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    重庆时时彩后三大底怎么做: 一种银杏叶提取物及该提取物高纯度有效成分的分离新生产工艺.pdf

    关 键 词:
    一种 银杏叶 提取物 纯度 有效成分 分离 生产工艺
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    摘要
    申请专利号:

    CN200610072435.2

    申请日:

    2006.04.13

    公开号:

    CN1847237A

    公开日:

    2006.10.18

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07D 311/30申请日:20060413授权公告日:20090318终止日期:20150413|||授权|||实质审查的生效|||公开
    IPC分类号: C07D311/30(2006.01); C07D493/22(2006.01) 主分类号: C07D311/30
    申请人: 厦门国宇知识产权研究有限公司;
    发明人: 郭东宇
    地址: 361012福建省厦门市东渡路226号五矿大厦1718
    优先权:
    专利代理机构: 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 代理人: 孙皓晨
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN200610072435.2

    授权公告号:

    |||100469774||||||

    法律状态公告日:

    2016.06.01|||2009.03.18|||2006.12.13|||2006.10.18

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种新的提取并分离高纯度银杏内酯和银杏黄酮的方法。本发明采用大孔吸附树脂色谱分离技术,将银杏药材用水提取,水提液直接上大孔吸附树脂柱,再依次用蒸馏水,5%~25%乙醇,0.01%~10%碱水,蒸馏水和30%~95%乙醇洗脱大孔吸附树脂柱,分别收集碱水洗脱液和30%~95%乙醇洗脱液,再分别浓缩、纯化可得到高纯度的银杏内酯或银杏黄酮。本发明方法在大孔吸附树脂柱上经简单的一步操作使银杏黄酮和银杏萜内酯得到较好分离,只需简单纯化步骤就得到高纯度的终产品,避免了传统提取方法对药材资源所造成的极大浪费。本发明方法高效,简捷,生产成本低,对人体和环境损害小,所制备的产品具有质量好、收率高等优点。

    权利要求书

    权利要求书
    1、  一种提取并分离银杏内酯和银杏黄酮的方法,包括以下步骤:
    (1)、将新鲜或干燥银杏叶用水煎煮或将银杏叶粗提物用水溶解,煎煮液或水溶液过滤,所得滤液全部上大孔吸附树脂柱后,依次用蒸馏水和5%~25%乙醇洗脱杂质,接着用0.01%~10%碱水洗脱树脂柱至流出液无色,收集碱水洗脱液,调pH3~5后浓缩至干,洗涤,烘干,得银杏黄酮;
    (2)、大孔吸附树脂柱继续以水洗至流出液pH值为中性,弃去水洗液;再以30%~95%乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂柱至流出液无色,收集该乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,萃取,减压蒸除萃取溶剂,残留物用甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、戊醇、丙酮、甲乙酮或上述两种或两种以上以任意比例所组成的混合溶液溶解后加入吸附剂,搅拌吸附,过滤,滤渣弃去,滤液减压回收溶剂,残物在40~80℃环境中干燥,得银杏内酯粗品;或进一步将银杏内酯粗品采用常规方法精制为精品。

    2、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(1)中将银杏叶药材粉末加1~100倍药材量(W/V)的水,煎煮1-3次,每次煎煮5min~3h。

    3、  按照权利要求1的方法,其特征是所述的大孔吸附树脂柱为AB-8、X-5、S-8、SIP-1300、MDA、NKA-II、D-101、HPD-100、HPD-400、ADS-17或BS-55大孔吸附树脂柱。

    4、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(1)中滤液上大孔吸附树脂柱时,大孔树脂用量与原药材银杏叶用量之比(V/W)为1∶10~10∶1,控制滤液液体流速为0.5~10倍树脂柱体积/h。

    5、  按照权利要求4的方法,其特征是大孔树脂用量与原药材银杏叶用量之比(V/W)为1∶1~3∶1,控制滤液液体流速为1~3倍树脂柱体积/h。

    6、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(1)中用蒸馏水洗柱时,用3~50倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱大孔吸附树脂柱,控制洗脱液的流速为0.5~10倍树脂柱体积/h。

    7、  按照权利要求6的方法,其特征是用5~8倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,控制洗脱液的流速为1~3倍树脂柱体积/h。

    8、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(1)中用20%乙醇洗脱杂质,洗脱量为至流出液澄清透明为止;接着用0.1~1%NaOH进行洗脱,洗脱量为至流出液颜色淡或无色为止。

    9、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(2)中用蒸馏水洗脱大孔吸附树脂柱时,其洗脱量为至流出液pH值为中性为止;接着用60%乙醇洗脱大孔吸附树脂柱,洗脱量为至流出液颜色淡或无色为止;将所收集的乙醇洗脱液减压浓缩至无醇味后进行萃取时,用1~20倍重量的乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、正丁醇、戊醇或乙醚萃取2~10次;减压蒸除萃取有机溶剂后,残留物用1/10~5倍重量的低炭醇或低炭酮或相互以任意比例所组成的混合溶液溶解,向溶解液中加入1/100~1/5倍重量的活性炭,搅拌吸附15min~5h,过滤,滤渣弃去,滤液减压回收溶剂,残物在50~60℃环境中干燥,得银杏内酯粗品。

    10、  按照权利要求9的方法,其特征是将所收集的乙醇洗脱液减压浓缩至无醇味后用4倍重量的乙酸乙酯萃取5次;减压蒸除乙酸乙酯后,残留物用1~3倍重量的乙醇溶解,向溶解液中加入1/10倍重量的活性炭,搅拌吸附1~2h。

    11、  按照权利要求1的方法,其特征是步骤(2)中将银杏内酯粗品精制为精品时,包括以下步骤:
    将银杏内酯粗品溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述两种或几种溶剂以任意比例所组成的混合溶液中,加入蒸馏水,离心除去胶状水液,减压干燥;将干燥后的银杏内酯固体溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述两种或两种以上以任意比例所组成的混合溶液中,精滤,滤液在25℃以下放置过夜,析出白色结晶,过滤,干燥,得银杏内酯精品。

    12、  按照权利要求11的方法,其特征是将银杏内酯粗品溶于0.5~10倍重量的丙酮中,搅拌下慢慢加入2~20倍重量的蒸馏水,离心除去胶状水液,减压干燥;向干燥后的银杏内酯固体中加入0.5~5倍量(W/V)10%~60%甲醇中,于40~80℃溶解,采用微孔滤膜精滤,滤液在10~12℃放置过夜。

    13、  按照权利要求12的方法,其特征是将银杏内酯粗品溶于2~3倍重量的丙酮中,搅拌下慢慢加入8倍重量的蒸馏水;向干燥后的银杏内酯固体中加入等量(W/V)的30%甲醇中,于50~60℃溶解。

    说明书

    说明书一种银杏叶提取物及该提取物高纯度有效成分的分离新生产工艺
    技术领域
    本发明涉及一种从植物中提取并分离药物有效成分的方法,尤其涉及一种采用大孔吸附树脂色谱分离技术从银杏叶或银杏叶粗提物中提取和分离高纯度银杏内酯和银杏黄酮的方法,属于生物医药领域。
    背景技术
    银杏(Ginkgo biloba L.)又名公孙树,是最古老的中生代孑遗植物之一,素有裸子植物“活化石”之称,为我国特产。我国银杏资源拥有量约占世界总量的70%。银杏叶中主要有效成份为黄酮类(flavonoids)和萜内酯类化合物(terpene lactones),具有扩张冠状血管、改善脑循环、消除氧自由基、抑制血小板活化因子(PA F)等作用,临床上用于治疗冠心病、脑血栓、脑缺血、脑功能障碍、脑伤后遗症、神经系统疾病和哮喘等。
    最近十年来的研究表明,银杏内酯是PAF的高效拮抗剂,尤其是银杏内酯B对PAF的拮抗作用最强。由于PAF与心脑血管疾病的发生发展密切相关,也与哮喘、休克、炎症、胃溃疡、肾病等发生密切相关,故银杏内酯目前被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂。新近提出的一种观点是:由于银杏叶提取物中的黄酮、银杏内酯和白果内酯三大成份药理作用各不相同,为了更经济合理地使用药物,让每种有效成份都充分发挥药理作用,应区别不同病种分别给药,当治疗神经系统疾病如脊髓神经脱髓鞘症及老年痴呆症给白果内酯最好,而不必给予银杏黄酮和银杏内酯;当治疗心脑血管疾病时则主要使用银杏黄酮和银杏内酯,对于PAF引起的疾病则只需要银杏内酯就可。
    目前国内外提取、分离银杏叶及其提取物中主要有效成分银杏内酯和银杏黄酮的方法主要有大孔吸附树脂法、酶法、超临界CO2萃取法和高速逆流色谱技术提取法(High-speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)等。但上述所有的方法制备而得的产品都是银杏内酯和银杏黄酮的混合物,其中两种成分的含量相对较低,分别为约10%和30%。若要将两种成分分离,则须较多步骤,操作繁琐,有效成分种类和数量损失均较大。
    发明内容
    本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种能够快速、简捷的从银杏叶或银杏叶粗提物中提取并分离高纯度银杏内酯和银杏黄酮的方法,该银杏叶粗提物可市售购买得到也可按照常规方法(参考文献:1、Klaus-Peter Schwabe,Karlsruhe.Extract from Leaves of Ginkgo Biloba for Intravenous Injection or Infusion.U.S.P.,5512286;2、李新岗,韦玮,陈薇.富含银杏内酯的银杏叶干浸膏制备工艺.中国医药工业杂志,1998,29(1):8~9)制备得到。
    本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的:
    一种从银杏叶或银杏叶粗提物中提取并分离银杏内酯和银杏黄酮的方法,包括以下步骤:
    (1)、将新鲜或干燥银杏叶用水煎煮或将银杏叶粗提物用水溶解,将煎煮液或水溶液过滤,将所得滤液全部上大孔吸附树脂柱后,依次用蒸馏水和5%~25%乙醇,煎煮液或水溶液过滤,洗脱杂质,接着用0.01%~10%碱水洗脱树脂柱至流出液无色,收集碱水洗脱液,调pH 3~5后浓缩至干,洗涤,烘干,得银杏黄酮;
    (2)、树脂柱继续以蒸馏水洗至流出液pH为中性,弃去水洗液;再以30%~95%乙醇溶液洗脱至流出液无色,收集乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味,萃取,减压蒸除萃取溶剂,残留物用乙醇溶解,向溶解液中加入吸附剂,搅拌吸附,过滤,滤渣弃去,滤液减压回收溶剂,残物在40~80℃(更优选为50~60℃)条件下干燥,得银杏内酯粗品;或进一步将银杏内酯粗品采用常规方法精制为银杏内酯精品。
    上述制备方法中,步骤(1)中优选将银杏叶药材粉末加1~100倍药材量(W/V)的水,煎煮1~3次,每次煎煮5min~3h;滤液上大孔吸附树脂柱时,大孔树脂用量与原药材量之比(V/W)为1∶10~10∶1,更优选为1∶1~3∶1;控制滤液上柱的液体流速为0.5~10倍树脂柱体积/h,优选为控制滤液上柱的液体流速为1~3倍树脂柱体积/h;
    步骤(1)中用蒸馏水洗柱时,优选用3~50倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,更优选用5~8倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱;控制洗脱液的流速为0.5~10倍树脂柱体积/h,优选为1~3倍树脂柱体积/h;
    步骤(1)中用5%~25%乙醇洗脱杂质时,优选用20%乙醇进行洗脱,洗脱量为至流出液澄清透明为止;
    步骤(1)中用0.01%~10%碱水洗脱树脂柱时,优选用0.1~1%NaOH进行洗脱,洗脱量为至流出液颜色淡或无色为止;
    步骤(2)中,用蒸馏水洗柱时,其洗脱量优选为洗脱至流出液pH值为中性时为止;
    步骤(2)中用30%~95%乙醇溶液洗脱树脂柱时,优选用60%乙醇进行洗脱,洗脱量为至流出液颜色淡或无色为止;
    步骤(2)中将所收集的乙醇洗脱液,减压浓缩至无醇味后进行萃取时,优选用1~20倍重量的乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、正丁醇、戊醇或乙醚萃取2~10次,更优选用4倍重量的乙酸乙酯萃取5次;
    步骤(2)中减压蒸除萃取溶剂后,残留物优选用1/10~5倍重量的乙醇溶解,向溶解液中优选加入1/100~1/5倍重量的活性炭,搅拌吸附15min~5h;更优选的,减压蒸除乙酸乙酯后,残留物用1~3倍重量的乙醇溶解,向溶解液中加入1/10倍重量的活性炭,搅拌吸附1~2h;
    步骤(2)中将银杏内酯粗品精制为银杏内酯精品时,作为优选的,包括以下步骤:将银杏内酯粗品溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述两种或两种以上以任意比例所组成的混合溶液中,加入蒸馏水,离心除去胶状水液,减压干燥;将干燥后的银杏内酯固体溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述两种或两种以上以任意比例所组成的混合溶液中,精滤,滤液在低于25℃(更优选为10~12℃)条件下放置过夜,析出白色结晶,过滤,干燥,得银杏内酯精品;
    更优选的,将银杏内酯粗品溶于0.5~10倍重量的丙酮中,搅拌下慢慢加入2~20倍重量的蒸馏水;向干燥后的银杏内酯固体中加入0.5~5倍量(W/V)10%~60%甲醇,于40~80℃溶解,采用微孔滤膜精滤;最优选的,将银杏内酯粗品溶于2~3倍重量的丙酮中,搅拌下慢慢加入8倍重量的蒸馏水;向干燥后的银杏内酯固体中加入等量(W/V)的30%甲醇,于50~60℃溶解。
    本发明中所述的大孔吸附树脂柱填料型号可选自AB-8、X-5、S-8、SIP-1300、MDA、NKA-II、D-101、HPD-100、HPD-400、ADS-17、或BS-55等大孔吸附树脂柱;所述的大孔吸附树脂柱的材质为玻璃、不锈钢或耐酸、碱及有机溶剂的有机高分子;大孔吸附树脂柱的径高比为1∶1~1∶20。
    本发明方法中所用到的碱可以为任意一种强碱,弱碱或弱酸的碱金属盐等,例如可以为NaOH、KOH、NaHCO3、Na2CO3、NH4OH等。
    银杏黄酮类成分化学结构的共同特征是含有多个弱酸性的酚羟基,特别是都含有酸性最强的7位和4’位游离酚羟基。因此,此类结构的化合物都可溶于弱碱

                        (R1~R4分别被H或糖基所取代)
                        银杏黄酮类化合物结构式
    性溶液,在大孔吸附树脂上就可生成水溶性的盐类被先洗脱,实现与银杏内酯类成分的完全分离(如下所示)。银杏内酯类成分化学结构中有3个内酯环,虽然

          难溶于水                             水溶性
                   (R1~R4分别被H或糖基所取代)
    银杏黄酮类化合物在酸、碱溶液中的化学结构互变示意图在碱性环境中易开环,但只有在体系受热情况下开环反应才易发生,在常温下内酯环不易开环。本发明大孔吸附树脂的洗脱过程都是在常温下进行,在用稀碱液洗脱黄酮类成分时不会使内酯类成分化学结构发生化学变化。同时,将银杏叶水提液流经大孔吸附树脂柱时,水提液中大量鞣质等酚性成分也被大孔吸附树脂吸附,蒸馏水或低浓度醇对此类成分并无很好的洗脱作用;再以较高浓度醇洗脱有效成分时,此类物质也被大量洗脱,从而影响产品质量。因此,本发明方法采用在树脂柱上进行稀碱液洗脱操作步骤,可有效洗脱鞣质等酚性杂质,从而得到高纯度的银杏内酯。通过本发明方法制备而得地银杏内酯和银杏黄酮,二者既可以配伍使用,用于治疗心脑血管病,也可以单独使用银杏内酯治疗顽固性哮喘等PAF所致的疾患。如此不仅使原药材得到更经济合理地利用,也将有助于国内第四代银杏制剂的研发。
    现有技术从银杏叶或其提取物中提取银杏内酯和银杏黄酮时,使用乙醇或丙酮等有机溶剂作为银杏药材提取溶剂,使用有机溶剂提取银杏药材后再减压蒸除溶剂,残液再上大孔吸附树脂,银杏药材提取液上大孔吸附树脂后,先用水及低浓度乙醇洗脱除去杂质,再用较高浓度乙醇洗脱有效成分,所得产品是黄酮和萜内酯的混合物,若要将两者分离,则需极繁杂工艺,所制备的高纯度银杏总黄酮是以完全损失总萜内酯为代价,反之亦然。
    本发明方法采用廉价且环保的水作为银杏溶剂提取药材,药材中有效成分提取转移率与现有方法相当,同时又避免了有机溶剂的使用导致生产成本上升以及所造成的环境污染。提取液经过滤后直接过大孔吸附树脂柱,避免了现有技术中需要采用的将有机溶剂提取液加热、减压浓缩等烦琐步骤,所以本发明方法工艺简单,能耗低,生产成本低。另外,本发明生产工艺中由于减少了加热程序,可避免热不稳定的萜内酯类成分受到破坏。银杏药材水提液上大孔吸附树脂吸附后,本发明先用水及低浓度乙醇洗脱除去杂质,再用稀碱液洗脱得到较高纯度的弱酸性黄酮类成分,再用较高浓度乙醇洗脱得到较高纯度的中性萜内酯类成分,经简单的一步操作在大孔吸附树脂柱上就可使银杏黄酮和银杏萜内酯得到较好分离(产品纯度分别达80%和87%),再经过简单纯化步骤就可使产品含量达95%以上,且中间体产品含量较高,避免了传统提取方法对药材资源所造成的极大浪费。
    总之,本发明方法高效,简捷,生产成本低,对人体和环境损害小,由本发明方法所制备的产品具有质量好、收率高等优点。
    具体实施方式
    以下通过实施例来进一步描述本发明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的?;し段?。
    实施例1
    往12kg干银杏叶粉末中加入120L水,煮沸0.5h。过滤,滤渣中再依次加60L和36L水各煮沸0.5h,合并三次提取液。水提药液上12kg预先处理好的AB-8大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂产品),控制水提药液上柱流速为1倍树脂柱体积/h。待提取液全部上柱后,树脂柱以8倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,控制洗脱液的流速为3倍树脂柱体积/h,至流出液无色,再以20%乙醇洗脱至流出液无色。
    树脂柱继续以1%NaOH溶液洗脱至流出液无色,收集稀碱洗脱液,以6N HCl调pH至3。溶液喷雾干燥,固体以适量蒸馏水洗涤,干燥,得黄色粉末状固体。
    取上述黄色粉末状固体2mg,加无水乙醇1ml使溶解,再加盐酸液(2mol/L)1ml,置水浴中回流2小时,放冷至室温,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇0.5ml使溶解,作为供试品溶液;另取槲皮素对照品,加无水乙醇制成每1ml中含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。分别吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨蒸汽中熏约5min,供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的斑点,确定该黄色粉末状固体含黄酮类成分。
    取上述黄酮类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定黄酮醇苷含量,结果表明,该黄色粉末状固体中黄酮类化合物的含量为83.2%。
    树脂柱经稀碱洗脱后,以蒸馏水洗至流出液pH为中性,再以60%乙醇洗脱,至流出液无色,收集60%乙醇洗脱液,减压回收至无醇味,残液用3L乙酸乙酯萃取,共萃取5次,合并乙酸乙酯萃取液,用1%(V/W)Na2SO4脱水干燥后,回收乙酸乙酯,残渣60℃烘干,研细,得350g白色粉末状固体。
    取上述白色粉末状固体适量,加丙酮配制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一以4%醋酸钠的CMC-Na溶液制备的硅胶H薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30min,置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,故确定该白色粉末状固体含银杏内酯类成分。
    取上述银杏内酯类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为87.6%。
    用1000ml 95%的乙醇溶解银杏萜内酯粗品,并加入100g活性炭粉,搅拌1h,抽滤,滤液回收乙醇后,60℃烘干,得白色固体330g。将此固体溶于1000ml丙酮中,搅拌下慢慢加入3L蒸馏水,慢搅0.5h,离心除去胶状水液,滤渣于60℃烘干得210g干粉。向此干粉中加入210ml含量为30%的甲醇,在50℃水浴上使之溶化,微孔滤膜精滤,滤液转放于4℃条件下,静置8h,析出白色结晶,得银杏内酯精品140g。
    取上述银杏内酯精品适量,加丙酮配制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一以4%醋酸钠的CMC-Na溶液制备的硅胶H薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30min,置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯精品适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为97.5%。
    实施例2
    往10kg干银杏叶粉末中加入100L水,煮沸1h。过滤,滤渣中再依次加50L和30L水各煮沸1h,合并三次提取液。水提药液上10kg预先处理好的D-101大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂产品),控制水提药液流速为2倍树脂柱体积/h。待提取液全部上柱后,树脂柱以5倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,控制洗脱液的流速为1倍树脂柱体积/h,洗脱至流出液无色,再以25%乙醇洗脱至流出液无色。
    树脂柱继续以0.5%NaOH溶液洗脱至流出液无色,收集稀碱洗脱液,以6N HCl调pH至4。溶液喷雾干燥,固体以适量蒸馏水洗涤,干燥,即得黄色粉末状固体。
    取上述黄色粉末状固体适量,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述溶液6μl,点于含4%醋酸钠的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以三氯化铝乙醇溶液,热风吹干,置紫外灯(365nm)下检测。供试品色谱中显黄酮类化合物特征性的黄绿色荧光主斑点,故确定该黄色粉末状固体含黄酮类成分。
    取上述黄酮类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定黄酮醇苷含量,结果表明,该黄色粉末状固体中黄酮类化合物的含量为80.3%。
    树脂柱经稀碱洗脱后,以蒸馏水洗至流出液pH为中性,再以70%乙醇洗脱,至流出液无色,收集70%乙醇洗脱液,减压回收至无醇味,残液用2.5L甲酸乙酯萃取,共萃取3次,合并甲酸乙酯萃取液,用10%(V/W)Na2SO4脱水干燥后,回收甲酸乙酯,残渣55℃烘干,研细,得320g白色粉末状固体。
    取上述白色粉末状固体适量,加丙酮制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述供试品和对照品溶液各5μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为86.3%。
    用1000ml 95%的乙醇溶解银杏萜内酯粗品,并加入100g活性炭粉,搅拌1h,抽滤,滤液回收乙醇后,55℃烘干,得白色固体305g。将此固体溶于1000ml乙醇中,搅拌下慢慢加入3L蒸馏水,慢搅0.5h,离心除去胶状水液,滤渣于60℃烘干得195g干粉。向此干粉中加入195ml含量为30%的甲醇,在50℃水浴上使之溶化,微孔滤膜精滤,滤液转放于4℃条件下,静置8h,析出白色结晶,得银杏内酯精品135g。
    取上述银杏内酯精品适量,加丙酮制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述供试品和对照品溶液各5μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯精品适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该银杏内酯精品中银杏内酯类化合物的含量为96.3%。
    实施例3
    往1kg市售银杏叶粗提取物(浙江康恩贝制药有限公司产品,商品名称为“银杏叶粗提取物”,该银杏叶粗提取物含银杏总黄酮约24%,银杏总萜内酯约6%)中加入100L水,搅拌使溶解,过滤。水提药液上50kg预先处理好的S-8大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂产品),控制水提药液上柱流速为1倍树脂柱体积/h。待提取液全部上柱后,树脂柱以5倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,控制洗脱液的流速为0.5倍树脂柱体积/h,至流出液无色,再以18%乙醇洗脱至流出液无色。
    树脂柱继续以0.5%KOH溶液洗脱至流出液无色,收集稀碱洗脱液,以6N HCl调pH至5。溶液喷雾干燥,固体以适量蒸馏水洗涤,干燥,得黄色粉末状固体。
    取上述黄色粉末状固体2mg,加无水乙醇1ml使溶解,再加盐酸液(2mol/L)1ml,置水浴中回流2小时,放冷至室温,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇0.5ml使溶解,作为供试品溶液。另取槲皮素对照品,加无水乙醇制成每1ml中含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置氨蒸汽中熏约5min,供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的斑点,故确定该黄色粉末状固体含黄酮类成分。
    取上述黄酮类成分100mg,置于250ml烧瓶中,加入50ml的乙醇和20ml双蒸水,超声处理5min,加入8ml的浓盐酸和沸石,回流2.25小时,冷却至室温。将溶液定量转移至100ml的容量瓶中,用双蒸水稀释至刻度,混匀,过滤,作为供试品溶液。另用甲醇制备0.6mg/ml槲皮素,0.6mg/ml山奈素和0.2mg/ml异鼠李素溶液,以甲醇稀释成1∶5和1∶10的溶液作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)测定黄酮醇苷含量,结果表明,该黄色粉末状固体中黄酮类化合物的含量为90.2%。
    树脂柱经稀碱洗脱后,以蒸馏水洗至流出液pH为中性,再以90%乙醇洗脱,至流出液无色,收集90%乙醇洗脱液,减压回收至无醇味,残液用3L乙醚萃取,共萃取3次,合并乙醚萃取液,用10%(V/W)Na2SO4脱水干燥后,回收乙醚,残渣50℃烘干,研细,得650g白色粉末状固体。
    取上述白色粉末状固体适量,加丙酮配制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一以4%醋酸钠的CMC-Na溶液制备的硅胶H薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30min,置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,故确定该白色粉末状固体含银杏内酯类成分。
    取上述银杏内酯类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为92.6%。
    用2000ml 95%的乙醇溶解银杏萜内酯粗品,并加入200g活性炭粉,搅拌1h,抽滤,滤液回收乙醇后,60℃烘干,得白色固体630g。将此固体溶于2000ml丙酮中,搅拌下慢慢加入6L蒸馏水,慢搅0.5h,离心除去胶状水液,滤渣于60℃烘干得610g干粉。向此干粉中加入610ml含量为30%的乙醇,在50℃水浴上使之溶化,微孔滤膜精滤,滤液转放于10℃条件下,静置8h,析出白色结晶,得银杏内酯精品605g。
    取上述银杏内酯精品适量,加丙酮配制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一以4%醋酸钠的CMC-Na溶液制备的硅胶H薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30min,置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中,与对照品色谱在相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯精品适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为98.3%。
    实施例4
    往100kg新鲜银杏叶中加入200L水,煮沸1h。过滤,滤渣中再依次加100L和60L水各煮沸1h,合并三次提取液。水提药液上20kg预先处理好的NKA-II大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂产品),控制水提药液流速为1倍树脂柱体积/h。待提取液全部上柱后,树脂柱以15倍树脂柱体积的蒸馏水洗脱,控制洗脱液的流速为3倍树脂柱体积/h,洗脱至流出液无色,再以23%乙醇洗脱至流出液无色。
    树脂柱继续以1%KOH溶液洗脱至流出液无色,收集稀碱洗脱液,以6N HCl调pH至3。溶液喷雾干燥,固体以适量蒸馏水洗涤,干燥,即得黄色粉末状固体。
    取上述黄色粉末状固体适量,加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液,照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述溶液6μl,点于含4%醋酸钠的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以三氯化铝乙醇溶液,热风吹干,置紫外灯(365nm)下检测。供试品色谱中显黄酮类化合物特征性的黄绿色荧光主斑点,故确定该黄色粉末状固体含黄酮类成分。
    取上述黄酮类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定黄酮醇苷含量,结果表明,该黄色粉末状固体中黄酮类化合物的含量为82.3%。
    树脂柱经稀碱洗脱后,以蒸馏水洗至流出液pH为中性,再以40%乙醇洗脱,至流出液无色,收集40%乙醇洗脱液,减压回收至无醇味,残液用5.0L甲乙酮萃取,共萃取3次,合并甲乙酮萃取液,用5%(V/W)Na2SO4脱水干燥后,回收乙酸乙酯,残渣60℃烘干,研细,得603g白色粉末状固体。
    取上述白色粉末状固体适量,加丙酮制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述供试品和对照品溶液各5μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯类成分适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该白色粉末状固体中银杏内酯类化合物的含量为85.7%。
    用2000ml 95%的乙醇溶解银杏萜内酯粗品,并加入200g活性炭粉,搅拌1h,抽滤,滤液回收乙醇后,60℃烘干,得白色固体585g。将此固体溶于2000ml丙醇中,搅拌下慢慢加入6L蒸馏水,慢搅0.5h,离心除去胶状水液,滤渣于60℃烘干得574g干粉。向此干粉中加入600ml含量为30%的丙酮,在50℃水浴上使之溶化,微孔滤膜精滤,滤液转放于4℃条件下,静置8h,析出白色结晶,得银杏内酯精品565g。
    取上述银杏内酯精品适量,加丙酮制成每1ml含3.0mg样品的溶液,作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,加丙酮制成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VIB)试验,吸取上述供试品和对照品溶液各5μl,分别点于同一以含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)为展开剂,在15℃以下展开,取出,晾干,在140~160℃加热约30分钟,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
    取上述银杏内酯精品适量,照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)及中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中“含量测定”法测定银杏内酯含量,结果表明,该银杏内酯精品中银杏内酯类化合物的含量为95.6%。
    试验例1不同提取方法对银杏叶药材中银杏总黄酮、银杏总萜内酯转移率的影响试验
    一、试验方法
    精密称取银杏叶药材粉末9份,每份10g。3份采用25%乙醇提取,每份加10倍重量25%乙醇于60℃温浸1小时,共提取3次,过滤,合并滤液;3份采用60%丙酮参照上法提??;另3份采用加10倍重量水,煮沸1小时,共提3次,过滤,合并滤液。
    二、测定方法
    按照高效色相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)和中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中药材“含量测定”项测定上述3种方法提取液种银杏总黄酮和总萜内酯的含量。
    以槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量计算总黄酮的含量,以银杏内酯A、B、C及白果内酯的含量计算总萜内酯含量:

    测定结果见表1。
    表1不同提取方法对银杏叶药材中银杏总黄酮、银杏总萜内酯转移率的影响  批次  稀乙醇法(%)  稀丙酮法(%)  水提取法(%)  总黄酮  总萜内酯  总黄酮  总萜内酯  总黄酮  总萜内酯  1  89.6  85.1  87.1  89.3  86.2  87.2  2  87.3  86.4  83.7  90.1  89.1  85.3  3  88.4  89.2  85.4  88.6  89.4  84.5
    由表1可知,采用本发明的水提法与传统的25%乙醇或60%丙酮法相比药材中有效成分提取转移率无显著性差异,说明采用本发明的水提法也可将药材中的有效成分充分提出。
    试验例2大孔吸附树脂不同富集方法对中间体中银杏总黄酮、银杏总萜内酯含量的影响试验
    一、试验方法
    1、试验组:将试验例1所制备的银杏药材水提液上AB-8大孔吸附树脂吸附后,先用水及25%乙醇洗脱除去杂质,再用1.0%NaOH洗脱得到弱酸性黄酮类成分,再用60~70%乙醇洗脱得到中性萜内酯类成分。
    2、对照组:药材提取液上AB-8大孔吸附树脂后,先用水洗脱至流出液无色,再用20%乙醇洗脱除去杂质至流出液无色,然后用60~70%乙醇洗脱有效成分,所得中间体产品是黄酮和萜内酯的混合物。
    二、测定方法
    照高效色相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)和中华人民共和国药典2005年版一部“银杏叶”项中药材“含量测定”项测定上述试验组和对照组所得中间体中银杏总黄酮和总萜内酯的含量。
    以槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量计算总黄酮的含量,以银杏内酯A、B、C及白果内酯的含量计算总萜内酯含量。
    三、测定结果
    测定结果见表2。
    表2大孔吸附树脂不同富集方法对中间体中银杏总黄酮、银杏总萜内酯含量的影响  组别  对照组(混合物,%)  试验组(%)  总黄酮  总萜内酯  总黄酮  总萜内酯  1  31.6  9.2  83.6  89.2  2  28.3  6.4  81.9  91.3  3  28.4  8.9  84.2  87.5
    由表2可知,采用本发明的大孔吸附树脂稀碱洗脱富集法与对照组方法相比中间体产品中有效成分含量显著提高,产品再经简单纯化可使含量均达95%以上。试验例3不同制备方法对银杏总黄酮精品、银杏总萜内酯精品得率的影响试验
    一、试验方法
    1、试验组:将试验例2中试验组经大孔吸附树脂富集所制备得到的银杏总黄酮粗品以蒸馏水洗涤3次,干燥,加热溶于适量甲醇,过滤,滤液于10~12℃放置过夜,过滤析出的结晶,于60℃干燥,得银杏总黄酮精品。
    将试验例2中试验组经大孔吸附树脂富集所制备得到的银杏总萜内酯粗品照本发明之实施例1方法纯化,得到银杏总萜内酯精品。
    2、对照组:将试验例2中对照组经大孔吸附树脂富集所制备得到的银杏叶中有效成分中间体产品(总黄酮和总萜内酯混合物)加水溶解,以适量乙酸乙酯萃取3次。水相上聚酰胺色谱柱,水洗,再以10%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱部分,减压回收至干,加热溶于适量甲醇,过滤,滤液于10~12℃放置过夜,过滤析出的结晶,于60℃干燥,得银杏总黄酮精品。
    乙酸乙酯萃取液减压回收至干,加适量乙醇溶解,再以蒸馏水稀释至溶液中乙醇含量为15%,过滤,滤液上聚酰胺柱,再以5%乙醇洗柱,收集洗脱液,减压回收至无醇味,以乙酸乙酯萃取,再按照本发明之实施例1方法纯化,得到银杏总萜内酯精品。
    二、测定方法
    照高效色相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录VID)测定银杏总黄酮、银杏总萜内酯含量,按照以下公式计算药材有效成分得率。

    三、测定结果
    表3不同制备方法对银杏总黄酮精品、银杏总萜内酯精品得率的影响  组别  对照组(%)  试验组(%)  总黄酮  总萜内酯  总黄酮  总萜内酯  1  0.60  0.42  1.06  0.62  2  0.71  0.39  1.21  0.73  3  0.63  0.46  1.09  0.67
    由表3可知,采用本发明的制备方法所得银杏总黄酮和银杏总萜内酯精品得率均明显高于对照组所采用的方法,故采用本发明方法可使银杏叶药材资源得到更充分利用。

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