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    重庆时时彩开奖号码盛宏彩票: 一种用CCLSUB4/SUB诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 CCLSUB4 SUB 诱导 鲤鱼 损伤 模型 筛选 鱼类 药物 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201110260881.7

    申请日:

    2011.09.05

    公开号:

    CN102360017A

    公开日:

    2012.02.22

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A61K 49/00申请公布日:20120222|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/96申请日:20110905|||公开
    IPC分类号: G01N33/96 主分类号: G01N33/96
    申请人: 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
    发明人: 殷国俊; 曹丽萍; 贾睿
    地址: 214081 江苏省无锡市滨湖区山水东路9号中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
    优先权:
    专利代理机构: 无锡互维知识产权代理有限公司 32236 代理人: 岳强;陈军
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201110260881.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.01.21|||2012.04.04|||2012.02.22

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法,该方法将受试药物添加到鲤鱼饲料中,口服给药1-2个月后,用优选的浓度为25-30%的CCl4植物油溶液,按每10g鱼体重注射0.05mL的剂量,腹腔注射,48-72小时后,用血清GPT、GOT和LDH活性的变化来评价不同受试药物的保肝活性。本发明以生产上肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为模型生物,针对性强;口服给药,方便实用;通过血液肝功能指标变化评价受试药物的保肝活性,不必处死试验鱼,可操作性强。实验结果表明,本发明提供的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法,结果准确,可重复性强,成本低,应用范围广,可成批量进行筛选,效率高。

    权利要求书

    1: 一种用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特征在于, 包括 : (1) 取具有相同遗传背景的鲤鱼, 随机分为正常对照组、 CCl4 模型对照组、 受试药物组, 每组鱼的数量相同, 饲养在循环水养殖系统中, 正常对照组和 CCl4 模型对照组投喂鲤鱼颗 粒饲料, 受试药物组投喂添加了受试药物的鲤鱼颗粒饲料, 日投喂量为鱼体重的 3%, 连续 投喂 1-2 月 ; (2) 用药投喂 1-2 月后, 按照每 10g 鱼体重注射 0.05mL 浓度为 25-30%的 CCl4 植物油 溶液, 对 CCl4 模型对照组、 受试药物组进行腹腔注射, 正常对照组按照同样的剂量注射植物 油, 48-72h 后, 将试验鱼麻醉, 每条鱼尾静脉采血, 离心分离血清, 检测血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平, 根据 GPT、 GOT 和 LDH 的变化评价受试药物的保肝功效, 筛选鱼类保肝药物。
    2: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (1) 所述的鲤鱼大小相近、 饲养环境相同。
    3: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (1) 所述的连续投喂 1-2 月可根据药物功效的不同延长或缩短。
    4: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (1) 所述的受试药物用少量植物油均匀搅拌在颗粒饲料的外表, 对照组投喂 的颗粒饲料用相同剂量的植物油搅拌在其表面, 风干后保存于 4℃。
    5: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (2) 用 CCl4 造模的最佳浓度为 30%的植物油溶液。
    6: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (2) 所述的最佳造模时间为 72 小时。
    7: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 步骤 (2) 所述的试验鱼采血前用 MS-222 麻醉。
    8: 根据权利要求 1 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其特 征在于, 在步骤 (1) 中, 受试药物包括多种, 每种受试药物设 2-3 个剂量梯度, 每种受试药物 的每个剂量对应一个受试药物组, 对每一个受试药物组投喂添加了对应剂量的受试药物的 鲤鱼颗粒饲料。
    9: 根据权利要求 1 至 8 任一项所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物 的方法, 其特征在于, 步骤 (1) 所述的受试药物包括中草药、 其提取物或其提取物复方。
    10: 根据权利要求 9 所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其 特征在于, 所述受试药物包括黄芪多糖和当归提取物。

    说明书


    一种用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法

        技术领域 本发明涉及一种水产药物的筛选方法, 具体涉及一种用四氯化碳 (CCl4) 诱导鲤鱼 肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。
         背景技术 近年来, 由于环境污染, 高蛋白、 高脂肪或霉变饲料的使用、 抗生素和杀虫剂的滥 用等因素所造成的鱼类肝胆综合症在全国许多地区频繁发生, 造成了鲤、 鲫、 草鱼、 团头鲂 和青鱼等多种鱼类的大面积死亡, 死亡率高达 60-90 %, 给水产养殖业造成极大的经济损 失。
         鱼类肝胆综合症的病因多样, 但其共性都是造成鱼类肝组织损伤, 进而引起代谢 紊乱并引发细菌和病毒感染而造成鱼类的死亡。各种抗生素、 杀虫剂和抗病毒药物都不能 有效地控制鱼类肝胆综合症, 该病目前还没有有效的治疗方法。
         哺乳动物抗肝损伤药物的筛选通常选用小鼠 ( 或大鼠 ) 急性肝损伤模型, 其中 CCl4 诱导的小鼠急性肝损伤模型是最经典的实验性肝损伤模型, 被广泛应用于保肝药物的 研究和开发。 鱼类是变温动物, 药物在鱼体内与其在哺乳动物体内的代谢有所不同, 因此用 小鼠急性肝损伤模筛选出的保肝药物对鱼类未必适用。
         中国专利 201010170675.2 公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的方 法, 该专利虽然用水产动物斑马鱼作为模型生物, 但是筛选出的抗肝损伤药物对水产养殖 中鱼类肝病的预防并不适用。 首先, 该发明先用 CCl4 浸泡斑马鱼诱导肝损伤, 然后将受试药 物加入水中浸泡肝损伤的斑马鱼 3 天, 因此该发明实际上是筛选肝损伤治疗药物而非预防 药物, 而水产动物病害的防治是以预防为主 ; 其次, 该发明给药的方式是药物浸泡 3 天, 在 生产上如果也通过浸泡的方式给药且全池使用, 势必需要很大的药量, 如果将池塘中的鱼 集中用药浸泡长达 3 天, 虽然可以降低用药量, 但操作难度极大, 极易引起鱼类缺氧死亡, 实用性不强 ; 另外, 由于斑马鱼小, 长度只有 3-4 厘米, 体重不足 1 克, 抽血难度极大, 不能通 过测量血清中谷丙转氨酶 (GPT) 和谷草转氨酶 (GOT) 的变化来评价受试药物的抗肝损伤活 性, 只能检测肝匀浆中的 GPT 和 GOT, 这样就必须将斑马鱼处死, 取出其很小的肝脏, 制成肝 匀浆, 操作难度大。
         发明内容
         本发明所要解决的技术问题是针对水产养殖中日趋严重的以肝损伤为主要特征 的鱼类肝胆综合症, 克服现有技术的不足, 提供一种以肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为 模型生物筛选预防鱼类肝损伤药物的方法。
         为了实现以上目的, 本发明采取的技术方案为 :
         一种用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 具体包括以下步骤 :
         (1) 取具有相同遗传背景的鲤鱼, 随机分为正常对照组、 CCl4 模型对照组、 受试药 物组, 每组鱼的数量相同, 饲养在循环水养殖系统中, 正常对照组和 CCl4 模型对照组投喂鲤鱼颗粒饲料, 受试药物组投喂添加了受试药物的鲤鱼颗粒饲料, 日投喂量为鱼体重的 3%, 连续投喂 1-2 月。
         (2) 用药投喂 1-2 月后, 按照每 10g 鱼体重注射 0.05mL 浓度为 25-30% (v/v) 的 CCl4 植物油溶液, 对 CCl4 模型对照组、 受试药物组进行腹腔注射, 正常对照组按照同样的剂 量注射植物油, 48-72h 后, 将试验鱼麻醉, 每条鱼尾静脉采血, 离心分离血清, 检测血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平, 根据 GPT、 GOT 和 LDH 的变化评价受试药物的保肝功效, 筛选鱼类保肝 药物。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (2) 用 CCl4 造模时, 其浓度为 25-30%的植物油溶液。因为 CCl4 的浓度如果 太高, 会对试验鱼造成严重的毒性, 导致试验鱼的死亡, 从而使造模失败 ; 如果 CCl4 的浓度 如果太低, 不足以造成对试验鱼的肝损伤, 也不能得到符合要求的肝损伤模型, 本发明通过 对不同浓度的 CCl4 浓度进行筛选, 以试验鱼肝功能 ( 血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平 ) 为指 标, 得出最佳造模所需的 CCl4 浓度为 30%的植物油溶液。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (2) 所述的造模时间为 48-72 小时, 因为如果造模时间短, 试验鱼血液中的肝 功能指标没有发生变化, 不符合造模要求, 但是如果造模时间太长, 试验鱼会出现耐受, 血 液中的肝功能指标会恢复, 也不符合造模要求, 本发明通过对不同的造模时间进行筛选, 确 定 CCl4 造模的最佳时间为 72 小时。 作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (2) 所述的注射计量为每 10g 鱼体重注射 0.05mL 30%的 CCl4 植物油溶液, 因 为如果注射剂量太大, 注射液容易溢出, 且大量的植物油在试验鱼体内也会增加试验鱼的 代谢负担, 如果注射剂量太小, 注射时的误差偏大, 也会影响造模的准确性。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (2) 所述的检测血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平而不是肝匀浆中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平。因为制备血清更方便, 而且不必处死试验鱼。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (2) 所述的尾静脉采血量为 1.5mL, 因为如果采血量太多, 会导致鱼的死亡, 如 果采血量太少, 血清量不足以检测 GPT、 GOT 和 LDH 三个指标。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (1) 中的鲤鱼大小相近、 饲养环境相同。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (1) 所述的受试药物用少量植物油均匀搅拌在颗粒饲料的外表, 对照组投喂 的颗粒饲料用相同剂量的植物油搅拌在其表面, 风干后保存于 4℃。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (1) 受试药物包括多种, 每种受试药物设 2-3 个剂量梯度, 每种受试药物的每 个剂量对应一个受试药物组, 对每一个受试药物组投喂添加了对应剂量的受试药物的鲤鱼 颗粒饲料。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (1) 所述的用 MS222(100mg/L) 麻醉后采血可有效降低应激对试验鱼血液学指
         标的影响, 并可降低试验鱼的痛苦。
         作为优选方案, 以上所述的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方 法, 其中步骤 (1) 所述的受试药物可为化学药品、 中草药或其提取物、 中草药或其提取物复 方。 受试药物用少量植物油均匀搅拌在颗粒饲料的外表 (20 克植物油 /kg 饲料 ), 通过饲喂 的方式给药, 操作方便, 实用性强。
         本发明提供的 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法和现有技术相 比具有以下优点 :
         本发明提供的 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的制备方法, 以生产上肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为模型生物, 针对性强 ; 试验鱼个体大, 不仅造模 成功率高, 而且抽血容易, 可以利用血清中肝功能指标的变化作为肝损伤和药物保肝功效 的评价指标, 不必制备肝匀浆, 因而不必处死试验鱼, 操作方便简单 ; 通过饲喂口服给药, 克 服了浸泡给药的弊端, 实用性强, 可操作性强 ; 通过先给药后损伤的方法筛选鱼类预防肝损 伤药物, 符合水产养殖病害防治以防为主的方针 ; 可成批量进行筛选, 效率高。 具体实施方式
         根据下述实施例, 可以更好地理解本发明。然而, 本领域的技术人员容易理解, 实 施例所描述的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于本发明, 而不应当也不会限制权利要求 书中所详细描述的本发明。
         实施例 1 急性肝损伤造模筛选实验
         1、 诱导鲤鱼急性肝损伤模型所用 CCl4 浓度的选择
         取 50 条体重 150 克左右的鲤鱼, 随机分为对照组和不同浓度 CCl4 组 (12.5 %、 25%、 30%和 50% ), 共 5 组, 每组 10 条, 饲养在循环水养殖系统 5 个水族箱中, 每个水族箱 的水量为 150 升。饲养 2 周后, 用浓度为 0、 12.5%、 25%、 30%和 50% (v/v) 的 CCl4 植物油 溶液分别腹腔注射对照组和不同浓度 CCl4 组, 剂量为 0.05mL/10g 鱼体重。 注射 72 小时后, 各组鱼用 3- 氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐 MS222(100mg/L) 麻醉, 每条鱼尾静脉采血 1.5mL, 离心分离血清, 用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒检测血清中的 GPT、 GOT 和乳酸 脱氢酶 (LDH) 水平。具体结果如表 1 所示。 表 1 不同浓度 CCl4 对鲤鱼血清 GPT、 GOT 和 LDH 影响 ( 平均值 ±S.D., 样本数 n = 10 或 7)
         * ** 与正常对照组比较, t- 检验, P < 0.05, P < 0.01。由表 1 实验结果表明, 当 CCl4 的浓度为 12.5%时, 试验鱼血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 与正常对照组没有显著差异 ; 当 CCl4 的浓度为 50%时, 有 30%的鱼注射后死亡 ; 当 CCl4 的 浓度为 25 ~ 30%时, 试验鱼血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 与正常对照组有显著差异, 且没有出 现死亡现象。作为最佳选择, 本发明在用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型时, 选用 30%的 CCl4 植 物油溶液。
         2、 用 CCl4 诱导鲤鱼急性肝损伤模型造模时间的选择
         取 120 条体重 150 克左右的鲤鱼, 饲养在循环水养殖系统 12 个水族箱中, 每个水 族箱水量为 150 升, 饲养 10 条。随机分为对照组 (6 个水族箱 ) 和浓度为 30%的 CCl4 组 (6 个水族箱 )。饲养 2 周后, 用植物油和浓度为 30%的 CCl4 植物油溶液分别腹腔注射对照 组和 CCl4 组, 剂量为 0.05mL/10g 鱼体重。注射 24, 48, 72, 96, 120, 144 小时后, 取对照组和 CCl4 组鱼用 MS222(100mg/L) 麻醉, 每条鱼尾静脉采血 1.5mL, 离心分离血清, 用南京建成生 物技术有限公司生产的试剂盒检测血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平。具体结果如表 2 所示。 表 2CCl4 注射鲤鱼后不同时间对血清 GPT、 GOT 和 LDH 的影响 ( 平均值 ±S.D., 样本数 n = 10)* ** 与正常对照组比较, t- 检验, P < 0.05, P < 0.01。
         由表 2 实验结果表明, 用浓度为 30%的 CCl4 植物油溶液腹腔注射 24 小时后, GPT 和 GOT 与对照组相比显著升高, LDH 虽然升高但与对照组没有显著差异, 48 小时后, GPT、 GOT 和 LDH 值继续升高, 72 小时后达到最高, 与对照组均有显著差异, 96 小时以后逐渐恢复, 除 GPT 外, GOT 和 LDH 与对照组已无显著差异, 120 小时后与对照组没有显著差异。由此可见, 用浓度为 30%的 CCl4 植物油溶液腹腔注射造模的适宜时间为 48-72 小时, 最佳时间为 72 小时。
         本发明通过对 CCl4 的浓度和造模时间进行筛选确定最佳造模方法, 可以为抗肝损 伤药物的筛选提供保证。
         实施例 2 用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物
         实验方法 : 取 60 条体重 150 克左右的鲤鱼, 饲养在循环水养殖系统 6 个水族箱中, 每个水族箱水量为 150 升, 饲养 10 条。随机分为正常对照组、 CCl4 模型对照组和受试药物 组, 所述受试药物组包括黄芪多糖高剂量组、 黄芪多糖低剂量组、 当归提取物高剂量组和当 归提取物低剂量组。正常对照组和 CCl4 模型对照组投喂鲤鱼颗粒饲料, 受试药物组分别投 喂添加了一定剂量黄芪多糖或当归提取物的鲤鱼颗粒饲料, 日投喂量为鱼体重的 3%, 连续 投喂 6 周后, 用植物油腹腔注射正常对照组, 用浓度为 30%的 CCl4 植物油溶液腹腔注射其 余各组, 剂量为 0.05mL/10g 鱼体重。注射 72 小时后, 各组鱼用 MS222(100mg/L) 麻醉, 每条 鱼尾静脉采血 1.5mL, 离心分离血清, 用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒检测血清 中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平。具体结果如表 3 所示。 表 3 不同药物对 CCl4 诱导的鲤鱼肝损伤的?;ぷ饔?( 平均值 ±S.D., n = 10)* ** 与模型对照组比较, t- 检验, P < 0.05, P < 0.01。
         由以上表 3 的实验结果表明, 与正常对照组相比较, CCl4 模型对照组鲤鱼血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平有极显著的升高 (P < 0.01), 表明鲤鱼的肝功能受到了明显损伤, 说明 用 CCl4 诱导造成的鲤鱼肝损伤模型是成功的。而在 CCl4 造模前投喂不同剂量的黄芪多糖 和当归提取物 6 周后, 则能显著降低鲤鱼血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平 (P < 0.01), 表明 黄芪多糖和当归提取物都具有抗肝损伤的功效, 同时也表明本发明所提供的用 CCl4 诱导鲤 鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法是切实可行的。
         在其他实施例中, 在用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物时可以对一 些数据进行调整, 比如每条鲤鱼的体重可以改为其他重量, 每组包括鲤鱼的数目可以改变, CCl4 造模时采用浓度可以为 25-30%的植物油溶液, CCl4 造模时的造模时间可以为 48-72 小时, 鲤鱼颗粒饲料连续投喂时间也可以根据药物功效的不同延长或缩短。 此外, 除了黄芪 多糖和当归提取物外, 受试药物还可以为其他中草药、 其提取物或其提取物复方。
         综上所述, 本发明提出的用 CCl4 诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法, 其包括 : (1) 取具有相同遗传背景的鲤鱼, 随机分为正常对照组、 CCl4 模型对照组、 受试药物 组, 每组鱼的数量相同, 饲养在循环水养殖系统中, 正常对照组和 CCl4 模型对照组投喂鲤鱼 颗粒饲料, 受试药物组投喂添加了受试药物的鲤鱼颗粒饲料, 日投喂量为鱼体重的 3%, 连 续投喂 1-2 月 ; (2) 用药投喂 1-2 月后, 按照每 10g 鱼体重注射 0.05mL 浓度为 25-30 %的
         CCl4 植物油溶液, 对 CCl4 模型对照组、 受试药物组进行腹腔注射, 正常对照组按照同样的剂 量注射植物油, 48-72h 后, 将试验鱼麻醉, 每条鱼尾静脉采血, 离心分离血清, 检测血清中的 GPT、 GOT 和 LDH 水平, 根据 GPT、 GOT 和 LDH 的变化评价受试药物的保肝功效, 筛选鱼类保肝 药物。
         优选的, 在步骤 (1) 中, 受试药物包括多种, 每种受试药物设 2-3 个剂量梯度, 每种 受试药物的每个剂量对应一个受试药物组, 对每一个受试药物组投喂添加了对应剂量的受 试药物的鲤鱼颗粒饲料。
         优选的, 步骤 (1) 所述的受试药物用少量植物油均匀搅拌在颗粒饲料的外表 (20 克植物油 /kg 饲料 ), 对照组投喂的颗粒饲料用相同剂量的植物油搅拌在其表面, 风干后保 存于 4℃。
         以上所述是本发明的优选实施方式, 应当指出, 对于本技术领域的普通技术人员 来说, 在不脱离本发明原理的前提下, 还可以做出若干改进和润饰, 这些改进和润饰也应该 视为本发明的?;し段?。8

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