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    形成 质量 图像 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201080015616.6

    申请日:

    2010.03.30

    公开号:

    CN102388304A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):G01N 27/62申请日:20100330授权公告日:20140312终止日期:20170330|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/62申请日:20100330|||公开
    IPC分类号: G01N27/62; G01N33/483; G01N33/68 主分类号: G01N27/62
    申请人: 佳能株式会社
    发明人: 小松学; 桥本浩行
    地址: 日本东京
    优先权: 2009.04.10 JP 2009-096091
    专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 11038 代理人: 李颖
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201080015616.6

    授权公告号:

    |||102388304B||||||

    法律状态公告日:

    2018.04.17|||2014.03.12|||2012.05.02|||2012.03.21

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明的目的是,提供在细胞水平上综合地将肿瘤组织等中的构成物可视化的方法。本发明提供一种基于关于组织切片的构成物的质量的信息而形成目标构成物的二维分布图像的方法,其中,作为内部标准材料,在细胞内部区域中使用肌动蛋白、微管蛋白和GAPDH中的任一种,在核区域中使用组蛋白和核酸中的一种,并且,在细胞外部区域中使用白蛋白和细胞因子中的一种。

    权利要求书

    1.一种基于关于组织切片的构成物的质量的信息而形成组织切片
    的构成物中的目标构成物的二维分布图像的方法,所述方法包括以下
    步骤:
    将构成物所属于的区域确定为细胞内部区域、核区域和细胞外部
    区域中的至少一个;
    对于在之前的区域确定中确定的每个区域,根据从构成物的质谱
    中的目标构成物导出的质量信号强度和从构成物中的内部标准材料导
    出的质量信号强度,计算从目标构成物导出的质量的归一化强度;和
    基于从目标构成物导出的质量的归一化强度,形成目标构成物的
    二维分布图像,
    其中,作为内部标准材料,(i)在所述细胞内部区域中使用肌动
    蛋白、微管蛋白和GAPDH中的任一种;(ii)在所述核区域中使用
    组蛋白和核酸中的一种,以及(iii)在细胞外部区域中使用白蛋白和
    细胞因子中的一种。
    2.根据权利要求1的方法,其中,通过TOF-SIMS方法测量构
    成物的质谱。
    3.根据权利要求1或2的方法,其中,关于构成物的质量的信息
    基于一个边的长度为5μm或更小的每个像素的信息。

    说明书

    形成质量图像的方法

    技术领域

    本发明涉及使用质谱分析法(mass?spectrometry)来获取关于分
    析物中的构成物(constituent)的质量的信息作为图像的方法,特别
    是涉及通过信号强度的归一化(normalize)来形成包含于组织切片
    (tissue?section)中的诸如蛋白质和肽(peptide)的生物物质的二维
    分布状态的图像的方法。

    背景技术

    已知有这样的分析方法(美国专利No.7446309):该分析方法使
    用飞行时间(time-of-flight)二次离子质谱分析仪(TOF-SIMS)、基
    于信号强度将在肿瘤组织中表现(express)的蛋白质的表现量全面地
    (comprehensively)可视化。

    此外,使用标准材料的质谱分析的信号强度的归一化是已知的。
    在蛋白质分析中,通过二维电泳(electrophoresis)来分离蛋白质并且
    通过质谱分析来分析所分离的蛋白质。然后,使用具有已知含量的蛋
    白质的强度作为标准,将所关心的蛋白质的强度归一化以获得定量
    (quantitative)的结果。

    可通过使用诸如TOF-SIMS和基质辅助激光脱附离子化质谱分析
    (matrix-assisted?laser?desorption-ionization?mass?spectrometry,
    MALDI-MS)而基于目标蛋白质的信号强度形成目标蛋白质的二维分
    布图像。在这种情况下,已知有这样的方法:该方法使用一次离子的
    总剂量、脉冲激光的照射量、或者得到的二次离子的总计数作为标准
    而将信号强度归一化。

    还提出了使用外部标准材料的归一化。这里,外部标准材料指的
    是不包含于测量样本中但被添加到样本中的、用于将通过质谱分析而
    获得的质量信号强度归一化的标准材料。在日本专利申请公开No.
    2004-037120中示出了在TOF-SIMS中使用外部标准材料。在该公布
    中,用作外部标准的材料被布置在样本的测量范围之外。然后,通过
    外部标准的信号强度将样本中的所关心的蛋白质的信号强度归一化。
    通过该方法,可以在相同条件下获得样本和外部标准的信号强度。

    在MALDI-MS中使用外部标准材料也是已知的。例如,一定量
    的特定的肽与基质剂混合并且基质被均匀地喷涂于样本表面上以便使
    用所述肽作为外部标准以获得组织切片的构成物的质谱的二维分布图
    像是已知的。

    还提出了使用内部标准的归一化。这里,内部标准材料指的是事
    先包含于测量样本中的用于将通过质谱分析获得的质量信号强度归一
    化的标准材料。例如,在S.G.Ostrowski?et?al.,Anal.Chem.79,3554
    (2007)中,使用从细胞的脂质(lipid)成分获得的碎片离子(fragment?
    ion)的信号强度作为标准,将细胞膜表面中的胆固醇(cholesterol)
    的信号强度归一化,以通过TOF-SIMS形成二维分布图像。

    发明内容

    在日本专利申请公开No.2004-037120中,由于外部标准材料被布
    置在离开目标构成物的位置中,因此难以校正由局部地存在于测量范
    围中的诸如盐和脂质的离子化抑制物质导致的局部灵敏度
    (sensitivity)变化。

    在S.G.Ostrowski?et?al.,Anal.Chem.79,3554(2007)中,培养
    的细胞经受二维分布测量,并且,使用细胞膜上的脂质分子的碎片离
    子(C5H9+)的信号作为图像中的每个像素中的内部标准。但是,用于
    内部标准的脂质分子根据细胞膜的形状具有偏倚的(biased)二维分
    布。例如,在组织切片的细胞外部或核中,很少存在脂质分子。因此,
    归一化信号被计算为比与实际丰度(abundance)对应的信号高的值。
    出于这种原因,当形成二维分布图像时,难以形成适当地反映测量对
    象的丰度的图像。

    作为用于解决上述问题的深入研究的结果,本发明的发明人实现
    了本发明。

    本发明涉及一种基于关于组织切片的构成物的质量的信息而形成
    组织切片的构成物中的目标构成物的二维分布图像的方法,该方法包
    括:将构成物所属于的区域确定为细胞内部区域、核区域和细胞外部
    区域中的至少一个;对于在先前的区域确定中确定的每个区域,根据
    从构成物的质谱中的目标构成物导出的质量信号强度和从构成物中的
    内部标准材料导出的质量信号强度,计算从目标构成物导出的质量的
    归一化强度;以及基于从目标构成物导出的质量的归一化强度而形成
    目标构成物的二维分布图像,其中,作为内部标准材料,(i)在细胞
    内部区域中使用肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)和GAPDH
    中的任一种;(ii)在核区域中使用组蛋白(histone)和核酸中的一
    种,以及(iii)在细胞外部区域中使用白蛋白(albumin)和细胞因子
    (cytokine)中的一种。

    根据本发明,当基于关于分析物中的构成物的质量的信息的二维
    分布图像被获取时,可以获得在对于各像素已校正了质谱的情况下的
    诸如灵敏度差异的变化的信号强度。另外,由于通过像素所属于的区
    域选择内部标准,所以,更合适的内部标准被选择。因此,归一化的
    信号强度的分布与构成物的实际分布相匹配。

    参照附图阅读示例性实施例的以下描述,本发明的其它特征将变
    得清晰。

    附图说明

    图1示出分析物的光学显微镜图像和测量范围中的像素坐标XY
    的示意图。

    图2示出用于规定“像素所属于的区域”的校正后的脂质碎片二
    次离子信号分布(128×128个像素)。

    图3(a)、图3(b)和图3(c)分别示出分配给被规定为“像
    素所属于的区域”的(a)细胞内部区域、(b)核区域和(c)细胞外
    部区域的各内部标准材料的信号强度的二维信号分布(128×128个像
    素)。

    图4示出通过测量而获得的并且不经受归一化处理的蛋白质C的
    二次离子信号强度的分布(128×128个像素)。

    图5示出规定了“像素所属于的区域”并且通过向各像素分配内
    部标准材料而执行了归一化处理的蛋白质C的信号强度的二维分布
    (128×128个像素)。

    图6A和图6B分别示出没有规定“像素所属于的区域”并且通过
    向测量范围中的所有像素施加相同的内部标准材料而执行了归一化的
    蛋白质C的信号强度的二维分布(128×128个像素)。通过分别使用
    β-肌动蛋白(图6A)和脂质成分(图6B)作为内部标准材料而将信
    号强度归一化。

    图7(a)、图7(b)和图7(c)分别示出分配给被规定为“像
    素所属于的区域”的(a)细胞内部区域、(b)核区域和(c)细胞外
    部区域的各内部标准材料的信号强度的二维分布(64×64个像素)。

    图8示出通过测量获得的并且不经受归一化处理的蛋白质C的二
    次离子信号强度的分布(64×64个像素)。

    图9示出半自动地规定了“像素所属于的区域”并且通过向各像
    素分配内部标准材料而执行了归一化的蛋白质C的信号强度的二维分
    布(64×64个像素)。

    图10A和图10B示出没有规定“像素所属于的区域”并且通过向
    所有像素施加相同的内部标准材料而执行了归一化的蛋白质C的信号
    强度的二维分布(64×64个像素)。通过分别对于图10A使用β-肌动
    蛋白并且对于图10B使用脂质成分作为内部标准材料,将信号强度归
    一化。

    具体实施方式

    本发明涉及一种基于关于组织切片的构成物的质量的信息而形成
    组织切片的构成物中的目标构成物的二维分布图像的方法,该方法包
    括以下步骤:将构成物所属于的区域确定为细胞内部区域、核区域和
    细胞外部区域中的至少一个;对于在前一步骤中确定的每个区域,根
    据从构成物的质谱中的目标构成物导出的质量信号强度和从构成物中
    的内部标准材料导出的质量信号强度,计算从目标构成物导出的质量
    的归一化强度;以及基于从目标构成物导出的质量的归一化强度而形
    成目标构成物的二维分布图像,其中,作为内部标准材料,(i)在细
    胞内部区域中使用肌动蛋白、微管蛋白和GAPDH中的任一种;(ii)
    在核区域中使用组蛋白和核酸中的一种,以及(iii)在细胞外部区域
    中使用白蛋白和细胞因子中的一种。

    本发明的方法是使用质谱分析法来获取关于分析物中的构成物的
    质量的信息并且基于获取的关于质量的信息而形成目标构成物的二维
    分布图像的方法??赏ü韵虏街枥粗葱懈梅椒ǎ?br />

    (1)确定分析物的测量范围的步骤;

    (2)将测量范围划分为像素的步骤;

    (3)通过质谱分析法获得像素的质谱的步骤;

    (4)确定像素所属于的区域的步骤;

    (5)确定像素的质谱分析的内部标准材料的步骤;

    (6)根据从像素的质谱中的目标构成物导出的质量的信号强度和
    从内部标准材料导出的质量的信号强度而计算从目标构成物导出的质
    量的归一化强度的步骤;以及

    (7)在从目标构成物导出的质量的归一化强度的测量范围中构建
    二维分布图像的步骤;

    以下,将详细描述各步骤。

    (1)确定分析物的测量范围的步骤

    通过观察分析物来确定测量范围。用于观察的单元不被特别限制,
    而是可以使用附接于质谱分析仪上的显微镜、和光学显微镜等。当目
    标是施加了荧光着色处理的组织切片时,可以使用荧光显微镜。

    当使用附接于质谱分析仪上的显微镜时,先以低倍率观察样品,
    并且,在观察期间,上面放置了样品的台架被移位以便粗略地确定要
    观察的测量范围。然后,可按高倍率观察样品以细微地调整,使得目
    标细胞可包含于测量范围内。

    注意,在本发明中,分析物是组织切片,并且测量范围一般在细
    胞水平?!跋赴健币馕蹲趴芍辽偈侗鸬ジ鱿赴乃?。细胞的直
    径一般在10μm~20μm的范围内,而诸如神经细胞的大细胞具有约
    50μm的直径。因此,对于本步骤中的观察来说,空间分辨率需要为
    10μm或更小,优选地为5μm或更小,更优选地为2μm或更小,再
    更优选地为1μm或更小。

    (2)将测量范围划分为像素的步骤

    每个像素的一个边的长度需要为10μm或更小,优选地为5μm
    或更小,更优选地为2μm或更小,再更优选地为1μm或更小。

    当在附接于质谱分析仪上的显微镜下观察分析物时,可通过在软
    件上选择要测量的像素的数量来执行成为像素的分割。像素的数量可
    选自例如由64×64、128×128、256×256和512×512个像素构成的组。

    注意,可在整个步骤中参照多个二维数据,并且,为了匹配像素
    的各数据,可以在各二维数据中设定二维坐标。

    (3)通过质谱分析法获得像素的质谱的步骤

    使用质谱分析仪,分析物的测量范围经过综合二维质谱分析以获
    得与像素对应的质谱。当使用附接于质谱分析仪上的显微镜和软件来
    执行步骤(1)和(2)时,可以在本步骤中自动地获得各像素的质谱。
    另一方面,当不使用附接于质谱分析仪上的显微镜和软件执行步骤(1)
    和(2)时,或者当需要时,各像素的各二维数据需要相互对应。针对
    每个像素获得的质谱的数量可以为一个或更多个。当获得多个质谱时,
    可以使用它们中的任一个,或者可以将多个谱平均化。

    可事先确定或者可在每次确定用于质谱分析的测量条件。质谱分
    析的一次探测器的照射区域优选地比在步骤(2)中确定的各像素的面
    积小。优选地,还可以获得足够细微到这样的程度的质谱的二维分布
    图像:该二维分布图像允许区分各像素的区域是否属于例如细胞内部
    区域、细胞外部区域和核区域之一。出于这种目的,可手动或自动地
    控制一次探测器的孔径(aperture)和透镜系统电压。

    注意,在本步骤中使用的质谱分析仪不被特别限制。以下,将详
    细描述质谱分析仪。

    用于执行质谱分析的质谱分析仪一般具有用于将样品离子化的样
    品引入部分和用于分析离子化了样品的分析部分。质谱分析仪可根据
    分析部分的系统被归类入各种分析方法。

    这里,样品引入部分中的离子化的方法包含以下方法:

    (i)使用一次离子的方法;

    (ii)FAB(快速原子轰击,Fast?Atom?Bombardment)方法;和

    (iii)MALDI(基质辅助激光脱附离子化,Matrix?Assisted?Laser?
    Adsorption?Ionization)方法。

    这里,FAB方法指的是将样品与基质混合并且允许中性原子以高
    速与得到的混合物碰撞以将样品离子化的方法。

    MALDI方法指的是将样品与基质混合以产生被激光照射以将样
    品离子化的晶体的方法。

    分析部分的系统包含以下方法:

    (i)四极(quadrupole)类型;

    (ii)磁偏转类型;

    (iii)傅立叶变换离子回旋加速器(cyclotron)共振类型;

    (iv)离子阱(trap)类型;

    (v)飞行时间二次离子质谱分析(TOF-SIMS)类型;和

    (vi)级联(tandem)类型。

    这里,(i)四极类型指的离子穿过四个电极并且向这些电极施加
    高频电压以由此使得样品中的扰动(perturbation)仅经过目标离子的
    分析方法;

    (ii)磁偏转类型指的是使离子通过磁场并且利用通过向磁场中
    的离子施加的洛伦兹(Lorentz)力而导致的离子的飞行路径的变化的
    分析方法;

    (iii)傅立叶变换离子回旋加速器共振类型指的是这样的分析方
    法,其中,离子被引入到已被施加了静电场和静磁场的细胞,并且施
    加用于激发离子运动的高频电压以检测离子的轨道周期,并且根据回
    旋加速器状况来计算质量;

    (iv)离子阱类型指的是离子被保持在由电极构成的阱室内并且
    其电势被改变以由此有选择地释放离子以使这些离子分开的分析方
    法;

    (vi)级联类型指的是将以上分析方法中的两种或更多种组合起
    来的方法;

    可优选地使用第(v)种方法,即,对于离子化使用一次离子的飞
    行时间二次离子质谱分析(TOF-SIMS方法)。TOF-SIMS方法是能
    够在质谱分析中以非常高的精确度(accuracy)测量非常少量的样品
    的方法。另外,由于通过使用一次离子的对于样品表面的脉冲状的照
    射而将样品离子化,因此,可以减少对于样品的损害,并且,可以正
    确地获得关于目标成分的分布信息。

    在TOF-SIMS方法中,通过用一次离子照射样品而执行样品的离
    子化。从离子化效率和质量分辨率(resolution)等的观点看,作为一
    次离子种类,不仅可以使用诸如镓离子(Ga+)的一般液体金属离子,
    而且可以使用诸如三价金离子(Au3+)和三价铋离子(Bi3+)的簇离
    子(cluster?ion)。注意,优选地使用Bi离子,原因是可以用非常高
    的灵敏度执行分析。

    在TOF-SIMS方法中,通过一次离子的入射而从成分的正面(face
    side)产生二次离子。在通过TOF-SIMS方法进行的分析中,在成分
    和飞行时间二次离子质谱分析仪之间施加几kV的电场,并且,通过
    电场将二次离子取入检测器中以便进行分析。

    在使用TOF-SIMS的成像中,诸如质量分辨率、分析区域和诸如
    一次离子脉冲频率、一次离子束能量和一次离子脉冲宽度的测量条件
    的条件与成像能力紧密相关。出于这种原因,不唯一地决定优选的分
    析条件。但是,从可以分析的观点看,测量条件的各设定值需要处于
    一定范围内。在本发明中,一次离子束脉冲频率优选地处于1kHz~
    50kHz的范围中。一次离子束能量优选地处于12keV~25keV的范
    围中,并且,一次离子束脉冲宽度优选地处于0.5ns~10ns的范围中。
    可通过在10μm2~500μm2的测量范围中的64~512像素平方的像素
    表面上重复扫描一次离子束16~512次而获得各像素中的离子质量信
    号强度??梢愿莞髯耆〕龊筒贾谜饫锘竦玫谋戎柿渴?specific?
    mass?number)的各像素中的信号强度以获得图像。

    类似地,当使用MALDI来成像时,不唯一地决定优选的分析条
    件,但各值处于一定范围内。在本发明中,脉冲激光频率优选地处于
    1Hz~200Hz的范围中。脉冲激光能量优选地处于10~300mW的范
    围中,并且,脉冲激光脉冲宽度优选地处于0.5ns~10ns的范围中。
    在MALDI的情况下,通过以1μm为单位移动样品台架以扫描脉冲激
    光的照射位置,获得各像素的质量信号??赏ü?0μm2~500μm2
    的范围中的10~500个像素平方的像素表面上扫描样品台架一次,获
    得各像素中的离子质量信号强度??梢愿莞髯耆〕龊筒贾谜饫锘?br />得的比质量数的各像素中的信号强度以获得图像。

    在TOF-SIMS和MALDI两者中,当目标构成物是蛋白质或脂质
    时,优选地检测正离子,相反,当目标构成物是诸如DNA和RNA的
    低聚物(oligomer)或糖链(sugar?chain)的碎片时,优选地检测负
    离子,但是,不特别限于这些条件??梢栽谙嗤牟饬糠段е兄葱姓?br />离子和负离子的测量,以获得关于许多构成物的信息。此外,为了有
    利于质谱分析,特别当目标构成物是蛋白质时,分析物样品可经受诸
    如事先添加消化酶或敏化材料的预处理。但是,这需要极其仔细,使
    得目标构成物的分布可以被维持并且不可扩展。

    (4)确定像素所属于的区域的步骤

    在本发明中,分析物主要是组织切片,并且,像素所属于的区域
    可例如选自细胞内部区域、核区域和细胞外部区域。注意,细胞内部
    区域指的是被细胞膜包围的部分,并且可以包含细胞膜或者可以不包
    含细胞膜。此外,细胞内部区域可以包含或者可以不包含核。此外,
    可将诸如微粒体(microsome)、Golgi体、内涵体(endosome)、溶
    酶体(lysosome)、线粒体(mitochondrion)和过氧物酶体(peroxisome)
    的细胞器官(cell?organelle),或者骨组织,以及脂肪组织规定为区
    域。

    可以从基于步骤(1)中的观察的形状来确定像素所属于的区域,
    或者,可在其中添加以下的步骤。即,通过使用更高精度的光学显微
    镜而获得测量范围中的分析物样品的数字图像并且根据该数字图像的
    对比度差值来区分分析物中的细胞的断面轮廓,规定各像素所属于的
    区域。在光学显微镜的观察中,通常使用反射型显微镜,但是,当向
    分析物样品施加了HE着色或荧光着色时,也可使用荧光显微镜。

    作为替代方案,可基于在步骤(3)中获得的质谱的二维分布来确
    定像素所属于的区域。在这种情况下,基于来自步骤(3)中的质谱分
    析的结果而得到的比质量的信号强度的二维分布来确定该区域。希望
    比质量是与可表示细胞或细胞膜的断面轮廓的分布的脂质成分的碎片
    离子和已知主要存在于细胞质(cytoplasmic)区域(以下,称为细胞
    内部区域)的核的位置中的蛋白质、肽、DNA和RNA等的碎片离子
    对应的质量。更具体而言,希望比质量是与细胞内部区域中的肌动蛋
    白、微管蛋白和GAPDH,核区域中的组蛋白和核酸,以及细胞外部
    区域中的白蛋白和细胞因子的碎片离子对应的质量??梢曰谡庵中?br />号强度的二维分布图像来确定特定的像素属于哪种类型的区域。

    为了去除对于由盐杂质所施予的对于离子检测灵敏度的影响,可
    通过对于以上各图像的各像素将各图像乘以Na的信号强度来校正信
    号强度。

    在任何情况下,当两个或更多个区域成分在像素所属于的区域中
    的一个像素中重叠时,还可以计算包含于像素中的各区域成分的面积
    比,并且在下一步骤中在应用内部标准时使用加权形式的面积比。

    (5)确定像素的质谱分析的内部标准材料的步骤

    可通过像素所属于的区域的属性确定像素的内部标准。注意,希
    望选择内部标准材料使得它满足以下两个条件:

    (i)所述材料稳定地存在于断面(cross-sectional)细胞内部区域、
    细胞中的断面核区域、或者细胞外部区域中的每一个中;和

    (ii)丰度处于范围为10~103件/μm3的水平。

    特别地,作为内部标准材料,优选地应用蛋白质、肽、氨基酸、
    脂质、磷酸、糖链和核酸。更具体而言,当区域属于细胞内部区域时,
    优选地被应用的内部标准材料包含肌动蛋白、微管蛋白和GAPDH;
    当区域属于核时,优选地被应用的内部标准材料包含组蛋白和核酸;
    并且,当区域属于细胞外部区域时,优选地被应用的内部标准材料包
    含诸如白蛋白和细胞因子的蛋白质分子。

    (6)根据从像素的质谱中的目标构成物导出的质量的信号强度和
    从内部标准材料导出的质量的信号强度而计算从目标构成物导出的质
    量的归一化强度的步骤

    通过基于在步骤(5)中确定的分配给各像素的内部标准材料而向
    在步骤(3)中获得的质谱应用“目标构成物的信号强度和所分配的内
    部标准材料的信号强度”,对于各像素归一化和计算目标构成物的信
    号强度。此时,所分配的内部标准材料的信号强度不需要是内部标准
    材料自身的分子的强度,而可以是可规定内部标准材料的信号。例如,
    如果蛋白质经受作为步骤(2)中的预处理的消化(digestion)处理,
    那么可以使用通过消化蛋白质而产生的碎片分子的检测信号作为内部
    标准材料的信号。

    例如,可以使用比值(目标构成物的信号强度)/(所分配的内部
    标准材料的信号强度)作为归一化信号强度。

    此外,例如,可通过将比值(目标构成物的信号强度)/(所分配
    的内部标准材料的信号强度)乘以诸如所分配的内部标准材料等的权
    重的适当的常数而对于归一化信号强度的值进行进一步的计算。

    如上所述,当多个内部标准材料被分配给一个像素时,也可通过
    根据像素中的各占据面积比的加权来校正信号强度。

    此外,当存在多个要经受归一化处理的目标构成物时,可对于多
    个目标构成物同时执行本步骤。

    (7)在从目标构成物导出的质量的归一化信号强度的测量范围中
    构建二维分布图像的步骤

    为了重构图像,基于测量范围中的各像素的位置而形成在步骤(4)
    中获得的各像素的归一化信号强度作为二维分布图像。

    此外,可以有多个如上面所述的那样用于重构图像的目标构成物。

    例子

    以下,将参例子更具体地描述本发明。以下的具体例子是本发明
    的最佳实施例的例子,但是,本发明不限于这样的具体实施方式。

    例子1

    以下,示出了使用组织切片作为分析物并且通过TOF-SIMS方法
    获取图像的例子。

    依次用丙酮、乙醇和去离子水冲洗不包含杂质的硅(Si)基板,
    在该硅(Si)基板上沉积100nm的金(Au)以形成分析基板。

    在本例子中,使用患病的组织切片作为分析物?;疾〉淖橹磺?br />入OCT化合物中,被冷冻,并然后被切片机(microtome)切成约4μm
    的厚度以获得切片。得到的切片被布置在切片机中的事先被安装和冷
    却的基板上,使得分析物表面面朝上。通过用毛刷(wool?brush)按
    压切片的边缘以使其粘附从而将切片固定于基板上。在样品被冷冻干
    燥之后,在样品的表面上滴落具有适当的浓度的10μL的胰蛋白酶
    (trypsin)溶液。在37℃在使湿度保持恒定的状态下使样品消化一整
    夜,以使得样品构成物的蛋白质成分破碎。

    如上面描述的那样的被固定于基板上并已经受消化处理的组织切
    片被引入TOF-SIMS仪器。在附接于仪器的显微镜下观察切片,并且,
    基于显微镜图像的对比度差异来选择测量范围。同时,在附接于
    TOF-SIMS仪器的软件上确定构成测量范围的像素的数量。此时的样
    品台架位置被记录为XY坐标。另外,作为数字数据,存储在组织切
    片上叠加了测量范围的外框线的光学显微镜图像。图像中的测量范围
    的位置被记录为XY坐标。图1表示示出了此时的光学显微镜图像和
    测量范围中的像素坐标XY的获取的情况的示意图。在图1中,附图
    标记1表示组织切片,附图标记2表示细胞,附图标记3表示核,附
    图标记4表示测量范围(由128×128个测量像素构成),附图标记5
    表示测量像素。在本例子中,使用由ION-TOF制造的TOF-SIMS型
    号5仪器(商标名称)和由ION-TOF制造的IONSPEC(商标名称)
    和IONIMAGE(商标名称)作为附接于其上的软件,在下述条件下
    执行TOF-SIMS分析和分析工作。注意,为了获得更清楚的测量范围,
    可以在TOF-SIMS测量之后在获得光学显微镜图像之前将组织切片样
    品中的细胞核和膜部分染色。

    一次离子:25kV?Bi3+,0.3pA(脉冲电流值),锯齿扫描模式

    一次离子的脉冲频率:2.5kHz(400μs/发(shot))

    一次离子的脉冲宽度:约0.8ns

    一次离子束的直径:约0.8μm

    测量范围:26μm×26μm

    要测量的二次离子的像素的数量:128×128

    积分(integration)时间:128次扫描(约500秒)

    二次离子的检测模式:正离子

    对于各像素,根据所获得的质谱的二维分布的和关于“像素所属
    于的区域”的信息确定内部标准材料。此时,需要连续地执行样品的
    测量和后面要描述的分析处理,但是,关于事先测量的质谱的二维分
    布的信息可被存储为电子数据。此时,如果测量中区分“像素所属于
    的区域”所需的信息也被单独地存储并且可被任选地参照,那么也可
    以例如在与TOF-SIMS仪器不同的计算机上稍后仅执行分析处理操
    作。将在随后的例子2中描述细节。在本例子中,为了区分“像素所
    属于的区域”,使用这样的信号分布作为质谱二维分布:该信号分布
    已通过将从细胞膜检测的脂质碎片离子(磷酸胆碱(Phosphocholine):
    m/z?184)的信号强度乘以各像素中的纳离子(Na+:m/z?23)的信号
    强度和适当的常数而被归一化,以便去除盐的影响。如图2所示,与
    各像素坐标XY(0~127、0~127)对应的位置使用通过脂质碎片的
    信号强度分布绘制的除细胞轮廓和细胞核以外的细胞膜部分作为主要
    标准来规定(a)细胞内部区域(附图标记6)、(b)核区域(附图
    标记7)以及(c)细胞外部区域(附图标记8)中的一个。为了在区
    域之间清楚地区分,在图2中用白色封闭线示出规定的区域的边界。
    注意,在本例子中,没有设定包含多个区域的像素。在规定像素所属
    于的区域时,可以从如上面描述的那样获得的图1所示的光学显微镜
    照片规定各像素坐标XY所属于的(a)~(c)的各区域。

    然后,适当的内部标准材料被分配给各像素坐标XY中的“像素
    所属于的区域”(a)~(c)中的每一个。在本例子中,作为内部标
    准材料分别分配以下的碎片离子:区域(a)中的蛋白质β-肌动蛋白(氨
    基酸序列LDLAGR+H:m/z?644)的碎片离子;区域(b)中的蛋白
    质组蛋白(LLGR+H:m/z?457)的碎片离子;和区域(c)中的蛋白
    质血白蛋白(FPK+Na:m/z?413)的碎片离子。对于图3中的各区域
    呈现出分配给区域(a)~(c)中的每一个的内部标准材料的信号强
    度的二维分布。这里使用的上述蛋白质中的每一个的碎片离子是具体
    地从TOF-SIMS方法中的各母蛋白质检测的材料。因此,可以间接地
    表现作为原内部标准的蛋白质的分布和量,并且它适用为用于归一化
    的检测信号。但是,内部标准材料及其碎片离子不一定限于以上描述
    的那些,而是可以取决于测量方法以及样品和目标构成物的状态来使
    用适当的内部标准材料及其碎片离子。

    在本例子中,使用主要具体地在患病细胞的细胞内部区域中发展
    的蛋白质细胞角蛋白(cytokeratin)19(以下,称为蛋白质C)作为
    目标,并且,对于分析使用具体地从蛋白质C检测的碎片离子
    (IRDWYQK+H:m/z?1008)的信号强度。图4示出没有经受归一化
    处理的碎片离子信号强度的分布。

    下面,基于如上面描述的那样被归一化的蛋白质C碎片离子的强
    度值构成测量图像。图5示出结果。在图5中,由于信号强度被归一
    化,因此,对于各像素的测量的变化被校正。此外,在图5中,如果
    碎片离子种类之间的检测效率差异被忽略,那么也可根据用作内部标
    准的材料的丰度和归一化的离子强度值来估计蛋白质C的大致丰度。
    在本例子的情况下,通过从这样的事实来估计值,断面细胞内部区域
    的平面中的蛋白质C的丰度可被估计为约30~1×102件/μm2:用作断
    面细胞内部区域(a)中的内部标准的蛋白质β-肌动蛋白的丰度被视为
    每个细胞约105~106件。此外,关于图5中的归一化的信号强度的每
    个计数的量,断面细胞内部区域的平面中的蛋白质C的丰度将为4~
    100件/计数。

    比较例

    出于比较的目的,图6A和图6B分别示出对于整个测量范围中的
    所有像素使用相同的内部标准材料(上述的蛋白质β-肌动蛋白碎片离
    子和脂质碎片离子之一)通过归一化而重构测量图像的情况下的结果。
    在归一化中,当因内部标准的信号强度为零的事实而出现划分误差时,
    通过向内部标准的信号适当地加入小的值(例如,1)而进行校正。

    当使用蛋白质β-肌动蛋白的碎片离子作为内部标准时,获得图6A
    的图像。由于对于整个测量范围的像素使用了相同的内部标准材料的
    碎片离子信号强度,因此,对于例如很少存在蛋白质β-肌动蛋白的细
    胞外部区域和核区域中的实际丰度,蛋白质C碎片离子的信号强度是
    比该信号强度高的值。在图5中,在几乎所有的像素中,细胞外部归
    一化信号强度示为0~10。另一方面,在图6A中,通过像素,细胞外
    部归一化信号强度在0~10和90~100之间大大改变。图6A缺少与
    实际蛋白质C的丰度的相关性,原因是蛋白质C原本仅在细胞内部区
    域中。

    当使用脂质碎片离子作为内部标准时,将获得图6B。然后,在很
    少存在脂质的细胞外部区域和核区域中,呈现出缺少与实际丰度的相
    关性的归一化信号强度。

    由于图5使用适于每个区域的内部标准而被归一化,因此,区域
    之间的对比度被调整以创建比图6A和图6B清楚的图像。

    表1示出在上述的例子1和比较例中没有经受归一化处理的蛋白
    质C的信号分布(图4)和通过归一化处理方法获得的蛋白质C的信
    号分布(图5、图6A和图6B)中的断面细胞内部区域、细胞中的断
    面核区域、以及细胞外部区域中的每一个中的信号强度(计数或任意
    单位)及其分布百分比。表1示出了,在以上的例子中的通过归一化
    过程获得的蛋白质C的信号分布(图5)中,以所有信号的97%或更
    大的高百分比从断面细胞内部区域检测蛋白质C的信号。这示出了适
    于主要存在于细胞内部区域中的蛋白质C的原本的分布的存在分布。
    另一方面,在比较例中的没有经受归一化处理的信号分布(图4)和
    通过归一化处理方法获得的信号分布(图6A和图6B)中,断面细胞
    内部区域中的检测率不那么高,并且,即使在断面核区域和细胞外部
    区域中也检测到信号。这些分布没有正确地示出蛋白质C的原本的分
    布。以上的结果还示出通过本例子的过程执行适当的信号归一化。因
    此,通过在没有规定“像素所属于的区域”的情况下使用向分析物的
    测量范围中的所有像素施加内部标准材料的常规的归一化过程,在细
    胞水平上将蛋白质可视化是非常困难的,并且,也难以获得稳定的定
    量结果。

    如上所述,例子1和比较例验证了可通过借助于根据“像素所属
    于的区域”施加内部标准材料并且执行图像重构而使TOF-SIMS测量
    结果经受目标构成物的归一化来更定量地获得关于存在于患病组织切
    片中的特定蛋白质的二维分布状态的信息。

    例子2

    以下,示出保持从确定的测量范围获得的分析物中的构成物的质
    量的信息作为电子数据并且对于所述电子数据使用计算机软件以半自
    动地形成目标构成物的二维分布图像的方法。

    用于处理的数据是存储通过测量在例子1中获得的胰蛋白酶消化
    组织切片获得的质谱二维分布的电子数据。处理的过程如下。

    (步骤1)规定测量范围中的像素的数量。该质谱的二维分布数
    据由XY方向上的128×128个测量像素构成。出于减少处理时间的目
    的,通过将XY方向上的2×2个测量像素重新定义为一个像素,将测
    量范围划分成64×64个像素。并且,向XY坐标中的每个像素新赋予
    0~63的编号。

    (步骤2)从各像素提取质谱,并且,每个谱与XY坐标一起作
    为单个数据被保存在存储器区域中。

    (步骤3)根据所获得的质谱确定各像素所属于的区域。(1)作
    为用于区分区域的标准,规定在例子1中使用的以下离子峰值(ion?
    peak)中的每一个:(a)的蛋白质β-肌动蛋白(氨基酸序列
    LDLAGR+H:m/z?644)的碎片离子、(b)的蛋白质组蛋白(LLGR+H:
    m/z?457)的碎片离子、以及(c)的蛋白质血清白蛋白(FPK+Na:
    m/z?413)的碎片离子。(2)计算各像素的质谱中的(a)、(b)和
    (c)中的每一个的信号强度。通过分别将离子峰值(a)、(b)和(c)
    指定为N=1、2和3并且使用各像素的坐标XY作为指数,在阵列P
    (X、Y、Z)中存储信号强度的值。(3)确定所有测量像素中的离
    子峰值(a)、(b)和(c)中的每一个的各平均强度值,并且,得到
    的值被存储在阵列Q(N)中。(4)在所有的像素中,N从1依次变
    为3,并且,检索P(X、Y、N)>Q(N)的情况。各像素所属于的
    区域是以下中的任何一个:当N=1时的细胞内部区域,即(a);当
    N=2时的核区域,即(b);以及当N=3时的细胞外部区域,即(c)。
    当所检索的结果与以上情况中的任一个都不对应时,由于像素没有它
    所属于的区域,因此随后的步骤4~6中的处理被省略。出于参照目的,
    图7示出64×64个像素中的(a)、(b)和(c)中的每一个的离子峰
    值强度(归一化值)。

    (步骤4)根据各像素所属于的每个区域,对于已确定属于哪个
    区域的像素确定要施加到归一化计算的内部标准材料。在本例子中,
    上述的用于区分区域的(a)的蛋白质β-肌动蛋白及其碎片离子(氨基
    酸序列LDLAGR+H:m/z?644)、(b)的蛋白质组蛋白及其碎片离
    子(LLGR+H:m/z?457)、以及(c)的蛋白质血清白蛋白及其碎片
    离子(FPK+Na:m/z?413)作为从这些材料导出的内部标准材料和碎
    片离子分别被分配给像素所属于的细胞内部区域(a)、核区域(b)
    和细胞外部区域(c)。

    (步骤5)使用从各像素中的质谱的目标构成物导出的质量的信
    号强度和从在步骤4中分配的内部标准材料导出的碎片离子的强度,
    计算归一化的信号强度。在由像素的XY坐标表示的阵列存储区域R
    (X,Y)中存储所得到的归一化值。在本例子中,与例子1类似,使
    用蛋白质C作为目标构成物,并且,对于归一化的目标使用其碎片离
    子(IRDWYQK+H:m/z?1008)的信号强度。图8示出归一化之前的
    蛋白质C碎片离子的信号强度的分布。

    (步骤6)使用从目标构成物导出的质量信号强度的归一化值,
    构建测量范围中的二维分布图像。在图9中构建所构建的归一化质量
    信号的二维分布图像。

    出于比较目的,示出了对于整个测量范围中的所有像素通过使用
    相同的内部标准材料执行归一化的情况的结果。使用上述的β-肌动蛋
    白碎片离子(LDLAGR+H:m/z?644)和脂质碎片离子(磷酸胆碱:
    m/z?184)中的一种作为内部标准材料。分别在图10A和图10B中示
    出了结果。在归一化中,当由于内部标准的信号强度为零的事实而出
    现划分误差时,事先跳过计算并且将0(零)值输入到阵列存储区域
    (X,Y)中。显然,与通过其它方法进行归一化的信号分布(图10A
    和图10B)相比,通过以上的处理,使用适于各区域的内部标准而归
    一化的信号分布(图9)正确地表现了存在于细胞内部区域中的蛋白
    质C的原本的分布。

    表1

    通过各种归一化处理方法的各区域的蛋白质C的信号分布比较


    虽然已参照示例性实施例说明了本发明,但应理解,本发明不限
    于公开的示例性实施例。以下的权利要求的范围应被赋予最宽的解释
    以包含所有的变更方式和等同的结构和功能。

    本申请要求在2009年4月10日提交的日本专利申请No.
    2009-096091的权益,在此以引用方式将其全部内容并入本文。

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