SOD;IgM_CNP?1-20;
    IgM_ecLPS;IgG_HSP70?121-140;IgM_MOBP?61-80;和IgG_OSP?1-20。

    热图(图2B)显示了抗体反应性通过了显著性检验并且能够在训练集
    (P<0.0001,Fisher精确检验)和测试集(P<0.01,Fisher精确检验)中
    区别PPMS和HC。学习集的LOOCV揭示86%的总效率,PPV=0.87并
    且NPV=0.85。测试集的效率为72%;PPV=0.79且NPV=0.75。正如
    RRMS一样,抗原微阵列能够在1∶10稀释度区别PPMS与对照受试者,
    但在1∶100或1∶1000的稀释度不能。此外,正如RRMS一样,抗原微
    阵列分析区别PPMS与其他疾病(SLE、ALD、AD;P<0.001,Fisher精
    确检验)。

    在PPMS中区别性的反应性是IgG(51%)和IgM(49%)并且主要
    是针对CNS抗原(图2B-2D)。PPMS免疫特征标记中的CNS抗原不同
    于RRMS特征标记中的那些CNS抗原。RRMS?CNS特征标记命名为CNS1,
    PPMS?CNS特征标记命名为CNS2(图2H和表8)。RRMS与PPMS的进
    一步比较揭示了在RRMS中针对HSP60或HSP70的明显反应性,在PPMS
    中没有观察到这种反应性(图2A-2D)。此外,在PPMS中46%区别性的
    反应性由与HC相比在PPMS中减少的抗体组成,而在RRMS中仅4%区
    别性的抗体与HC相比减少(图2B-2D及表8和表9)。在区别PPMS与
    HC的反应性和区别RRMS与HC的反应性之间只有微小重叠。这一发现
    与如下观点相容:在这两种MS形式中发生不同的免疫过程(Miller?&
    Leary,2007)。

    实施例4

    自身抗体模式分析鉴定SPMS的免疫特征标记

    大约50%的RRMS患者变为进展型的(SPMS)。尽管对转变成SPMS
    所牵涉的机制没有达成共识,几项研究表明炎症应答的本质改变和神经变
    性过程的出现发生在MS的继发进展阶段。已经鉴定了RRMS中的自身抗
    体特征标记,其由对HSP增加的反应性和对CNS抗原的独特反应性模式
    (CNS1)组成,通过比较37份RRMS样品与30份SPMS样品中的抗体
    反应性研究了与SPMS相关的抗体特征标记(图2E)。

    图2E所示的热图中包括的抗体反应性在此列出(以与热图中相同的
    次序,即,从上到下):IgM_MOG?61-80;IgM_HSP60376-395;IgM_MOG
    31-50;IgM_CNP?361-380;IgM_淀粉状蛋白β1-23;IgM_CNP?346-365;
    IgM_HSP60496-515;IgM_OSP?1-20;IgM_HSP60511-530;IgM_OSP
    61-80;IgM_HSP60?286-305;IgM_CNP?240-259;IgM_HSP70?601-620;
    IgM_HSP60?210-229;IgM_HSP60?451-470;IgM_MOBP?166-185;
    IgM_HSP60?166-185;IgM_MBP?138-147;IgM_CNP?195-214;IgM_MBP
    1-20;IgM_HSP60?526-545;IgM_P21-20;IgM_HSP70?286-305;IgM_MBP
    155-178;IgM_P2?46-65;IgM_HSP60?195-214;IgM_P2?31-50;IgM_HSP60
    271-290;IgM_HSP60?136-155;IgM_CNP?286-305;IgM_HSP70?210-229;
    IgM_HSP70?136-155;IgM_PLP?150-163;IgM_HSP70?166-185;IgM_HSP60
    255-275;IgM_HSP60?16-35;IgM_牛MBP;IgM_CNP?181-199;IgM_CNP
    121-140;IgM无唾液酸神经节苷脂-GM2;IgM淀粉状蛋白β1-12;
    IgM_OSP?121-140;IgM_分泌的APPβ;IgM_心磷脂;IgM_HSP70?406-425;
    IgG_HSP60?361-380;IgG_淀粉状蛋白β17-40;IgG_胆固醇;IgG_淀粉状
    蛋白β1-42;IgG_PLP?80-99;IgG_PLP?65-84;IgG_PLP?40-59;IgG_PLP
    1-19;IgM_PLP?1-19;IgG_PLP?151-173;IgG_HSP70?421-440;IgG_huMBP;
    IgG_MOBP?16-35;IgG_CNP?16-35;IgG_RBP;IgG_HSP70?331-350;
    IgG_OSP?121-140;IgG_MBP?113-132;IgG_β晶状体蛋白;IgG_CNP
    240-259;和IgG_PLP?178-191。

    结果显示可将SPMS与RRMS区别,成功率为71%(P=0.0073)。
    SPMS以针对HSP60和HSP70的IgM抗体减少为特征,这些特征在RRMS
    中被发现(图2E及表8和表9)。因此,SPMS和PPMS的相似之处在于
    对HSP都只具有最小的反应性。SPMS中CNS反应性的检验揭示在RRMS
    中上调的CNS?IgM抗体的减少,以及CNS反应性IgG抗体的增加。SPMS
    的CNS特征标记与RRMS和PPMS不同,命名为CNS3(图2E-2H,表8)。

    表8:在RRMS、PPMS和SPMS中对CNS抗原的反应性


    表9-在RRMS、SPMS和PPMS中对HSP的反应性


    将表8和表9中的分别针对CNP和HSP的抗体反应性的显著变化的
    检测显示为黑色方格,其中‘s’表示相对于HC(对于RRMS和PPMS来说)
    或RRMS(对于SPMS来说)的上调,‘t’显示下调。

    实施例5

    自身抗体模式区别MS病理亚型

    Lucchinetti、Bruck和Lassman已定义了四种MS免疫病理学类型
    (Lucchinetti等人,2000;Lucchinetti等人,2004)。对在脑活组织检查
    时从15位I型受试者和30位II型受试者取得的血清进行研究。

    图3所示的热图中包括的抗体反应性在此列出(以与热图中相同的次
    序,即,从上到下):IgG_15-酮胆甾烷;IgG_15α-羟基胆甾烯;IgG_神经
    节苷脂-GM4;IgG_15-酮胆甾烯;IgG_四唾液酸神经节苷脂-GQ1B;IgG_
    脑L-α-溶血磷脂酰丝氨酸;IgG_乳糖基神经酰胺;IgM_160kDa.神经微丝;
    IgG_HSP60?240-259;IgG_OSP?166-185;IgG_MOG?196-215;IgG_OSP
    61-80;IgG_OSP?1-20;和IgG_PLP?215-232。如图3所示,自身抗体模式
    能够区分I型与II型(P=0.0082,Fisher精确检验)。为了验证这一发现,
    对与23份新的II型样品随机混合的包含用于以上分析的15份I型样品的
    盲集进行分析。在这项验证测试中,将I型与II型区别(P=0.0017,Fisher
    精确检验)。学习集的LOOCV揭示0.78的成功率,PPV=0.78且NPV=
    0.67,测试集的成功率为0.78;PPV=0.82且NPV=0.73。

    区分I型与II型的免疫特征标记由针对脂质、HSP和CNS抗原的13
    种IgG反应性和1种IgM反应性组成(图3)。II型受试者显示针对HSP60、
    MOG、OSP和PLP肽表位的IgG反应性提高。值得注意的是,在I型受
    试者中的上调反应性是针对7种脂质的IgG抗体;这些脂质中的3种为胆
    固醇的氧化衍生物(15-酮胆甾烯、15-酮胆甾烷和15a-羟基胆甾烯)。

    实施例6

    胆固醇衍生物使实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)恶化

    已推测胆固醇的氧化衍生物7-酮胆固醇通过借助多聚(ADP-核糖)-
    聚合酶-1酶(PARP)依赖性途径激活小神经胶质细胞促成MS病理学。
    为了探寻针对氧化胆固醇衍生物(oxChol)的自身抗体与疾病病理学的关
    系,对MS免疫模型EAE检验实施例5中发现的脂质的作用。

    在C57BL/6小鼠中用MOG35-55诱导EAE,在EAE诱导后第0、4、
    7和10天施用15-酮胆甾烯、15-酮胆甾烷和15a-羟基胆甾烯(10μg/小鼠)。
    每天向腹膜内施用AIQ(60μg/小鼠)。在这些小鼠中EAE的病程显示为
    EAE平均得分+标准误(MOG35-55?n=22,MOG35-55+oxChol?n=24,
    MOG35-55+oxChol+AIQ?n=18)。

    在第19天取得脊髓,用苏木精和曙红、坚牢蓝或银染染色来分别对
    细胞浸润、脱髓鞘和轴突缺失进行定量。每个柱代表由至少8个切片的分
    析得到的平均值±SEM。oxChol的施用如临床测量的那样增强了EAE(图
    4A,P<0.0001,双因素ANOVA)并增加了炎性浸润(图4B;P<0.05,
    单因素ANOVA)、脱髓鞘(图4C;P<0.01,单因素ANOVA)和轴突
    缺失(图4D;P<0.001,单因素ANOVA);这些作用被AIQ处理所抑
    制(P<0.001,单因素ANOVA)。

    进行进一步研究来确定oxChol对EAE的作用是否被PARP介导。使
    用PARP抑制剂5-氨基异喹啉酮(AIQ),发现AIQ从临床上(P<0.0001,
    双因素ANOVA)和组织病理学上(P<0.001,单因素ANOVA)(图4A-D)
    消除了由oxChol引起的EAE的恶化,但是不影响通过细胞因子(IFN-γ
    和IL-17)或增殖所测量的T细胞对MOG35-55的应答。此外,从oxChol
    处理的小鼠转移血清不增强EAE。综观来说,这些结果表明,oxChol对
    EAE的作用是由于oxChol通过PARP而作用,不是通过诱导抗脂质抗体
    或影响对MOG35-55的适应性T细胞应答而作用。

    以上描述的具体实施方案如此完全地揭示本发明的一般本质,以至于
    其他人能够通过运用当前知识容易地针对各种应用修改和/或改变这些具
    体实施方案而无需过多实验且不偏离总概念,并且因此,这些改变和修改
    应该且旨在被包括在公开的实施方案的等同物的含义和范围之内。应理解
    本文所采用的措辞或术语是为描述的目的而非限制。用于实现各种公开的
    功能的手段、材料和步骤可采用多种替代形式而不偏离本发明。























































































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