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    重庆时时彩五星综合走势图表: 通过EB病毒P18与P23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法.pdf

    关 键 词:
    通过 EB 病毒 P18 P23 融合 抗原 检测 EBV 特异性 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110281092.1

    申请日:

    2011.09.21

    公开号:

    CN102384976A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/569申请公布日:20120321|||公开
    IPC分类号: G01N33/569 主分类号: G01N33/569
    申请人: 邱清芳
    发明人: 邱清芳
    地址: 264006 山东省烟台市莱州市文化东路288号莱州市人民医院
    优先权:
    专利代理机构: 烟台双联专利事务所(普通合伙) 37225 代理人: 梁翠荣
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110281092.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2015.05.13|||2012.03.21

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||公开

    摘要

    本发明是一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法,采用重叠延伸PCR技术,借一中间接头(Gly4Ser)3的编码序列,将编码p23和p18编码基因在体外进行融合;表达融合蛋白并将表达产物纯化后应用免疫印迹法鉴定其特异性,然后以纯化融合蛋白包被ELISA反应板,优化各种成分含量及反应条件,配套商品化的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgM、IgG及其它一系列试剂,组装成EBV?VCA特异性IgM和IgG间接法ELISA诊断试剂盒。

    权利要求书

    1.一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法,其特征在于:
    采用重叠延伸PCR技术,借一中间接头(Gly4Ser)3的编码序列,将编码p23和p18编
    码基因在体外进行融合;
    测序无误后将融合基因克隆至表达载体,利用大肠杆菌表达融合蛋白;
    将表达产物纯化后应用免疫印迹法鉴定其特异性,然后以纯化融合蛋白包被ELISA反
    应板,优化各种成分含量及反应条件,配套商品化的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgM、IgG
    及其它一系列试剂,组装成EBV?VCA特异性IgM和IgG间接法ELISA诊断试剂盒;
    选择相关病人进行检测,并与EB病毒血清学检测IFA法进行比较,计算所述试剂盒的
    敏感性、特异性、约登指数、符合率、阳性预测值和阴性预测值等指标,同时检测诊断试
    剂的特异性、重复性和稳定性。

    说明书

    通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法

    技术领域

    本发明涉及一种EBV特异性检测方法。特别涉及一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳
    抗原检测EBV特异性的方法。

    背景技术

    EB病毒(Epstein-Barr?virus,EBV)为嗜B淋巴细胞的人疱疹病毒,是传染性单核细胞
    增多症(IM)的病原体,还与多种淋巴系统恶性肿瘤及胃癌、乳腺癌等的发生密切相关。EBV
    具有潜伏感染的特点,一定条件下潜伏病毒可被激活,引起增殖性感染,感染后引起多系统
    病变,且临床表现也呈多样性,容易造成误诊,对人类健康危害极大。因此,对EBV感染进
    行检测,在诊断疾病并对疗效进行有效监测及流行病学调查中起着重要的作用。

    目前诊断EBV感染的方法包括3个方面:①用疑有EBV感染的标本通过B细胞转化试验
    分离病毒;②应用分子生物学方法如核酸杂交、聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法直接检测
    临床标本中病毒基因组或其表达产物(RNA、蛋白);③血清学检测。病毒分离和分子生物学
    方法都需要一定的仪器设备和专业人员操作,步骤繁琐,不适于临床应用,且某些方法不能
    区别EBV潜伏感染和增殖性感染,临床上应用较多的仍然是血清学检测。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是,提供一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV
    特异性的方法,将VCA?p23和p18基因进行融合后再表达,以融合基因的表达产物作为ELISA
    检测的抗原,建立一套以p23-p18融合蛋白为抗原的VCA特异性IgM和IgG间接ELISA检测
    方法。

    本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下:

    一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法,其特征在于:

    采用重叠延伸PCR技术,借一中间接头(Gly4Ser)3的编码序列,将编码p23和p18编
    码基因在体外进行融合;

    测序无误后将融合基因克隆至表达载体,利用大肠杆菌表达融合蛋白;

    将表达产物纯化后应用免疫印迹法鉴定其特异性,然后以纯化融合蛋白包被ELISA反
    应板,优化各种成分含量及反应条件,配套商品化的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgM、IgG
    及其它一系列试剂,组装成EBV?VCA特异性IgM和IgG间接法ELISA诊断试剂盒;

    选择相关病人进行检测,并与EB病毒血清学检测IFA法进行比较,计算所述试剂盒的
    敏感性、特异性、约登指数、符合率、阳性预测值和阴性预测值等指标,同时检测诊断试
    剂的特异性、重复性和稳定性。

    本发明的积极效果在于:

    人类对EBV普遍易感。EBV是一种重要的DNA病毒,是传染性单核细胞增多症(IM)的
    病原体,且与多种淋巴系统恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤(BL)和某些上皮细胞肿瘤如未分化
    的鼻咽癌(NPC)等的发病高度相关,EBV感染越来越受到人们的关注。VCA抗体的消长与疾
    病的发生发展有密切关系,EBV?VCA抗体的检测对疾病的早期诊断、疗效观察及流行病学调
    查有重要意义。

    本发明成功建立了EBV?VCA融合抗原表达株,并用融合抗原做为ELISA包被抗原,建立
    了EBV?VCA特异性IgG和IgM抗体间接ELISA诊断试剂盒,检测结果可靠,操作简单,易自
    动化,能有效检测EBV感染患者VCA抗体水平,对疾病的早期诊断、疗效观察及流行病学调
    查有重要意义。

    本发明利用基因融合技术将EBV?VCA?p23和p18基因融合,并导入原核表达载体获得高
    效表达的融合蛋白,既利用p23和p18蛋白的高度特异性,又具备p23易于表达和p18免疫
    原性强的特点,Western?blot显示融合抗原具有较高的特异性和敏感性。只需要作一次克隆,
    降低了抗原制作成本,又可同时利用多种种抗原的免疫原性,提高了检测的敏感性和特异性,
    还可以在基因水平控制不同抗原的比例。

    具体实施方式

    下面结合实施例进一步说明本发明。

    p23和p18融合基因的制备

    (1)模板DNA的制备:以B95-8株病毒DNA为模板通过PCR获取目的基因。常规培养
    收获B95-8细胞,酚、氯仿、异戊醇法提取细胞DNA,步骤如下:

    用适量STE重悬细胞,加蛋白酶K至终浓度200μg/mL,42℃消化3~5h,期间振摇数次。
    加等体积饱和酚,颠倒混匀20min,4℃,12000r/min离心15min。转移上层水相至新离心管
    中,加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提,12000r/min离心5min。转移上层水相至新离心
    管中,加2倍体积的预冷无水乙醇,1/10体积3M?NaAc(pH?5.2),-20℃过夜。4℃,12000r/min
    离心15min,沉淀DNA。弃上清,用预冷70%乙醇洗DNA沉淀。4℃瞬时离心,弃上清,DNA沉
    淀干燥后加适量TE缓冲液(pH?8.0)溶解,4℃保存备用。

    (2)目的基因的选择及引物设计:选择p23编码基因BLRF2(氨基酸1~162)和p18编
    码基因BFRF3的C端(氨基酸105~176)基因序列,DNAStar软件设计扩增两段基因的特异
    性引物,并在p23上游引物的5’端引入限制性核酸内切酶Kpn?I的酶切位点(GGTACC)和保
    护碱基GTC,下游引物3’端删除终止密码TAA,引入linker;p18下游引物5’端引入限制
    性核酸内切酶Sal?I酶切位点(GTCGAC)和?;ぜ罨鵆AC,上游引物5’端引入linker。
    linker(Gly4Ser)3为编码15个氨基酸的DNA序列,序列为
    5′-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGC-3′。p23上游引物P1序列为:
    5’-GTCGGTACCATGTCAGCTCCACGCAAAGTCAG-3’(B95-8coordinate?88925-88947),下游重叠
    引物P2序列为:
    5’-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCATCAGAAATTTGCACTTTCTT-3’
    (B95-8coordinate?89410-89391)。p18上游重叠引物P3序列为:
    5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGC?CGCATCCGCTGGGACCGG-3’(B95-8
    coordinate?61819-61839),下游引物P4序列为:5’-CACGTCGACCTACTGTTTCTTACGTGCCCC-3’
    (B95-8coordinate?62037-62017)。扩增产物p23为540bp(目的基因486bp+?;ぜ罨兔?br />切位点9bp+linker?45bp),p18为273bp(目的基因219bp+?;ぜ罨兔盖形坏?bp+linker
    45bp),融合基因为768bp(p23和p18均携带互补的45bp的linker,因此融合基因的大
    小为540bp+273bp-45bp)。

    (3)目的基因的PCR扩增:采用重叠延伸PCR获得融合基因:首先分别以P1和P2配对、
    P3和P4配对进行PCR获得p23和p18目的基因片段,然后将两种基因片段混合,二者通过
    引物P2和P3的互补形成异源双链,最后以P1和P4配对通过PCR延伸形成融合基因。

    融合蛋白的表达

    (1)原核表达载体pThioHis?A的转化与纯化

    应用TSS两步法,将载体pThioHis?A转化新鲜制备的E.coli?BL21感受态细菌,以获得
    大量的载体。具体步骤如下:

    自LB平板挑取单个新鲜BL21菌落接种于3mL?LB液体培养基,37℃200r/min振荡培
    养16~20h。1∶100稀释活化菌液,37℃,200r/min振荡培养4h。取1mL菌液至1.5mL离心
    管中,5000r/min离心2min。弃上清,菌细胞沉淀用100μL?TSS液重悬。加1μL质粒pThioHis
    A,轻轻混匀,冰浴40min。42℃水浴90sec,再冰浴30sec。加100μL预温至37℃的LB
    液体培养基,37℃,200r/min振摇30min。取100μL转化菌,用无菌L棒均匀涂于琼脂
    平板(含氨苄青霉素100μg/mL),待液体吸收后,倒置平板于37℃温箱中培养18~24h。
    观察到单个菌落生长后用parafilm膜将平板封口,置4℃冰箱中保存,同步设立阴性对照(未
    用质粒转化)。

    ELISA间接法试剂盒组装

    (1)ELISA法原理:本实验采用间接ELISA法,以p23和p18融合蛋白作为抗原检测未
    知的VCA?IgG和IgM抗体;指示系统是利用辣根过氧化物酶(HRP)作用于特异性底物H2O2,
    催化时需供氢体,供氢体(DH2)为无色还原型化合物,通过反应可生成有色的氧化型化合物,
    本试验选用TMB为供氢体。

    (2)抗原滴定及及ELISA试剂盒的组装:分别用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释上述纯化的
    重组融合蛋白,以不同浓度包被ELISA反应板,与标准阳性血清及阴性血清反应,采用方阵
    法滴定抗原浓度,选择最适抗原浓度包板,组装ELISA试剂盒。操作步骤如下:

    将倍比稀释的细胞抗原或纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,每孔加100μL,轻摇ELISA
    反应板使抗原溶液均匀分布于孔底,37℃孵育2h,然后4℃过夜。0.02M?PBS(pH?7.4)洗板,
    以去掉结合不牢固的抗原。加200μL封闭液(含0.2%牛血清白蛋白的PBS),37℃作用2h以
    封闭板上未结合位点。0.02M?PBS(pH?7.4)洗板3次,每次5min,最后一次在吸水纸上甩
    干,使残留液体全部流出。ELISA板空气干燥,密封,置于干燥容器中,-70℃冻存2周后应
    用。1∶20稀释VCA?IgG或IgM标准阳性血清和阴性血清,血清稀释液为PBS-T(0.02M?PBS,
    1%BSA,0.05%Tween?20),每反应孔加100μL稀释血清,37℃孵育30min。用PBS-T洗板3
    次,每次5min,甩干。加100μL辣根过氧化物酶标羊抗人IgM或IgG抗体,37℃孵育30min。
    用PBS-T洗板3次,每次5min,甩干。加TMB底物A液和B液各100μL?37℃作用10~15min,
    反应至最佳颜色,加2M?H2SO4终止反应。以空白调零孔校正零点,450nm波长测定各反应孔
    的OD值。

    选择阳性血清和阴性血清出现最大OD差值的抗原浓度作为最适抗原浓度包板,配套商品
    化的辣根过氧化酶标羊抗人IgM、IgG及其它一系列试剂,经反复优化各种成分含量及反应条
    件,组装成试剂盒,对450份血清进行VCA?IgG和IgM检测。经上述滴定,抗原的最适浓度
    为2μg/mL。

    ELISA检测试剂方法验证与评估试验

    (1)重复性检测:用同一批试剂盒,对3份阳性和1份阴性血清分别在不同时间由不同
    人员操作,进行10次重复性检测,计算10次重复检测值的变异度。

    (2)稳定性检测:取3批试剂盒,于4℃保存1周、1个月、3个月、6个月、1年,取
    阳性血清和阴性血清进行ELISA试验。

    (3)与“金标准”IFA法及国外同类产品比较:用p23和p18融合抗原ELISA试剂检
    测450份血清中VCA?IgG和IgM。将血清1∶20稀释,按照5(2)步骤进行测定,判断结果
    前首先计算临界值(cut-off?value,CV),测定3份VCA?IgG或IgM阴性血清在自制ELISA
    试剂盒检测中的平均OD值(mean?OD)和标准差(SD),CV=mean?OD+3SD。血清标本OD值大
    于CV判断为阳性血清,小于CV×0.09判断为阴性血清,在CV与CV×0.09之间视为可疑,
    重新进行测定后判断结果,如测定结果仍介于CV与CV×0.09之间或>CV,判为阳性。检测
    IgM时,首先用血清吸附剂吸附血清中的IgG和类风湿因子再进行IgM的检测。

    同时以IFA检测450份血清,NOVATEC公司生产的IgG和IgM?ELISA试剂盒检测其中的
    175份血清,比较融合抗原ELISA、IFA及NOVATEC?ELISA的检测结果,计算评价自制试剂盒
    的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率、一致性、诊断阳性率、诊断阴性率和约登指数等
    指标。

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