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    重庆时时彩5合法吗: 人体血浆中洛伐他汀酸及HMGCOA还原酶抑制剂的定量分析方法.pdf

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    人体 血浆 洛伐他汀 HMGCOA 还原酶 抑制剂 定量分析 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201010270536.7

    申请日:

    2010.09.01

    公开号:

    CN102384955A

    公开日:

    2012.03.21

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20100901|||公开
    IPC分类号: G01N30/88 主分类号: G01N30/88
    申请人: 北京北大维信生物科技有限公司
    发明人: 段震文; 郭树仁
    地址: 100080 北京市海淀南路30号航天精密大厦10层
    优先权:
    专利代理机构: 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 11108 代理人: 张韬
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201010270536.7

    授权公告号:

    102384955B||||||

    法律状态公告日:

    2014.04.30|||2012.05.02|||2012.03.21

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。经过方法适用性实验验证,用本方法在测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性可满足方法学要求,可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。

    权利要求书

    1.一种人体血浆中洛伐他汀酸及HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法,其特征在于该方法包括如下步骤:A.试剂溶液的配制(1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4,PBS)的配制称取10.6g?K3PO4·3H2O于烧杯中,加180mL水溶解,用H3PO4调节pH至7.4,再加入纯水至200mL,摇匀;(2)200mM?EDTA(乙二胺四乙酸)(在200mM?pH7.4的PBS中)的配制向200mL?pH7.4,200mM的PBS中加入162mg?K2EDTA·2H2O(乙二胺四乙酸二钾),摇匀;(3)10mM?DTT(二硫苏糖醇)(在2mM?EDTA和200mM?PBS(PH7.4)中)的配制取15.4mg?DTT至10mL容量瓶中,以2mM?EDTA定容至刻度;(4)12mM?NADPH(还原型辅酶II)的配制取20mg?NADPH·Na4至5mL塑料管中,加入2mL纯水,溶解混匀,于-20℃保存,备用;(5)0.4mM?HMG-CoA的配制将10mg?HMG-CoA加至25mL容量瓶中,纯水稀释至刻度并混合均匀,每3mLHMG-CoA分装至一只5mL?PP试管中,于-20℃冷冻保存;(6)3.3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM?NADPH中)的配制以10mM?DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至4mg/mL,将该溶液以5∶1的比例与12mM?NADPH混合;(7)5N?HCl的配制将5mL?HCl倒至玻璃容器中,以7mL水溶解,摇匀;(8)0.1N?HCl的配制取9.0mL?HCl至1000mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀;(9)15%甲醇的配制加入75mL甲醇至425mL水中,摇匀;(10)0.2%氨水的配制取8.0mL?25%氨水至1000mL容量瓶中,用纯水定容至刻度,摇匀;(11)10mM甲酸铵(pH=8.0)的配制?在1000mL烧瓶中,将630g甲酸铵用800mL水溶解,以0.2%氨水调至pH?8.0,转移至1000mL容量瓶中并用纯水定容至刻度,摇匀;(12)流动相的配制700mL?10mM,pH=8.0的甲酸铵与300mL乙腈混合均匀;(13)稀释液:0.1%甲酸甲醇溶液的配制移取100μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;(14)0.5%甲酸甲醇溶液的配制移取500μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;(15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS,1mg/mL):精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;羟基洛伐他汀酸标准储备液1(LSS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LSS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;(16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制以表1的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制(17)羟基洛伐他汀酸(QC)储备液的配制羟基洛伐他汀酸QC储备液(LQS,1mg/mL)的配制:精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;羟基洛伐他汀酸QC储备液1(LQS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LQS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;(18)羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制以表2的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?表2羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制(19)羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制以表3的方法配制样品溶液,于-20℃下冷冻保存;表3羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制(20)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准储备液的配制甲瓦龙酸内酯标准储备液(MSS,2mg/mL):精密称取20mg甲瓦龙酸内酯至10mL容量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,摇匀,4℃保存;甲瓦龙酸内酯标准储备液1(MSS1,5μg/mL):取50μL?MSS至20mL容量瓶中并以水定容至刻度,摇匀,4℃保存;(21)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制以表4的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;表4甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制(22)内标物溶液的制备内标物储备液(ISS,500μg/mL):移取10mg甲瓦龙酸内酯-d7(MVAL-d7,内标物)于20mL容量瓶中,乙腈溶解并稀释至刻度;4℃保存;内标物储备液1(ISS1,100μg/mL)的制备:取1000μL?ISS至5mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;?内标物储备液2(ISS2,10μg/mL)的制备:取200μL?ISS至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;内标物溶液(200ng/mL)的制备:取200μL?ISS2至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度;4℃保存;B.试验前预处理(1)羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备在2mL塑料管中以表5的方法配制工作标准溶液:表5羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备(2)取100μL血浆(双空白溶液**,空白溶液***,工作曲线溶液,QC样品溶液)至1.2mL?96深孔板中;加入400μL?0.5%甲酸(Formic?Acid,FA),盖板并充分振荡;3750rpm离心10min,取上清液300μL加至1.2mL可拆装的96孔板中,30℃氮气吹干,得提取物于-20℃下保存;STD?0*:0ng/mL样品溶液(阴性对照);双空白溶液**:含有肝脏微粒体和NADPH,而不含有HMG-CoA和内标物的血浆样品;空白溶液***:含有肝脏微粒体、NADPH以及内标物,而不含有HMG-CoA的血浆样品;C.HMG-CoA酶反应将上述可拆装的96孔板中的1.2mL小管重新装配至96孔板上,向各小管中分别加入20μL水,涡流振荡混匀;冰浴下,用排枪向各管中加入3.3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μL,涡流振荡混匀;37℃水浴预孵育,同时振摇15min;再用排枪加入0.4mM的HMG-CoA溶液20μL,涡流振荡混匀,其中双空白和空白样品溶液中均加入20mL纯水代替HMG-CoA;37℃水浴孵育,同时振摇30min;用排枪向各孔加入5N的HCl?20μL,涡?流振荡混匀;再次37℃水浴孵育,同时振摇15min以终止反应,得反应溶液,备用;D.MVAL含量测定前处理分别取150μL?MVAL标准加样溶液或反应溶液(双空白溶液、空白溶液、羟基洛伐他汀酸工作溶液、QC样品溶液和待测样品溶液)至玻璃试管中;除双空白溶液外,向其余各试管分别加入100μL内标物加样溶液;再加入900μL?0.1N的HCl和1mL水,涡流振荡混匀,静置30min使MVA转化为MVAL;采用1mL甲醇和1mL?0.1N的HCl次序活化ENV-SPE小柱;将样品上ENV-SPE小柱后,以1mL?0.1N的HCl,1mL纯水和1mL?15%甲醇依次洗脱,抽干小柱;再以0.5mL甲醇洗脱ENV-SPE小柱3次,富集流份;洗脱液在40℃下,氮气吹干;干燥物以200μL?0.2%氨水重溶,涡流振荡混匀,静置30min使MVAL转化为MVA;接着进样LC/MS/MS系统,30μL/针;E.数据计算(1)MVAL定量分析色谱峰保留时间和峰面积由分析软件(1.4.1)确定;以峰面积比率和浓度得曲线,计算出MVAL的浓度;采用线性回归根据以下等式计算出MVAL的浓度:y=ax+b其中:y=被测物与内标物的峰面积比率b=标准曲线的截距a=标准曲线的斜率x=被测物浓度(ng/mL)(采用加权最小二乘法进行回归运算)(2)HMG-CoA还原酶抑制剂定量分析①计算HMG-CoA还原酶(HMGR)的抑制率:首先,计算标准品和样品(QC):y=HMGR的活性抑制率注:标准曲线测定在QC样品测定前后至少重复两次,测得的MVAL含量的平均数值用于计算抑制率;用空白血浆制备的阴性对照液需要重复制备并测定四次,测得阴性对照液中MVAL的平均含量用于上式计算;其次,计算血浆样品:?y=HMGR的活性抑制率注:不同个体可能有不同的阴性对照值(基线值),如果没有对于每个个体都合适的阴性对照值,则取给药前的(0h)MVAL血浆浓度作个体阴性对照浓度;②作HMGR的抑制率与羟基洛伐他汀酸浓度的相关曲线;③以人血浆中羟基洛伐他汀酸的含量定量HMG-CoA还原酶抑制剂的含量:血浆中羟基洛伐他汀酸和其它HMG-CoA还原酶抑制剂(统称羟基洛伐他汀酸类似物)的浓度由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线计算得来;浓度计算采用药理/化学软件Origin?7.5中的对数剂量响应法;y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]其中:X=羟基洛伐他汀酸浓度(ng/mL)(无加权处理)-5≤A1<A2≤115A1,A2,X0和P来自软件中的原始参数;交互作用过程中,简化的卡方检验并没有降低;(3)准确度和精密度的检测①羟基洛伐他汀酸准确度:羟基洛伐他汀酸计算浓度是由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线回溯计算得来;精密度:所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在出具报告数据时进行舍入处理;②MVAL准确度:MVAL计算浓度是由MVAL的峰面积比率与MVAL浓度的相关曲线回溯计算而来的;精密度:所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在最终出具报告数据时进行舍入处理。?

    说明书

    人体血浆中洛伐他汀酸及HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法

    发明领域

    本发明涉及一种人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法,特别涉及一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。?

    背景技术

    HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶,抑制HMG-CoA还原酶可以限制胆固醇的合成,达到调节血脂的目的。目前HMG-CoA还原酶抑制剂主要有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等。文献报道的技术方法均为针对单个他汀的定量分析方法,由于他汀类的血浆代谢产物他汀酸类亦具有一定的HMG-CoA还原酶抑制活性,所以定量分析血浆中他汀类药物的含量并不能真实的反应此他汀对HMG-CoA还原酶的抑制活性。本方法通过HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析,可以从总体上评价洛伐他汀对HMG-CoA还原酶的抑制活性,而不单是洛伐他汀本身,尚包含其他洛伐他汀代谢物等活性成分对HMG-CoA还原酶的抑制作用。目前尚未见定量分析HMG-CoA还原酶抑制剂的方法学报道。?

    发明内容

    本发明目的在于公开一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。?

    本发明目的是通过如下方案实现的:?

    本发明定量分析方法具体包括如下步骤:?

    A.试剂溶液的配制?

    (1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4,PBS)的配制?

    称取10.6g?K3PO4·3H2O于烧杯中,加180mL水溶解,用H3PO4调节pH至7.4,再加入纯水至200mL,摇匀;?

    (2)200mM?EDTA(乙二胺四乙酸)(在200mM?pH7.4的PBS中)的配制?

    向200mL?pH7.4,200mM的PBS中加入162mg?K2EDTA·2H2O(乙二胺四乙酸二钾),摇匀;?

    (3)10mM?DTT(二硫苏糖醇)(在2mM?EDTA和200mM?PBS(PH7.4)中)的配制取15.4mg?DTT至10mL容量瓶中,以2mM?EDTA定容至刻度;?

    (4)12mM?NADPH(还原型辅酶II)的配制?

    取20mg?NADPH·Na4至5mL塑料管中,加入2mL纯水,溶解混匀,于-20℃保存,备用;?

    (5)0.4mM?HMG-CoA的配制?

    将10mg?HMG-CoA加至25mL容量瓶中,纯水稀释至刻度并混合均匀,每3mLHMG-CoA分装至一只5mL?PP试管中,于-20℃冷冻保存;?

    (6)3.3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM?NADPH中)的配制?

    以10mM?DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至4mg/mL,将该溶液以5∶1的比例与12mM?NADPH混合;?

    (7)5N?HCl的配制?

    将5mL?HCl倒至玻璃容器中,以7mL水溶解,摇匀;?

    (8)0.1N?HCl的配制?

    取9.0mL?HCl至1000mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀;?

    (9)15%甲醇的配制?

    加入75mL甲醇至425mL水中,摇匀;?

    (10)0.2%氨水的配制?

    取8.0mL?25%氨水至1000mL容量瓶中,用纯水定容至刻度,摇匀;?

    (11)10mM甲酸铵(pH=8.0)的配制?

    在1000mL烧瓶中,将630g甲酸铵用800mL水溶解,以0.2%氨水调至pH?8.0,转移至1000mL容量瓶中并用纯水定容至刻度,摇匀;?

    (12)流动相的配制?

    700mL?10mM,pH=8.0的甲酸铵与300mL乙腈混合均匀;?

    (13)稀释液:0.1%甲酸甲醇溶液的配制?

    移取100μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;?

    (14)0.5%甲酸甲醇溶液的配制?

    移取500μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;?

    (15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制?

    羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS,1mg/mL):精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    羟基洛伐他汀酸标准储备液1(LSS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LSS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    (16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制?

    以表1的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制?

    (17)羟基洛伐他汀酸(QC)储备液的配制?

    羟基洛伐他汀酸QC储备液(LQS,1mg/mL)的配制:精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    羟基洛伐他汀酸QC储备液1(LQS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LQS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    (18)羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制?

    以表2的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表2羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制?

    (19)羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制?

    以表3的方法配制样品溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表3羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制?

    (20)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准储备液的配制?

    甲瓦龙酸内酯标准储备液(MSS,2mg/mL):精密称取20mg甲瓦龙酸内酯至10mL容量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,摇匀,4℃保存;?

    甲瓦龙酸内酯标准储备液1(MSS1,5μg/mL):取50μL?MSS至20mL容量瓶中并以水定容至刻度,摇匀,4℃保存;?

    (21)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制?

    以表4的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表4甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制?

    (22)内标物溶液的制备?

    内标物储备液(ISS,500μg/mL):移取10mg甲瓦龙酸内酯-d7(MVAL-d7,内标物)于20mL容量瓶中,乙腈溶解并稀释至刻度;4℃保存;?

    内标物储备液1(ISS1,100μg/mL)的制备:取1000μL?ISS至5mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;?

    内标物储备液2(ISS2,10μg/mL)的制备:取200μL?ISS至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;?

    内标物溶液(200ng/mL)的制备:取200μL?ISS2至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度;4℃保存;?

    B.试验前预处理?

    (1)羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备?

    在2mL塑料管中以表5的方法配制工作标准溶液:?

    表5羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备?

    (2)取100μL血浆(双空白溶液**,空白溶液***,工作曲线溶液,QC样品溶液)至1.2mL?96深孔板中;加入400μL?0.5%甲酸(Formic?Acid,FA),盖板并充分振荡;3750rpm离心10min,取上清液300μL加至1.2mL可拆装的96孔板中,30℃氮气吹干,得提取物于-20℃下保存;?

    STD?0*:0ng/mL样品溶液(阴性对照);?

    双空白溶液**:含有肝脏微粒体和NADPH,而不含有HMG-CoA和内标物的血浆样品;?

    空白溶液***:含有肝脏微粒体、NADPH以及内标物,而不含有HMG-CoA的血浆样品;?

    C.HMG-CoA酶反应?

    将上述可拆装的96孔板中的1.2mL小管重新装配至96孔板上,向各小管中分别加入20μL水,涡流振荡混匀;冰浴下,用排枪向各管中加入3.3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μL,涡流振荡混匀;37℃水浴预孵育,同时振摇15min;再用排枪加入0.4mM的HMG-CoA溶液20μL,涡流振荡混匀,其中双空白和空白样品溶液中均加入20mL纯水代替HMG-CoA;37℃水浴孵育,同时振摇30min;用排枪向各孔加入5N的HCl?20μL,涡流振荡混匀;再次37℃水浴孵育,同时振摇15min以终止反应,得反应溶液,备用;?

    D.MVAL含量测定前处理?

    分别取150μL?MVAL标准加样溶液或反应溶液(双空白溶液、空白溶液、羟基洛伐他汀酸工作溶液、QC样品溶液和待测样品溶液)至玻璃试管中;除双空白溶液外,向其余各试管分别加入100μL内标物加样溶液;再加入900μL?0.1N的HCl和1mL水,涡流振荡混匀,静置30min使MVA转化为MVAL;采用1mL甲醇和1mL?0.1N的HCl次序活化ENV-SPE小柱;将样品上ENV-SPE小柱后,以1mL?0.1N的HCl,1mL纯水和1mL?15%甲醇依次洗脱,抽干小柱;再以0.5mL甲醇洗脱ENV-SPE小柱3次,富集流份;洗脱液在40℃下,氮气吹干;干燥物以200μL?0.2%氨水重溶,涡流振荡混匀,静置30min使MVAL转化为MVA;接着进样LC/MS/MS系统,30μL/针;?

    E.仪器设置?

    (1)HPLC条件:?

    HPLC色谱柱:??????????Venusil?ABS?C18柱(5μm,4.6×150mm)?

    流动相:??????????????10mM甲酸铵(pH=8.0)和乙腈(70/30,v/v)?

    流速:????????????????0.8mL/min(不分流)?

    进样针清洗液:????????50∶50甲醇/水?

    进样体积:????????????30μL?

    数据采集时间:????????3min?

    柱温:????????????????室温?

    自动进样温度:????????室温;?

    (2)转换阀条件:?

    具体转换时间和数据采集时间根据色谱柱条件改变,T1为1.2min,该设置在第一个色谱峰出峰前0.5min,数据采集时间应设置在最后一个色谱峰出峰至少0.5min后;T2为2.5min。?

    (3)MS/MS条件?

    MVA:极性为负离子模式,母离子和子离子荷质比分别为147.0和59.1,延滞时间为200msec,停顿时间为5msec,保留时间为~1.8min;?

    MVA-d7(MVA的内标物):极性为负离子模式,母离子和子离子荷质比分别为154.0和59.1,延滞时间为200msec,停顿时间为5msec,保留时间为~1.8min;?

    F.数据计算?

    (1)MVAL定量分析?

    色谱峰保留时间和峰面积由分析软件(1.4.1)确定;以峰面积比率和浓度得曲线,计算出MVAL的浓度;采用线性回归根据以下等式计算出MVAL的浓度:?

    y=ax+b?

    其中:y=被测物与内标物的峰面积比率?

    b=标准曲线的截距?

    a=标准曲线的斜率?

    x=被测物浓度(ng/mL)?

    (采用加权最小二乘法进行回归运算)?

    (2)HMG-CoA还原酶抑制剂定量分析?

    ①计算HMG-CoA还原酶(HMGR)的抑制率:?

    首先,计算标准品和样品(QC):?

    y=HMGR的活性抑制率?

    注:标准曲线测定在QC样品测定前后至少重复两次,测得的MVAL含量的平均数值用于计算抑制率;用空白血浆制备的阴性对照液需要重复制备并测定四次,测得阴性对?照液中MVAL的平均含量用于上式计算;?

    其次,计算血浆样品:?

    y=HMGR的活性抑制率?

    注:不同个体可能有不同的阴性对照值(基线值),如果没有对于每个个体都合适的阴性对照值,则取给药前的(0h)MVAL血浆浓度作个体阴性对照浓度。?

    ②作HMGR的抑制率与羟基洛伐他汀酸浓度的相关曲线;?

    ③以人血浆中羟基洛伐他汀酸的含量定量HMG-CoA还原酶抑制剂的含量:?

    血浆中羟基洛伐他汀酸和其它HMG-CoA还原酶抑制剂(统称羟基洛伐他汀酸类似物)的浓度由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线计算得来;浓度计算采用药理/化学软件Origin?7.5中的对数剂量响应法;?

    y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]?

    其中:X=羟基洛伐他汀酸浓度(ng/mL)?

    (无加权处理)?

    -5≤A1<A2≤115?

    A1,A2,X0和P来自软件中的原始参数;交互作用过程中,简化的卡方检验并没有降低;?

    (3)准确度和精密度的检测?

    ①羟基洛伐他汀酸?

    准确度:?

    羟基洛伐他汀酸计算浓度是由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线回溯计算得来;?

    精密度:?

    所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在出具报告数据时进行舍入处理;?

    ②MVAL?

    准确度:?

    MVAL计算浓度是由MVAL的峰面积比率与MVAL浓度的相关曲线回溯计算而来的;?

    精密度:?

    所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在最终出具报告数据时进行舍入处理。?

    附图说明

    图1:洛伐他汀酸双空白的代表色谱图;?

    图2:洛伐他汀酸空白的代表色谱图;?

    图3:MVAL低限校正标准溶液的代表色谱图;?

    图4:洛伐他汀酸低限校正标准溶液的代表色谱图;?

    图5:洛伐他汀酸最高浓度标准溶液的代表色谱图;?

    图6:MVAL代表标准曲线;?

    图7:洛伐他汀酸代表标准曲线;?

    图8:HMG-CoA转化为MVA示意图;?

    图9:MVA与MVAL的相互转化示意图。?

    本发明公开了一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。经过方法适用性实验验证,用本方法在测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性可满足方法学要求,可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。?

    下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。?

    下述实验例1-8为按照本发明实施例1所述方法定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂,下述实验例1-8是对该方法的验证以评估该方法的适用性,以测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性。研究结果表明,本发明定量分析方法可满足方法学要求,可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。?

    实验例1本发明定量分析方法的选择性实验?

    对照组血浆采集自6个不同的个体,分析不含内标物和HMG-CoA的双空白对照血浆、?含有内标物但不含HMG-CoA的空白对照血浆、含有内标物(n=1)的洛伐他汀酸的定量上限(ULOQ,MVAL的较低浓度)的样品,如表6所示,对照样品没有干扰峰。洛伐他汀酸的双空白色谱图、空白色谱图,MVAL的定量下限色谱图,洛伐他汀酸的定量下限和定量上限色谱图分别见附图1,2,3,4,5。?

    表6洛伐他汀选择性研究?

    注:从每天的结果中收集选择性研究数据。?

    双空白:内标和HMG-CoA都没加的空白对照血浆?

    空白:没加HMG-CoA,加内标的空白对照血浆?

    定量上限:加内标的洛伐他汀酸样品的定量上限(洛伐他汀酸是25ng/mL,MVAL浓度的定量下限)。?

    实验例2本发明定量分析方法的灵敏度实验?

    按照本发明实施例2所述的方法定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂,将洛伐他汀酸的定量下限(LLOQ)设计为0.5ng/mL。为了评估方法的灵敏度,在该浓度检测了至少8个样品。由5个不同批次的血浆制备,检测结果由标准曲线回溯计算得到,结果见表7。该结果不符合设计要求(所有洛伐他汀酸LLOQ的测定结果的准确度应为真实值的100±30%,LLOQ的测定结果的RSD应≤25%)。将标准曲线上的次低浓度点1ng/mL设置为定量最低限则满足设计要求。数据(见表12)说明,该方法在洛伐他汀酸浓度为1ng/mL时具有足够的灵敏度。?

    表7洛伐他汀酸定量下限样品结果?

    实验例3本发明定量分析方法中标准曲线的实验?

    表8和表9分别显示了洛伐他汀酸和MVAL的校正曲线上标准品的回溯计算浓度,结果表明符合设计要求(洛伐他汀酸的LLOQ的回溯计算值未超出其真实值的100±30%,其余各点的回溯计算值未超出其真实值的100±25%;MVLA的LLOQ的回溯计算值未超出其真实值的100±20%,其余各点的回溯计算值未超出其真实值的100±15%;包括定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)在内的至少75%非零标准品符合上述验收标准)。?

    表8本发明分析过程:洛伐他汀酸校正标准溶液的实测浓度?

    表9本发明分析过程:MVAL校正标准溶液的实测浓度?

    实验例4本发明定量分析方法中曲线拟合算法的实验?

    在10-2000ng/mL的MVAL标准浓度范围内评估该方法的线性。线性回归(加权最小二乘法)表明血浆中MVAL浓度/检测器响应关系的最佳拟合曲线。MVAL的校正曲线参数见表10,曲线上各点相关系数R大于0.99。MVAL的代表性线性点见附图6。?

    洛伐他汀酸的校正曲线由一份双空白样品、一份空白样品、一份0ng/mL样品和至少6个非零标准品浓度点(在线性1~25ng/mL浓度范围内),其中包括定量上限和定量下限。采用对数回归拟合法绘出血浆中洛伐他汀酸的浓度抑制曲线。洛伐他汀的校正曲线参数见表11。曲线上各点相关系数R大于0.99。洛伐他汀酸的代表性线性点见附图7。?

    表10本发明分析过程:MVAL的校正曲线参数?

    表11本发明分析过程:洛伐他汀酸的校正曲线参数?

    实验例5本发明定量分析方法日内和日间的准确度和精密度实验?

    在三个不同浓度水平(1ng/mL,10ng/mL和20ng/mL洛伐他汀酸)评估本发明定量分析方法的日内和日间的准确度和精密度。洛伐他汀酸的样品(QC)的统计结果见表12。?

    结果显示,该方法的日内和日间的准确度和精密度均符合本研究要求(%Nom在[100±25]%范围内,%RSD不大于20%)。?

    表12洛伐他汀酸日内和日间的准确度和精密度?

    注:*异常值,不计入统计分析?

    实验例6本发明定量分析方法回收率实验?

    分别在两个QC浓度(1.5ng/mL和36ng/mL)测定洛伐他汀和洛伐他汀酸的回收率。每个浓度水平制备3个平行样品,采用3个结果的平均值进行比较。表13显示的是不同浓度水平的洛伐他汀的回收率,分别是86.1%和85.5%。表14显示的是不同浓度水平的洛伐他汀酸的回收率,分别是83.3%和81.8%。?

    在3个浓度水平(20ng/mL,100ng/mL和2000ng/mL)测定MVAL的回收率,结果见表15,分别是82.2%(低)、72.3%(中)、72.3%(高)。在浓度200ng/mL测定MVAL-d7(内标物)的回收率,结果为72.4%,见表16。?

    表13洛伐他汀的回收率?

    表14洛伐他汀酸的回收率?

    表15MVAL的回收率?

    表16MVAL-d7(内标)的回收率?

    实验例7本发明定量分析方法稀释完整性实验?

    为了验证高浓度的样品稀释后仍在可分析的范围内,并为检测限所接受,在人血浆中加入加倍的洛伐他汀酸,达到500ng/mL。QC样品的稀释液至少准备6份平行样,加入空白血浆稀释50倍至洛伐他汀酸的浓度为10ng/mL。稀释后的样品采用标准校正曲线分析。实测浓度乘以稀释倍数(50)即可得到准确浓度。计算得到的浓度乘以稀释因子(50)得到准确的样品浓度。稀释完整性评估表明符合生物分析研究要求(%准确度在100±25%范围内,%RSD在20%范围内)。结果见表17,洛伐他汀酸的稀释完整性符合试?验要求。?

    表17洛伐他汀酸的稀释完整性研究结果(稀释因子=50)?

    注:*异常值,不计入统计分析?

    实验例8本发明定量分析方法稳定性实验?

    (1)提取物的稳定性?

    在评估经处理样品的完整性时,在预实验之后准备两个浓度水平的QC样品(含洛伐他汀酸1ng/mL(LQC)和20ng/mL(HQC)),置-20℃冷冻保存120h。采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线,并用它们定量分析上述样品。每个浓度水平的QC样品至少准备6个平行样品进行分析测定。结果见表18,均满足方案设计的验收标准(如果在-20℃提取物的测定浓度平均值在真实值的100±25%内,则认为提取物是稳定的)。?

    表18-20℃条件下放置120小时后提取物样品中洛伐他汀酸的稳定性结果?

    (2)短期稳定性?

    为了评价血浆中洛伐他汀酸的短期稳定性,将两个浓度水平的QC样品(含洛伐他汀酸1ng/mL(LQC)和20ng/mL(HQC))在冰水浴中放置6h,采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线,并用它们定量分析以上样品。?每个浓度水平的QC样品至少准备6个平行样品进行分析。结果见表19,说明血浆中洛伐他汀酸在冰水浴条件下6h是稳定的。?

    表19冰水条件下放置6小时后洛伐他汀酸的稳定性结果?

    (3)自动进样器内的样品稳定性?

    为了评估人血浆中洛伐他汀酸在处理样品时的稳定性,将处理样品置于自动进样器中,于15℃放置44h。采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线,并用它们定量分析自动进样器中的样品。结果见表20,符合试验方案的验收标准(测定结果的平均值在真实浓度的[100±25]%内),表明洛伐他汀酸在自动进样器中于15℃放置44h是稳定的。?

    表20室温(15℃)条件下在自动进样器中放置44小时后洛伐他汀酸的稳定性结果?

    注:*异常值,不计入统计分析?

    (4)冻溶稳定性?

    采用两个浓度的样品(含洛伐他汀酸1ng/mL和20ng/mL),每个浓度水平至少准备6个平行样品,以评估血浆中洛伐他汀酸的冻溶稳定性。经过冻溶循环的样品浓度与真实浓度进行比较,结果见表21,符合方案的验收标准(测定结果平均值在真实浓度的[100±25]%内),说明洛伐他汀酸在冻溶循环中是稳定的。?

    表21洛伐他汀酸的冻融稳定性研究结果?

    (5)标准加样样品稳定性?

    为了评估冷藏条件下标准加样样品的稳定性,将MVAL和MVAL-d7(IS)的标准加样样品在4℃放置22天。结果分别与新配制的MVAL和MVAL-d7的标准加样样品进行比较。结果见表22和23,表明MVAL和MVAL-d7的标准加样溶液在4℃放置22天是稳定的。?

    表22MVAL加样溶液在冷藏(4℃)条件下放置22天后的稳定性结果?

    表23MVAL-d7(内标)加样溶液在冷藏(4℃)条件下放置22天后的稳定性结果?

    (6)储备液稳定性?

    为了评估冷藏条件下储备液的稳定性,将MVAL和MVAL-d7(IS)的储备液在4℃分别放置62天和82天。结果分别与新配制的MVAL和MVAL-d7的标准加样样品进行比较。结?果见表24和25,表明MVAL和MVAL-d7的标准加样溶液在4℃分别放置62天和82天是稳定的。?

    表24MVAL储备液在冷藏(4℃)条件下放置62天后的稳定性结果?

    表25MVAL-d7(内标)储备液在冷冻(-20℃)条件下放置82天后的稳定性结果?

    下述实施例均能实现上述实验例所述效果。?

    具体实施方式

    实施例1:本发明定量分析方法?

    A.试剂溶液的配制?

    (1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4,PBS)的配制?

    称取10.6g?K3PO4·3H2O于烧杯中,加180mL水溶解,用H3PO4调节pH至7.4,再加入纯水至200mL,摇匀;?

    (2)200mM?EDTA(乙二胺四乙酸)(在200mM?pH7.4的PBS中)的配制?

    向200mL?pH7.4,200mM的PBS中加入162mg?K2EDTA·2H2O(乙二胺四乙酸二钾),摇匀;?

    (3)10mM?DTT(二硫苏糖醇)(在2mM?EDTA和200mM?PBS(PH7.4)中)的配制取15.4mg?DTT至10mL容量瓶中,以2mM?EDTA定容至刻度;?

    (4)12mM?NADPH(还原型辅酶II)的配制?

    取20mg?NADPH·Na4至5mL塑料管中,加入2mL纯水,溶解混匀,于-20℃保存,备用;?

    (5)0.4mM?HMG-CoA的配制?

    将10mg?HMG-CoA加至25mL容量瓶中,纯水稀释至刻度并混合均匀,每3mLHMG-CoA分装至一只5mL?PP试管中,于-20℃冷冻保存;?

    (6)3.3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM?NADPH中)的配制?

    以10mM?DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至4mg/mL,将该溶液以5∶1的比例与12mM?NADPH混合;?

    (7)5N?HCl的配制?

    将5mL?HCl倒至玻璃容器中,以7mL水溶解,摇匀;?

    (8)0.1N?HCl的配制?

    取9.0mL?HCl至1000mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀;?

    (9)15%甲醇的配制?

    加入75mL甲醇至425mL水中,摇匀;?

    (10)0.2%氨水的配制?

    取8.0mL?25%氨水至1000mL容量瓶中,用纯水定容至刻度,摇匀;?

    (11)10mM甲酸铵(pH=8.0)的配制?

    在1000mL烧瓶中,将630g甲酸铵用800mL水溶解,以0.2%氨水调至pH?8.0,转移至1000mL容量瓶中并用纯水定容至刻度,摇匀;?

    (12)流动相的配制?

    700mL?10mM,pH=8.0的甲酸铵与300mL乙腈混合均匀;?

    (13)稀释液:0.1%甲酸甲醇溶液的配制?

    移取100μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;?

    (14)0.5%甲酸甲醇溶液的配制?

    移取500μL甲酸至100mL甲醇中,摇匀;?

    (15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制?

    羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS,1mg/mL):精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    羟基洛伐他汀酸标准储备液1(LSS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LSS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    (16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制?

    以表1的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制?

    (17)羟基洛伐他汀酸(QC)储备液的配制?

    羟基洛伐他汀酸QC储备液(LQS,1mg/mL)的配制:精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中,以稀释液溶解并定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    羟基洛伐他汀酸QC储备液1(LQS1,10μg/mL)的配制:取100μL?LQS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度,于-20℃下冷冻保存;?

    (18)羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制?

    以表2的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表2羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制?

    (19)羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制?

    以表3的方法配制样品溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表3羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制?

    (20)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准储备液的配制?

    甲瓦龙酸内酯标准储备液(MSS,2mg/mL):精密称取20mg甲瓦龙酸内酯至10mL容量瓶中,乙腈溶解并定容至刻度,摇匀,4℃保存;?

    甲瓦龙酸内酯标准储备液1(MSS1,5μg/mL):取50μL?MSS至20mL容量瓶中并以水定容至刻度,摇匀,4℃保存;?

    (22)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制?

    以表4的方法配制标准加样溶液,于-20℃下冷冻保存;?

    表4甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制?

    (22)内标物溶液的制备?

    内标物储备液(ISS,500μg/mL):移取10mg甲瓦龙酸内酯-d7(MVAL-d7,内标物)于20mL容量瓶中,乙腈溶解并稀释至刻度;4℃保存;?

    内标物储备液1(ISS1,100μg/mL)的制备:取1000μL?ISS至5mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;?

    内标物储备液2(ISS2,10μg/mL)的制备:取200μL?ISS至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度,摇匀,MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算;4℃保存;?

    内标物溶液(200ng/mL)的制备:取200μL?ISS2至10mL容量瓶中,纯水溶解并稀释至刻度;4℃保存;?

    B.试验前预处理?

    (1)羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备?

    在2mL塑料管中以表5的方法配制工作标准溶液:?

    表5羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备?

    (2)取100μL血浆(双空白溶液**,空白溶液***,工作曲线溶液,QC样品溶液)至1.2mL?96深孔板中;加入400μL?0.5%甲酸(Formic?Acid,FA),盖板并充分振荡;3750rpm离心10min,取上清液300μL加至1.2mL可拆装的96孔板中,30℃氮气吹干,得提取物于-20℃下保存;?

    STD?0*:0ng/mL样品溶液(阴性对照);?

    双空白溶液**:含有肝脏微粒体和NADPH,而不含有HMG-CoA和内标物的血浆样品;?

    空白溶液***:含有肝脏微粒体、NADPH以及内标物,而不含有HMG-CoA的血浆样品;?

    C.HMG-CoA酶反应?

    将上述可拆装的96孔板中的1.2mL小管重新装配至96孔板上,向各小管中分别加入20μL水,涡流振荡混匀;冰浴下,用排枪向各管中加入3.3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μL,涡流振荡混匀;37℃水浴预孵育,同时振摇15min;再用排枪加入0.4mM的HMG-CoA溶液20μL,涡流振荡混匀,其中双空白和空白样品溶液中均加入20mL纯水代替HMG-CoA;37℃水浴孵育,同时振摇30min;用排枪向各孔加入5N的HCl?20μL,涡流振荡混匀;再次37℃水浴孵育,同时振摇15min以终止反应,得反应溶液,备用;HMG-CoA转化为MVA的示意图见附图8。?

    D.MVAL含量测定前处理?

    分别取150μL?MVAL标准加样溶液或反应溶液(双空白溶液、空白溶液、羟基洛伐他汀酸工作溶液、QC样品溶液和待测样品溶液)至玻璃试管中;除双空白溶液外,向其余各试管分别加入100μL内标物加样溶液;再加入900μL?0.1N的HCl和1mL水,涡流振荡混匀,静置30min使MVA转化为MVAL;采用1mL甲醇和1mL?0.1N的HCl次序活化ENV-SPE小柱;将样品上ENV-SPE小柱后,以1mL?0.1N的HCl,1mL纯水和1mL?15%甲醇依次洗脱,抽干小柱;再以0.5mL甲醇洗脱ENV-SPE小柱3次,富集流份;洗脱液在40℃下,氮气吹干;干燥物以200μL?0.2%氨水重溶,涡流振荡混匀,静置30min使MVAL转化为MVA;接着进样LC/MS/MS系统,30μL/针;MVA与MVAL的相互转化的示意图详见附图9。?

    E.仪器设置?

    (1)HPLC条件:?

    HPLC色谱柱:????????Venusil?ABS?C18柱(5μm,4.6×150mm)?

    流动相:????????????10mM甲酸铵(pH=8.0)和乙腈(70/30,v/v)?

    流速:??????????????0.8mL/min(不分流)?

    进样针清洗液:??????50∶50甲醇/水?

    进样体积:????????????30μL?

    数据采集时间:????????3min?

    柱温:????????????????室温?

    自动进样温度:????????室温;?

    (2)转换阀条件:?

    具体转换时间和数据采集时间根据色谱柱条件改变,T1为1.2min,该设置在第一个色谱峰出峰前0.5min,数据采集时间应设置在最后一个色谱峰出峰至少0.5min后;T2为2.5min。?

    (3)MS/MS条件?

    MVA:极性为负离子模式,母离子和子离子荷质比分别为147.0和59.1,延滞时间为200msec,停顿时间为5msec,保留时间为~1.8min;?

    MVA-d7(MVA的内标物):极性为负离子模式,母离子和子离子荷质比分别为154.0和59.1,延滞时间为200msec,停顿时间为5msec,保留时间为~1.8min;?

    F.数据计算?

    (1)MVAL定量分析?

    色谱峰保留时间和峰面积由分析软件(1.4.1)确定;以峰面积比率和浓度得曲线,计算出MVAL的浓度;采用线性回归根据以下等式计算出MVAL的浓度:?

    y=ax+b?

    其中:y=被测物与内标物的峰面积比率?

    b=标准曲线的截距?

    a=标准曲线的斜率?

    x=被测物浓度(ng/mL)?

    (采用加权最小二乘法进行回归运算)?

    (2)HMG-CoA还原酶抑制剂定量分析?

    ①计算HMG-CoA还原酶(HMGR)的抑制率:?

    首先,计算标准品和样品(QC):?

    y=HMGR的活性抑制率?

    注:标准曲线测定在QC样品测定前后至少重复两次,测得的MVAL含量的平均数值用于计算抑制率;用空白血浆制备的阴性对照液需要重复制备并测定四次,测得阴性对?照液中MVAL的平均含量用于上式计算;?

    其次,计算血浆样品:?

    y=HMGR的活性抑制率?

    注:不同个体可能有不同的阴性对照值(基线值),如果没有阴性对照值对于每个个体都是合适的,则取给药前的(0h)MVAL血浆浓度作个体阴性对照浓度。?

    ②作HMGR的抑制率与羟基洛伐他汀酸浓度的相关曲线;?

    ③以人血浆中羟基洛伐他汀酸的含量定量HMG-CoA还原酶抑制剂的含量:?

    血浆中羟基洛伐他汀酸和其它HMG-CoA还原酶抑制剂(统称羟基洛伐他汀酸类似物)的浓度由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线计算得来;浓度计算采用药理/化学软件Origin?7.5中的对数剂量响应法;?

    y=A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P]?

    其中:X=羟基洛伐他汀酸浓度(ng/mL)?

    (无加权处理)?

    -5≤A1<A2≤115?

    A1,A2,X0和P来自软件中的原始参数;交互作用过程中,简化的卡方检验并没有降低;?

    (3)准确度和精密度?

    ①羟基洛伐他汀酸?

    准确度:?

    羟基洛伐他汀酸计算浓度是由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线回溯计算得来;?

    精密度:?

    所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在出具报告数据时进行舍入处理;?

    ②MVAL?

    准确度:?

    MVAL计算浓度是由MVAL的峰面积比率与MVAL浓度的相关曲线回溯计算而来的;?

    精密度:?

    所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理,只有在最终出具报告数据时进行舍入处理;?

    G.验收标准?

    1、标准品验收标准?

    (1)羟基洛伐他汀酸:?

    羟基洛伐他汀酸的校正曲线应至少包含1~25ng/mL范围内六个浓度样品。这些样品准备相应的平行样,在样品测定之前和之后,进样检测。采用MVAL的平均浓度计算抑制率。为更好的曲线拟合,亦将0.25ng/mL、0.5ng/mL和30ng/mL作为浓度测定点,但并不进行报告和评估。其余校正曲线样品的理论计算浓度将予以报告。?

    验收标准:?

    1)标准品的定量低限(LLOQ)的回溯计算值不应超出其真实值的(100±30)%、所有其他标准品的(100±25)%。?

    2)舍弃不符合验收标准的标准品值,但不改变已经建立的标准。?

    3)包括定量低限(LLOQ)和定量高限(ULOQ)在内的所有标准曲线中各浓度的回溯计算值应至少有75%符合验收标准,并且校正曲线中应至少包含六个符合标准的数据,回归系数≥0.99。?

    4)如果LLOQ或ULOQ不满足验收标准,可适当调节方法的浓度范围并予以记录。?

    (2)MVAL?

    MVAL的校正曲线至少包含10~2000ng/mL六个浓度的样品。在每一个样品进样之前,这些样品均进行相应的检测。校正曲线中样品的理论计算浓度将予以报告。?

    验收标准?

    1)标准品的定量低限(LLOQ)的回溯计算值不应超出其真实值的(100±20)%、所有其他标准品的(100±15)%。?

    2)舍弃不符合验收标准的标准品值,但不改变已经建立的标准。?

    3)包括定量低限(LLOQ)和定量高限(ULOQ)在内的所有标准曲线中各浓度的回溯计算值应至少有75%符合验收标准,并且校正曲线应该由至少6个可以接受的标准品所构成。?

    4)如果LLOQ或ULOQ不满足验收标准,可适当调节方法的浓度范围并予以记录。?

    2、验收标准?

    1)LQC样品(1ng/mL)计算值(测量值)的准确度应在标识值(真实值)的70%~130%,其余样品(10ng/mL和20ng/mL)测量值的准确度应在真实值的75%~125%。?

    2)至少2/3样品的计算值(测量值)必须在各自的标识值(真实值)范围内,每个浓度水平必须有一个样品在标识值(真实值)范围内。?

    关于本文
    本文标题:人体血浆中洛伐他汀酸及HMGCOA还原酶抑制剂的定量分析方法.pdf
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