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    vv重庆时时彩平台: 一种测定人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 测定 血浆 洛伐他汀 羟基 浓度 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010270529.7

    申请日:

    2010.09.01

    公开号:

    CN102384954A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/72申请日:20100901|||公开
    IPC分类号: G01N30/72; G01N30/06 主分类号: G01N30/72
    申请人: 北京北大维信生物科技有限公司
    发明人: 段震文; 郭树仁
    地址: 100080 北京市海淀南路30号航天精密大厦10层
    优先权:
    专利代理机构: 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 11108 代理人: 张韬
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010270529.7

    授权公告号:

    102384954B||||||

    法律状态公告日:

    2015.03.11|||2012.05.02|||2012.03.21

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种采用LC/MS/MS法测定K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法。经过实验,结果表明本发明浓度测定方法适用于浓度在0.5-48ng/mL范围内的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的测定。

    权利要求书

    1.一种测定人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法,其特征在于该方法
    包括如下步骤:
    A.配备溶液:
    (1)空白介质的配制:配制pH?4±0.1的空白K2ETDA人血浆
    移取166.7μL?96%甲酸至50mL空白K2ETDA(乙二胺四乙酸二钾)人血浆,并充分
    混合;
    (2)洗针液的配制:甲醇∶水=50∶50
    移取500mL水和500mL甲醇至容器中;充分混合,室温存放;
    (3)0.1%甲酸溶液(用甲醇配制)的配制
    移取100μL的甲酸和100ml甲醇至试剂瓶中;充分混合,室温存放;
    (4)流动相A:0.5%甲酸水溶液的配制
    移取1000mL水和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温存放;
    (5)流动相B:0.5%甲酸甲醇溶液的配制
    移取1000mL甲醇和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温存放;
    (6)0.5%甲酸的甲醇/水(50∶50)溶液的配制
    移取500mL甲醇,500mL水和5mL甲酸至试剂瓶,充分混合,超声5min,室温
    存放;
    (7)标准储备液的配制
    洛伐他汀标准储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液
    溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀标准储备液,于-20℃
    储存;
    羟基洛伐他汀酸标准储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量瓶中,
    用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的羟基洛伐他汀酸
    标准储备液,于-20℃储存;
    标准储备液1:移取0.1mL洛伐他汀标准储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸标准储备液
    至10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10μg/ml的洛伐他汀
    和10μg/ml的羟基洛伐他汀酸的混合标准储备液,充分混合,得标准储备液1,于-20℃
    储存;
    (8)标准曲线用标准工作溶液的配制
    标准曲线用标准工作溶液:用0.1%甲酸甲醇溶液稀释标准储备液1配制,如表1
    所示;充分混合并于-20℃储存;
    表1标准曲线用标准工作溶液的配制

    (9)储备液的配制
    洛伐他汀储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液溶解
    并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀储备液;于-20℃储存;
    羟基洛伐他汀酸储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量瓶中,用0.1%
    甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的羟基洛伐他汀酸储备液,
    于-20℃储存;
    储备液1:移取0.1mL洛伐他汀储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸储备液至10mL容量
    瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10μg/ml的洛伐他汀和10μg/ml
    的羟基洛伐他汀酸的混合储备液,充分混合,即得储备液1,于-20℃储存;
    (10)样品用工作溶液的配制:用K2ETDA人血浆稀释储备液1配制,表2所示;于-20℃
    储存;
    表2样品用工作溶液的配制

    注:QCH:高浓度样品
    QCM:中浓度样品
    QCL:低浓度样品
    (11)内标溶液的配制
    羟基辛伐他汀酸钠储备液:精确称取5mg羟基辛伐他汀酸钠至25mL容量瓶,用0.1%
    甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得终浓度为200μg/ml的羟基辛伐他汀酸钠储
    备液,于-20℃储存;
    辛伐他汀储备液:精确称取5mg辛伐他汀至25mL容量瓶,用0.1%甲酸溶液溶解
    并稀释至刻度,充分混合即得浓度为200μg/ml的辛伐他汀储备液,于-20℃储存;
    内标加样溶液:移取20μL浓度为200μg/ml的羟基辛伐他汀酸钠储备液和20μL浓
    度为200μg/ml的辛伐他汀储备液至20mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液稀释至刻度,充分
    混合,即得内标加样溶液,于-20℃储存;
    B.提取
    (1)如表3配制标准工作溶液:
    表3标准工作溶液的配制

    (2)将标准工作溶液,储备液1,待测样品,和空白K2ETDA人血浆在冰水浴中涡流
    振荡解冻;
    (3)吸取500μL血浆(含双空白,空白和样品)各置一玻璃试管,加入50μL的
    0.1%甲酸溶液;
    (4)双空白加10μL的0.1%甲酸溶液,在其它样品中分别加入10μL的内标加样
    溶液,涡流15秒;
    (5)加入2mL流动相B,试管加盖后充分涡流混合;
    (6)以3500rpm速度离心10分钟,上清液转移到另一支玻璃试管,每支试管内加
    入2mL流动相A,充分混合;
    (7)将SPE板先用1000μL流动相B冲洗2次,再用1000μL流动相A冲洗2次,
    低真空度抽干;
    (8)将步骤(6)的溶液移至SPE板,让样品液慢慢通过填料床,低真空度至每个
    小室都变干后再调到最大真空度以保证所有上清液都被完全抽干;
    (9)分别用1000μL流动相A冲洗各小室两次,抽干1分钟,再用1000μL?0.5%的
    甲酸甲醇∶水=50∶50的溶液冲洗各小室3次,低真空抽干15秒;
    (10)把一块2.2mL深孔96孔接收板置于SPE板下面,每个小孔分别用1000μL
    流动相B洗脱,洗脱液用氮气在35℃条件下吹干;
    (11)干燥后的残渣200μL流动相B溶解,涡流30秒;以大于3200rpm的速度离
    心10分钟,上清液转移至HPLC进样瓶;
    其中,上述步骤(1)到(5),除了涡流混合,都在冰水浴中操作;
    C.数据分析
    保留时间和峰面积由数据采集和分析软件(Version?1.4.1)确定;以峰面积比对浓
    度做标准工作曲线,得到如下线性回归方程,用以计算待测溶液中被分析物的浓度:
    y=ax+b
    其中:y=被分析物与内标的峰面积比
    a=相应标准工作曲线的斜率
    b=相应标准工作曲线的截距
    x=被分析物的浓度(ng/mL)
    (采用加权最小二乘法)。

    说明书

    一种测定人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法

    技术领域

    本发明涉及一种测定人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法,特
    别涉及一种液相色谱-质谱法(LC/MS/MS法),用于测定含甲酸乙二胺四乙酸抗
    凝血浆(ETDA-K2人血浆)中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法。

    背景技术

    目前测定血浆中洛伐他汀和洛伐他汀酸的方法主要有HPLC/GC/MS、
    HPLC/MS、HPLC/MS/MS、RP-HPLC以及固相萃取法等等。HPLC/GC/MS和HPLC/MS
    法测定需要的血浆用量较大,而且最低检测浓度高(一般为0.36-2.5μg/L)。
    HPLC/MS/MS法的预处理方法为离心后取上层液直接进样,血浆中的杂质易保留
    在色谱柱上,引起柱压升高,寿命缩短,最低检测浓度亦较高,一般为0.97μg/L。
    RP-HPLC法样品处理复杂、测定速度慢,不能满足实际检测的需要。固萃取法步
    骤多,成本高,最低检测浓度一般为0.5μg/L,不利于大量样品的测定。本法
    采用LC/MS/MS法测定含甲酸乙二胺四乙酸抗凝血浆(ETDA-K2人血浆)中洛伐他
    汀和羟基洛伐他汀酸浓度的方法尚未见文献报道,本法具有血浆用量少、稳定性
    好、最低检测浓度小等优点,且对于长期储存的样品是稳定的,因此可以用于大
    量血浆样品的检测。

    发明内容

    本发明的目的在于公开一种测定ETDA-K2人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀
    酸的浓度的方法。

    本发明是通过如下方案实现的:

    本发明浓度测定方法包括如下步骤:

    A.配备溶液:

    (1)空白介质的配制:配制pH?4±0.1的空白K2ETDA人血浆

    移取166.7μL?96%甲酸至50mL空白ETDA-K2(乙二胺四乙酸二钾)人血浆,
    并充分混合;

    (2)洗针液的配制:甲醇∶水=50∶50

    移取500mL水和500mL甲醇至容器中;充分混合,室温存放;

    (3)0.1%甲酸溶液(用甲醇配制)的配制

    移取100μL的甲酸和100ml甲醇至试剂瓶中;充分混合,室温存放;

    (4)流动相A:0.5%甲酸水溶液的配制

    移取1000mL水和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温存
    放;

    (5)流动相B:0.5%甲酸甲醇溶液的配制

    移取1000mL甲醇和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温
    存放;

    (6)0.5%甲酸的甲醇/水(50∶50)溶液的配制

    移取500mL甲醇,500mL水和5mL甲酸至试剂瓶,充分混合,超声5min,
    室温存放;

    (7)标准储备液的配制

    洛伐他汀标准储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲
    酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀标准储备
    液,于-20℃储存;

    羟基洛伐他汀酸标准储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量
    瓶中,用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的
    羟基洛伐他汀酸标准储备液,于-20℃储存;

    标准储备液1:移取0.1mL洛伐他汀标准储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸标
    准储备液至10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10
    μg/ml的洛伐他汀和10μg/ml的羟基洛伐他汀酸的混合标准储备液,充分混合,
    得标准储备液1,于-20℃储存;

    (8)标准曲线用标准工作溶液的配制

    标准曲线用标准工作溶液:用0.1%甲酸甲醇溶液稀释标准储备液1配制,
    如表1所示;充分混合并于-20℃储存;

    表1标准曲线用标准工作溶液的配制



    (9)储备液的配制

    洛伐他汀储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲酸
    溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀储备液;于
    -20℃储存;

    羟基洛伐他汀酸储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量瓶中,
    用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的羟基洛伐
    他汀酸储备液,于-20℃储存;

    储备液1:移取0.1mL洛伐他汀储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸储备液至
    10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10μg/ml的洛
    伐他汀和10μg/ml的羟基洛伐他汀酸的混合储备液,充分混合,即得储备液1,
    于-20℃储存;

    (10)样品用工作溶液的配制:用K2ETDA人血浆稀释储备液1配制,表2
    所示;于-20℃储存;

    表2样品用工作溶液的配制


    注:QCH:高浓度样品

    QCM:中浓度样品

    QCL:低浓度样品

    (11)内标溶液的配制

    羟基辛伐他汀酸钠储备液:精确称取5mg羟基辛伐他汀酸钠至25mL容量
    瓶,用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得终浓度为200μg/ml的
    羟基辛伐他汀酸钠储备液,于-20℃储存;

    辛伐他汀储备液:精确称取5mg辛伐他汀至25mL容量瓶,用0.1%甲酸
    溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为200μg/ml的辛伐他汀储备液,于
    -20℃储存;

    内标加样溶液:移取20μL浓度为200μg/ml的羟基辛伐他汀酸钠储备液和
    20μL浓度为200μg/ml的辛伐他汀储备液至20mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液稀
    释至刻度,充分混合,即得内标加样溶液,于-20℃储存;

    B.提取

    (1)如表3配制标准工作溶液:

    表3标准工作溶液的配制


    (2)将标准工作溶液,储备液1,待测样品,和空白ETDA-K2人血浆分别在
    冰水浴中涡流振荡解冻;

    (3)吸取500μL血浆(含双空白,空白和样品)各置一玻璃试管,加入
    50μL的0.1%甲酸溶液;

    (4)双空白加10μL的0.1%甲酸溶液,在其它样品中分别加入10μL的
    内标加样溶液,涡流15秒;

    (5)加入2mL流动相B,试管加盖后充分涡流混合;

    (6)以3500rpm速度离心10分钟,上清液转移到另一支玻璃试管,每支
    试管内加入2mL流动相A,充分混合;

    (7)将SPE板先用1000μL流动相B冲洗2次,再用1000μL流动相A冲
    洗2次,低真空度抽干;

    (8)将步骤(6)的溶液移至SPE板,让样品液慢慢通过填料床,低真空度
    至每个小室都变干后再调到最大真空度以保证所有上清液都被完全抽干;

    (9)分别用1000μL流动相A冲洗各小室两次,抽干1分钟,再用1000μL?0.5%
    的甲酸甲醇∶水=50∶50的溶液冲洗各小室3次,低真空抽干15秒;

    (10)把一块2.2mL深孔96孔接收板置于SPE板下面,每个小孔分别用
    1000μL流动相B洗脱,洗脱液用氮气在35℃条件下吹干;

    (11)干燥后的残渣200μL流动相B溶解,涡流30秒;以大于3200rpm
    的速度离心10分钟,上清液转移至HPLC进样瓶;

    其中,上述步骤(1)到(5),除了涡流混合,都在冰水浴中操作;

    C.数据分析

    保留时间和峰面积由数据采集和分析软件(Version?1.4.1)确定;以峰面
    积比对浓度做标准工作曲线,得到如下线性回归方程,用以计算待测溶液中被分
    析物的浓度:

    y=ax+b

    其中:y=被分析物与内标的峰面积比

    a=相应标准工作曲线的斜率

    b=相应标准工作曲线的截距

    x=被分析物的浓度(ng/mL)

    (采用加权最小二乘法)

    附图说明

    图1:洛伐他汀双空白介质的代表图谱;

    图2:洛伐他汀酸双空白介质的代表图谱;

    图3:洛伐他汀的空白介质代表图谱;

    图4:洛伐他汀酸的空白介质代表图谱;

    图5:洛伐他汀低限校正标准溶液的代表图谱;

    图6:洛伐他汀酸低限校正标准溶液的代表图谱;

    图7:洛伐他汀代表线性图;

    图8:洛伐他汀酸代表线性图;

    图9:洛伐他汀平均血药浓度-时间曲线;

    图10:洛伐他汀酸平均血药浓度-时间曲线。

    本发明公开了一种采用LC/MS/MS法测定K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他
    汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法。实验采用500μL样品,洛伐他汀和羟基洛
    伐他汀酸的定量限均为0.5ng/mL。经过实验证明本方法对洛伐他汀和羟基洛伐
    他汀酸的分析范围都是0.5-48ng/mL。分析浓度超出定量上限的样品可用K2ETDA
    人血浆稀释到适宜浓度范围内(稀释因子=20)。洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸在人
    血浆中经过3次冻融循环和冰-水条件下放置6小时均是稳定的。中间样品在4
    ℃下放置48小时后是稳定的。洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸分别在-20℃条件下储
    存在人血浆中42天也是稳定的。将洛伐他汀储备液(1mg/mL)、羟基洛伐他汀
    酸储备液(1mg/mL)、洛伐他汀储备液(10μg/mL)、羟基洛伐他汀酸储备液(10
    μg/mL)和羟基辛伐他汀酸储备液在-20℃条件下分别放置18、30、16、16和30
    天也是稳定的。将羟基洛伐他汀酸(25ng/mL)、辛伐他汀和羟基辛伐他汀酸标准
    加样样品在-20℃条件下分别放置23天、27天和2个月也是稳定的。结果表明
    本发明浓度测定方法适用于浓度在0.5-48ng/mL范围内的洛伐他汀和羟基洛伐
    他汀酸的测定。

    以下实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

    下述实验例1-8为按照本发明实施例1所述方法测定K2ETDA人血浆中洛伐
    他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度,分别使用辛伐他汀及辛伐他汀酸为内标测定洛伐
    他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度。下列实验中对该方法进行了验证性评估,评价其
    是否适用于测定K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度。
    研究结果表明该方法完全符合各项要求,可用于生物学研究。所有数据均合乎标
    准。

    实验例1:本发明浓度测定方法的选择性实验

    用本发明方法分析收集自6份不同批次的对照血浆(n=6),1份对照血浆
    加入内标(0ng/mL样品,n=1),1份加入含内标的定量下限(Low?Limit?of?
    Quantitation,LLOQ)样品(n=1)。分析结果见表4和表5。

    表4洛伐他汀选择性研究


    *注:使用的是标准数据

    表5洛伐他汀酸的选择性研究



    *注:使用的是标准数据

    结果表明在洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸以及它们的内标的保留时间(Rt)附
    近没有明显的基线干扰:在分析目的物的保留时间处无显著干扰峰(小于LLOQ
    的20%)。而且在内标物质的保留时间处无显著干扰峰(小于内标信号的5%)。双
    空白介质、空白介质和校正标准下限(0.5ng/mL洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸)
    的代表图谱分别见附图1、2、3、4、5和6。洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的保留
    时间分别约为1.36min和1.33min。

    实验例2本发明浓度测定方法的灵敏度实验

    洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的定量下限(LLOQ)设定为0.5ng/mL。为了确
    证灵敏度,检测了6份加入LLOQ浓度水平的分析目的物的样品,依据相应校正
    曲线计算实测浓度。洛伐他汀的结果见表6、羟基洛伐他汀酸的结果见表7:

    表6洛伐他汀定量下限样品结果


    表7羟基洛伐他汀酸定量下限样品结果



    注:*异常值,统计中删除

    结果证明,本方法在LLOQ的精密度和准确度均达到生物分析研究的要求:
    准确度(%Nom)在(100±20)%范围内,变异系数(%CV)不大于20%。数据表明,
    本方法灵敏度足以测定浓度为0.5ng/mL的洛伐他汀与羟基洛伐他汀酸。

    实验例3本发明浓度测定方法校正曲线标准浓度实验

    洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的每条校正曲线的标准溶液的实测浓度分别见
    表8和表9。

    表8洛伐他汀的校正标准溶液的实测浓度




    表9羟基洛伐他汀酸的校正标准溶液的实测浓度




    结果表明,本方法符合生物分析方法验证研究的要求:实测浓度不超出理论
    浓度的±15%,而LLOQ浓度点的实测浓度不超出理论浓度的±20%;至少75%非
    零浓度点(包括LLOQ和ULOQ)必须达到上述标准。

    实验例4本发明浓度测定方法线性实验

    本方法的线性在洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸0.5-48ng/mL浓度范围内进行
    评价。线性回归(加权最小二乘法)最适于反映K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛
    伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度与响应值的关系。洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的
    校正曲线参数分别见表10和表11,洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的代表线性图分
    别见附图7和附图8:

    表10羟基洛伐他汀酸的校正曲线参数


    表11羟基洛伐他汀酸的校正曲线参数


    结果:洛伐他汀所有的线性图都具有良好相关性(R),大于0.997。羟基洛
    伐他汀酸每条线性图的相关性(R)均大于0.993。

    实验例5本发明浓度测定方法日内和日间精密度实验

    分别选择3个不同浓度水平(1.5ng/ml、15ng/ml、36ng/ml的洛伐他汀
    和羟基洛伐他汀酸),考察本发明方法日内和日间精密度。洛伐他汀和羟基洛伐
    他汀酸样品的统计结果分别见表12和表13。

    表12洛伐他汀的日内和日间准确度和精密度



    表13羟基洛伐他汀酸的日内和日间准确度和精密度



    结果表明本发明浓度测定方法的日内和日间精密度符合生物分析研究的要
    求:准确度(%Nom)在(100±15)%范围内,变异系数(%CV)不大于15%。

    实验例6本发明浓度测定方法回收率的实验

    洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的回收率分别以两个(QC)浓度水平(1.5ng/ml、
    36ng/ml)进行测量。每个条件分别制备3份平行样,以结果的平均值进行比较。
    洛伐他汀不同浓度水平的回收率结果见表14,分别为74.3%和76.4%。羟基洛伐
    他汀酸不同浓度水平的回收率结果见表15,分别为72.5%和65.8%。

    表14洛伐他汀回收率


    表15羟基洛伐他汀酸回收率


    在分别含1.5ng/ml和36ng/ml的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的样品中分
    别加入辛伐他汀及羟基辛伐他汀酸至浓度达到200ng/mL,以此溶液测定内标辛
    伐他汀及羟基辛伐他汀酸的回收率。每个条件分别制备3份平行样品,以结果的
    平均值进行比较。辛伐他汀不同浓度水平的回收率结果见表16和表17,分别为
    85.5%和81.6%。羟基洛伐他汀酸不同浓度水平的回收率结果见表18和表19,
    分别为85.0%和96.2%。

    表16加入洛伐他汀(1.5ng/ml)的辛伐他汀(内标)的回收率



    表17加入洛伐他汀(36ng/ml)的辛伐他汀(内标)的回收率


    表18加入羟基洛伐他汀酸(1.5ng/ml)的羟基辛伐他汀酸(内标)的回收率



    表19加入羟基洛伐他汀酸(36ng/ml)的羟基辛伐他汀酸(内标)的回收率


    实验例7本发明浓度测定方法稀释完整性实验

    在分析样品时,当分析浓度超出定量上限就必须对样品进行稀释。为了确保
    高浓度样品的稀释液的分析信号在分析范围和可接受的偏差限度内,在混合血浆
    里分别加入超出本发明方法分析范围浓度的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸(500
    mg/mL的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸)。通过将样品用混合血浆稀释20倍得到分
    别含25ng/mL洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的6份平行样。稀释后的样品分别用
    洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸标准校正曲线进行分析。实测浓度乘以相应稀释因子
    (20)得到校正浓度。结果表明稀释完整性评价符合生物分析研究的要求:校正
    浓度的准确度(%Nom)在(100±15)%范围内,变异系数(%CV)小于15%。洛伐
    他汀和羟基洛伐他汀酸的稀释完整性试验结果是可接受的,分别见表20和表
    21。

    表20洛伐他汀的稀释完整性研究结果



    表21羟基洛伐他汀酸的稀释完整性研究结果


    实验例8本发明浓度测定方法的稳定性实验

    1、短期稳定性(冰-水)

    将两个浓度(1.5ng/mL和36ng/mL)的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸样品在
    冰水条件下放置6小时以考察它们在K2ETDA人血浆(含甲酸)中的短期稳定性,
    采用新制定的校正曲线进行含量计算。洛伐他汀结果见表22、羟基洛伐他汀酸
    结果见表23:

    表22冰水条件下放置6小时后K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀的短期
    稳定性结果


    表23冰水条件下放置6小时后K2ETDA人血浆(含甲酸)中羟基洛伐他汀酸的
    短期稳定性结果



    结果证明人血浆中的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸在冰-水条件下放置6小
    时是稳定的。

    2、长期稳定性

    将两个浓度(1.5ng/ml、36ng/ml的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸,n=6)
    的样品在-20℃一般冷冻温度下放置14天和42天考察K2ETDA人血浆(含甲酸)
    中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的在-20℃储存条件下的长期稳定性,用新制备的
    校正曲线进行含量计算,洛伐他汀结果见表24和表25、羟基洛伐他汀酸结果见
    表26和表27:

    表24在-20℃冷冻条件下放置14天的K2EDTA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀的
    长期稳定性结果


    表25在-20℃冷冻条件下放置42天的K2EDTA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀的
    长期稳定性结果



    表26在-20℃冷冻条件下放置14天的K2EDTA人血浆(含甲酸)中羟基洛伐他
    汀酸的长期稳定性结果


    表27在-20℃冷冻条件下放置42天的K2EDTA人血浆(含甲酸)中羟基洛伐他
    汀酸的长期稳定性结果


    结果证明人血浆中的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸在42天内是稳定的。

    3、冻融稳定性

    使用两个浓度(1.5ng/ml、36ng/ml的洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的样品
    考察K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的在冻融循环后的
    稳定性,每个浓度设6个平行样品。结果证明人血浆中的洛伐他汀和羟基洛伐他
    汀酸经过3次冻融操作是稳定的,见表28和表29:

    表28洛伐他汀的冻融稳定性结果


    表29羟基洛伐他汀酸的冻融稳定性结果



    4、中间样品(Processed?Sample)稳定性

    将初步处理后的中间样品在4℃下放置48小时后用新制备的校正曲线再分
    析考察K2ETDA人血浆(含甲酸)中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的中间样品的稳
    定性。结果见表30和表31:

    表30中间样品在4℃条件下放置48小时的洛伐他汀稳定性结果


    表31中间样品在4℃条件下放置48小时的羟基洛伐他汀酸稳定性结果



    结果证明洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸中间样品是稳定的。

    5、储备液稳定性

    将洛伐他汀储备液(1mg/ml)、羟基洛伐他汀酸储备液(1mg/ml)、洛伐他
    汀储备液(10μg/ml)、羟基洛伐他汀酸储备液(10μg/ml)和羟基辛伐他汀酸
    储备液在-20℃条件下分别放置18、30、16、16和30天考察储备液冷冻条件下
    的稳定性,结果见表32、表33、表34、表35、表36:

    表32洛伐他汀储备液(1mg/ml)-20℃条件下放置18天的稳定性结果


    表33羟基洛伐他汀酸储备液(1mg/ml)-20℃条件下放置30天的稳定性结果


    表34洛伐他汀储备液(10μg/ml)-20℃条件下放置16天的稳定性结果


    表35羟基洛伐他汀酸储备液(10μg/ml)-20℃条件下放置16天的稳定性结



    表36羟基辛伐他汀酸储备液-20℃条件下放置30天的稳定性结果


    结果证明洛伐他汀储备液(1mg/ml)、羟基洛伐他汀酸储备液(1mg/ml)、
    洛伐他汀储备液(10μg/ml)、羟基洛伐他汀酸储备液(10μg/ml)和羟基辛伐
    他汀酸储备液在-20℃条件下分别放置18、30、16、16和30天是稳定的。

    6、标准加样样品(Standard?Spike)稳定性

    将羟基洛伐他汀酸(25ng/mL)、辛伐他汀和羟基辛伐他汀酸标准加样样品在
    -20℃条件下分别放置23天、27天和2个月。分别与新配制的羟基洛伐他汀酸、
    辛伐他汀和羟基辛伐他汀酸相比较。表37是洛伐他汀标准加样样品在-20℃条
    件下分别放置23天的稳定性结果,表38是羟基洛伐他汀酸标准加样样品在-20
    ℃条件下分别放置27天的稳定性结果,表39是羟基辛伐他汀酸标准加样样品
    在-20℃条件下分别放置2个月的稳定性结果。

    表37羟基洛伐他汀酸标准加样样品-20℃条件下放置23天的稳定性结果


    表38辛伐他汀标准加样样品-20℃条件下放置27天的稳定性结果



    表39羟基辛伐他汀酸标准加样样品-20℃条件下放置2个月的稳定性结果


    下述实施例均能实现上述实验例所述效果。

    具体实施方式

    实施例1:本发明浓度测定方法

    一、实施设备:

    LC/MS/MS,岛津AP15000型液相高压泵及自动进样器;

    数据采集和分析软件(Version?1.4.1);

    离心机,3500转;

    色谱柱:AtlantisTM?dC18,3μm,3.0×20mm;

    分析天平,最小称量至0.00001g;

    纯水系统:ELGA?Classic?UV(>18.0MΩ);

    固相萃取(SPE)96孔板(cleanert?C896-well,Agela);

    2.2ml?96孔板。

    二、试剂和材料:

    羟基洛伐他汀酸钠????????????????????????????????标准品

    羟基辛伐他汀酸钠(内标)??????????????????????????标准品

    洛伐他汀????????????????????????????????????????标准品

    辛伐他汀(内标)??????????????????????????????????标准品

    甲醇????????????????????????????????????????????色谱纯

    96%甲酸????????????????????????????????????????色谱纯

    水??????????????????????????????????????????????≥18.0MΩ

    空白人血浆??????????????????????????????????????抗凝血K2ETDA

    三、仪器条件:

    (1)高效液相色谱条件:

    流动相A:?????????????????????????0.5%甲酸水溶液

    流动相B:?????????????????????????0.5%甲酸甲醇溶液

    流速:????????????????????????????1.0mL/min

    进样体积:????????????????????????10μL

    洗针液:??????????????????????????甲醇/水(50∶50)

    自动进样器温度:??????????????????4℃

    柱温箱:??????????????????????????室温

    数据采集时间:????????????????????7.0min

    色谱柱:??????????????????????????AtlantisTMdC18,3μm,3.0×20mm

    梯度程序(洛伐他汀和辛伐他汀):

    梯度洗脱时间分别为0、1、3、3.1、5、5.1、7min,所用流动相A、B的百
    分比分别为40%和60%、5%和95%、5%和95%、0和100%、0和100%、40%和60%、
    40%和60%。

    梯度程序(洛伐他汀酸和辛伐他汀酸):

    梯度洗脱时间分别为0、1、5、5.1、7min,所用流动相A、B的百分比分别
    为40%和60%、5%和95%、5%和95%、40%和60%、40%和60%。

    (2)MS/MS条件

    洛伐他?。?br />

    极性为正离子,母离子的m/z为405.4,子离子的m/z为199.1,扫描时间
    为150msec,暂停时间为5msec,保留时间为~1.36min。

    辛伐他汀(内标):

    极性为正离子,母离子的m/z为419.5,子离子的m/z为199.3,扫描时间
    为100msec,暂停时间为5msec,保留时间为~1.42min。

    洛伐他汀酸:

    极性为负离子,母离子的m/z为421.6,子离子的m/z为319.3,扫描时间
    为100msec,暂停时间为5msec,保留时间为~1.33min。

    辛伐他汀酸:

    极性为负离子,母离子的m/z为435.4,子离子的m/z为319.4,扫描时间
    为100msec,暂停时间为5msec,保留时间为~1.38min。

    四、实施步骤:

    A.配备溶液:

    (1)空白介质的配制:配制pH?4±0.1的空白K2ETDA人血浆

    移取166.7μL?96%甲酸至50mL空白ETDA-K2人血浆,并充分混合;

    (2)洗针液的配制:甲醇∶水=50∶50

    移取500mL水和500mL甲醇至容器中;充分混合,室温存放;

    (3)0.1%甲酸溶液(用甲醇配制)的配制

    移取100μL的甲酸和100ml甲醇至试剂瓶中;充分混合,室温存放;

    (4)流动相A:0.5%甲酸水溶液的配制

    移取1000mL水和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温存
    放;

    (5)流动相B:0.5%甲酸甲醇溶液的配制

    移取1000mL甲醇和5mL甲酸至试剂瓶中;充分混合,超声5min,室温
    存放;

    (6)0.5%甲酸的甲醇/水(50∶50)溶液的配制

    移取500mL甲醇,500mL水和5mL甲酸至试剂瓶,充分混合,超声5min,
    室温存放;

    (7)标准储备液的配制

    洛伐他汀标准储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲
    酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀标准储备
    液,于-20℃储存;

    羟基洛伐他汀酸标准储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量
    瓶中,用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合,即得浓度为1mg/ml的
    羟基洛伐他汀酸标准储备液,于-20℃储存;

    标准储备液1:移取0.1mL洛伐他汀标准储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸标
    准储备液至10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10
    μg/ml的洛伐他汀和10μg/ml的羟基洛伐他汀酸的混合标准储备液,充分混合,
    得标准储备液1,于-20℃储存;

    (8)标准曲线用标准工作溶液的配制

    标准曲线用标准工作溶液:用0.1%甲酸甲醇溶液稀释标准储备液1配制,
    如表1所示;充分混合并于=20℃储存;

    表1标准曲线用标准工作溶液的配制


    (9)储备液的配制

    洛伐他汀储备液:精确称取5mg洛伐他汀至5mL容量瓶中,用0.1%甲酸
    溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的洛伐他汀储备液;于
    -20℃储存;

    羟基洛伐他汀酸储备液:精确称取5mg羟基洛伐他汀酸钠至5mL容量瓶中,
    用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为1mg/ml的羟基洛伐
    他汀酸储备液,于-20℃储存;

    储备液1:移取0.1mL洛伐他汀储备液和0.1mL羟基洛伐他汀酸储备液至
    10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度,即得浓度为10μg/ml的洛
    伐他汀和10μg/ml的羟基洛伐他汀酸的混合储备液,充分混合,即得储备液1,
    于-20℃储存;

    (10)样品用工作溶液的配制:用K2ETDA人血浆稀释储备液1配制,表2
    所示;于-20℃储存;

    表2样品用工作溶液的配制


    注:QCH:高浓度样品

    QCM:中浓度样品

    QCL:低浓度样品

    (11)内标溶液的配制

    羟基辛伐他汀酸钠储备液:精确称取5mg羟基辛伐他汀酸钠至25mL容量
    瓶,用0.1%甲酸溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得终浓度为200μg/ml的
    羟基辛伐他汀酸钠储备液,于-20℃储存;

    辛伐他汀储备液:精确称取5mg辛伐他汀至25mL容量瓶,用0.1%甲酸
    溶液溶解并稀释至刻度,充分混合即得浓度为200μg/ml的辛伐他汀储备液,于
    -20℃储存;

    内标加样溶液:移取20μL浓度为200μg/ml的羟基辛伐他汀酸钠储备液和
    20μL浓度为200μg/ml的辛伐他汀储备液至20mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液稀
    释至刻度,充分混合,即得内标加样溶液,于-20℃储存;

    B.提取

    (1)如表3配制标准工作溶液:

    表3标准工作溶液的配制


    (2)将标准工作溶液,储备液1,待测样品,和空白ETDA-K2人血浆分别在
    冰水浴中涡流振荡解冻;

    (3)吸取500μL血浆(含双空白,空白和样品)各置一玻璃试管,加入
    50μL的0.1%甲酸溶液;

    (4)双空白加10μL的0.1%甲酸溶液,在其它样品中分别加入10μL的
    内标加样溶液,涡流15秒;

    (5)加入2mL流动相B,试管加盖后充分涡流混合;

    (6)以3500rpm速度离心10分钟,上清液转移到另一支玻璃试管,每支
    试管内加入2mL流动相A,充分混合;

    (7)将SPE板先用1000μL流动相B冲洗2次,再用1000μL流动相A冲
    洗2次,低真空度抽干;

    (8)将步骤(6)的溶液移至SPE板,让样品液慢慢通过填料床,低真空度
    至每个小室都变干后再调到最大真空度以保证所有上清液都被完全抽干;

    (9)分别用1000μL流动相A冲洗各小室两次,抽干1分钟,再用1000μL?0.5%
    的甲酸甲醇∶水=50∶50的溶液冲洗各小室3次,低真空抽干15秒;

    (10)把一块2.2mL深孔96孔接收板置于SPE板下面,每个小孔分别用
    1000μL流动相B洗脱,洗脱液用氮气在35℃条件下吹干;

    (11)干燥后的残渣200μL流动相B溶解,涡流30秒;以大于3200rpm
    的速度离心10分钟,上清液转移至HPLC进样瓶;

    其中,上述步骤(1)到(5),除了涡流混合,都在冰水浴中操作;

    C.数据分析

    保留时间和峰面积由数据采集和分析软件(Version?1.4.1)确定;以峰面
    积比对浓度做标准工作曲线,得到如下线性回归方程,用以计算待测溶液中被分
    析物的浓度:

    y=ax+b

    其中:y=被分析物与内标的峰面积比

    a=相应标准工作曲线的斜率

    b=相应标准工作曲线的截距

    x=被分析物的浓度(ng/mL)

    (采用加权最小二乘法)

    五、研究结果

    1.他汀

    洛伐他汀的药代动力学参数及统计结果分别见表40和附图9。

    单剂量口服1200mg?XZK胶囊或20mg的洛伐他汀药代动力学参
    数如表40所示。

    表40洛伐他汀药代动力学参数的平均值(标准偏差)


    药代动力学参数Cmax,AUC0-t,and?AUC0-∞方差分析的(ANOVA)结果见表40。
    1200mg?XZK试验组与20mg洛伐他汀胶囊的洛伐他汀全身暴露量相当。然而,
    XZK胶囊的吸收力、Cmax值都高得多。

    2.洛伐他汀酸

    洛伐他汀酸的的药代动力学参数及统计结果分别见附图10及表41。

    单剂量口服1200mg?XZK胶囊或20mg的洛伐他汀酸药代动力学
    参数如表41所示。

    表41洛伐他汀酸药代动力学参数的平均值(标准偏差)


    药代动力学参数Cmax,AUC0-t,and?AUC0-∞的方差分析(ANOVA)结果见表41。
    结果显示:1200mg?XZK试验组无论洛伐他汀酸的吸收速率还是吸收量都显著由
    于20mg洛伐他汀胶囊对照组。

    关于本文
    本文标题:一种测定人血浆中洛伐他汀和羟基洛伐他汀酸的浓度的方法.pdf
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