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    重庆时时彩攻略论坛: 抗分泌因子AF的用于优化细胞吸收的用途.pdf

    关 键 词:
    分泌 因子 AF 用于 优化 细胞 吸收 用途
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    摘要
    申请专利号:

    CN201080016356.4

    申请日:

    2010.02.11

    公开号:

    CN102387811A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 38/17申请日:20100211|||公开
    IPC分类号: A61K38/17; A61P35/00; G01N33/574 主分类号: A61K38/17
    申请人: 兰特门内阿斯-法克托尔公司
    发明人: 埃娃·延尼斯歇; 斯特凡·朗厄; 汉斯-阿尔内·汉松
    地址: 瑞典斯德哥尔摩
    优先权: 2009.02.11 SE 0900170-2
    专利代理机构: 北京同达信恒知识产权代理有限公司 11291 代理人: 黄志华
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201080016356.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.01.19|||2012.05.02|||2012.03.21

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白、具有等同功能活性的肽、其衍生物、其同系物、和/或其片段、和/或其药学活性的盐在优化药物和/或制剂的递送和细胞吸收或者基因递送中的应用。典型地,所述药物和/或制剂包括抗癌药物、辐射治疗药物、抗细菌药物、抗病毒药物、或者靶向外伤后引起的损伤、神经退化、寄生虫或者炎症的药物。

    权利要求书

    1.抗分泌因子(AF)蛋白、具有等同活性的其衍生物、其同系物、和/或其片
    段、和/或其药学活性的盐在制备用于优化另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞
    吸收的药物组合物和/或医疗食品中的用途。
    2.根据权利要求1所述的用途,其中所述第二或另外的药物和/或制剂选自
    于:抗癌药物,细胞抑制生长药物,辐射治疗药物,抗微生物药物,抗细菌药
    物,抗病毒药物,以及靶向外伤后所引起损伤、神经退化、寄生虫、或者炎症
    的药物。
    3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途,所述用途用于治疗和/或预防肿
    瘤及其并发症。
    4.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述抗分泌因子(AF)蛋白、
    具有等同活性的其衍生物、其同系物、和/或其片段由下列式的序列或者不改变
    多肽的功能的该序列的修饰物所组成:
    X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
    其中X1为I、SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-35、或者缺失,X2为H、R或K,X3
    为S或L,X4为T或A,X5为SEQ?ID?NO?6的氨基酸43-46、43-51、43-80或
    43-163、或者缺失。
    5.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述药物组合物包括两种
    或多于两种的抗分泌因子(AF)蛋白。
    6.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述药物组合物还包括药
    学上可接受的赋形剂。
    7.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述药物组合物被制成用
    于眼内、鼻内、口服、局部、皮下和/或系统给药。
    8.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述药物组合物被制成用
    于以喷雾剂、气雾剂、吸入剂和/或通过雾化器给药。
    9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途,其中所述药物组合物和/或医疗
    食品被制成用于以0.1μg-10mg/次/kg体重/天的剂量、优选为以1-1000μg/次/kg
    体重/天的剂量系统给药至血液。
    10.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述给药是以单次剂量或
    者以每天多次进行的。
    11.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述抗分泌因子(AF)蛋
    白、具有等同活性的其衍生物、其同系物、和/或其片段是以富集抗分泌因子的
    卵黄提供的。
    12.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述抗分泌因子(AF)蛋
    白、具有等同活性的其衍生物、其同系物、和/或其片段是通过服用食物和/或特
    定食谱之后由患者内源性产生的,其中所述食物和/或特定食谱诱导抗分泌因子
    (AF)蛋白的吸收、形成、和/或释放。
    13.一种治疗需要治疗的哺乳动物的方法,所述方法包括喂服富含抗分泌因
    子的SPC或卵黄,由此诱导AF的内源性产生,以促进和优化另外的药物的药
    物吸收和递送。
    14.一种治疗需要治疗的哺乳动物的方法,所述方法包括给予抗分泌因子
    (AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物、和/或片段、或者其不
    改变多肽功能的修饰物、和/或其药学活性的盐,以促进另外的药物的优化药物
    吸收和递送。
    15.一种药物组合物,所述药物组合物包括与第二或另外的药物和/或制剂
    组合的抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物、和/
    或片段、或者其不改变多肽功能的修饰物、和/或其药学活性的盐,其中所述第
    二或另外的药物和/或制剂选自于:抗癌药物,辐射治疗药物,抗细菌药物,抗
    病毒药物,以及靶向外伤后所引起损伤、神经退化、寄生虫或者炎症的药物。
    16.用于在医药中使用的根据权利要求15所述的药物组合物。
    17.用于优化另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收的抗分泌因子(AF)
    蛋白、具有等同活性的其衍生物、其同系物和/或其片段、或者其不改变多肽功
    能的修饰物、和/或其药学活性的盐。
    18.一种设计诊断和/或预后工具的方法,所述工具用于监控和/或验证和/
    或加强癌症患者中的恶性肿瘤的治疗性控制,所述方法的特征在于:
    a.检测分离自所述癌症患者的肿瘤组织的样品或分离自所述癌症患者的细
    胞中的磷酸化FAK的量化的出现率。
    19.一种改进药物设计的方法,其特征在于:
    a.检测经受物质或药物的处理的细胞或组织的应答,以及通过测量磷酸化
    FAK的量化的出现率来评估AF对所述药物应答的影响。
    20.一种用于筛选和/或评估潜在的抗分泌因子(AF)蛋白抑制剂和/或增强剂
    的方法,其特征在于:
    a.将抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物、
    和/或片段、和/或其药学活性的盐与选择的物质进行暴露接触,
    b.通过测量磷酸化FAK的量化的出现率来测定暴露接触的AF调节NKCC1
    复合物中FAK的可能性。
    21.根据权利要求20所述的方法,所述方法有利于高通量筛选。
    22.一种对新颖或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、其肽、衍生物、同系物和/
    或片段、和/或其药学上活性的盐进行功效评估和/或功能活性验证的方法,其特
    征在于:
    a.通过测量磷酸化FAK的量化的出现率来测定所述新颖或已知的AF调节
    NKCC1复合物中FAK的可能性。
    23.一种用于筛选和/或评估潜在的新颖的AF的方法,其特征在于:
    a.通过测量磷酸化FAK的量化的出现率来测定所述潜在的新颖的AF调节
    NKCC1复合物中FAK的可能性。

    说明书

    抗分泌因子(AF)的用于优化细胞吸收的用途

    技术领域

    本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白、具有等同功能活性的肽、其衍生物、其同
    系物、和/或其片段、和/或其药学活性的盐在优化药物和/或制剂的递送和细胞吸
    收,或者基因递送中的应用。典型地,所述药物和/或制剂包括抗癌药物、辐射
    治疗、抗细菌药物、抗病毒药物、或者针对靶向外伤后引起的脑损伤、神经退
    化、寄生虫或者炎症的后遗症的药物。

    总之,本发明涉及惊奇的发现:抗分泌因子(AF)能有效影响大量功能蛋白的
    磷酸化状态和去磷酸化状态之间的平衡,以及通过与CAP/ponsin(c-Cbl相关蛋
    白)和FAK(粘着斑激酶)之间相互作用,它特别能干预跨膜蛋白(例如Na+-K+-2Cl
    -协同转运蛋白(NKCC1))的生物活性。因此,AF能够在紊乱和/或病理细胞中,
    有效调节和/或纠正所述离子通道的异?;钚?,从而有效纠正病理细胞的细胞内
    压,进而潜在使药物(例如,在如癌症、炎症、或外伤治疗中所使用的药物,
    或者在基因递送中所使用的核酸序列药物)的细胞吸收得到改善。

    本发明当然进一步也涉及上述惊奇发现的应用,即抗分泌因子(AF)蛋白及其
    包含AF的必要共有序列(consensus?sequence)的衍生肽,通过CAP/ponsinh和
    FAK能够干预跨膜蛋白和/或特别是协同转运蛋白,例如NKCC1的生物活性,
    其可以在广泛的大量方法中用于改进药物设计、用于筛选和/或评估潜在的AF
    抑制剂和/或增强剂,以及用于具有等同功能活性的、新颖或已知抗分泌因子(AF)
    蛋白、肽、衍生物、同系物和/或其片段、和/或其药学活性盐的效力评估和/或功
    能活性验证。

    另一方面,AF生物学细胞功能的新发现,将进一步使设计新的可靠的诊断
    和/或预防工具成为可能,所述工具可以监测和/或验证和/或增强在患有例如癌症
    的个体中的癌症和/或异常的组织生长或活性的治疗调控。

    背景技术

    细胞分泌的缺陷性调节,是从囊肿性纤维化至分泌性腹泻和脑水肿的范围
    的许多重要人类疾病的临床表现基础。

    多细胞动物细胞的尺寸和内环境调节,对其正常的功能、增殖和存活极其
    重要。由相对静态的微管和中间纤维形成的细胞骨架,与动态的肌动蛋白微丝
    网络,是细胞形状、尺寸、三维形态和机械负载的传感元件。水和离子的过量
    流入,将增加细胞的尺寸,例如,如果将细胞暴露于低渗的细胞外环境就会发
    生。相反地,高渗的细胞外环境,将会使细胞变小。细胞的偏离正常状态的任
    何偏离将会立即受到强有力地抵制,因为细胞为了生存和获得最佳功能,其最
    优先做的是维持“正?!弊刺?。由此,肌动蛋白微丝和相关肌球蛋白1形成感
    测系统,对偏离正常状态的任何偏离进行警报。肌动蛋白微丝附着于脂筏和细
    胞膜穴样内陷,以及附着于联络复合体和细胞桥粒/细胞半桥粒、以及细胞骨架、
    微管和中间纤维的其他成分,从而能够感知细胞当前的状态。肌动蛋白微丝系
    统在脂筏和细胞膜穴样内陷的胞质面与蛋白复合物连接,这样的安排可以使肌
    动蛋白微丝监测到细胞的效应器部分。由此,肌动蛋白微丝发出的信号将诱导
    出反作用,使细胞维持其正常状态。这些肌动蛋白相关蛋白为例如半乳糖结合
    蛋白、细丝蛋白和阀蛋白(flotillin),它们经常形成寡聚体。阀蛋白-1和阀蛋白
    -2形成寡聚体,其大多数是四聚体,其将脂筏固定到肌动蛋白微丝网络。阀蛋
    白-1与AF蛋白和AF-衍生肽AF-16高亲和力结合,而阀蛋白-2则与肌动蛋白微
    丝牢固地连接。阀蛋白-1的水平可以通过游离阀蛋白-1的降解而迅速调整,以
    使体系保持动态。已知阀蛋白监控某些激酶和磷酸酶,由此转而调节跨膜蛋白
    的活性,例如离子泵和G-蛋白相关体系,例如NKCCs,它们的活性进一步与
    CAP/ponsin和FAK的含量和活性相关。

    药物和基因递送的优化,是相当感兴趣的主题。通过位点特异性和靶向的
    递送,药物的控制释放,以及寻找途径以递送更高浓度药物至感兴趣组织,可
    以实现优化,尽管有各种障碍存在。靶向递送能够用于降低低所需要的药物剂
    量并使其毒性副作用最小化,例如这在通过免疫治疗、化学治疗和/或辐射的成
    功癌症治疗中显得相当重要。药物的控制释放在慢性疾病(例如外伤相关的疾
    病、神经退化性疾病、糖尿病、和高血压)的处理中具有优势。

    化学治疗和免疫治疗对于治疗局部和转移肿瘤,都是相当重要的治疗方法。
    因为抗癌药物既不是特异性,也不靶向癌细胞,因此,抗癌药物至人体肿瘤组
    织的递送的改善,将是合理、有益、值得完成的挑战??蒲Ъ彝ü韵录际跏?br />段增加肿瘤吸收的药物利用度:1)持续长期作用的延迟释放制剂;2)利用脂质
    体包埋药物以延长作用效果或降低毒性;3)在肿瘤位点给予惰性、非毒性的前
    药以特异性激活;4)递送抗体介导的药物;或者5)结合位点特异性载体以将药
    物靶向目标肿瘤。后者很大程度上取决于药物动力学研究。在增强作用效果和
    降低药物毒性方面,已经取得了一些成功。

    更重要的是,本领域通常已知,肿瘤对各种抗癌药物的应答,在许多方面
    是依赖于肿瘤大小的。一般而言,问题部分基于以下事实:整个肿瘤细胞群对
    于某种治疗并不具有等同性应答。作为癌症生物学最新进展的结果,显示,肿
    瘤的细胞异质性,是化学治疗原发性和转移性肿瘤的困难之基础。而且,当肿
    瘤生长时,显著的多样性也在组织水平上逐步显现。较低生长分数和较差药物
    递送的面积的增加的不均匀分布,在较大肿瘤中比较显著。肿瘤血流的低水平
    和异质性分布,据认为与肿瘤组织的不均匀性在因果上相关。鉴于缺少肿瘤内
    淋巴系统证据,增加的间隙流体压力可能是自然结果,其进一步阻碍肿瘤内的
    血流。

    新颖的例如为单克隆抗体、细胞因子和效应细胞的治疗剂在癌症治疗中的
    作用已经受限于它们相当数量地不能到达体内的靶体。仅仅瘤细胞的分子和细
    胞生物学,不能解释这些药剂吸收的不均一性。这并不惊奇,因为体内的实体
    瘤并不仅仅是癌细胞的集合体。事实上,它包括两种细胞外成分:血管和间隙。
    因为不经过这些部件,血液运载的分子或细胞将不能到达癌细胞,因此,肿瘤
    的血管和间隙生理学,在最近几年受到相当地关注。已鉴定出大分子在肿瘤中
    定位较差的三种生理学因素:(i)不均匀的血液供应,(ii)增加的间隙压力,以
    及(iii)较长的运输距离。第一种因素限制了血液所载试剂至肿瘤的良好灌注区
    的递送;第二种因素降低了在高间隙压力区的流体、营养物、氧份和大分子的
    外渗,并还导致了在肿瘤外围中的在实验上可验证的放射状向外溢流,这与向
    内扩散相反。第三种因素增加了缓慢移动大分子、营养物、或氧份到达肿瘤远
    端区域所需的时间。任何分子与例如抗原的结合,通过降低游离分子的浓度,
    可进一步降低有效扩散速率。虽然效应细胞能够活性迁移,但是肿瘤血管系统
    和间隙系统的特性也可能是淋巴活性杀伤细胞和肿瘤浸润免疫活性细胞在实体
    肿瘤内递送较差的原因?;谥琢鑫⒐酆秃旯鄣囊熘市?,相当数量的这些生理
    学障碍每种,都会基于同一肿瘤的不同位置和不同日期、以及不同的肿瘤变化
    而变化。如果遗传工程的大分子和效应细胞,以及低分子量的细胞毒性试剂,
    要达到它们的临床期望,那么,必须发展出策略以克服或利用这些障碍。

    被囊膜包裹并且有时被隔膜分隔的实体瘤经常由于增加了的流体渗漏、损
    伤了的血液循环和淋巴导流、以及在细胞外基质的组成和弹性方面的改变而产
    生出高的间隙流体压(IFP)。这意味着在许多情形下的小动脉血压,将导致IFP
    达到高水平。肿瘤细胞的膨胀也可引起IFP升高。升高的间隙流体压力,形成
    了药物递送的障碍,因此对治疗具有妨碍。

    在细胞转变为恶性细胞期间,它将经历遗传的和后生的变化。恶性转化也
    伴随着组织动态平衡的进行性丧失和组织结构的紊乱,在肿瘤细胞侵入软组织
    和转移扩散至远端组织和器官位点时,这最后达到顶点。癌症生物学家愈加开
    始认识到,该转化过程的关键要素涉及到细胞的机理表现和其周围微环境的显
    著变化。这些包括细胞和组织结构的变化、环境中的适应性压力诱导改变、细
    胞外基质(ECM)中编码的微机制线路的过程改变、以及细胞外基质的细胞定向改
    造。实体瘤通常比正常组织更硬,而且肿瘤具有改变的整合素。

    越来越多的证据显示,癌症发展(例如细胞粘附、迁移和细胞周期进程)
    的关键步骤部分地由微环境的组成和构造所调节。癌细胞至微环境成分的粘附,
    和经由肌动蛋白网络传递至细胞的张力,以及在病灶粘附、脂筏和细胞膜穴样
    内陷处形成的信号复合物,将使癌细胞对细胞外基质的局部解剖敏感,并对生
    长和迁移促进机制产生出有效响应。

    细胞骨架,包括其肌动蛋白网络,已知对正常、炎症和肿瘤细胞的结构与
    功能非常重要。例如在脑损伤中,细胞骨架局部非常紊乱而且在某种程度上随
    着施加力变化而变化。肌动蛋白微丝也在脑炎(Jennische等,2008)和霍乱毒素诱
    导的腹泻(Hansson等,1984)中分解。因此,可以确信细胞骨架对维持正常细胞
    尺寸和功能异常事件突发,都具有重要作用。

    有许多关注聚焦于膜氯离子(Cl-)通道在维持正常细胞功能中的作用,其中
    出现证据显示Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白(NKCC)作为非依赖性调节位点的重
    要性,它可能决定了细胞的整体分泌率。协同转运蛋白NKCC1在基本所有的哺
    乳动物细胞中表达,其中,它在细胞体积的体内平衡、细胞离子的组成、以及
    可能细胞生长的控制中,具有比较普遍性的作用。呈现的分子证据显示,NKCC1
    的功能在蛋白磷酸化、膜靶向和基因表达水平上,被短期和长期调控(Mathews,
    2002)。因此,对细胞骨架、阀蛋白寡聚体、脂筏和效应分子例如NKCC1之间
    相互作用的深入理解,促使本发明人产生癌症和神经退化性疾病的新的治疗方
    法,以及对细胞尺寸和离子成分紊乱的一系列临床症状进行治疗。

    Na-K-Cl协同转运蛋白是转运Na+、K+和Cl-进出多种上皮和非上皮细胞的
    一类膜蛋白。Na-K-Cl协同转运蛋白介导的转运过程,以电中性(几乎总是以1
    Na∶1K∶2Cl的化学计量)并且被“环”利尿剂所抑制(例如丁苯氧酸,苯甲苯氧
    酸,和呋喃苯胺酸)为特征。目前,两种不同的Na-K-Cl协同转运蛋白异构体已
    被cDNA克隆和表达所鉴定;这两种异构体所编码基因位于不同的染色体上,
    其基因产物共有大约60%的氨基酸序列同一性。

    NKCC1(CCC1,BSC2)异构体在多种组织中存在。含有NKCC1的最普遍上
    皮细胞是,具有定位于基底外侧膜的Na-K-Cl协同转运蛋白的分泌性上皮细胞。
    与之相对照的是,NKCC2(CCC2,BSC1)仅发现于肾脏,其定位于亨利氏环
    (Henle′s?loop)和致密斑(macula?densa)升支粗段的上皮细胞的顶膜。NKCC2
    基因突变将导致Bartter′s综合症,其为以低钾代谢碱毒症、高钙尿、盐耗和体积
    损耗为特征的遗传疾病。两种Na-K-Cl协同转运蛋白异构体也是阳离子-氯离子
    协同转运蛋白超家族的一部分,该超家族包括电中性的K-Cl和Na-Cl协同转
    运蛋白。癌细胞,其大多是非极性的,其表达高水平的NKCC,导致肿瘤细胞
    实际上是膨胀的,例如具有增加的尺寸。肿瘤细胞具有不太精确调节的离子泵
    和水通道系统,但其仍然显示出维持内在体内平衡的强烈倾向性。这意味着囊
    膜包裹的肿瘤细胞的尺寸增加,归因于通常在实体瘤内的IFP的升高。

    Na-K-Cl协同转运蛋白活性也受许多种激素刺激以及细胞体积变化的影
    响。在许多组织中,该调节(特别是NKCC1异构体)受调节系统磷酸化与去磷
    酸化之间的平衡所调控,以通过特异性的蛋白激酶或磷酸酶控制脂筏中所普遍
    存在的离子泵(Haas,1998)。

    NKCC活性诱导的细胞收缩,涉及细胞骨架与蛋白磷酸化事件之间、经由
    PKC和肌动蛋白轻链激酶(MLCK)的相互作用。Cl-分泌透过上皮细胞的渗透调
    节包括:(i)经由PKC,MLCK,p38,OSR1和SPAK的NKCC1的高渗透性收
    缩激活;(ii)低渗细胞膨胀和蛋白磷酸酶的NKCC去激活;和(iii)蛋白酪氨酸
    激酶作用于粘着斑激酶(FAK),以设定NKCC的活性水平。CAP成分也被提出
    在某种程度上参与了NKCC磷酸化的逐步调控,这确定了其在脂筏中的功能
    (Hoffmann?2007)。

    在电子显微水平上,整合素β1、FAK在酪氨酸407的磷酸化形式(pY407)、
    以及Na(+)、K(+)、2CI(-)协同转运蛋白(NKCC1)的独特组合,仅仅在正常细
    胞的基底外侧膜被共同定位。这三种蛋白在等渗条件下也互相共免疫沉淀,显
    示包含这三种蛋白的渗透传感复合物。仅仅FAK?pY407对低渗作用敏感而去磷
    酸化,而顶膜(顶膜)中的FAK?pY576和细胞-细胞粘附中的pY861对低渗不
    敏感。已经报道,氯化细胞利用整合素β1作为与FAK?pY407去磷酸化相关联
    的渗透传感器而对低渗作用产生响应,这将导致这些上皮细胞的基底外侧膜中
    NKCC1的去激活和NaCl分泌的抑制(Marshall,2008)。再次,肿瘤细胞通常是非
    极性的,由此脂筏中的离子泵总是沿着细胞表面定位,而顶端和基底外侧区域
    不是普遍情形。因此,与癌细胞和类似警示的其他情形一样,同样类型的离子
    泵普遍存在于正常细胞中,尽管它们的定位存在不同。

    整合素是细胞表面受体,其部分介导细胞与细胞外基质的粘附。除了提供
    对组织的机体和生存所必要的分子“粘附”以外,整合素也用作动力学的信号
    分子。整合素允许正常的非转化细胞去感受,它们粘附于细胞外的基质,由此
    提供了细胞的存活信号。该信号允许细胞在生长因子存在情形下增殖,在某些
    情形下阻止凋亡。整合素也在正常进程中介导细胞迁移,例如血管生成、伤口
    愈合、损伤修复、监测免疫系统功能、以及生长。整合素的表达和功能异常,
    可归因于多种疾病和病症,包括癌症。

    粘着斑激酶(FAK)是非受体的酪氨酸激酶,其在多种癌症中过量表达,其
    在细胞粘附、迁移和锚点依赖性生长中具有重要作用(Tilgham,2007)。

    粘着斑激酶(FAK)在实际上的所有正常细胞中普遍存在,它在侵袭性和转
    移性的结肠癌、乳房癌、甲状腺癌、和前列腺癌中过量表达。增强的FAK免疫
    染色在少部分侵袭前(原位癌)口腔癌和大部分侵袭性口腔癌细胞中可以检测
    到。据推测FAK可能不是传统的癌基因,但是可能涉及癌的侵袭和转移进程。
    进一步推测FAK在肿瘤细胞亚群中的过量表达,可能导致细胞群具有侵袭和转
    移的高倾向性(Kornberg,1998)。

    粘着斑激酶(FAK)定位于细胞外基质内的细胞粘着斑或细胞触点。FAK被
    各种细胞表面受体激活,并传输信号至各种靶分子。FAK参与生长因子受体介
    导的信号途径,它在细胞存活、增殖、迁移和侵袭中扮演重要作用。

    FAK的过量表达在多种肿瘤类型中被广泛观测到,其可用作侵袭和转移的
    标记物。FAK能够在不同水平被治疗性靶向,例如在FAK基因转录水平利用
    siRNA调节其转录因子,在FAK?mRNA水平利用FAK?siRNA,或者在蛋白水平。
    在蛋白水平,FAK在粘着斑处定位于脂筏,可能受结构域阴性的FAK相关非激
    酶或其粘着斑向结构域的表达所干预,FAK的激酶活性可能被FIP200、FAK激
    酶结构域相互作用蛋白、以及激酶活性抑制剂所抑制。最近几年,研究集中在
    发展针对FAK转录和激活的小分子抑制剂,以提供潜在肿瘤治疗的另外方法(Lis.
    2008)。

    另一分子涉及到细胞内分子的磷酸化,调节信号的传导与控制,以及决定
    离子泵的活性水平,它是CAP,其是CbI原癌基因产物的修饰蛋白。CAP在阀
    蛋白和FAK之间,在脂筏的胞质小叶处,作为信号路径的联接。CAP也以名称
    ponsin而知晓。该名称反映,该因子原先是在过表达肿瘤中所分离和鉴定,因此
    命名为原癌基因产物,然而接着发现其在正常细胞中也普遍存在。

    抗分泌因子是41kDa蛋白,其原先描述为对腹泻疾病和肠道炎症提供?;?br />(for?a?review,see?Lange?and?Lonnroth,2001)??狗置谝蜃?AF)蛋白已被测序,其
    cDNA已被克隆??狗置诨钚跃萑衔怯晌挥诳狗置谝蜃?AF)蛋白序列的氨基酸
    位置35至50之间的肽所主要赋予,该肽包括至少4-16个,例如4,6,8或16
    个保守序列的氨基酸。免疫化学和免疫组织化学研究显示,抗分泌因子(AF)蛋
    白存在并且可能也被身体的大部分组织和器官所合成。合成肽,包括抗腹泻序
    列,在先前已明确(WO?97/08202;WO?05/030246)??狗置谝蜃?AF)蛋白和肽先
    前被公开用于调理病流体传递和/或炎症反应,例如在霍乱毒素激发后的肠道和
    中枢神经系统脉络丛(WO?97/08202)。能诱导AF内源性合成或服用额外AF的
    食物和饲料,因此在WO?97/08202中被认为在治疗水肿,腹泻,脱水和炎症中有
    用。WO?98/21978公开了具有酶活性的产品,在制备诱导抗分泌因子(AF)蛋白形
    成的食物中应用。WO?00/038535进一步公开了富含抗分泌因子(AF)蛋白及类似
    的食品。

    抗分泌因子(AF)蛋白及其片段也显示,在与细胞减少和/或增多相关的治疗
    条件下,可以改善神经组织的修复,干细胞、祖细胞及其衍生细胞的增殖、凋
    亡、分化、和/或迁移(WO?05/030246),对于治疗和/或预防幽闭症(WO?07/126363),
    它也在治疗和/或预防眼内高压中同样有效(WO?07/126364)。

    更重要的是,本发明人最近发现,抗分泌因子能够监控和/或有利影响膜内
    脂筏、受体和/或细胞膜穴样内陷的结构、分布和其多种功能,因此,它可以用
    于治疗和/或预防细胞膜内脂筏和/或细胞膜穴样内陷的结构紊乱和功能异常
    (WO?07/126365)。

    令人惊奇地是,本发明人现在可以证明,同样的抗分泌因子能够干预上述
    跨膜蛋白的生物活性,例如经由FAK和CAP的NKCC1,因此,可以在病理和/
    或紊乱细胞中直接调节离子通道的病理学活性,有效调节所述细胞的细胞内压
    和跨膜蛋白功能,由此,允许改进用于例如癌症的治疗中的药物的吸收。

    发明内容

    本发明涉及包含抗分泌因子(AF)蛋白、抗分泌因子(AF)蛋白的具有抗分泌和
    /或等同功能和/或类似活性的同系物、衍生物、肽、和/或片段的药物组合物在制
    备用于优化第二或者另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收的药物组合物
    的用途,抗分泌因子(AF)蛋白优选选自由下列式的序列所组成的抗分泌因子(AF)
    蛋白、或者其不改变多肽的功能的修饰物、或者其药学活性的盐:

    X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,

    其中X1为I、SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-35、或者缺失,X2为H、R或K,X3为
    S或L,X4为T或A,X5为SEQ?ID?NO?6的氨基酸43-46、43-51、43-80或43-163、
    或者缺失。

    典型地,所述第二或另外的药物和/或制剂包括抗癌药物、辐射治疗药物、
    抗细菌药物、抗病毒药物、和/或针对外伤后所引起损伤、神经退化、寄生虫、
    或炎症症状的药物。

    本发明在另一同样优选的方面还涉及抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能
    活性的肽、衍生物、同系物和/或片段、和/或其药学活性的盐在优化递送和基因
    递送的细胞吸收中的用途。

    总之,本发明涉及令人惊奇地发现:抗分泌因子(AF)特别地能干预跨膜蛋白
    的生物活性,例如其通过与CAP/ponsin(c-Cbl相关蛋白)和/或FAK(粘着斑激
    酶)相互作用而干预NKCC1。

    AF先前已知与阀蛋白1和2共存,阀蛋白1和2是固定在细胞膜脂筏
    中的的一种蛋白并与肌动蛋白和CAP结合,CAP转而以其非磷酸化形式与FAK
    的SHP-2/PTPD1结构域和SH3结合。本发明首次表明AF能够有效地调节CAP
    和FAK与NKCC1的相互作用,可引起非耦联磷酸化FAK的发生。通过NKCC1
    复合物中的非耦联FAK,离子通道被有效关闭。本发明的发明人首次显示充分
    证据,AF能够调节CAP与阀蛋白1和2的结合,以及CAP与FAK的
    SHP-2/PTPD1结构域的结合,因此能够有效干预阀蛋白1和2的寡聚体及其与
    细胞膜中脂筏的结合。本发明的发明人进一步首次显示,AF可以有效地干预蛋
    白磷酸酶。

    通过上述记载的生物活性,AF能够有效监控跨膜蛋白(例如细胞膜中
    NKCC1离子通道)的异常功能和/或使跨膜蛋白的异常功能正?;?。

    在健康细胞中,NKCC1/FAK/CAP复合物在磷酸化与非磷酸化状态之间显
    示出自然平衡,由此,多种细胞内和细胞外的效应器(例如受体和渗透压)能
    够进行以及有助于离子通道状态的精细调控。

    在病理和/或紊乱细胞中,离子通道NKCC1/FAK/CAP复合物的精细调控状
    态被扰乱,由此离子通道持续活化。由此,例如转化细胞的细胞内压通常要高
    于健康细胞。在病理细胞中,FAK持续被去磷酸化,并且与NKCC1复合物结
    合?;贏F可独特地能够监控NKCC1复合物中的FAK,由此FAK被磷酸化,
    由此AF能够有效地使病理细胞的细胞内压正?;?,由此而潜在地使得改善药物
    (例如在癌症治疗中所使用药物)的细胞吸收。结果,使病理细胞的细胞内压
    正?;材苡兄谑共±碜橹械募湎堆拐;?。应该强调,异常的细胞
    内离子水平,将会导致发生通过例如水孔蛋白(水通道)进行的水转移。

    在各种疾病的药理学治疗中,众所周知的缺点是,必须增加给予患者药物
    在最适宜剂量之上的剂量,因为药物不能被病理细胞有效的吸收。本发明使得
    能够利用已证实无毒、可生物降解、内源性的小分子来使病理细胞的细胞内压
    正?;?,由此潜在地允许改善任一药物的细胞吸收,从而使由于所述活性的另
    外的组分的过量给药而导致严重副作用的风险最小化。

    而且,抗分泌因子(AF)已经证实对健康的正常细胞没有不利效应,但是它
    仅仅只对病理细胞具有使其正?;淖饔?。相反地,抗分泌因子(AF)蛋白、其
    具有抗分泌和/或等同功能和/或类似活性的同系物、衍生物和/或片段、或者其药
    学活性的盐的给药反而可能甚至帮助在病理和/或紊乱细胞邻近的健康细胞获得
    NKCC1/FAK/CAP复合物磷酸化与非磷酸化状态之间的最佳平衡。

    而且,许多年来一直已知,包括某些数量麦芽谷物的特异性食物,可以诱
    导患者血液抗分泌因子的身体自身内源性生产和/或激活。因此,在治疗前、治
    疗期间和/或治疗后,通过简单喂服待用某种物质治疗或将进行某种治疗的患者
    例如为在WO?1998/21978或WO?05/030246中所记载的食物,则可有效引致病
    理细胞的细胞内压和/或病理组织的间隙压力的类似的正?;?。由此可有效和廉
    价地地改善药物(例如抗癌药物,辐射治疗药物,抗细菌药物,抗病毒药物,
    或者靶向外伤后所引起损伤、神经退化、寄生虫、或炎症的药物)的细胞吸收。

    本发明当然还进一步涉及上述惊奇发现的用途,即抗分泌因子(AF)能够在大
    量的方法中干预跨膜蛋白(例如离子通道,尤其是经由FAK的NKCC1)的生
    物活性,用于改进药物设计、用于筛选和/或评估潜在的AF抑制剂和/或增强剂、
    以及用于效力评估和/或功能活性验证新颖或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、其具
    有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或片段、和/或其药学上活性的盐。

    例如,磷酸化FAK与非磷酸化FAK可以通过特异性的商业可获得的抗体而
    轻易区分。如本发明人清楚地所示培养物中的未处理MATB细胞(AtCC?N.:
    CRL-1666,名称13762?MATB?111)可显示出磷酸化FAK的清晰标记。当将其置
    于可激活细胞NKCC1通道的高渗溶液,磷酸化FAK的水平被显著降低,即
    NKCC1被激活、细胞膨胀。在本文的淀粉对照中,用AF处理不仅恢复了而且
    清楚地诱导了培养细胞中磷酸化FAK的显著的高水平,即NKCC1被关闭、细
    胞尺寸归为正常。

    用于改进药物设计、用于筛选和/或评估潜在的AF抑制剂和/或增强剂、以
    及用于效力评估和/或功能活性验证新颖或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、其具有
    等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或片段、和/或其药学上活性的盐的标准
    方法在本领域中是众所周知的,而且它们中的一部分被进一步记载在本申请的
    具体实施方式部分。

    在另一方面,本发明还涉及包含抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性
    的同系物、衍生物和/或片段、或者其药学上活性的盐的药物组合物的用途,它
    们用于制备治疗和/或预防选自下列组的各种医学病况的药物组合物:癌症相关
    医学病况、肿瘤或肿瘤相关病况、感染、炎症、外伤后的脑损伤、神经退化和
    寄生虫。

    再一方面,本发明涉及新发现的AF生物细胞功能的用途,其用于设计新的
    可靠的诊断和/或预后工具,用于在患有肿瘤疾病(例如癌症)的个体中,监控
    和/或验证和/或加强恶性肿瘤的治疗性调控。

    在优选的实施方式中,本发明所应用的所述抗分泌因子(AF)蛋白,由下列式
    的序列或者其不改变多肽或肽的功能的修饰物所组成:

    X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,

    其中X1为I、SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-35、或者缺失,X2为H、R或K,X3为S
    或L,X4为T或A,X5为SEQ?ID?NO?6的氨基酸43-46、43-51、43-80或43-163、
    或者缺失。

    本发明还涉及适合于期望治疗目的、以及患者年龄、性别、症状等的各种
    给药剂量和给药途径。

    附图说明

    图1:经受压力和AD处理的游离MAT?B?III肿瘤的细胞计数分析。

    对10000个细胞进行FACS分析显示FSC-水平中值,瓶1为620(对照),
    瓶2为450(高渗NaCl?5分钟),瓶3为514(高渗NaCl+AF-16,60分钟),瓶
    4为576(高渗NaCl+PBS,60分钟)。

    图2:利用针对磷酸化FAK的抗体进行的免疫组织化学分析,可在对照细
    胞中显示出强烈的红色染色(瓶1),而瓶4中的细胞(PBS-处理)具有显著较
    低的强度。用AF-16处理的细胞(瓶3),显示出与对照细胞相似的染色强度。
    A.处理前。B.用高渗NaCl处理,之后接着PBS处理。C.用高渗NaCl处理,
    之后接着AF-16处理。

    将细胞处理,以显示磷酸化的FAK(pFAK),红色荧光。

    细胞核被染成蓝色(DAPI)。

    强染色=高水平的pFAK,即NKCC1通道被关闭。

    弱染色=低水平的pFAK,即NKCC1通道被开启。

    图3:在一系列实验中将GMK培养于固体表面,以借助鬼笔环肽-FITC以
    免疫组织化学阐明肌动蛋白微丝的存在和分布。

    A=未处理的正常的GMK细胞,其粘附于表面培养(对照),并且其被处
    理以利用鬼笔环肽-FITC复合物,以显示出肌动蛋白微丝。细胞核被染成蓝色。

    B=用细胞松弛素B处理,可以使肌动蛋白网络解体,并且仅有一些群簇
    可以保持在细胞质中

    C=用细胞松弛素B和AF-16共同处理,可产生肌动蛋白网络的部分恢复。
    因此,AF-16可以部分使细胞的肌动蛋白细胞骨架正?;?。

    图4:

    A=瓶1对照

    B=瓶4高渗NaCl+赋形剂,60分钟

    C=瓶3高渗NaCl+AF-16,60分钟

    图5:将大鼠MAT?B?III肿瘤细胞的外廓低温切片预处理60分钟,用赋形
    剂(上排,A-B)或者用AF-16(下排,C-D),在静脉内注射阿霉素之前进行所
    述预处理。在注射阿霉素之后15分钟,将大鼠处死。阿霉素与DNA的结合,
    将在与药物接触的细胞核中,产生出红色荧光。

    在用赋形剂(A和B)预处理的大鼠肿瘤中,仅有分散的细胞核被染色。在用
    AF-16预处理的大鼠肿瘤细胞中,大多数细胞核被染色。这显示用AF-16预处
    理可以有效增加细胞生长抑制药物对肿瘤细胞核的进入渗透。

    比例尺=100μm

    定义与缩写

    缩写

    IFP:间隙流体压力;

    PBS:磷酸缓冲盐水;

    AF:抗分泌因子,

    AF-16:由氨基酸VCHSKTRSNPENNVGL;八肽IVCHSKTR;七肽
    VCHSKTR;六肽CHSKTR;五肽HSKTR所组成的肽;

    FSC:前向散射计数

    SSC:侧向散射计数

    SPC:特别地加工过的谷类食物

    定义

    蛋白是指由肽键连接在一起、由氨基酸残基所构成的生物学大分子。蛋白,
    当作为氨基酸的线性多聚体时,也被称为多肽。典型地,蛋白具有50-800个氨
    基酸残基,因此具有约6,000至约几十万道尔顿或更大范围的分子量。较小的蛋
    白称为肽、多肽或寡肽。术语“蛋白”、“多肽”、“寡肽”、和“肽”,可以在本
    文内容中交换使用。

    “药物组合物”,在本文中是指包含治疗活性量的抗分泌因子(AF)蛋白的组
    合物,可选地与药学活性的赋形剂,例如载体或赋形剂进行组合。所述药物组
    合物被制成用于适合的给药途径,其可以根据患者的症状和诸如年龄或喜好等
    的其他因素而进行变化。包含抗分泌因子(AF)蛋白的药物组合物,可以用于药
    物递送系统。该给予的药物组合物,给人体或动物体可提供活性成分。所述药
    物组合物可以是,例如片剂、丸剂、锭剂、胶囊、大丸剂、凝胶、溶液等等,
    但不限于此。

    术语“药学活性的盐”,是指抗分泌因子(AF)蛋白的盐,其可以基于所称
    Hofmeiser′s系列的任何衍生出的盐。药学活性的盐的其他实例,包括三氟乙酸
    盐、乙酸盐、和赖氨酸氯化盐,本发明不限于此。

    术语“抗分泌”在本文中是指,抑制或降低分泌、特别是肠道的分泌。因
    此,术语“抗分泌因子(AF)蛋白”是指,能够抑制或降低身体分泌的蛋白。

    在本文中,“等同功能和/或类似活性”涉及到抗分泌因子(AF)蛋白、肽、或
    多肽、或者其同系物、衍生物或其片段的生物效应,即其能够优化药物和/或制
    剂的递送和细胞吸收。验证和/或测量这种能力的标准实例,是本领域众所周知
    的。本申请的实验部分给出了实施例,例如实施例1-6。

    在本文中,“抗分泌因子(AF)蛋白”或其同系物、衍生物或其片段,可以与
    WO?97/08202中定义的术语“抗分泌因子”或“抗分泌因子蛋白”交换使用,
    它们指的是具有抗分泌和/或等同功能和/或类似活性的抗分泌因子(AF)蛋白、或
    肽、或同系物、或衍生物、和/或其片段,或者指其不改变多肽功能的修饰物。
    因此,应当理解,″抗分泌因子″,″抗分泌因子蛋白″,″抗分泌肽″,″抗分泌片段″,
    或者本文中的″抗分泌因子(AF)蛋白″,也可以指其衍生物、同系物或片段。这些
    术语都可以在本发明的内容中交换使用。而且,在本文中,术语″抗分泌因子″
    可以缩写为″AF″。本文中的抗分泌因子(AF)蛋白也指先前定义在WO97/08202
    和WO?00/38535中的具有抗分泌特性的蛋白??狗置谝蜃右惨丫诶?br />WO?05/030246中。术语抗分泌因子也期望为富含抗分泌因子的卵黄物,其公开
    于SE?900028-2和WO?00/38535,下文中将进一步描述。

    “医疗食品”,在本文中是指,食品或者特定食用的食物,其用含有抗分泌
    因子(AF)蛋白的组合物制备,或者可选地其能够诱导内源性AF的合成或激活。
    所述食品可以是任何合适的液态或固态食品,例如液体或粉末,或者任何其他
    合适的食物。该物质的实例可以在WO?0038535或WO?91/09536中找到。所述
    成分也可以引导抗分泌因子(AF)蛋白的吸收、形成和释放。

    “喷雾剂”,在本文中,是指以薄雾经由呼吸道,递送液体药物的医疗装置。
    “喷雾剂”的压缩装置,使空气经由管道进入充满液体药物的药杯??掌帕?br />将液体碎分成微小的雾状颗粒,以被深吸入至呼吸道。

    术语“气溶胶”,在本文中是指精细固体或液体颗粒的气体悬液。

    在本文中,所用的术语“细胞抑制剂”以及“细胞抑制药物”、“细胞抑制
    试剂”或“细胞抑制化合物”,这些术语可以交换使用,它们涉及在癌症治疗中
    使用的药物,典型地在经过化疗后给予患者。细胞抑制试剂为不仅控制病理细
    胞而且控制正常细胞生长的物质。因此,这样的物质不仅可以用于化学治疗肿
    瘤,而且可以用于肿瘤去除后的术后治疗。细胞抑制剂可以为液体、粉末、或
    颗粒形式,可选地也可被深度冷冻。本领域的技术人员可从多种商业可获得的
    细胞抑制剂中,调整细胞抑制剂的选择和用量。

    发明详述

    本发明涉及监控与细胞中的调控所述细胞的尺寸和其内在环境的系统相关
    的细胞功能的新方法??狗置谝蜃?AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生
    物、同系物、和/或片段、或者其不改变多肽功能的修饰物、和/或其药学活性的
    盐,在本文可用于优化药物和/或制剂的递送和细胞吸收。所述药物和/或制剂在
    本文中选自下列的组:抗癌药物,抗肿瘤药物,辐射治疗药物,抗细菌药物,
    抗病毒药物,靶向外伤后所引起损伤的药物,靶向神经退化的药物,靶向寄生
    虫的药物,以及抗炎症的药物。

    总之,本发明涉及令人惊奇的发现,AF可以用于纠正具有损伤尺寸和内在
    细胞环境的细胞的结构和功能。例如,抗分泌因子(AF)先前已经显示能够干预
    细胞骨架及其与脂筏和细胞膜穴样内陷、细丝蛋白、半乳糖结合蛋白和阀蛋白
    复合物的结合,它现在进一步描述为有效用于通过与CAP/ponsin(c-Cbl相关蛋
    白)和FAK(粘着斑激酶)相互作用而监控例如为NKCC1的离子泵的活性。不希
    望受限于单一科学的假设,本文可以预想AF通过其先前文献记载中的对cAMP
    细胞水平的影响,而至少施加了对NKCC1的部分调节作用,进而在多种功能蛋
    白(例如CAP/ponsin(c-Cbl相关蛋白)和/或FAK(粘着斑激酶))的磷酸化与去
    磷酸化状态之间产生平衡效应。这些蛋白的功能因此被AF的水平所影响。例如,
    AF对在FAK磷酸化与去磷酸化状态之间的平衡的作用,已被本发明人所证明,
    其记载在实验部分。而且,本发明人进一步能证明,AF与磷酸酶之间的关联。

    如实验部分所示,AF-16显示可以阻止细胞偏离正常状态,其高度优先于使
    细胞正?;?。由此,本发明人预料不到地证明了AF-16使紊乱细胞转变正常的
    能力的重要性,例如已揭示的对于一系列细胞系统组织和器官的重要性。

    AF在紊乱和病理细胞中有效调节所述离子通道的异?;钚院?或使所述粒
    子通道的异?;钚哉;?,由此有效使细胞的尺寸和细胞内压正?;?,进而还
    能够使紊乱组织的间隙压力正?;?,由此潜在地使得药物具有改善的细胞吸收,
    该药物例如为在癌症、炎症和外伤治疗中使用的那些药物。

    本发明当然还进一步涉及上述记载的令人惊奇地发现的用途,抗分泌因子
    (AF)经由与CAP/ponsin(c-Cbl相关蛋白)和FAK(粘着斑激酶)相互作用,通过调
    节NKCC1,可以干预调节紊乱的细胞尺寸和内在细胞环境的细胞系统的生物活
    性,其可以在广泛的方法中用于改进药物设计、用于筛选和/或评估潜在的AF
    抑制剂和/或增强剂、以及用于效力评估和/或功能活性验证新颖或已知的抗分泌
    因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或片段、和/或其
    药学上活性的盐。

    本发明涉及包括抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、衍生物、
    同系物、和/或片段、或者其不改变多肽功能的修饰物,和/或其药学活性的盐的
    药物组合物的用途,该用途为用于制备用于优化第二或另外的药物和/或制剂的
    递送和/或细胞吸收的药物组合物。典型地,所述第二或另外的药物和/或制剂,
    包括抗癌药物,辐射治疗药物,抗微生物药物,抗细菌药物,抗病毒药物,靶
    向外伤后所引起损伤的药物,靶向神经退化的药物,靶向寄生虫的药物,以及
    靶向炎症的药物。

    再一方面,本发明涉及包括与第二或另外的药物和/或制剂联用的抗分泌因
    子(AF)蛋白、具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物、和/或片段、或者其不
    改变多肽功能的修饰物、和/或其药学活性的盐的药物组合物,以及它们在医药
    中的应用,特别是本申请中记载的在治疗各种医学适应症中的应用,其中所述
    第二或另外的药物和/或制剂选自下列的组:抗癌药物,辐射治疗药物,抗细菌
    药物,抗病毒药物,靶向外伤后所引起损伤的药物,靶向神经退化的药物,靶
    向寄生虫的药物,或靶向炎症的药物,等等。

    进一步地,所述药物组合物当然可以包括两种或多种抗分泌因子(AF)蛋白、
    片段或衍生物、或它们的组合,以及可进一步包括药学上可接受的赋形剂。

    在本发明的优选实施方式中,抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的
    肽、衍生物、同系物、和/或片段、和/或其药学活性的盐显示能够在恶性和/或病
    理细胞中克服细胞屏障,由此可以用于降低需要的药物剂量,可选地可以用于
    使所述药物和/或制剂的剂量效果最大化。因此,所述上述记载的AF能够用于
    使所述药物和/或制剂的毒性或不期望的副作用最小化。

    本发明涉及包括抗分泌因子(AF)蛋白、其具有抗分泌和/或等同功能和/或类
    似活性的同系物、衍生物、和/或片段、或者其药学活性的盐的药物组合物的用
    途,该用途为用于制备优化第二或另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收的
    药物组合物。AF与第二或另外的药物和/或制剂,可以同时或者依次给药。它们
    可以制成单一制剂或者以单独的制剂给药。

    如实验1所记载的,AF-16在肿瘤细胞中在几小时内暂时降低IFP,此后IFP
    在24h内恢复至原始高位。初步地认为,该受到时间限制的对IFP的抑制作用
    可能与改善了的肿瘤的血液循环和代谢相关,其可能增强辐射治疗的功效。因
    此,在辐射治疗期间血流的增加,将会产生更多的游离基,这在消除恶性细胞
    中将会更加有效。

    因此,本发明目前优选的实施方式是,包含根据本发明的抗分泌因子(AF)
    蛋白、其同系物、衍生物、肽、和/或片段的药物组合物在用于制备用于优化辐
    射治疗的药物组合物。

    而且,基于细胞IFP降低的暂时性和可逆性,临床医师可以容易地设想给药
    途径,其中AF以最佳时间间隔被给药,该时间间隔被调整成使得恰好当给予第
    二或另外的药物和/或制剂时,靶细胞中的IFP被降低。

    因此,另一同样优选的实施方式涉及优化第二或另外的药物和/或制剂的递
    送和/或细胞吸收的方法或者给药剂量方案,其中所述第二或另外的药物和/或制
    剂包括抗癌药物,辐射治疗药物,抗细菌药物,抗病毒药物,和/或靶向外伤后
    所引起损伤、神经退化、寄生虫、或炎症的药物。

    AF与第二或另外的药物和/或制剂,可以同时或者依次给药。它们可以制成
    单一制剂或者在单独的制剂的形式给药。

    另一方面,本发明涉及包括抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的同
    系物、衍生物、和/或片段、或者其药学活性的盐的药物组合物的应用,该应用
    为用于制备优化第二或另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收的药物组合
    物,该第二或另外的药物和/或制剂用于治疗和/或预防选自下列组的各种医学病
    况:癌症、肿瘤或肿瘤相关病况、辐射治疗、感染、外伤后引起的损伤、神经
    退化、寄生虫传染、以及炎症。

    本发明还涉及适于期望目的的治疗、以及患者的年龄、性别、症状等等的
    各种给药剂量和途径。

    药物组合物在本文可以制成眼内、鼻内、口腔、局部、皮下和/或系统给药,
    例如能够制成以喷雾剂、气雾剂、和吸入剂、或者通过雾化器给药。当制成系
    统给药至血液时,所述组合物优选制成以0.1μg-10mg/次/kg体重/天的剂量,
    例如以0.1μg-1mg/次/kg体重/天,再优选以1-500μg/次/kg体重/天,例如
    以1-50μg/次/kg体重/天或1-100μg/次/kg体重/天。这样的给药可以单剂量
    或者每天多次施用。

    使用的极为宽范的有效剂量方案显示,副作用和不期望的并发症风险极微。
    因此,本发明使得能够对细胞和组织进行过度负载治疗,以及能够用宽范的与
    个体的应答以及疾病和/或不适的严重程度相配的剂量治疗患者。

    本发明的药物组合物,一方面,能够通过局部、原位局部、口服、鼻内、
    皮下、和/或经由血管或经由呼吸道的全身系统地施加而给药。

    本发明当然还进一步涉及上述记载的令人惊奇的发现用在用于改进药物设
    计、用于筛选和/或评估潜在的AF抑制剂和/或增强剂、以及用于效力评估和/
    或功能活性验证新颖或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、其具有等同功能活性的肽、
    衍生物、同系物和/或片段、和/或其药学上活性的盐的大量方法中的应用,该发
    现为抗分泌因子(AF)能够通过FAK干预NKCC1和其他跨膜蛋白的生物活性。

    例如,通过特异性和商业可获得的抗体,可以将磷酸化的FAK与非磷酸化
    的FAK,进行容易地区分。如本发明人清楚地所证实,培养物中的未处理MATB
    细胞(已建立的乳房癌细胞系),可显示出磷酸化FAK的清晰标记。当将其置于
    可激活细胞NKCC1通道的高渗溶液中,则磷酸化FAK的水平显著降低,即
    NKCC1被激活、细胞膨胀。在本文的淀粉对照中,用AF处理不仅恢复了而且
    清楚地诱导了培养细胞中磷酸化FAK的显著的高水平,即NKCC1被关闭、细
    胞尺寸归为正常。

    因此,在一当前优选的实施方式中,本发明涉及改进药物设计的方法,其
    特征在于,针对本申请所涉及物质或者药物制剂的治疗、对细胞或组织的应答
    进行测试,然后通过例如测量磷酸化FAK的量而评估AF、抗分泌因子(AF)蛋白、
    片段或衍生物、或者其组合对所述物质或制剂细胞吸收的影响。

    在另一同等优选的实施方式中,本发明涉及筛选和/或评估潜在的AF抑制
    剂和/或增强剂的方法,其特征在于,选择化学或生物学物质,将抗分泌因子(AF)
    蛋白、具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或其片段、和/或其药学活性
    的盐暴露于所述选择的物质,然后通过测量磷酸化FAK的数量情形,来确定所
    述暴露的AF可在NKCC1复合物中阻断FAK去磷酸化的可能性。在该特定的
    优选实施方式中,所述检测方法以高通量的筛选进行。

    本文还涉及用于效力评估和/或功能活性验证新颖或已知的抗分泌因子(AF)
    蛋白、具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或其片段、和/或其药学上活
    性的盐的另外的方法,其特征在于,通过检测和定量磷酸化FAK的出现率,来
    确定所述新颖或已知的AF的在NKCC1复合物中阻断FAK去磷酸化的可能性。

    上述记载的任一方法,典型可选地,可以在细胞系统或者实验生物中进行。
    该方法也可以等同地应用于体内、原位、和硅系统。

    标准方法:

    -用于改进药物设计,

    -用于筛选和/或评估潜在的AF抑制剂和/或增强剂,

    -用于效力评估和/或功能活性验证新颖或已知的抗分泌因子(AF)蛋白、具
    有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或其片段、和/或其药学上活性的盐,
    它们都是本领域众所周知的。

    再一方面,本发明涉及新发现的AF生物细胞功能的应用,该应用为用于设
    计新的可靠的诊断和/或预后工具,以在患有癌症的个体中,监控和/或验证和/
    或加强恶性肿瘤的治疗性调控。在本发明的一个实施方式中,抗分泌因子(AF)
    蛋白、具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或其片段被用作各个肿瘤类
    型和/或癌症形式侵袭和/或转移的标记。

    抗分泌因子(AF)蛋白、具有等同功能活性的肽、衍生物、同系物和/或其片
    段、和/或其药学活性的盐特别对FAK磷酸化状态的直接调节效应,使得所述
    AF本身将为癌症和/或肿瘤治疗的潜在候选药物。

    抗分泌因子是体内自然形成的一类蛋白。人类的抗分泌因子蛋白为41kDa
    蛋白,从垂体腺分离时,包括382-288个氨基酸。根据本发明的与对使NKCC1
    正?;挠幸孀饔孟喙氐幕钚晕坏阄挥诹诮玫鞍椎腘-末端的区域,特别是定
    位于SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-163,更特别地是抗分泌因子(AF)蛋白序列的氨基
    酸位置35-50。包括所述共有序列的至少4-6个氨基酸的任一肽或者多肽或者其
    不改变多肽和/或肽的功能的修饰物可以施加该生物学作用。

    本发明人显示抗分泌因子与蛋白S5a和Rpn10在某些程度上同源,所述蛋
    白构成在所有细胞中普遍存在的成分26S蛋白体的亚基,更特别地是在19S/PA
    700帽中。在本发明中,抗分泌因子(AF)蛋白定义为具有相同功能特性的一类同
    源性蛋白。蛋白体具有多种功能,其涉及多余的蛋白、以及短期不期望的、变
    性的、错误折叠的、以及其他异常的蛋白的降解。而且,抗分泌因子/S5a/Rpn?10
    涉及细胞成分、更确切地涉及蛋白的分布和运输??狗置谝蜃右灿隺ngiocidin高
    度相似,其是已知结合血小板反应蛋白-1并且与癌症进展相关的另一蛋白异构
    体。

    本发明的抗分泌因子(AF)蛋白和/或肽的同系物、衍生物和片段,都具有能
    够用于制备用于优化另外的药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收的食用药物、以
    及用在治疗例如为肿瘤和肿瘤相关病况、感染、炎症、和/或寄生虫引起的病况
    的疾病的方法中的类似生物活性。本文中的同系物、衍生物和片段,包括天然
    形成的抗分泌因子(AF)蛋白的至少4个氨基酸,其可以在不改变多肽和/或肽的
    必要功能的情形下通过改变一个或多个氨基酸进一步修饰,以优化抗分泌因子
    的生物活性,用于优化本发明涉及的第二药物和/或制剂的递送和/或细胞吸收。

    抗分泌因子(AF)蛋白的片段通常包括制备物中的肽/氨基酸序列或其片段,
    其中,制备物中多于90%(例如95%、96%、97%、98%或99%)的蛋白,为本
    发明的蛋白、肽、和/或其片段。

    而且,与本发明抗分泌因子(AF)蛋白、肽、同系物、衍生物和/或片段的氨
    基酸序列至少70%同一性的任何氨基酸序列(例如至少72%,75%,77%,80%,
    82%,85%,87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%同一
    性的序列)也认为在本发明的范围内。在本文中,术语同源性与同一性可以交
    换使用,也就是,与另一氨基酸序列具有特定程度同一性的氨基酸序列将与该
    特定氨基酸序列具有相同程度的同源性。

    本文中的衍生物指,具有与本文所定义抗分泌因子等同活性和/或功能等同
    活性的蛋白,其或者直接或者修饰或者部分取代而衍生于另一物质,其中一个
    或多个氨基酸被另一的氨基酸所取代,该另一的氨基酸可以是修饰或非天然的
    氨基酸。例如,本发明的抗分泌因子衍生物,可以包括N末端和/或C末端?;?br />基团。N末端?;せ诺囊桓鍪道ㄒ阴;?。C末端?;せ诺囊桓鍪道?br />酰胺基。

    具有与参考氨基酸序列至少例如95%同一性的氨基酸序列的蛋白、同系物、
    衍生物、肽和/或其片段被用于指除了所述氨基酸序列可以包括参考氨基酸序列
    每100个氨基酸有多达5个的位点突变以外,例如为所述肽的氨基酸序列与参
    考序列完全相同?;痪浠八?,要获得具有氨基酸序列与参考氨基酸序列至少95%
    同一性的多肽,那么,参考序列中多达5%的氨基酸可以被删除或者被另一氨基
    酸所取代,或者参考序列中全部氨基酸的多达5%的氨基酸的数量可以插入至该
    参考序列。参考序列的这些突变,可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末
    端位置,或者在那些末端位置之间的任何位置,或者在参考序列的氨基酸中分
    别散布,或者在参考序列内以一个或多个毗连基团散布。

    在本发明中,局部运算程序(local?algorithm?program)最适于确定同一性。
    局部运算程序(例如Smith?Waterman)将一个序列的子序列与另一序列的子序
    列进行比较,然后寻找子序列的组合和那些子序列的队列,由此产生最高的总
    相似度得分。如果允许,存在内部空隙将被罚分。局部运算能有效的用于比较
    两个多结构域的蛋白,所述蛋白具有单一的结构域或者仅共有结合位点。

    确定同一性和相似性的方法,已被编写为公众可获得的程序。确定两个序
    列间同一性和相似性的优选的计算机程序方法,包括但不限于GCG程序包
    (Devereux,J等(1994))BLASTP,BLASTN,和FASTA(Altschul,S.F.等
    (1990))。BLASTX程序从NCBI和其他资源(BLAST?Manual,Altschul,S.F.等,
    Altschul,S.F.et?al(1990))中公开地获得。每一序列的分析程序,具有默认的得分
    模型和默认的空隙罚分。总之,分子生物学者可以期望使用所用软件程序所建
    立的默认设置。

    本文所定义的抗分泌因子(AF)蛋白或肽、或其具有等同活性的同系物、衍生
    物和/或片段,能够包括4个氨基酸或更多,例如5-16个氨基酸,例如5,6,7,8,
    9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸,或者更多。在另一优选的
    实施方式中,抗分泌因子由42,43,45,46,51,80,128,129或163个氨基酸组成。
    在优选的实施方式中,抗分泌因子(AF)由5,6,7,8或16个氨基酸组成。

    在另一优选的实施方式中,本发明抗分泌因子(AF)蛋白或肽、或具有等同活
    性的同系物、衍生物或其片段,由下列式的序列组成:

    X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,

    其中X1为I、SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-35或者缺失,X2为H、R或K,X3为S
    或L,X4为T或A,X5为SEQ?ID?NO?6的氨基酸43-46、43-51、43-80或43-163、
    或者缺失。

    本发明的抗分泌因子可以体内或体外生产(例如重组合成、合成和/或化学
    合成)和/或分离自抗分泌因子的天然生成资源,例如分离自猪垂体腺或者禽卵。
    在生产之后,抗分泌因子可以被进一步加工,例如被化学或酶学裂解至较小的
    抗分泌活性片段,或者被氨基酸修饰。目前不可能通过纯化,获得纯化形式的
    抗分泌因子(AF)蛋白。但是可以重组或合成生产出生物活性的抗分泌因子蛋白,
    这先前已公开在WO?97/08202和WO?05/030246中。WO?97/08202也公开了7-80
    个氨基酸的该蛋白的生物活性片段的生产。

    本发明的抗分泌因子可以进一步包括N末端和/或C末端?;せ?。N末端
    ?;せ诺囊桓鍪道ㄒ阴;?。C末端?;せ诺囊桓鍪道0坊?。

    在本发明的优选实施方式中,抗分泌因子选自SEQ?ID?NO?1-6,即使用氨基
    酸的通常单字母缩写表示的VCHSKTRSNPENNVGL(SEQ?ID?NO?1,在本文中
    也称为AF-16)、IVCHSKTR(SEQ?ID?NO?2)、VCHSKTR(SEQ?ID?NO?3)、CHSKTR
    (SEQ?ID?NO?4)、HSKTR(SEQ?ID?NO?5)、或者SEQ?ID?NO?6的抗分泌因子(AF)
    蛋白的氨基酸序列。SEQ?ID?NO?1、2和3先前已公开在例如WO?05/030246中。
    如所附的序列表所示的,上述所示序列的某些氨基酸,可以被其他氨基酸所取
    代。在本段下文中,特定氨基酸序列的特定氨基酸位置是从左开始计算的,这
    意味着在该特定的序列中最N-末端的氨基酸作为位置1。下文列出的任何氨基
    酸的取代可以独立于在该序列中的任何其他氨基酸的取代而进行。在SEQ?ID?
    NO?1中,位置2的C可以被S取代,位置3的H可以被R或K取代,位置4
    的S可以被L取代,和/或位置6的T可以被A取代。在SEQ?ID?NO?2中,位置
    3的C可以被S取代,位置4的H可以被R或K取代,位置5的S可以被L取
    代,和/或位置7的T可以被A取代。在SEQ?ID?NO?3中,位置2的C可以被S
    取代,位置3的H可以被R或K取代,位置4的S可以被L取代,和/或位置6
    的T可以被A取代。在SEQ?ID?NO?4中,位置1的C可以被S取代,位置2的
    H可以被R或K取代,位置3的S可以被L取代,和/或位置5的T可以被A
    取代。在SEQ?ID?NO?5中,位置1的H可以被R或K取代,位置2的S可以被
    L取代,和/或位置4的T可以被A取代。

    本发明还SEQ?ID?NO?1-6任一片段的两个或多个的组合。

    在本发明的实施方式中,本发明的药物组合物进一步包括药学上可接受的
    赋形剂。本发明药学上可接受的赋形剂及其最佳使用浓度的选择,可以通过实
    验由技术人员容易地确定。本发明使用的药学上可接受的赋形剂,包括溶剂、
    缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂、以及稳定剂、乳化剂、悬浮剂、和/或稀
    释剂。本发明的药物组合物可以根据常用药物手册制成,例如根据″Remington:
    The?science?and?practice?of?pharmacy″,第21版,ISBN?0-7817-4673-6或者
    ″Encyclopedia?of?pharmaceutical?technology″,第2版,ed.Swarbrick?J.,ISBN:
    0-8247-2152-7。药学上可接受的赋形剂,是对给予该组合物的个体基本上无害
    的物质。这样的赋形剂通常满足国家健康机构的既定要求。官方药典,例如英
    国药典、美利坚合众国药典、以及欧洲药典,对药学上可接受的赋形剂设定有
    标准。

    下文是可选择性地用在本发明药物组合物中的相关组合物的综述。该综述
    是基于特定的给药途径。然而,应当理解,在药学上可接受的赋形剂可以用于
    不同的剂型或者组合物的情形中,该特定的药学上可接受的赋形剂的应用并不
    限于特定的剂型或者所述赋形剂的特定功能。应当强调,本发明并不限于下列
    所提及的组合物的应用。

    肠胃外组合物:

    对于系统性应用而言,本发明的组合物可以包括常规、非毒性的药学上可
    接受的载体和赋形剂,其包括微球和脂质体。

    本发明所用的组合物,可以包括任何种类的固体、半固体、和液体的组合
    物。

    药学上可接受的赋形剂可以包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化
    剂、以及稳定剂、乳化剂、悬浮剂、和/或稀释剂。下文给出不同试剂的实例。

    各种试剂的实例:

    溶剂的实例包括但不限于水、醇、血液、血浆、脊髓液、腹水、和淋巴液。

    缓冲剂的实例包括但不限于柠檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、磷酸氢盐、碳
    酸氢盐、磷酸盐、二乙基酰胺盐,等等。

    螯合剂的实例包括但不限于EDTA和柠檬酸。

    抗氧化剂的实例包括但不限于丁基羟基茴香醚(BHA),抗坏血酸及其衍生
    物,生育酚及其衍生物,半胱氨酸,以及它们的混合物。

    稀释剂和崩解剂的实例包括但不限于乳糖、蔗糖、淀粉-糖类复合物、磷酸
    钙、碳酸钙、硫酸钙、甘露糖、淀粉、和微结晶纤维素。

    结合剂的实例包括但不限于蔗糖,山梨醇,阿拉伯树胶,藻酸钠,明胶,壳
    聚糖,淀粉,纤维素,羧甲基纤维素,甲基纤维素,羟丙基纤维素,聚乙烯吡咯
    烷酮和聚乙二醇。

    本发明的药物组合物,在一方面,能够以局部、或者经由静脉内外周输注、
    或者经由肌内或皮下注射给药至患者,或者经由面颊、肺、鼻、皮肤或口服途
    径给药。而且,也可以通过外科插入至患者脑室的导流管给予该组合物。

    在一个实施方式中,本发明所用的药物组合物,被制成眼内、局部、鼻内、
    口服、皮下、和/或系统给药。在优选的实施方式中,本发明的组合物以悬浮液,
    或者甚至更优选地,以喷射吸入的粉末剂、气雾剂、吸入剂、或者鼻内和/或至
    呼吸道的雾化剂施用给药。

    包含抗分泌因子的粉末给药,在稳定性和剂量方面有额外的优点。本发明
    的药物组合物也可以局部施用,眼内、鼻内、口服、皮下、和/或经由血管系统
    给药。在优选的实施方式中,药物组合物被制成静脉内、肌肉内、局部、口服、
    或鼻部给药。典型地,当用于局部施用于眼部时,本发明组合物的施用浓度为
    以每天单剂量或以每天重复几次(多剂量)给药计1μg-1mg/次,优选50-250
    μg,但不限于此。

    系统给药至血液,以每天单剂量或以每天重复几次给药,其剂量在0.1μg-
    10mg/次/kg体重范围内,例如0.1μg-1mg/次/kg体重,优选1-500μg/kg
    体重,更优选1-100μg/kg体重。当富含抗分泌因子的卵黄用于本发明时,该
    制剂优选口服给予。

    因此,本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白、或具有等同活性的衍生物、同系物
    和/或其片段,和/或其药学活性的盐的应用,该应用为用于优化第二药物和/或制
    剂的递送和/或细胞吸收。在一个实施方式中,所述抗分泌因子(AF)蛋白由下列
    式的序列组成:

    X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,

    其中X1为I、SEQ?ID?NO?6的氨基酸1-35、或者缺失,X2为H、R或K,X3为
    S或L,X4为T或A,X5为SEQ?ID?NO?6的氨基酸43-46、43-51、43-80或43-163、
    或者缺失。在另一实施方式中,本发明涉及包括SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列
    的抗分泌因子(AF)蛋白的应用。在另一实施方式中,本发明涉及包括SEQ?ID?NO:
    2所示氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白的应用。在又一实施方式中,本发明涉
    及包括SEQ?ID?NO:3所示氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋白的应用。在又一实
    施方式中,本发明涉及包括SEQ?ID?NO:4所示氨基酸序列的抗分泌因子(AF)蛋
    白的应用。在又一实施方式中,本发明涉及包括SEQ?ID?NO:5所示氨基酸序列
    的抗分泌因子(AF)蛋白的应用。

    进一步地,在又一实施方式中,本发明涉及抗分泌因子(AF)蛋白的应用,所
    述蛋白为SEQ?ID?NO?6所示氨基酸序列的蛋白、或其包含SEQ?ID?NO?6氨基酸
    38-42的同系物、衍生物、和/或片段。

    在又一实施方式中,本发明涉及本文所公开的药物组合物的应用,其包括
    选自下列的两种或多种抗分泌因子(AF)蛋白:SEQ?ID?NO:1-6所公开的蛋白,
    以及SEQ?ID?NO?6或者包含SEQ?ID?NO?6氨基酸38-42的同系物、衍生物、和/
    或其片段,或者本文所记载通式所公开的序列。所述的序列都同等优选地用于
    本发明。

    在本发明的一个实施方式中,所述药物组合物进一步包括药学上可接受的
    赋形剂。这样的赋形剂可以是选择适于特定目的的任何优选的赋形剂。赋形剂
    的实例已在本文中公开。

    在本发明的另一实施方式中,所述药物组合物被制成眼内、鼻内、口服、
    局部、皮下、和/或系统给药。选择的给药途径可以根据患者的治疗症状,以及
    患者的年龄和性别等等而变化。

    在另一实施方式中,药物组合物被制成以喷雾剂、气雾剂、或经由雾化器
    或吸入器给药。在又一实施方式中,本发明涉及药物组合物和/或医疗食品,它
    们被制成以0.1μg-10mg/次/kg体重/天的剂量经由血液的系统给药,例如0.1
    μg-1mg/次/kg体重/天,优选1-500μg/次/kg体重/天,更优选1-50μg/
    次/kg体重/天。在另一实施方式中,所述剂量为1-1000μg/次/kg体重/天,
    例如1-100μg/次/kg体重/天。分发给所需患者的药物组合物的量,当然会根
    据待治疗患者的变化而变化,其可以由技术人员例如执业医生根据每一情形决
    定。所述给药可以单剂量施用或以每天多次施用。

    实验部分

    实施例1

    肠道上皮细胞中的肌动蛋白微丝降解

    本实验的目标是阐明肠道上皮细胞(肠细胞)中的肌动蛋白微丝降解是否
    会影响在成年鼠的小肠中流体的分泌。

    材料和方法

    将霍乱毒素(Sigma),3μg,灌注至15cm长的空肠所形成的结扎环。该处理
    导致了5h内的流体积聚,其测量可达到340mg/厘米肠道长度。上皮细胞中通常
    清楚并秩序排列的肌动蛋白网络非常紊乱。肠道上皮细胞内腔表面上的微绒毛
    变短、结团、且轮廓不规则,而且它们的核心微绒毛几乎完全缺失。

    结果

    当肠道环用霍乱毒素激发,然后10分钟内用AF-16,100μg系统性灌注,
    可以消除预期的高分泌。,环的重量大致等于在用缓冲平衡盐溶液激发后的组织
    的重量,没有观察到流体积聚或炎症反应。因此,AF-16可以完全抑制期望的流
    体高分泌。

    在另一方面,如果相同量的AF-16在霍乱毒素激发之后30分钟被递送,环
    中的液体积聚为320-350mg/厘米环长度的数量级。肠细胞以及微绒毛中的肌动
    蛋白网络极为紊乱。我们得出结论,霍乱毒素激发后,关于AF-16的高分泌预
    防效应,有一个时间窗。这些结果明确显示,AF-16仅仅在给予之后的第一个
    10分钟到最长至15分钟之间,可以预防肠道流体的高分泌。肠道流体的高分泌,
    与普遍存在的紊乱的肌动蛋白网络以及某些膨胀的肠细胞相关联。

    用霍乱毒素和甲基-β-环糊精(MβCD)对大鼠的结扎小肠环进行联合激发,导
    致了480-500mg流体/厘米长度环的积聚,以及有显著的组织炎症。肌动蛋白微
    丝极为紊乱。MβCD已知可以损耗胆固醇的脂筏,其可导致脂筏成分的分散和
    聚集,以及这些结构中普遍存在的离子泵和其他传导信号受体的功能异常。肌
    动蛋白细胞骨架也显示紊乱。

    用霍乱毒素和甲基-β-环糊精(MβCD)对大鼠的结扎小肠环进行联合激发,
    10分钟之内接着用100μg?AF-16给药,导致少于100mg流体/厘米环长度的积
    聚,以及没有显著的组织炎症。肌动蛋白微丝在肠细胞的顶端部分和大多数正
    常显现的微绒毛中,都清楚地有组织地排列。我们得出结论,肌动蛋白网络和
    脂筏的紊乱,导致了强烈的流体高分泌,如果10-15分钟之内给予足够单剂量的
    AF-16,可以完全将之预防。

    实施例2

    AF-16对肿瘤细胞的阿霉素分布的影响

    通过利用可以发出清晰红色荧光并且可以结合DNA的阿霉素对AF-16对肿
    瘤中的细胞毒性的低分子量药物的血管和细胞供应的影响进行了研究。利用红
    色标记的细胞核频率作检测阿霉素到达和进入个体的肿瘤细胞的量度。在单一
    i.v.注射阿霉素(9mg/kg?b.w)之前60分钟,用鼻内剂量的100μg?AF-16(n=3)
    或者赋形剂PBS(n=3),预处理具有Mat?B?III肿瘤的动物。15分钟之后将动物
    处死,将肿瘤切离并用液氮速冻。制备出低温切片,将其贴附于玻片,并固定
    在4%的缓冲甲醛中。在用Hoechst?33342(Sigma)对核进行染色之后,将切片用
    VectashieldTM(Vector?Laboratories?Inc,USA)固定,并用Zeiss?Axio?10荧光显微镜
    检测。

    材料和方法

    动物和肿瘤。Fisher?344和Sprague-Dawley品种的雌性大鼠,购自B&K,斯
    德哥尔摩(Stockholm),瑞典(Sweden)。将动物圈养,以12h昼夜循环,以
    标准湿度和温度,以及可以随意接近饲料和水。

    MAT?B?III(ATCC;CRL-1666;#13762)同系肿瘤。在肩胛之间单次皮下注射
    溶解于0.2ml培养基的106MAT?B?III细胞之后,在雌性Fisher大鼠中建立该系
    肿瘤(160克b.w.)。在10-12天产生了一个或多个实体瘤,在2-5天达到了10x8
    x5mm大小,进行压力记录。

    伦理。按照地区动物实验伦理委员会授权许可进行实验,并且遵从地方和
    联邦行为指南(EU?86/609/EEC)。

    化学。合成肽AF-16,并用Ross?Pedersen?A/S,哥本哈根(Copenhagen),丹
    麦(Denmark)检测。DMBA(9,10二甲基-1,2-苯并蒽,Hoechst?33342)和阿霉
    素购自Sigma。添加L-谷氨酸盐的细胞培养基RPMI?1640购自Flow?Lab。

    组织病理学和免疫组织化学。在实验结束,将肿瘤切割、分离,并且在液
    氮中速冻或者固定在4%缓冲甲醛中。固定的肿瘤用石蜡包埋,切片,用苏木紫
    和曙红染色。

    统计。结果以平均值±SE给出。使用成对的设计实验,p<0.05被认为是
    显著的。

    结果

    AF-16对阿霉素分布的影响。与DNA结合的阿霉素,能够由细胞核的明亮
    红色荧光识别。用AF-16预处理大鼠的2/3的MAT?B?III肿瘤中,其红色细胞核
    的阳性频率要高于赋形剂预处理大鼠的肿瘤(图5)。蓝色染料Hoechst?33342可
    以染色所有细胞核,其能够得以显微观察肿瘤以选择同等细胞密度的区域。图
    5A/B和C/D,分别具有相同的肿瘤细胞密度,但是用AF-16预处理动物的样本,
    显示红色细胞核的出现率强烈增加。因此,本实验显示,AF-16能使阿霉素以足
    够的浓度接近每一细胞。我们进一步得出结论,这些结果显示,添加AF-16有
    利于优化低分子量药物至肿瘤组织个体细胞的递送和/或细胞吸收。

    实施例3

    本实验的目标是阐明细胞表面积的改变,即细胞体积的改变,其与流体介
    质的渗透压相关,MATB细胞悬浮于该流体介质中。与正常细胞一样,肿瘤细
    胞也以精确调节,优先保持它们的细胞体积。所用的MATB细胞株已知很大程
    度依赖于流体和离子转移泵NKCC-1的使用,用于监测其尺寸和内在的间隙。

    材料和方法

    肿瘤细胞系MATB细胞(ATCC?Nr:CRL-1666,命名为13762MATB?111),
    其是众所周知并且常用的细胞系,将其在悬浮液培养,并用在利用FACS设备
    的细胞流式实验中。因此,接近球形的肿瘤细胞能够迅速改变其表面积和细胞
    体积,以应对细胞外流体的激发。

    在缺乏能够干扰的任何血清或其他外部蛋白和肽成分的等渗介质中,FACS
    设备测量的MATB细胞表面为620个单位。将10%氯化钠(NaCl)添加至悬浮介
    质中,可以在5分钟内导致MATB细胞表面缩小至仅500单位以下。当细胞感
    觉到其尺寸减少时,这可激活NKCC-1离子泵系统。FAK和CAP系统与阀蛋白
    相连,连接至MATB细胞的肌动蛋白微丝。该系统的激活导致NKCC-
    1/FAK/CAP复合物的磷酸化,由此MATB细胞摄取水和离子以膨胀。细胞急剧
    努力,以争取所有机会再次获得正常的细胞体积。因此,相当明显地,Na+和水
    能使细胞增加其细胞表面至576个单位,即接近于实验之初的测量。然而,如
    果AF-16,100μg/ml在30分钟后添加,脂筏中的NKCC-1泵活性被迅速降低,
    因为NKCC-1去磷酸化而由此失活,这反映在MATB细胞的细胞表面,其达到
    514个单位?;诿垦范嘤?000个细胞,这些改变是显著的。

    结果

    MATB细胞离心、沉积于玻片的免疫组织过程证实了,CAP-FAK-NKCC-1
    系统之间相互作用的动力学。在添加盐水激发而将悬浮介质变成高渗之前,GMK
    细胞在等渗溶液中具有通常较高的磷酸化FAK。在用高渗溶液处理之后磷酸化
    FAK的表达几乎完全去除,这反映在使用AF-16的NKCC-1离子泵恢复了磷酸
    化FAK的高表达,显示所述NKCC-1泵系统被关闭。

    我们得出结论,将悬浮的MATB细胞暴露于高渗溶液,可以激活能够监控
    NKCC-1离子泵系统活性的CAP-FAK系统。因此,我们显示,通过监控
    CAP/ponsin和FAK系统,AF-16能够通过调节NKCC-1离子泵的活性而干预该
    系统。

    实施例5

    在一系列实验中将肿瘤细胞系GMK培养于固体表面,以用鬼笔环肽-FITC
    在免疫组织化学上阐明肌动蛋白微丝的存在和分布。

    材料和方法

    在培养至接近铺满之后,收获GMK细胞。然后,将细胞培养物一式三份,
    根据下列表1说明进行处理。在处理30分钟之后将细胞培养物用福尔马林缓冲
    液固定,然后进行肌动蛋白图案的免疫组织化学显示,其可用标记的鬼笔环肽
    进行观察。鬼笔环肽与肌动蛋白微丝以高亲和力连接,但是不与解聚的肌动蛋
    白微丝或G-肌动蛋白连接。在荧光显微镜辅助下,对所得结果进行评估和存照
    (图3)。

    结果

    我们得出结论,细胞松弛素B使培养的粘附GMK细胞中其正常的肌动蛋
    白微丝图案紊乱,而且,用AF-16处理很大程度上可以恢复正常图案。因此,
    AF-16可以使紊乱的肌动蛋白细胞骨架正?;?。

    表1


    实施例6

    AF-16体外对MATB1细胞的细胞体积调节的影响

    材料和方法

    细胞制备

    将MATB细胞按照标准方法培养,然后在用谷氨酸盐取代的RPMI中稀释
    至1x106/ml。将细胞分成4瓶,命名为1,2,3和4。瓶1作为对照。在瓶2,3和
    4中添加高渗的NaCl(在含有谷氨酸盐的RPMI中10mg/ml),30分钟后接着添
    加50mg的AF-16(瓶3)或PBS(瓶4)。在添加高渗NaCl溶液之后将瓶2进行
    FACS分析,而瓶1,3和4中的细胞在总共60分钟之后进行FACS分析。从所
    有瓶制得细胞离心涂片器的制备物,并用于免疫组织化学分析。

    结果

    对10,000细胞的FACS分析显示中值FSC-水平为:瓶1为620(对照),
    瓶2为450(高渗NaCl?5分钟),瓶3为514(高渗NaCl+AF-16,60分钟),瓶
    4为576(高渗NaCl+PBS,60分钟)(图1)。利用磷酸化FAK的抗体进行的免
    疫组织化学分析显示,在对照细胞中具有强烈的红色染色(瓶1),而瓶4中的
    细胞(PBS-处理)具有显著的低强度。在用AF-16处理的细胞中(瓶3)显现与对
    照细胞相似的染色强度(图2)。

    结果解释

    将游离的MAT?B?III肿瘤细胞用于细胞计数分析并暴露于高渗透压,目的是
    模拟实体瘤的类似情形。实验设置被设计为以解释细胞膨胀,即细胞内流体积
    聚是否可以引起高IFP。因此,包埋肿瘤中的细胞被认为会膨胀,高度优先通过
    泵流体和离子来维持其形状和大小的状态,以便对抗pH和渗透压的影响。

    因此,将悬浮的MAT?B?III细胞暴露于通过在营养介质中添加氯化钠所产生
    的高渗环境。流式细胞计数分析显示,平均细胞体积的迅速减少(图1)。在10
    分钟内,MAT?B?III细胞的体积调节系统,开始恢复其细胞体积,在60分钟后
    达到其原始细胞体积。然而,在高渗激发开始后30分钟内,将AF-16添加至
    MAT?B?III细胞,可抑制细胞体积的反应性增加。将AF-16添加至细胞介质,当
    在高渗压诱导之前加入时,其并不影响游离MAT?B?III细胞的体积(未图示)。
    在反应性恢复开始之前添加AF-16时的效应缺失,显示受AF-16影响的流体转
    移系统暂时失活,直至体积恢复开始。本实验设计重复进行三次,获得相似的
    结果。以总体考虑,这些结果显示AF-16能够影响监控肿瘤细胞尺寸和体积的
    细胞系统。在体外对各种正常成人细胞进行的测试中,AF-16对细胞体积的影响
    一直没有记载。

    维持细胞的尺寸和形状,不仅对于正常细胞而且对于恶性细胞,都是很重
    要的。当环境改变时,细胞迅速产生应答。因此,本实验中的悬浮MAT?B?III
    细胞,通过缩小以应对高渗环境。然而,反方向的反应也迅速开始,以通过增
    加流体吸收而达到恢复细胞的尺寸。然而,AF-16的添加可以在高渗环境中,抑
    制该激活细胞的体积膨胀。在AF-16处理后显示的IFP压力降低,可能是因为
    对肿瘤细胞、对血管或者对它们的组合影响。流式细胞计数分析结果显示,该
    影响可能是对肿瘤细胞减少其体积产生直接影响,由此有利于经由肿瘤的输注。
    这样的效果已经显示在,以药理学诱导的凋亡频率升高的肿瘤中,其可以引起
    肿瘤质量的降低,该效果最终可以产生改善的血液输注(Jain?2008)。实体瘤中的
    高IFP,通常与阻碍细胞毒性药物的渗透和不均匀分布相关。药物分布的这些限
    制,经常导致细胞毒性药物的抗肿瘤效应降低。

    应当强调,AF-16在几小时内可以暂时降低IFP,然后IFP在24h内恢复至
    原始的高水平。实验性地,抑制IFP的该时间限制效应,可能与改善的肿瘤血
    液循环和代谢相关,这可能可以增强辐射治疗的效果。由此,辐射治疗期间的
    血流增加,将会产生更多的游离基团,这将会在消除恶性细胞中更加有效。

    流式细胞计数分析结果显示,AF-16能够直接或间接影响肿瘤细胞和/或基
    质中的基本离子和水转运系统??赡艿暮蜓《韵罂赡芪说鞍譔KCC-1,
    其已知可以影响细胞的体积。

    由于细胞外介质的渗透压改变,添加高渗的NaCl将会导致MATB细胞立即
    缩小,这将导致NKCC1泵的激活,使进入细胞的Na+和水浓度增加,由此对抗
    细胞的缩小。在该激活之前是FAK的去磷酸化,以及同时是NKCC1和其他跨
    膜蛋白的磷酸化。该FAK的去磷酸化,被添加AF-16所抑制。另一命名为CAP
    =ponsin的酶系统,与FAK以及阀蛋白复合物相互作用。因此,AF-16通过干
    预FAK磷酸化与去磷酸化之间的平衡调节而起作用,由此可以改变NKCC1和
    其他跨膜蛋白的活性。AF-16消减了这些恶性细胞重新获得其细胞体积以及也同
    时获得其细胞内压和尺寸的企图。

    参考文献

    1.Marks,F.,Klingmuller,U.,&Muller-Decker,K.Cellular?signal?processing.
    Garland,2008.

    2.Alberts,B.等,Molecularbiology?of?the?cell.第5版,Garland,2008

    3.Krauss,G.Biochemistry?of?signal?transduction?and?regulation.第4版.Wiley
    2008

    4.Cooper,G.M,&Hausman,R.E.The?cell;a?molecular?approach.第4版.
    Sinauer?2007






    关于本文
    本文标题:抗分泌因子AF的用于优化细胞吸收的用途.pdf
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