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    重庆时时彩三星遗漏: 一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 制备 绍兴 黄酒 熟麦曲中米 曲霉 外分泌 蛋白 双向 电泳 样品 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110270987.5

    申请日:

    2011.09.14

    公开号:

    CN102359900A

    公开日:

    2012.02.22

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 1/28申请公布日:20120222|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 1/28申请日:20110914|||公开
    IPC分类号: G01N1/28; G01N27/26 主分类号: G01N1/28
    申请人: 江南大学
    发明人: 陆健; 管政兵; 张波
    地址: 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
    优先权:
    专利代理机构: 北京汇信合知识产权代理有限公司 11335 代理人: 王秀丽
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110270987.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2014.01.15|||2012.04.04|||2012.02.22

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法。该方法选取乙酸-乙酸钠缓冲溶液低温浸提麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白,通过clean?up?kit试剂盒来处理样品提取液,获得纯净的样品蛋白沉淀,最后加入样品裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。本发明制备出绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行,可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱,便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白,具有较大的实际应用价值。

    权利要求书

    1: 一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法, 包括以下步 骤: 1) 称取一定质量的绍兴黄酒熟麦曲, 加入适当体积浓度为 0.1mol/L, pH4.2 的乙酸 - 乙 酸钠缓冲溶液, 同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片, 在 4℃条件下浸提 4-12h 后使用 4 层纱 布过滤, 所得滤液利用高速冷冻离心机以 12000r/min 转速离心 30min, 收集上清液 ; 2) 将步骤 1) 得到的上清液经过微孔滤膜过滤两次, 使用超滤管进行浓缩去盐 ; 3) 吸取步骤 2) 制备的样品提取液 100μL 加到 1.5mL 离心管中, 使用美国 Bio-Rad 公 司生产的 clean up kit 试剂盒, 按照产品说明书进行样品处理, 最终获得样品沉淀 ; 4) 向步骤 3) 中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液, 室温下充分溶解, 离心取上清 液, 上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉分泌的胞外蛋白双向电泳样品。
    2: 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 1) 中绍兴黄酒熟麦曲用量 10g/20mL。
    3: 根据权利要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 1) 中在 4℃条件下浸提麦曲 12h。 4. 根 据 权 力 要 求 1 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于 所 述 步 骤 2) 中 微 孔 滤 膜 的 直 径 为 0.45μm.。 5. 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 2) 中超滤管截留分子量为 10KDa, 以 7000r/min 转速离心 60min 来浓缩样品提取液。 6. 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 4) 中制得蛋白沉淀与样品裂解液 的质量体积比为 150μg/200μL-250μg/200μL。 7. 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于 : 所述蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积 比为优选为 200μg/200μL。 8. 根据权力要求 1-5 任一所述的方法, 其特征在于所述样品裂解液含有 8mol/L 尿素、 0.02g/mLCHAPS、 体积百分含量为 0.5%的 IPG 缓冲液、 0.002g/mL 溴酚蓝、 50mmol/L DTT。
    4: 2 的乙酸 - 乙 酸钠缓冲溶液, 同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片, 在 4℃条件下浸提 4-12h 后使用 4 层纱 布过滤, 所得滤液利用高速冷冻离心机以 12000r/min 转速离心 30min, 收集上清液 ; 2) 将步骤 1) 得到的上清液经过微孔滤膜过滤两次, 使用超滤管进行浓缩去盐 ; 3) 吸取步骤 2) 制备的样品提取液 100μL 加到 1.5mL 离心管中, 使用美国 Bio-Rad 公 司生产的 clean up kit 试剂盒, 按照产品说明书进行样品处理, 最终获得样品沉淀 ; 4) 向步骤 3) 中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液, 室温下充分溶解, 离心取上清 液, 上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉分泌的胞外蛋白双向电泳样品。 2. 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 1) 中绍兴黄酒熟麦曲用量 10g/20mL。 3. 根据权利要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 1) 中在 4℃条件下浸提麦曲 12h。 4. 根 据 权 力 要 求 1 所 述 的 方 法, 其 特 征 在 于 所 述 步 骤 2) 中 微 孔 滤 膜 的 直 径 为 0.45μm.。
    5: 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 2) 中超滤管截留分子量为 10KDa, 以 7000r/min 转速离心 60min 来浓缩样品提取液。
    6: 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于所述步骤 4) 中制得蛋白沉淀与样品裂解液 的质量体积比为 150μg/200μL-250μg/200μL。
    7: 根据权力要求 1 所述的方法, 其特征在于 : 所述蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积 比为优选为 200μg/200μL。
    8: 根据权力要求 1-5 任一所述的方法, 其特征在于所述样品裂解液含有 8mol/L 尿素、 0.02g/mLCHAPS、 体积百分含量为 0.5%的 IPG 缓冲液、 0.002g/mL 溴酚蓝、 50mmol/L DTT。

    说明书


    一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳 样品的方法

        技术领域 本发明涉及一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白的方法, 特别涉及一 种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品方法。
         背景技术 黄酒是世界三大酿造酒之一, “以麦制曲, 用曲酿酒” 是中国黄酒的特色, 也是我国 黄酒酿造工艺中一项传统的操作工艺。目前黄酒生产用曲主要是生麦曲和熟麦曲。生麦曲 采用的是传统制曲工艺, 利用生小麦, 以自然培养为主, 网罗自然界中的微生物在小麦表面 生长繁殖并代谢产生各种代谢产物, 形成其独特的风格。 在黄酒酿造应用中, 所酿的酒香气 较浓, 口味醇厚, 但存在进入主酵时间迟, 发酵缓慢, 残糖高, 压榨困难, 原料利用率低等缺 点。 熟麦曲是对生麦曲生产工艺的继承和发展, 其生产工艺的不同之处是将小麦加热蒸熟, 杀死小麦中的微生物, 然后接种米曲霉进行纯种培养。 在实际生产应用中, 能够加快黄酒发 酵, 提高原料利用率, 但存在口感较淡, 杂味较重, 与传统的黄酒特有风味有一定差别。 目前 造成这些优缺点的原因至今尚未阐明。
         有研究表明, 生麦曲与熟麦曲由于制曲工艺的不同导致微生物来源的胞外分泌蛋 白种类存在很大的差异。目前国内针对黄酒麦曲微生物胞外分泌蛋白研究较少, 且主要是 利用色谱技术对麦曲中单一酶类进行纯化并开展酶学性质的研究, 而通过类似方法无法全 面获得麦曲中微生物胞外蛋白的组成信息。宏蛋白质组学是最近几年被提出的新概念, 其 定义是指对某一特定中环境中微生物群落的所有蛋白质进行大规模的分析和鉴定。 宏蛋白 质组学的研究策略与经典的蛋白质组学研究策略相似, 主要包括环境总蛋白的提取制备、 蛋白质分离以及质谱鉴定和数据库搜索 3 个步骤。应用宏蛋白质组学理论, 利用双向电泳 技术对从绍兴黄酒熟麦曲中浸提出的所有可溶性蛋白 ( 即米曲霉分泌的胞外蛋白 ) 进行高 分辨率分离, 将为后续利用质谱分析手段大规模鉴定麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白, 并进一 步在酶学水平弄清生麦曲与熟麦曲差异性奠定基础。
         选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一, 制备方法选择不当, 会造成大量盐离子和其他干扰物质残留, 严重影响等电聚焦, 从而影响双向电泳的结果。 熟 麦曲中米曲霉胞外的分泌蛋白必须尽可能从固态麦曲中利用缓冲体系全部浸提出来, 同时 还要除去多糖、 脂类、 核酸等干扰双向电泳的杂质, 并需尽量避免目标蛋白样品的降解。迄 今为止, 还没有制备熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的有效方法和技术, 从而 导致利用蛋白组学技术进行黄酒熟麦曲微生物胞外酶的相关研究一直停滞不前。
         发明内容 本发明所要解决的技术问题是提供一种制备较高质量的绍兴黄酒熟麦曲中米曲 霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法。
         为解决上述技术问题, 本发明采用的技术方案包括以下步骤 :
         1) 称取一定质量的绍兴黄酒熟麦曲, 加入适当体积浓度为 0.1mol/L, pH4.2 的乙 酸 - 乙酸钠缓冲溶液, 同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片, 在 4℃条件下浸提 4-12h ; 然后使 用 4 层纱布过滤, 所得滤液利用高速冷冻离心机以 12000r/min 转速离心 30min, 收集上清 液;
         2) 将步骤 1) 中得到的上清液经过微孔滤膜过滤两次, 使用超滤管进行浓缩去盐。
         3) 吸取步骤 2) 中制得的样品提取液 100μL 加到 1.5mL 离心管中, 使用 clean up kit 试剂盒按照产品说明书进行样品处理, 最终获得样品沉淀。
         4) 向步骤 3) 中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液 (8mol/L 尿素、 0.02g/mL 的 CHAPS、 体积百分含量为 0.5%的 IPG 缓冲液、 0.002g/mL 的溴酚蓝, 50mmol/L DTT), 室温 下充分溶解, 离心取上清液, 上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳 样品 ;
         所述步骤 1) 中绍兴黄酒熟麦曲用量 5-15g/20mL, 优选为 10g/20mL。
         所述步骤 1) 中在 4℃条件下浸提麦曲 12h。
         所述步骤 2) 中微孔滤膜的直径为 0.45μm。
         所述步骤 2) 中超滤管的截留分子量为 10KDa, 以 7000r/min 转速离心 60min 来浓 缩样品提取液。 所述步骤 3) 中 clean up kit 试剂盒处理样品程序如下 : 加入 300μL 沉淀试剂 I 于离心管中, 混合振荡, 冰上静置 15min ; 加入 300μL 沉淀试剂 II 于离心管中, 混合振荡 ; 以 12500r/min 转速离心 5min 来沉淀蛋白质, 离心结束后, 倾倒上清液 ; 加入 40μL 洗液 I 于离心管底, 混合振荡 ; 以 12500r/min 转速离心 5min 来沉淀蛋白质, 离心结束后, 倾倒上 清液 ; 加入 25μL 超纯水于离心管底, 混合振荡 10s ; 加入 1mL 的洗液 II 和 5μL 的洗液 II 添加剂于离心管中, 振荡 1min ; 将离心管在 -20℃下放置 30min, 放置过程中每 10min 振荡 30s ; 冷冻结束后, 以 13000r/min 转速离心 5min, 倾倒上清液, 蛋白沉淀在室温条件下, 空气 干燥 3min。
         所 述 步 骤 4) 中 制 得 蛋 白 沉 淀 与 样 品 裂 解 液 的 质 量 体 积 比 为 150μg/200μL-250μg/200μL, 优选为 200μg/200μL。
         发明人通过长时间的科学研究, 发现具有较低离子强度的弱酸性缓冲液提取绍兴 黄酒熟麦曲中米曲霉的胞外分泌蛋白, 能最大限度地提取出含有目标蛋白的样品。采用 clean up kit 试剂盒法来沉淀蛋白质, 可以有效地去除盐离子、 多糖、 脂类、 核酸等干扰电 泳效果的物质。 使用的样品裂解液中, 尿素作为变性剂能破坏蛋白质的高级结构, 打断非共 价连接。CHAPS 是一种兼性去污剂, 能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用, 增加蛋白质的 溶解性。 加入二硫苏糖醇是为了打断二硫键, 并使所有蛋白质处于还原状态。 IPG 缓冲液能 通过电荷与电荷之间的反应减少蛋白质结合, 从而增加蛋白质的可溶性。
         本发明制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法快速可 靠、 简单易行, 可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱, 便于后续的生物质谱分析鉴 定蛋白, 具有较大的实际应用价值。
         附图说明
         图 1 为绍兴黄酒熟麦曲米曲霉分泌胞外蛋白的双向电泳图谱具体实施方式
         在本发明中所使用的术语, 除非有另外说明, 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。在以下的实施例中, 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方 法
         实施例 1
         1、 样品制备
         1) 称取 10g 浙江绍兴某黄酒厂生产的的熟麦曲, 加入 20mL 浓度为 0.1mol/L, pH4.2 的乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液, 同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片, 在 4 ℃条件下浸 提 12h ; 然后使用 4 层纱布过滤, 所得滤液利用高速冷冻离心机以 12000r/min 转速离心 30min, 收集上清液, 此上清液为粗酶提取液。
         2) 将步骤 1) 中得到的上清液经过 0.45μm 微孔滤膜过滤两次, 使用截留分子量为 10KDa 超滤管以 7000r/min 转速离心 60min, 进行浓缩去盐。
         3) 吸取步骤 2) 制得样品提取液 100μL 加到 1.5mL 离心管中, 使用 clean up kit 试剂盒按照产品说明书进行样品处理, 最终获得样品沉淀。
         4) 向步骤 3) 中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液 (8mol/L 尿素、 0.02g/mL 的 CHAPS、 体积百分含量为 0.5%的 IPG 缓冲液、 0.002g/mL 的溴酚蓝, 50mmol/L DTT), 室温 下充分溶解, 然后 12000r/min 离心 10min 取上清液, 上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉 胞外分泌蛋白双向电泳样品。
         2、 电泳检测
         1) 水化上样 : 吸取 125μL 含有蛋白样品水化液, 加入到 IPG 胶条再泡涨盘中, 将 pH3-10NL, 7cm 的 IPG 胶条胶面向下放入盘中, 除去胶面与样品液之间的气泡, 加入 2mL 矿物 油覆盖胶条, 水化 12h。
         2) 等电聚焦 : 水化结束后将胶条转移至 Ettan IPGhor 胶条槽中, 进行等电聚 焦。 等 电 聚 焦 程 序 设 置 为 : Step, 50V×0.5h ; Gradient, 250V×1h ; Gradient, 500V×1h ; Gradient, 1000V×0.5h ; Gradient, 5000V×2h ; Step, 5000V, 10000Vh ; Step, 500V×3h。
         3) 胶条平衡 : 将聚焦好后的 IPG 胶条进行平衡。 采用两步平衡法, 每次平衡 15min, 平衡缓冲液配制如下 :
         胶条平衡缓冲液母液 : 6mol/L 尿素, 质量体积比 2%十二烷基磺酸钠 SDS, 50mmol/ L pH8.8 的 Tris-Hcl, 体积比 30%甘油, 体积比 0.002%溴酚蓝, 溶剂为水。
         胶条平衡缓冲液 I : 每 10mL 胶条平衡缓冲液母液加入 100mg DTT。
         胶条平衡缓冲液 II : 每 10mL 胶条平衡缓冲液母液加入 250mg IAA。
         4)SDS-PAGE 电泳 : 分离胶浓度为 12.5% (10cm×8cm×1mm), 将平衡结束后的 IPG 胶条转移至已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端, 用质量体积比 0.5%低熔点琼脂糖封住顶 部, 以恒流方式进行电泳 : 先 10mA 电泳 10min, 然后电流调至 20mA。当溴酚蓝指示剂迁移至 凝胶底部时, 关闭电源, 结束电泳。
         5) 凝胶染色、 脱色 : 剥离凝胶, 置于固定液 (50%乙醇, 10%乙酸 ) 固定 1h 后, 换到 考马斯亮蓝染色液 (0.025%考马斯亮蓝 R-250, 25%乙醇, 10%乙酸 ) 中染色 4h, 换脱色液 (10%甲醇, 10%乙酸 ) 中脱色, 直至背景为无色透明, 蛋白点清晰为止。6) 使用 GE 公司的 ImagescannerIII 扫描仪对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、 拍照。 双向电泳结果如图 1 所示, 结果表明该绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白样 品的制备和分离效果较好, 最终获得了分辨率较高, 重复性较好的双向电泳图谱 ( 图 1)。
         实施例 2
         1、 样品制备
         1) 称取 5g 浙江绍兴某黄酒厂生产的的熟麦曲, 加入 20mL 浓度为 0.1mol/L, pH42 的乙酸 - 乙酸钠缓冲溶液, 同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片, 在 4℃条件下浸提 4h ; 然后 使用 4 层纱布过滤, 所得滤液利用高速冷冻离心机以 12000r/min 转速离心 30min, 收集上清 液, 此上清液为粗酶提取液。
         2) 将步骤 1) 中得到的上清液经过 0.45μm 微孔滤膜过滤两次, 使用截留分子量为 10KDa 超滤管以 7000r/min 转速离心 60min, 进行浓缩去盐。
         3) 吸取步骤 2) 中制得样品提取液 100μL 加到 1.5mL 离心管中, 使用 clean up kit 试剂盒按照产品说明书进行样品处理, 最终获得样品沉淀。
         4) 按照 150μg/200μL 比例向步骤 3) 中制得的蛋白沉淀加入样品裂解液 (8mol/ L 尿素、 0.02g/mL 的 CHAPS、 体积百分含量为 0.5 %的 IPG 缓冲液、 0.002g/mL 的溴酚蓝, 50mmol/L DTT), 室温下充分溶解, 然后 12000r/min 离心 10min 取上清液, 上清液即为绍兴 黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品。
         2、 电泳检测
         1) 水化上样 : 吸取 125μL 含有蛋白样品水化液, 加入到 IPG 胶条再泡涨盘中, 将 pH3-10NL, 7cm 的 IPG 胶条胶面向下放入盘中, 除去胶面与样品液之间的气泡, 加入 2mL 矿物 油覆盖胶条, 水化 12h。
         2) 等电聚焦 : 水化结束后将胶条转移至 Ettan IPGhor 胶条槽中, 进行等电聚 焦。 等 电 聚 焦 程 序 设 置 为 : Step, 50V×0.5h ; Gradient, 250V×1h ; Gradient, 500V×1h ; Gradient, 1000V×0.5h ; Gradient, 5000V×2h ; Step, 5000V, 10000Vh ; Step, 500V×3h。
         3) 胶条平衡 : 将聚焦好后的 IPG 胶条进行平衡。 采用两步平衡法, 每次平衡 15min, 平衡缓冲液配制如下 :
         胶条平衡缓冲液母液 : 6mol/L 尿素, 质量体积比 2%十二烷基磺酸钠 SDS, 50mmol/ L pH8.8 的 Tris-Hcl, 体积比 30%甘油, 体积比 0.002%溴酚蓝, 溶剂为水。
         胶条平衡缓冲液 I : 每 10mL 胶条平衡缓冲液母液加入 100mg DTT。
         胶条平衡缓冲液 II : 每 10mL 胶条平衡缓冲液母液加入 250mg IAA。
         4)SDS-PAGE 电泳 : 分离胶浓度为 12.5% (10cm×8cm×1mm), 将平衡结束后的 IPG 胶条转移至已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端, 用质量体积比 0.5%的低熔点琼脂糖封住 顶部, 以恒流方式进行电泳 : 先 10mA 电泳 10min, 然后电流调至 20mA。当溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶底部时, 关闭电源, 结束电泳。
         5) 凝胶染色、 脱色 : 剥离凝胶, 置于固定液 (50%乙醇, 10%乙酸 ) 固定 1h 后, 换到 考马斯亮蓝染色液 (0.025%考马斯亮蓝 R-250, 25%乙醇, 10%乙酸 ) 中染色 4h, 换脱色液 (10%甲醇, 10%乙酸 ) 中脱色, 直至背景为无色透明, 蛋白点清晰为止。
         6) 使用 GE 公司的 ImagescannerIII 扫描仪对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、 拍
         照。 结果表明该绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白样品的制备和分离效果较好, 双向电泳图谱与图 1 高度相似。
         虽然本发明已以较佳实例公开如上, 但其并非用以限定本发明, 任何熟悉此技术 的人, 在不脱离本发明的精神和范围内, 都可以做各种改动与修饰, 因此本发明的?;し段?应该以权力要求书所界定的为准。
        

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